Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde Bağırsak Mikrobiyal Metabolitlerini Değerlendirmek için İnferior Vena Cava'dan Ardışık Kan Alımı ve Ardından Portal Ven

4.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66673

⸱

21 Haziran 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco and San Francisco General Hospital

Bu makalede

Özet

Protokol, bağırsak mikrobiyal metabolitlerinin üretimini ve emilimini değerlendirmek için portal venlerden ve farelerden inferior vena kava'dan sırayla kan toplamak için bir yöntem göstermektedir.

Özet

Bağırsak mikrobiyal ürünlerinin hem bağırsakta lokal olarak hareket ettiği hem de etkilerinin çok sayıda uzak organ sistemine yayılabileceği dolaşıma emildiği bilinmektedir. Kısa zincirli yağ asitleri (SCFA), sindirilemeyen diyet lifinin fermantasyonu sırasında bağırsak mikropları tarafından üretilen bir metabolit sınıfıdır. Artık bağırsak mikrobiyomunun, konakçı boyunca bağırsak-akciğer, bağırsak-beyin ve diğer bağırsak-organ eksenleri yoluyla bağırsak dışı organ sistemlerini nasıl etkilediğine önemli katkıda bulunanlar olarak kabul edilmektedirler. SCFA'lar kolondan bağırsak dokusu yoluyla portal ven (PV) içine emilir. Daha sonra karaciğerden geçerler ve beyin, kas, yağ dokusu ve akciğerler gibi çeşitli organlarda tüketilirler. SCFA'lar en kolay şekilde dışarı atılan dışkı materyalinde ölçülür, ancak koloni içi dışkı içeriğinden daha doğru ölçümler elde edilmiştir. Burada, farelerde SCFA'ların emilimini, taşınmasını ve sistemik seviyelerini incelemek için tek bir deneğin PV ve sistemik dolaşımdaki plazmasından numune alınmasının tercih edilebileceğini öneriyoruz. PV ve inferior vena kava'dan (IVC) etkili kan örneklemesi için portal ve sistemik dolaşımlardan nispeten büyük hacimlerde kan toplanmasına izin veren yeni bir teknik sunuyoruz. Bu, PV'nin bağlanmasıyla gerçekleştirilir, böylece PV'nin içine akan mezenterik damarlardan geri doldururken genişlemesine veya genişlemesine izin verilir. Bu yöntemi kullanarak, başarılı toplama oranının yanı sıra toplanan toplam kan miktarını da iyileştirebildik (IVC'den 0,3 mL'ye ve PV'den 0,5 mL'ye kadar).

Giriş

Kısa zincirli yağ asitleri (SCFA), bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen önemli bir metabolit sınıfıdır. Bağırsak mikrobiyomu ve diğer uzak organlar1 arasındaki etkileşimdeki kritik rolleri, iltihabı nasıl modüle ettiklerini, özel reseptörler aracılığıyla nasıl sinyal verdiklerini ve hücresel metabolizmadasubstratlar olarak nasıl hizmet ettiklerini açıklayan araştırmalarla desteklenmiştir 2,3,4,5. Grubumuzdan yapılan son çalışmalar, SCFA'ların in vivo olarak bağırsak-akciğer ekseni 6,7 yoluyla akciğer bağışıklık tonusunun in vivo inflamatuar düzenleyicileri olduğunu göstermiştir. Ek raporlar, bağırsak-beyin ekseni 8,9 yoluyla metabolizma üzerindeki fonksiyonel etkilerini açıklamıştır. Genel olarak, SCFA'ların konak fizyolojisi ve patolojisi üzerindeki etkisi, çok çeşitli hastalık süreçlerini kapsayan çok sayıda araştırma grubu tarafından aktif ve yoğun bir şekilde araştırılmaktadır.

Asetat (C2), propiyonat (C3) ve bütirat (C4) birincil SCFA'lardır ve çekum ve kalın bağırsakta sindirilebilir diyet lifinin fermantasyonu yoluyla bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilir. Her üç SCFA da doğrudan diyetten elde edilebilir ve memeli hücreleri tarafından sadece asetat da üretilebilir. SCFA'lar kolonda emilir ve kısmen bağırsak epitel hücreleri tarafından kullanılır (bir enerji kaynağı olarak, lokal doku bağışıklık modülasyonu için ve bağırsak bariyeri bakımını desteklemek için). Ayrıca mezenterik venöz sistem10 yoluyla portal ven içine taşınırlar. Bütirat esas olarak bağırsak epiteli tarafından tüketilir, karaciğer tarafından propiyonat11,12 ve asetatın periferik dolaşıma girdikten sonra kas ve yağ dokuları üzerinde etkili olduğu bildirilmiştir13,14.

SCFA üretimi, emilimi ve fonksiyonel aktivitesinin kapsamlı bir değerlendirmesi, kolon lümeni, portal dolaşımı ve periferik kandaki SCFA seviyeleri hakkında bilgi gerektirir. Bu, portal venden (PV) kan alınması ve aynı hayvanda aynı anda veya sırayla sistemik dolaşım ile gerçekleştirilebilir. SCFA'lar uçucu15 olduğundan, dışarı atılan dışkı peletlerindeki seviyelerinin ölçülmesi, kolon içindeki seviyeleri doğru bir şekilde yansıtmayabilir. Ayrıca, kolon içeriklerinden elde edilen ölçümlerle karşılaştırıldığında, PV'de bulunan SCFA'ların seviyesi, kolon11'in uzunluğu boyunca bağırsak mikrobiyomu tarafından üretilen eşit olmayan seviyelere karşı konakçı tarafından emilen kararlı durum seviyelerinin net toplamını daha doğru bir şekilde yansıtabilir. Bu nedenle, bu PV SCFA seviyeleri, SCFA'ların bağırsak içindeki lokal etkilerin ötesinde konak fizyolojisi ve patolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için daha uygun ve uygun olabilir.

PV ve sistemik dolaşımdaki kanın koordineli ve neredeyse eşzamanlı olarak toplanmasını gerçekleştirmek için, normal kan dolaşımını sürdürmek ve spontan solunumu desteklemek için diyafram sağlam kalmalıdır. Bu nedenle, inferior vena kava (IVC), PV kanı toplarken sistemik dolaşım kanı elde etmek için ideal bir bölge sunar. Bu IVC kanı, sistemik inflamasyonu değerlendirmek için dolaşımdaki sitokinleri ölçmek gibi başka amaçlar için de kullanılabilir.

Şu anda, daha büyük kemirgenlerde hem sistemik dolaşımdan hem de PV'den kan toplamak için sadece birkaç yöntem bildirilmiştir16,17. Sıçanlarda damarların kanülasyonunu gerektiren geleneksel yöntemlerin farelerde gerçekleştirilmesi teknik olarak zordur. Ek olarak, bu yöntemlerle toplanan maksimum kan miktarı genellikle 0.3 mL'den fazla değildir18.

Bu yazıda, aynı hayvanda fare IVC'den çift kan alma ve ardından PV'den çift kan alma sürecini basitleştiren yeni bir yöntem sunuyoruz. Yöntemin benzersiz özelliği, PV kan örneklemesinden hemen önce PV'nin hepatik hilus yakınında bağlanmasıdır. Bu yaklaşım, PV'nin boyutlarını genişletebilir, böylece başarı oranını önemli ölçüde artırabilir ve maksimum toplanabilir kan hacmini 0,5 mL'ye kadar artırabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu hayatta kalmama prosedüründeki tüm adımlar, California San Francisco Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Kullanılan fare cinsiyeti ve suşu, erkek C57BL / 6J fareleriydi (25-35 g ağırlığında ve 12-15 haftalık). Dişi ve/veya diğer standart fare türleri de kullanılabilir.

1. Anestezi

  1. Fare karnının alt yarısını% 70 etanol çubuklarıyla silin. İntraperitoneal tribromoetanol (250-400 mg / kg) enjeksiyonu yaparak anestezi uygulayın. Ketamin / ksilazin veya izofluran anestezisi de kullanılabilir. Kornea hasarını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
  2. Analjezi için intraperitoneal olarak buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) enjekte edin.
    NOT: Laparotomi işlemine bağlı ağrı nedeniyle buprenorfin gereklidir.

2. Laparotomi

  1. Anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda cerrahi yüzeye (altında bir ısıtma yastığı ile) yerleştirin. Cerrahi tahtadaki tüm fare uzuvlarını bantla sabitleyin. Pedal çekme refleksi olmadan ayak parmağını kıstırma ile uygun anestezi derinliğine ulaşıldığını onaylayın.
  2. Cildi kaldırın ve göbek deliğinden ksifoid sürecine kadar orta hat boyunca ve kaudal olarak karın tabanına (dış genital organ) doğru diseksiyon makası ile uzunlamasına bir kesi yapın.
  3. Bağırsakları, diyaframı veya karaciğeri delmeden veya zarar vermeden diseksiyon makasıyla peritona benzer bir kesi yapın.
  4. Göbek deliğinin her iki tarafında makasla tam uzunlukta enine bir kesi (karın genişliğini uzatan) yaparak cerrahi alanı genişletin.
  5. Aşağıdaki IVC'yi ortaya çıkarmak için ılık PBS'ye batırılmış temiz bir gazlı bez kullanarak kalın ve ince bağırsakları cerrahın sağ tarafına taşıyın.

3. PV için ligatür hazırlığı

  1. Mezenterin kökündeki PV'yi bulmak için cerrahi alandaki bağırsak segmentlerini pamuklu çubukla nazikçe manipüle edin.
  2. Damarları ve diğer karın yapılarını görselleştirmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, PV'nin arkasından karaciğer hilusunun yakınında (duodenal ven ile splenik ven arasında)19 7-0 prolen sütürü dikkatlice geçirin, böylece 5. adımda ligasyona hazır olur (Şekil 1).
    NOT: Bu adımdan itibaren mikroskop kullanmak zorunlu değildir, ancak genel prosedürün başarı oranını önemli ölçüde artırır.

4. IVC'den kan örneği alınması

  1. Heparinize 1 cc insülin şırıngasının 28G 1/2 inç iğnesini IVC'ye yerleştirin. 0.2-0.3 mL kan örneği alın.
    NOT: Bu adımda çok fazla kan alınırsa, 5. adımda daha düşük hacimlerde PV kanı toplanmasına neden olur.
  2. Çıkarılmasıyla oluşacak kanamayı önlemek için iğneyi IVC'nin içinde bırakın.

5. PV'den kan örneği alınması

  1. 7-0 prolene ligatürünü PV'nin etrafına nazikçe bağlayın; PV geri doldururken genişlemeli ve genişlemelidir. Başka bir heparinize 1cc insülin şırıngasının 28G 1/2 inçlik iğnesini PV'ye yerleştirin.
  2. PV'den 0.3-0.5 mL'ye kadar kan toplamak için yavaşça aspire edin. PV çökebilir, ancak mezenterik venöz sistemden kan dolumu ile yavaş yavaş yeniden genişlemelidir.

6. Örnek depolama

  1. Kan alındıktan sonra iğneleri IVC ve PV'den çıkarın.
  2. Kan örneklerini şırıngalardan 1.5 mL heparinize eppendorf tüplerine aktarın ve daha sonra saklanmak ve gerektiğinde analiz edilmek üzere plazmaya işlenmek üzere buz üzerine yerleştirin.
  3. Fareyi anestezik aşırı doz kullanarak ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın (UCSF IACUC onaylı yönergelere göre).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, aynı deney faresinde IVC ve PV'den sırayla kan örneklerinin neredeyse aynı anda toplanması için yenilikçi bir in vivo yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, portal dolaşımından geçen SCFA'lar gibi bağırsak mikrobiyotası tarafından oluşturulan ürünlerin seviyelerini ölçmek için kullanışlıdır. Farelerde (25-30 g ağırlığında) bir terminal prosedür sırasında toplanabilen ortalama maksimum kan hacmi yaklaşık 1 mL / faredir ve bu da toplam dolaşımdaki kan hacminin% 50'sini tems...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

AP, NIH/NHLBI'den (1R01HL146753) bir R01 ödülü ile finanse edilmektedir. DM, NIH'den bir T32 bursu ve UCSF Benioff Mikrobiyom Tıbbı Merkezi'nden bir Stajyer/Personel Pilot Ödülleri ile finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2,2,2 Tribromoetanol, %97 (Avertin)Sigma Aldrich T48402-25GAnestezik ajan 
Buprenorfin Hidroklorür Enjeksiyonu 0.3 mg / mLPAR İlaç NDC 42023-179-05Analjezik ajan
Pansuman ForsepsMiltex 6-100Diseksiyon 
Graefe ForsepsRobozRS-5136Diseksiyon 
Hepatin sodyum 1000 USP birimi/mLHikmeNDC 0641-0391-12Kan örneği şırıngaları/tüpleri heparinizasyon
Prolene 7-0Ethicon8696GPortal ven ligatür
MakasFST14058-11Diseksiyon 
Öğrenci Halsted-Sivrisinek Kanama DurdurucularF.S.T 91308-12Diseksiyon 
Cerrahi bant 3M Transpore1527-1Fare uzuvları fiksasyonu
U-100 İnsülin Şırıngası 28G1/2EXEL26027Kan örneği toplama 

Kaynaklar

  1. vander Hee, B., Wells, J. M. Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids. Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).
  2. Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
  3. Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. Regulation of inflammation by short chain fatty acids. Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).
  4. Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets. Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).
  5. den Besten, G., et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).
  6. Tian, X., et al. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Front Microbiol. 10, 159(2019).
  7. Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).
  8. De Vadder, F., et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).
  9. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).
  10. Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).
  11. Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).
  12. Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).
  13. Neis, E. P., et al. Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man. Gut. 68 (4), 764-765 (2019).
  14. Yamashita, H., et al. Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).
  15. Ríos-Covián, D., et al. Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health. Front Microbiol. 7, 185(2016).
  16. Jaworska, K., et al. An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products. J Vis Exp. (140), e58456(2018).
  17. Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
  18. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  19. Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).
  20. Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).
  21. Hoyles, L., et al. Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier. Microbiome. 6 (1), 55(2018).
  22. Shimizu, J., et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. PLoS One. 13 (9), e0203657(2018).
  23. Wang, J., et al. Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response. Front Immunol. 8, 1108(2017).
  24. Lucas, S., et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun. 9 (1), 55(2018).
  25. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J Vis Exp. (92), e51955(2014).
  26. Sänger, C., et al. Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications. PLoS One. 10 (11), e0141798(2015).
  27. Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. Portal Vein Injuries: A Review. J Emerg Trauma. 2 (2), 4(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kısa Zincirli Yağ AsitleriPortal Ven ÖrneklemesiFarelerden Kan ToplamaSCFA AbsorpsiyonuBağırsak MikrobiyomuPortal KanMetabolit TransportuFare Cerrahi Tekniği
Farelerde Bağırsak Mikrobiyal Metabolitlerini Değerlendirmek için İnferior Vena Cava'dan Ardışık Kan Alımı ve Ardından Portal Ven
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.