Mikroakışkan çip bazlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla alt solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti

Özet

Çeşitli bakteriyel patojenler, doğru bir şekilde tespit edilmez ve derhal tedavi edilmezse solunum yolu enfeksiyonlarına neden olabilir ve ciddi sağlık sorunlarına yol açabilir. Döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla bu patojenlerin hızlı ve doğru tespiti, klinik ortamlarda solunum yolu enfeksiyonlarının etkili bir şekilde yönetilmesini ve kontrol edilmesini sağlar.

Özet

Solunum yolu enfeksiyonları (RTI) klinik ortamlarda en sık görülen problemler arasındadır. Bakteriyel patojenlerin hızlı ve doğru bir şekilde tanımlanması, RTI'lerin yönetimi ve tedavisi için pratik kılavuzlar sağlayacaktır. Bu çalışma, çok kanallı döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) yoluyla solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenleri hızlı bir şekilde tespit etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. LAMP, bakteriyel nükleik asitleri yüksek doğruluk ve güvenilirlikle hızlı bir şekilde tespit eden hassas ve spesifik bir tanı aracıdır. Önerilen yöntem, zaman alıcı olan ve genellikle düşük bakteriyel nükleik asit seviyelerini tespit etmek için daha fazla hassasiyet gerektiren geleneksel bakteri kültürleme yöntemlerine göre önemli bir avantaj sunmaktadır. Bu makale, alt solunum yolundan örnekleri (balgam, bronşiyal lavaj sıvısı ve alveoler lavaj sıvısı) tespit etmek için LAMP kullanılarak K. pneumoniae enfeksiyonu ve çoklu ko-enfeksiyonlarının temsili sonuçlarını sunmaktadır. Özetle, çok kanallı LAMP yöntemi, klinik numunelerde tekli ve çoklu bakteriyel patojenleri tanımlamak için hızlı ve verimli bir yol sağlar, bu da bakteriyel patojenlerin yayılmasını önlemeye ve RTI'lerin uygun tedavisine yardımcı olabilir.

Giriş

Bakteriyel patojenlerin neden olduğu solunum yolu enfeksiyonları (RTI'ler) öncelikle dünya çapında morbidite ve mortaliteye katkıda bulunur¹. 2-3 gün süren ateşin eşlik ettiği herhangi bir üst veya alt solunum yolu belirtisi olarak tanımlanır. Üst solunum yolu enfeksiyonu, alt solunum yolu enfeksiyonuna göre daha sık görülürken, kronik ve tekrarlayan solunum yolu enfeksiyonları da sık görülen, bireyler için büyük riskler oluşturan ve sağlık sistemleri üzerinde önemli bir yük oluşturan klinik durumlardır². RTI'lerin yaygın bakteriyel patojenleri arasında Streptococcus pneumoniae³, Haemophilus influenzae⁴, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia ve diğerleri bulunur. Bu patojenik bakteriler genellikle konakçının nazofarenks ve üst solunum yollarının mukozal yüzeylerini kolonize ederek boğaz ağrısı ve bronşit gibi RTI'lerin tipik semptomlarına neden olur. Üst solunum yollarından alt solunum yollarının steril bölgelerine yayıldıklarında pnömoniye neden olurlar ve solunum yolu ile kişiden kişiye yayılabilirler⁵. Ciddi vakalarda, dünya çapında tüm yaş gruplarındaki insanlarda morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenleri olan bakteriyemik pnömoni, menenjit ve sepsis başta olmak üzere invaziv bakteriyel hastalıklara da yol açabilirler.

RTI'ler için geleneksel testler, boğaz sürüntüleri ve balgam solunum örnekleri kullanılarak yapılan mikrobiyolojik kültürü içerir⁶. Ek olarak, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi serolojik testler serumdaki antikorları veya antijenleri tespit ederken, aglütinasyon testleri enfeksiyonu tespit etmek için antikorların ve antijenlerin aglütinasyon reaksiyonunu gözlemler⁷. Mikrobiyal kültür, RTI'leri teşhis etmek için altın standart olarak kabul edilir, ancak düşük kültür pozitiflik oranı, düşük güvenilirliği ve uzun tespit döngüsü tanısal verimliliği sınırlar⁸. Gerçekte, RTI'lerin hızlı ve doğru teşhisi, bakteriyel patojenin kesin olarak ortadan kaldırılması için çok önemlidir. Hızlı ve etkili tespit yöntemleri, patojenlerin bulaşma hızını azaltmaya, enfeksiyon süresini kısaltmaya ve gereksiz antibiyotik kullanımını azaltmaya yardımcı olabilir ^9,10. Moleküler biyoloji tabanlı yöntemler, patojenleri tespit etmek için bir hedef genin DNA dizisini çoğaltan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi tespiti önemli ölçüde hızlandırır. Bununla birlikte, geleneksel PCR, hantal ve zaman alıcı olan karmaşık sıcaklık döngüsü ekipmanı gerektirir. Ayrıca, PCR kullanılarak yapılan her DNA amplifikasyonu (gerçek zamanlı PCR hariç), ürünün elektroforetik olarak ayrılmasıyla sonuçlanır ve bu da zaman alır. Ürünün görselleştirilmesi, çoğu mutajenik veya kanserojen olan boyalar gerektirir. Bu nedenle, RTI bakteriyel patojenlerini teşhis etmek için sürekli olarak yeni yöntemler ve teknolojiler geliştirmek zorunludur.

Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP), ilk olarak Notomi ve ark. 2000^{yılında 11}. LAMP, karmaşık sıcaklık döngüsü ekipmanı olmadan kararlı izotermal koşullar altında DNA'yı çoğaltabilir, bu da onu hızlı algılama için uygun hale getirir ve ekipman karmaşıklığını ve maliyetini^{azaltır 12}. LAMP, düşük konsantrasyonlarda hedef DNA'yı yüksek hassasiyetle^{tespit edebilir 13}. Hedef diziler için seçiciliği artırmak ve yanlış pozitifler¹⁴ olasılığını azaltmak için birden fazla spesifik primer kullanır. LAMP, RTI'leri tespit etmek için bile kolaylığı, hızı ve sezgisel kullanımı nedeniyle klinik laboratuvarlarda giderek yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, Şekil 1'de gösterildiği gibi klinik örneklerde (balgam, bronşiyal lavaj sıvısı ve alveoler lavaj sıvısı) düşük RTI'leri tespit etmede LAMP'nin etkinliğini araştırdık. LAMP'in daha düşük RTI tespitinde geleneksel testlere göre hız, hassasiyet ve kullanım kolaylığı gibi avantajlar sunduğu ve bu da onu umut verici bir uygulama haline getirdiği açıktır.

Şekil 1: LAMP algılama yönteminin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Bu çalışma için tüm örnekler Guangdong İl Halk Hastanesi Etik İnceleme Komitesi tarafından değerlendirilmiş ve onaylanmıştır (Onay Numarası: KY2023-1114-01). Tüm katılımcılar deneylerden önce yazılı bilgilendirilmiş onam imzaladılar. Çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Protokolde kullanılan kısaltmalar Ek Tablo 1'de listelenmiştir.

1. Alt solunum yollarından klinik örneklerin toplanması

1. Balgam toplama
   1. Ağız boşluğunu ve dişleri temiz suyla temizleyin ve varsa protezin çıkarılmasını sağlayın. Derin solunum balgamını bir balgam kabına (en az 0.6 mL) atmak için kuvvetlice öksürük.
   2. Tükürük veya burun akıntısı ile kontaminasyondan kaçının. Öksürük zorsa, balgam söktürmeyi kolaylaştırmak için 45 ° C'de 100 g / L NaCl solüsyonunun solunmasını sağlayın. Numuneyi steril, sızdırmaz bir kaba aktarın.
      NOT: Balgam örneklerinin sabahları ve herhangi bir antibakteriyel ilaç kullanımından önce alındığından emin olun.
2. Bronşiyal lavaj sıvısı (BLF)
   1. Kollektör kafasını burun deliğinden veya trakeostomi bölgesinden (yaklaşık 30 cm derinlikte) trakeaya yerleştirin. 5 mL salin enjekte edin, negatif basınç oluşturun, kolektör kafasını döndürün ve yavaşça geri çekin.
   2. Ekstrakte edilen mukusu toplayın ve toplayıcıyı bir kez örnekleme solüsyonu (fizyolojik tuzlu su veya enjeksiyon için steril su) ile durulayın. Alternatif olarak, toplama yerine bir pediatrik idrar kateterini 50 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
3. Alveoler lavaj sıvısı (ALF)
   1. Göğüs görüntüleme muayeneleri ile lezyonun yerini belirleyin. Lavaj için en önemli veya hızla ilerleyen alanı seçin.
   2. Lavaj sırasında biyopsi kanalı yoluyla bronş segmentine 1-2 mL% 2 lidokain enjekte edin ve lavajlanmış akciğer segmenti¹⁵ için lokal anestezi sağlayın. İntravenöz genel anestezi altında hala güçlü hava yolu reaksiyonları sergileyen hastalar için 1-2 mL% 2 lidokain enjekte edin.
   3. Lokal anesteziden sonra, farenksten sağ orta lobun bronşuna veya sol akciğerin lingual segmentine geçerek ağız veya burundan bir fiberoptik bronkoskop yerleştirin. Ucunu bronş dalının girişine yerleştirin ve yavaşça steril fizyolojik salin ekleyin.
   4. Seans başına 100-250 mL hacimde (maks. 300 mL) 30-50 mL salin uygulayın. Ekstrakte edilen mukusu kapalı steril bir kapta toplayın.

2. DNA ekstraksiyonu

1. Alt solunum yolu numunelerinin viskozitesine bağlı olarak, uygun miktarda NaOH ekleyin. Düşük viskoziteli numuneler için, sıvılaştırma çözeltisi numunesinin hacminin 2-3 katı ekleyin. Orta viskoziteye sahip numuneler için, sıvılaştırma çözeltisi numunesinin hacminin 5-6 katı ekleyin. Yüksek viskoziteli numuneler için, sıvılaştırma çözeltisi numunesinin hacminin 8-10 katı ekleyin.
   1. NaOH hacmini numune viskozitesine göre ayarlayın. Numuneleri 15 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı kullanarak mümkün olduğunca eşit bir şekilde dağıtın ve sıvılaştırma için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Daha kalın numuneler için NaOH hacmini artırın veya sıvılaştırma süresini uzatın. Numunelerin sıvılaştırma kalitesi, sonraki ekstraksiyon verimliliğini doğrudan etkiler. İdeal olarak, sıvılaştırılmış numuneler tutarlı, yapışkan olmayan bir kıvam göstermelidir.
2. Sıvılaştırılmış numunenin 1 mL'sini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. 2-6 °C'de 5 dakika boyunca 15.777 × g hızında santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarmak ve atmak için bir pipet kullanın.
   NOT: Numuneyi aspire ederken, tüpün altından yabancı maddeler çekmekten kaçının; Çok sayıda safsızlık varsa, numune aspirasyondan önce 1 dakika boyunca 1.753-2.739 × g'da santrifüjlenebilir.
3. Santrifüj tüpüne 1 mL yıkama solüsyonu ekleyin ve çökeltiyi tüpün altından kaldırmak için girdap yapın. Tamamen dağıtmaya gerek yoktur.
   1. Çözeltiyi 15.777 × g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve çökeltiye dokunmamaya çalışın.
      NOT: Sonraki amplifikasyonu etkilememek için yıkama solüsyonunun tamamen çıkarıldığından emin olun.
4. Santrifüj tüpüne 100 μL nükleik asit ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Çökeltiyi iyice aspire etmek ve karıştırmak için bir pipet kullanın. Sıvıyı aktarın ve birlikte bir nükleik asit ekstraksiyon tüpüne çökeltin. Nükleik asit ekstraksiyon çözeltisinin bileşimi Tablo 1'de sunulmuştur.
5. Nükleik asit ekstraksiyon tüplerini bir girdap karıştırıcısına yerleştirin ve en az 5 dakika orta hızda girdaplayın. Girdaplamadan sonra, nükleik asit ekstraksiyon tüplerini sabit bir sıcaklıkta metal bir banyoya aktarın ve 5 dakika boyunca 100 ° C'de ısıtın.
6. 15.777 × g'da 2-6 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve bir kenara koyun.
   NOT: PCR amplifikasyon reaksiyonu 24 saat içinde gerçekleştirilirse, nükleik asit 4 °C'de saklanabilir. Amplifikasyondan sonra nükleik asidi -20 °C'de saklayın. Uzun süreli depolama için (24 saatten fazla), nükleik asidi -20 °C'de saklayın. Tekrar kullanıma hazır olduğunda, numuneyi doğal olarak çözdürün, karıştırmak için girdaplayın, 95 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika ısıtın, 1 dakika boyunca 10.956 × g'da santrifüjleyin ve PCR amplifikasyonu için süpernatanı kullanın.

Çözüm	Bileşen	Sayı	Şartname
Yıkama Solüsyonu	10 mM EDTA	1 şişe	24 mL/şişe
Nükleik Asit Ekstraksiyon Reaktifi	10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, Nükleik asit koruyucular	2 tüp	1.2 mL/şişe
Nükleik Asit Ekstraksiyon Tüpü	Cam boncuklar	1 çanta	24 şişe / torba

Tablo 1: Nükleik asit ekstraksiyon reaktifinin bileşimi.

3. Döngü aracılı izotermal amplifikasyon ve mikroakışkan çip

1. Reaktif ve mikroakışkan çip
   1. Mikroakışkan disk şeklindeki bir çip üzerinde izotermal amplifikasyon reaksiyonları gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Sabit sıcaklık amplifikasyonunu 65 °C'de gerçekleştirin.
   2. Sabit sıcaklık amplifikasyonu mikroakışkan çip nükleik asit analizörü üzerinde bir floresan boya birleştirme yöntemi¹⁴ kullanarak gerçek zamanlı floresan analizi gerçekleştirin. İplik yer değiştirme işlevine sahip bir polimeraz kullanarak pozitif numuneler için S-şekilli bir amplifikasyon eğrisi gözlemleyin.
2. Döngü aracılı izotermal amplifikasyon
   1. İki iç astar ve iki dış astar (LAMP kiti ile birlikte verilir) dahil olmak üzere dört özel astar ile altı dizi bölgesini hedefleyin.
      NOT: DNA, iplik yer değiştirme işlevine sahip bir DNA polimeraz kullanılarak sabit bir sıcaklıkta sürekli olarak kopyalanır ve amplifiye edilir. Reaksiyon süreci, dambıl şeklindeki şablon sentez aşamasını, döngü amplifikasyon aşamasını, uzamayı ve geri dönüşüm aşamasını içerir ve sonuçta kök halka ve karnabahar benzeri yapılara sahip DNA parçalarının bir karışımını oluşturur. Ayrıntılı bilgi için kit talimatlarına bakın (Ek Dosya 1).
   2. Kök döngü yapılarına bağlanan, iplik yer değiştirme sentezini ve döngüsel replikasyonu başlatan reaksiyon verimliliğini artırmak için reaksiyon sistemine iki döngülü primerler ekleyin. Solunum yolu patojenleri için nükleik asit tespit kitinin bileşimi Tablo 2'de sunulmaktadır.
      NOT: Reaktif kiti LAMP yöntemini kullanır. Prensip, DNA'nın yaklaşık 65 °C'deki dinamik dengesine dayanır, burada çift sarmallı DNA'nın tamamlayıcı bölgesinde baz eşleşmesi yoluyla uzanan herhangi bir primer, diğer zincirin ayrışmasına ve tek bir iplik oluşturmasına neden olur.
3. Mikroakışkan çip
   NOT: Her bir mikroakışkan çip (Malzeme Tablosuna bakınız), saat yönünün tersine numaralandırılmış 24 reaksiyon kuyusu ile donatılmıştır ve kuyu 1'in giriş ve çıkışı reaksiyon kuyusu 1'e karşılık gelir (Şekil 2). Belirli bir nükleik asit hedef dizisinin amplifikasyonu ve tespiti için özel bir primer seti, her reaksiyon kuyusuna gömülür ve sabitlenir.
   1. Örnek DNA'yı amplifikasyon reaktifi ile karıştırın. Karışımı çipe enjekte edin ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1.000 × g'da her bir reaksiyon kuyusu santrifüjüne dağıtın.
      NOT: Bağımsız izotermal amplifikasyon reaksiyonları ve gerçek zamanlı floresan algılama, çip üzerindeki her reaksiyon kuyusunda birlikte meydana gelir. Belirli bir reaksiyon kuyusunda S-şekilli bir amplifikasyon eğrisi tespit edilirse, o kuyu için karşılık gelen algılama indeksi pozitiftir.

Bileşen	Kompozisyon	Sayı
Yonga	Astar	12 yer
Sızdırmazlık Filmi	/	1 yaprak
İzotermal Amplifikasyon Reaktifi	Floresan boya, Enzim	270 μL/tüp
Pozitif Kontrol	Escherichia coli Genomik DNA	160 μL/tüp

Tablo 2: Solunum yolu patojenleri için nükleik asit tespit kitinin bileşimi.

Şekil 2: Disk çip yapı şeması. Reaksiyon kuyuları saat yönünün tersine sıralı olarak numaralandırılır, burada giriş/çıkış portu 1, 1 numaralı reaksiyon kuyusuna karşılık gelir. Reaksiyon kuyuları 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 ve 24 negatif kontrollerdir. Reaksiyon kuyusu 6 pozitif bir kontroldür (E. coli). Reaksiyon kuyusu 12 dahili bir pozitif kontroldür ve reaksiyon kuyusu 23 harici bir pozitif kontroldür. Reaksiyon kuyusu 2 spn'yi algılar. Reaksiyon kuyusu 3 sau'yu algılar. Reaksiyon kuyusu 5 MRSA'yı tespit eder. Reaksiyon kuyusu 8 kpn'yi algılar. Reaksiyon kuyusu 9 pae'yi algılar. Reaksiyon kuyusu 11 aba'yı algılar. Reaksiyon kuyusu 14 sma'yı tespit eder. Reaksiyon kuyusu 15 hin'i tespit eder. Örnek ayrıntılar için lütfen Tablo 5'e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Numune hazırlama ve bakteri tespiti

1. İzotermal amplifikasyon reaksiyon sistemini hazırlayın
   1. İzotermal amplifikasyon reaktifini kitten alın ve oda sıcaklığında tamamen çözülmesine izin verin. İyice karıştırmak için hafifçe çalkalayın ve tüpün dibinde toplamak için kısa bir süre santrifüjleyin.
   2. Reaktif saklama ve hazırlama alanında, 20 μL izotermal amplifikasyon reaktifini hazırlanmış 200 μL'lik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Tüpün üzerini kapatın ve numune başına bir santrifüj tüpü ile numune hazırlama alanına taşıyın.
   3. Numune hazırlama alanına 34,5 μL hedef nükleik asit numunesi ekleyin. İyice karıştırmak için hafifçe çalkalayın ve tüpün dibinde toplamak için kısa bir süre santrifüjleyin. Her bir nükleik asit amplifikasyon reaksiyon sisteminin toplam hacmi 54.5 μL'dir (Tablo 3).
2. Talaş yükleme prosedürü
   1. Çip ambalajının üzerinde numune numarasını etiketleyin. Mikroakışkan çipi, ambalaj etiketi yukarı bakacak şekilde açın.
   2. Çipi giriş ve çıkış portları yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Bir pipet kullanarak, hazırlanan amplifikasyon reaksiyon sisteminden 50 μL çekin ve giriş portundan çipin ana kanalına ekleyin. Ana kanal dolduğunda eklemeyi bırakın ve giriş ve çıkış portlarının etrafındaki fazla sıvıyı tüy bırakmayan mendille hızlıca silin.
   3. Bir sızdırmazlık filmi almak için cımbız kullanın ve giriş ve çıkış portlarının üzerine kapatın. Temiz bir pipet ucunu sızdırmazlık filminin üzerine bir yönde bastırın. Sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.
3. qPCR reaksiyonu
   1. Nükleik asit analizörünün ışık kaynağı ön ısıtmayı tamamladıktan sonra, Tepsiyi Aç düğmesine tıklayın. Çipi ön tarafı yukarı bakacak şekilde tepsiye yerleştirin ve sabitlemek için yerleştirme küçük silindirinin çipin orta boşluğundan çıktığından emin olun. Tepsideki merkez konumlandırma cihazını çipteki büyük merkezi delikle hizalayın.
   2. Çipi nükleik asit analizörüne yerleştirmek için Tepsiyi Kapat düğmesine tıklayın.
   3. Algılama arabirimindeki Örnek Bilgileri alanına, örneği test etmek için bilgileri girin. Numune numarası, çip numarası ve numune tipi zorunludur; diğerleri isteğe bağlıdır.
   4. Numune algılamayı başlatmak için işlem alanındaki Algılamayı Başlat düğmesine tıklayın. Cihaz, önceden ayarlanmış programa göre numune testi yapacaktır.
      NOT: Algılama tamamlandıktan sonra, cihazın beraberindeki yazılım otomatik olarak veri analizi yapacaktır. Eşzamanlı olarak, nükleik asit analizörü otomatik bir soğutma işlemi başlatacaktır. Sıcaklık 37 °C'ye düştüğünde, cihaz tepsiyi otomatik olarak açar ve çipi almak için çıkarır. Sonuçlar sistem tarafından otomatik olarak yorumlanacaktır (Tablo 4).
4. Kalite kontrol standartları
   1. Bu reaktif kitindeki her çipte bir pozitif kalite kontrolü ve dokuz negatif kalite kontrolü bulunur. Pozitif kalite kontrolü için tespit sonuçlarının pozitif olduğundan ve aynı zamanda dokuz negatif kalite kontrolünün tümünün sonuçlarının negatif olduğundan emin olun.
      NOT: Sonuçlar, görüntünün sağ tarafında, test sonuçlarının geçerli olduğunu gösteren "Kalite Kontrol Sonuçları: Deney Normal (Pozitif Normal, Negatif Normal)" ifadesi görüntülenir. Herhangi bir sonucun yanlış olması ve numune test sonucunun geçersiz sayılması durumunda tekrar test yapılması gerekir. İnsana özgü primerleri kullanan bir pozitif dahili kontrol, çip içine yerleştirilmiştir, bunun sonucu klinik numune testi için pozitiftir, numunenin düşük bir insan genomik DNA içeriğine sahip olması durumunda negatiftir, bu da daha düşük bir hücre sayısını gösterir. Bu gibi durumlarda numuneleri toplayın ve yeniden test edin.
5. Sonuç analizi
   1. Algılamanın tamamlanmasından sonra, hızlı amplifikasyon aşaması sırasında S-şekilli amplifikasyon eğrisinin ilk bükülme noktasını hesaplamak için yazılımda ticari olarak korunan algoritmalarla birleştirilmiş ikinci türev maksimum yöntemini kullanın. Ayrıntılar, Solunum Patojenleri Nükleik Asit Tespit Kiti Talimatlarının (Ek Dosya 1) "Testin Prensipleri" bölümünde açıklanmıştır.
      NOT: TP değeri, bükülme noktası ile orijin arasındaki zaman farkıdır. Sonuç, TP ve olumlu yargı değerlerine göre yorumlanır. Bir algılama indeksi için TP değeri, o indeks için pozitif yargı değerinden küçük veya ona eşitse, pozitif olarak yorumlanır. TP değeri pozitif karar değerini aşarsa, talimatlarda yer alan "pozitif karar değeri" kriterine göre negatif olarak yorumlanır. "Floresan Eğrisi Alanı" normalleştirilmiş eğriyi gösterir ve "Algılama Sonucu" alanı her parametre için kalite kontrol ve algılama sonuçlarını gösterir (Tablo 5).

Reaktan	Hacim (μl)
İzotermal Amplifikasyon Reaktifi	20
Şablon DNA	34.5

Tablo 3: İzotermal amplifikasyon reaksiyon sistemi.

Adım	Bir	İki
Sıcaklık (°C)	37	65
Zaman (dk)	3	47

Tablo 4: Nükleik asit amplifikasyon reaksiyon programı.

Gösterge Adı	Pozitif Kontrol Değeri
Streptococcus pneumoniae (sp)	30
Staphylococcus aureus (sau)	34
Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (mrsa)	22
Klebsiella pneumoniae (kpn)	29
Pseudomonas aeruginosa (pae)	36
Acinetobacter baumannii (aba)	36
Stenotrophomonas maltophilia (sma)	27
Haemophilus influenzae (hin)	36

Tablo 5: Enfeksiyon göstergesi için pozitif kontrol değeri.

Sonuçlar

Bu deney, bir mikroakışkan disk çipi üzerinde reaksiyonlar yürüten izotermal amplifikasyon teknolojisini kullanır. Reaksiyon, bir floresan boya yerleştirme yöntemi kullanan bir mikroakışkan çip nükleik asit analizörü üzerinde gerçekleşir. İzotermal reaksiyon, 65 °C'lik sabit bir sıcaklıkta gerçekleştirilir ve gerçek zamanlı floresan analizi aynı anda gerçekleştirilir. Pozitif numuneler, zincir yer değiştirme işlevine sahip polimerazın etkisi altında amplifikasyona tabi tutulur ve bu da S-şekilli bir amplifikasyon eğrisi ile sonuçlanır. Bu tek adımlı süreç, hedef genin amplifikasyonunu ve tespitini tamamlar. Bu çalışma, deney tasarımının güvenilirliğini göstermek için farklı deney sonuçlarına sahip 7 örneklem seçmiştir. Büyük S harfi bir örnek anlamına gelir. S1, tek bir K. pneumoniae suşu ile enfekte olmuş bir örnektir. S2 ila S7, tümü K. pneumoniae ile enfekte olmuş polimikrobiyal enfeksiyonlu örneklerdir. Etkili algılama sonuçları için, görüntülerde görüntülenen normalleştirilmiş floresan eğrileri aracılığıyla yorumlama yapılabilir. Pozitif bir gösterge, S şekli sergileyen bir amplifikasyon eğrisi ile temsil edilirken, yatay bir çizgi negatif bir göstergeyi temsil eder (Şekil 3).

Şekil 3: LAMP aracılığıyla temsili nükleik asit amplifikasyon sonuçları. Büyük harf S, örnek anlamına gelir. S1, tek bir kpn suşu ile enfekte olmuş bir numunedir. S2 ila S7, tümü kpn ile enfekte olmuş polimikrobiyal enfeksiyonlu örneklerdir. S2, kpn ve sma ile enfekte olmuş bir örneği temsil eder. S3, kpn, sau ve MRSA ile aynı anda enfekte olmuş bir örneği belirtir. S4, kpn, sau, MRSA ve aba ile aynı anda enfekte olmuş bir numuneyi ifade eder. S5, kpn, sma, sau, MRSA ve aba ile aynı anda enfekte olmuş bir numuneyi gösterir. S6, kpn, sma, pae, sau, MRSA ve aba ile aynı anda enfekte olmuş bir numuneyi belirtir. S7, kpn, sma, pae, sau, MRSA, aba ve E. coli ile aynı anda enfekte olmuş bir numuneyi temsil eder. Örnek ayrıntılar için lütfen Tablo 5'e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu reaktif kiti, sekiz test göstergesi için pozitif eşik değerlerini hesaplamak için ROC yöntemini kullanır. Bir algılama göstergesinin TP değeri, karşılık gelen pozitif eşik değerinden küçük veya ona eşit olduğunda, pozitif olarak yorumlanır. Tersine, bir algılama göstergesinin TP değeri pozitif eşik değerinden büyük olduğunda, negatif olarak yorumlanır. Her bir gösterge için pozitif eşik değerleri Tablo 5'te detaylandırılmıştır. Farklı deney sonuçlarına sahip 7 örnek için tespit ettiğimiz gerçek pozitif TP değerleri Tablo 6'da gösterilmiştir.

ÖRNEK	kpn (İngilizce)	Sma	PAE (Gözden Geçirme)	Sau	MRSA (Radyo ve Sinema	Hin	Aba	eko
	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)
S1	19.68 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S2	17.73 (+)	18.30 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S3	16.73 (+)	U (-)	U (-)	18.05 (+)	12.18 (+)	U (-)	U (-)	U (-)
S4	21.66 (+)	U (-)	U (-)	27.07 (+)	19.61 (+)	U (-)	18.29 (+)	U (-)
S5	16.16 (+)	20.85 (+)	U (-)	23.80 (+)	17.13 (+)	U (-)	15.22 (+)	U (-)
S6	11.20 (+)	16.79(+)	17.18(+)	23.09 (+)	16.14 (+)	U (-)	14.28 (+)	U (-)
S7	14.69 (+)	24.84(+)	19.70(+)	24.07(+)	14.16 (+)	- (+)	15.23 (+)	20.12 (+)
Her Örnek+/-, nitel sonuç; +, olumlu sonuç; -, olumsuz sonuç.

Tablo 6: Enfeksiyon sonrası tespit için TP değerleri tablosu.

Ek Tablo 1: Kısaltmaların listesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Solunum yolu patojenleri nükleik asit tespit kiti talimatları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Solunum yolu enfeksiyonları, hastaneyle ilişkili yaygın enfeksiyonlardır ve hastalar üzerinde ciddi sonuçlar doğurur ve ölüm oranlarını artırır¹⁶. Potansiyel patojenlerin zamanında ve doğru bir şekilde tanımlanması ve ardından etkili antibiyotikler, özellikle geleneksel kültür yöntemlerinin doğasında bulunan sınırlamalar göz önüne alındığında, başarılı tedavinin ve prognozun iyileştirilmesinin anahtarıdır¹⁷. Bu çalışmada, RTI'lerin hızlı ve kesin tespiti için tekli veya çoklu enfeksiyonları belirlemek için LAMP tabanlı bir yöntem kullandık. Bu hızlı algılama sistemi, LAMP teknolojisinin mikroakışkan teknolojisi ile birleştirilmesiyle kurulmuştur. Balgam, BLF ve ALF gibi klinik örneklerden elde edilen nükleik asit hızlı bir şekilde ekstrakte edilebilir. Ekstrakte edilen bu materyal, bakteriyel patojenlerin hızlı ve hassas bir şekilde tespit edilmesini kolaylaştırarak, RTI'lerin daha iyi kontrolü ve tedavisi için klinik uygulamalara rehberlik eder.

Önceki çalışmalar, kültür bazlı yöntemler ve polimeraz zincir reaksiyonu ile karşılaştırıldığında, LAMP sonuçlarının saf kültürlerde ve kan örneklerinde %100 duyarlılık, özgüllük ve diğer bakterilerle çapraz reaksiyon elde etmediğini göstermiştir¹⁸. LAMP testleri ayrıca kan, plevral ve periton sıvısı ve beyin omurilik sıvısı gibi biyolojik sıvılardan doğrudan patojenleri de tespit edebilir¹⁹. Eksojen DNA ve inhibitörlerin PCR'nin duyarlılığını önemli ölçüde azaltabileceği daha önce gösterilmiştir ve LAMP tahlilleri için klinik örneklerden DNA'nın saflaştırılması gerekli değildir²⁰. Bu teknik, amplifikasyonun normalliğini değerlendirmek için amplifikasyon işlemi sırasında maya genlerini ve primerlerini kullanır, böylece harici kontrol kalite kontrolünün kalifikasyonunu belirler. İnsan genlerinden primerler kullanan iç kontroller, örnekleme, nükleik asit ekstraksiyonu ve amplifikasyon süreçlerinin normalliğini belirler. İç ve dış kontrollerin aynı anda kullanılması, sonuçların güvenilirliğini sağlar. Aynı zamanda, testin doğruluğunu büyük ölçüde sağlayan çoklu pozitif ve negatif kontrol kuyuları da kurulur. LAMP mikroakışkan çipi, klinik numuneleri tespit etmede qPCR'ye benzer yeteneklere sahiptir. Hızlı klinik tespit ve hassas tedavi için güvenilir bir temel sağlayan yüksek hassasiyet ve güçlü tespit yeteneği özelliklerine sahiptir²¹. Mikrobiyal kültür 3-5 gün veya daha uzun sürer ve Chlamydia pneumoniae ve Legionella pneumophila gibi bazı patojenler kültürlenemez. Buna karşılık, LAMP, 3 saatten daha kısa bir sürede birden fazla bakteriyel patojeni, hatta kültürlenemeyenleri bile tespit eder ve algılama hızını önemli ölçüde artırır.

Ayrıca birden fazla algılama gerçekleştirebilir. LAMP mikroakışkan çipi, birden fazla patojeni paralel olarak tespit eden, her reaksiyonun bağımsızlığını ve sonuçların doğruluğunu sağlayan çeşitli reaksiyon birimlerine bölünmüştür^22,23. Çin Ağı Antibakteriyel Gözetim Merkezi'nden elde edilen veriler, K. pneumoniae prevalansının 2022'de solunum örneklerinden elde edilen bakteri izolatları arasında ilk sırada yer aldığını gösterdi¹⁵. Guangdong İl Halk Hastanesi tarafından 2022 yılında toplanan solunum örnekleri arasında LAMP tarafından test edilen K. pneumoniae'nin pozitif oranı %18,6 olup, bu aynı zamanda en yüksek prevalansa sahip bakterilerden biridir. Tüm K. pneumoniae pozitif örneklerde, %30.6'sı yalnızca K. pneumoniae'nin neden olduğu enfeksiyonlardı ve %29.7'si K. pneumoniae'nin diğer bakteri türleriyle bir arada bulunduğu enfeksiyonlardı. Ek olarak, K. pneumoniae enfeksiyonunu içeren üçlü enfeksiyon (%23.9) ve dörtlü enfeksiyon (%10.5) vardı ve KP pozitif örneklerde çoğunluğu, yaklaşık %95'ini oluşturuyordu. Çok az sayıda beşli ve altılı enfeksiyon vakası vardı ve şu an itibariyle altılı ötesi enfeksiyonlar tespit edilmedi. Sonuçlar, her biri tek başına K. pneumoniae'nin neden olduğu veya diğer 1-5 bakteri türüyle bir arada bulunan enfeksiyonların tespit sonuçlarını temsil eden altı temsili senaryoyu göstermektedir.

Ek olarak, bu çalışmada kullanılan LAMP çip teknolojisi de bakteri direncini tespit edebilir. MecA geni aracılığıyla metisiline dirençli MRSA'yı tespit eder. Staphylococcus aureus'u temsil eden kuyucuklar ve mecA geni için kuyucuklar pozitif olduğunda, bir metisilin-MRSA enfeksiyonunu temsil ederler. Araştırmacılar, patojenleri ve antibiyotik direnç özelliklerini aynı anda hızlı bir şekilde tespit etmek için sürekli olarak yöntemler araştırıyorlar. Örneğin, Helicobacter pylori enfeksiyonu ve antibiyotik direnci için hızlı bir tanı yöntemi, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonuna (qPCR) ^{dayanmaktadır24}. Başka bir yaklaşım, yüzeyde geliştirilmiş Raman saçılımı (SERS) spektrumlarının²⁵ derin öğrenme analizi ve SERS spektrumları 26 kullanılarak K. pneumoniae ve karbapenemaz genlerini tespit etmek için bir yöntem yoluyla çoklu ilaca dirençli K. pneumoniae'nin hızlı bir şekilde tahmin edilmesini^içerir. Ek olarak, SERS spektrum analizine dayalı olarak K. pneumoniae suşlarının farklı çok lokuslu dizi tipleme (MLST) profilleri için bir sınıflandırma ve tahmin yöntemi vardır²⁷. Daha sonra, K. pneumoniae ve karbapenemaz genlerinin, zaman alıcı veya pahalı özel araçlara dayanan altın standart klinik yöntemlerle karşılaştırılabilir performansla hassas ve doğru bir şekilde tespit edilmesini geliştireceğiz. Ayrıca, ideal teşhis yaklaşımı hızlı, doğru, uygun maliyetli ve kullanıcı dostudur¹⁸. Mevcut teşhis teknolojileri için reaktiflerin maliyetini tahmin eden bir çalışma, PCR teknolojisine dayalı numune testinin maliyetinin 6,4-7,7 ABD Dolarına kadar çıktığını, LAMP teknolojisi için ise yalnızca 0,71-2 ABD Dolarına kadar çıktığını göstermiştir²⁸.

Çok kanallı döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) yöntemi, solunum yolu enfeksiyonlarında bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti için önemli avantajlar sunarken, sınırlamaları vardır. LAMP'nin yüksek hassasiyeti, minimum DNA kontaminasyonunun yanlış pozitif sonuçlara yol açabileceği çapraz kontaminasyon riski oluşturur²⁹; Bu nedenle, bu riski azaltmak için sıkı numune işleme ve prosedür protokolleri gereklidir. Yöntemin basitliğine rağmen, sonuçların yorumlanması, yanlış yorumlama veya teşhis hatalarını önlemek için özel uzmanlık ve deneyim gerektirir ve bu da iyi eğitimli personele olan ihtiyacı vurgular. Bu sınırlamaların tanınması, LAMP yönteminin klinik teşhis alanında etkili bir şekilde uygulanması ve daha da geliştirilmesi için esastır. Birlikte ele alındığında, bir mikroakışkan çip ile birleştirilen LAMP yöntemi, çeşitli bakteriyel patojenleri paralel olarak hızlı bir şekilde tespit edebilir. Yüksek hassasiyet ve güçlü özgüllük avantajlarına ve düşük maliyet, hızlılık ve rahatlık özelliklerine sahiptir. Klinik ortamlarda patojenik enfeksiyonların neden olduğu RTI'lerin önlenmesi ve kontrol edilmesi için önemli pratik önem göstermektedir. Bu çalışmada önerilen LAMP testinin önemli özelliği, laboratuvar personelinin ustalaşmasının kolay olmasıdır, bu da birinci basamak hastanelerine, hastalık önleme, kontrol merkezlerine ve muayene ve karantina departmanlarına çok yardımcı olmaktadır. Özetle, LAMP mikroakışkan çip sistemi, klinik laboratuvarlarda, klinik enfeksiyon teşhisinde yüksek harcama ve düşük geri dönüş süresi zorluklarını çözebilen ve klinik ortamlarda önemli uygulama değerlerine sahip güçlü bir tespit aracıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Banyo İnkübatörü (MK2000-2)	ALLSHENG		Sabit bir sıcaklık ortamı sağlayın
Bronşiyal lavaj sıvısı toplayıcı kafası	TIANPINGHUACHANG	SEDA 20172081375	Bronkoalveoler lavaj sıvısının toplanması
Fiberoptik bronkoskop	OLYMPUS	SEDA 20153062703	Akciğerlerdeki hava yollarını ve yapıları görsel olarak incelemek için fiberoptik ışık kaynağı ve kamera ile donatılmış esnek bir bronkoskop. Bronkoalveoler lavaj toplamaya yardımcı olun
HR1500-B2	Haier	SEDA 20183541642	Biyogüvenlik kabini
NAOH	MACKLIN	S817977	Sıvılaştırılmış viskoz alt solunum yolu numunesi
Solunum yolu patojenleri için nükleik asit tespit kiti	Capitalbio Technology	SEDA 20173401346	Bakteri enfeksiyonu testi
Nükleik asit ekstraksiyon reaktifi	DNA için Capitalbio Technology	SEDA 20160034	ekstraksiyon
RTisochip-W	Capitalbio Technology	SEDA 20193220539	Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon
THERMO ST16R	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20180585	Tüpün duvarından kalan sıvıyı santrifüjleyin.
Vorteks karıştırıcı VM-5005	JOANLAB		Reaktif karıştırmak için