Yöntem makalesi

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

4.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66679

⸱

7 Haziran 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 4Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Özet

Drosophila'daki transgenez, organizma düzeyinde gen fonksiyonunu incelemek için önemli bir yaklaşımdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, transgenik sineklerin inşası için çok önemli bir adımdır. Mikroenjeksiyon, bir mikroenjektör, bir mikromanipülatör, bir ters mikroskop ve bir stereo mikroskop dahil olmak üzere bazı ekipman türleri gerektirir. Bir plazmid miniprep kiti ile izole edilen plazmitler mikroenjeksiyon için uygundur. Çekirdeklerin ortak bir sitoplazmayı paylaştığı blastoderm öncesi veya sinsityal blastoderm aşamasındaki embriyolar mikroenjeksiyona tabi tutulur. Bir hücre süzgeci, embriyoların dekoryona ayrılma sürecini kolaylaştırır. Embriyoların dekoryonasyonu ve kuruması için en uygun zamanın deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Embriyo mikroenjeksiyonunun etkinliğini artırmak için, bir çektirme tarafından hazırlanan iğnelerin bir iğneli öğütücü ile pahlanması gerekir. İğneleri taşlama sürecinde, iğne ucunun kılcal etkisini önlemek için manometreli bir ayak hava pompası kullanıyoruz. Her plazmit için rutin olarak 120-140 embriyo enjekte ediyoruz ve plazmitlerin yaklaşık% 85'i için en az bir transgenik hat elde ediyoruz. Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Giriş

Meyve sineği Drosophila melanogaster, genetik manipülasyon ve genetik analiz için son derece uygundur. Transgenik meyve sinekleri biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. 1980'lerin başında geliştirildiğinden beri, P-element transpozon aracılı transgenez, Drosophila araştırması için vazgeçilmez olmuştur1. Bazı senaryolarda, Drosophila'da transgenez için piggyBac ve Minos gibi diğer transpozonlar dakullanılmıştır 2. Transpozon yoluyla transgenler rastgele Drosophila genomuna yerleştirilir ve farklı genomik lokuslardaki transgenlerin ekspresyon seviyeleri pozisyon etkilerine bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle karşılaştırılamaz2. Bu dezavantajlar, phiC31 aracılı bölgeye özgü transgenez3 ile aşıldı. Bakteriyofaj phiC31 geni, Drosophila3'teki attB ve attP bölgeleri arasındaki diziye özgü rekombinasyona aracılık eden bir integrazı kodlar. Birçok attP yerleştirme sahası karakterize edilmiştir ve Bloomington Drosophila Stok Merkezi 3,4,5,6,7,8,9'da mevcuttur.

Drosophila için phiC31 transgenez sistemi, sinek topluluğu tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. AttP yerleştirme bölgeleri arasında, X kromozomundaki attP18, ikinci kromozomdaki attP40 ve üçüncü kromozomdaki attP2, genellikle her bir kromozomdaki transgen entegrasyonu için tercih edilen bölgelerdir, çünkü üç bölgedeki transgenler, düşük bazal ekspresyon seviyelerine sahipken yüksek seviyelerde indüklenebilir ekspresyon gösterir5. Bununla birlikte, son zamanlarda, van der Graaf ve meslektaşları, Msp300 gen lokusuna yakın olan attP40 bölgesinin ve attP40'a entegre edilmiş transgenlerin, Drosophila10'da larva kası nükleer kümelenmesine neden olduğunu buldular. Yakın tarihli bir başka çalışmada, Duan ve meslektaşları, homozigot attP40 kromozomunun, Drosophila11'deki Or47b koku alma reseptörü nöron sınıfının normal glomerüler organizasyonunu bozduğunu buldular. Bu bulgular, deneyler tasarlanırken ve veriler yorumlanırken titiz kontrollerin dahil edilmesi gerektiğini göstermektedir.

Drosophila, kısa yaşam döngüsü, düşük maliyeti ve kolay bakımı nedeniyle gen fonksiyonunun in vivo sorgulanması için ideal bir model organizmadır. Genom çapında genetik tarama, Drosophila 12,13,14,15'te genom çapında transgenik kütüphanelerin inşasına dayanır. Daha önce, Drosophila Genomik Kaynak Merkezi (DGRC) Altın Koleksiyonu16'da insanlarda korunan Drosophila genlerinin %83'ünü kapsayan ikili GAL4/yukarı akış aktivasyon dizisi (GAL4/UAS) sistemine dayalı 5551 UAS-cDNA/ORF yapısı oluşturduk. UAS-cDNA/ORF plazmitleri, Drosophila'da transgenik bir UAS-cDNA/ORF kütüphanesinin oluşturulması için kullanılabilir. Verimli embriyo mikroenjeksiyon teknolojisi, transgenik sinek kütüphanelerinin oluşturulmasını hızlandırabilir.

Embriyo mikroenjeksiyonu için, iğne ucu normalde bir lamel17'ye karşı kırılır. Bu nedenle, iğneler sıklıkla tıkanır veya büyük miktarlarda sitoplazma sızıntısına neden olur ve bu sorunlar ortaya çıktığında yeni iğneler kullanılmalıdır. Kaynak ağzı açma iğneleri mikroenjeksiyon verimliliğini artırabilse de, öğütme çözeltisi öğütme işlemi sırasında eğimli uca girer. Eğimli uçtaki öğütme çözeltisi doğal olarak hızlı bir şekilde buharlaşmaz; Bu nedenle, iğneler eğim verildikten hemen sonra mikroenjeksiyon için kullanılamaz. Bu faktörler embriyo mikroenjeksiyon işlemlerinin etkinliğini azaltmaktadır. Burada, örnek olarak Drosophila'da phiC31 aracılı bölgeye özgü transgenezi kullanarak, Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Öğütme çözeltisinin iğneye girmesini önlemek için, iğne içinde hava basıncı uygulamak için bir hava pompası kullanıyoruz, böylece öğütme çözeltisinin eğimli uca girmesini önlüyoruz. Eğimli iğneler, eğim verildikten hemen sonra numune yükleme ve mikroenjeksiyon için hazırdır.

Protokol

1. Plazmitlerin hazırlanması

  1. Bir plazmid miniprep kiti kullanarak gece boyunca 4 mL bakteri kültürlerinden plazmitleri izole edin. 40 μL elüsyon tamponu ile elute.
    NOT: Bir plazmit midi hazırlama kiti kullanılarak plazmitlerin izolasyonu gerekli değildir. Bir plazmid miniprep kiti, embriyo mikroenjeksiyonu için deneysel gereksinimleri tam olarak karşılayabilir. Bu protokolde, hazırlanan UAS-cDNA/ORF plazmitleri, UAS'ın on kopyası, bir Hsp70 minimal promotörü, bir attB bölgesi, bir mini-beyaz gen ve ilgilenilen bir gen içerir.
  2. Bir spektrofotometre kullanarak plazmit DNA konsantrasyonunu belirleyin ve -80 °C dondurucuda saklayın.
    NOT: 20 ng/μL ila 1683 ng/μL arasında değişen plazmit konsantrasyonları Drosophila'da transgenez için iyi çalıştığından, plazmit konsantrasyonu başarılı embriyo mikroenjeksiyonu için kritik değildir (Ek Tablo 1).
  3. Mikroenjeksiyondan hemen önce, plazmitleri çözdürün ve 5 dakika boyunca 13000 x g'da santrifüjleyin.
  4. Her bir plazmitin 10 μL'sini sıvının üst katmanından 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.

2. İğne çekme

  1. Seçili ayarlarla bir iğne çektirmesini açın (Isı: 500, Çekme: 50, Vel: 60, Gecikme: 90, Basınç: 200, Rampa Testi: 510).
  2. İğne çekiciye bir borosilikat cam kılcal damar (dış çap 1.0 mm, iç çap 0.75 mm, 10 cm uzunluk) yerleştirin ve kapağı kapatın.
  3. Çekme düğmesine basın. Her cam kılcal damar iki iğne yapar.

3. Taşlama iğneleri (Şekil 1)

  1. Bir iğneli taşlama makinesinin uygun bir aşındırıcı plakası (0,7-2,0 μm uç boyutları için) ile monte edilmiş bir iğneli öğütücü kullanın.
  2. Bezi (referans teli) öğütme solüsyonu (0,9 g NaCl ile 100 mL damıtılmış su, 1 mL ıslatıcı madde) ile ıslatın ve bezi sabitleyin.
  3. İğneli öğütücüyü açın ve taşlama plakasını döndürmeye devam edin.
  4. Silikon kılcal boru aracılığıyla bir basınç göstergesi ile bir ayak hava pompasına bir iğne bağlayın ve ardından iğneyi iğneli öğütücünün bir iğne tutucusuna monte edin. İğnenin taşlama plakasına göre açısını 35°'ye ayarlayın (Şekil 1A, B).
  5. Mikroskop altında kaba bir kontrol düğmesi kullanarak iğne ucunun taşlama plakası yüzeyinin hemen üzerindeki konumunu ayarlayın (Şekil 1C).
    NOT: Bölüm 2'de elde edilen çekilen iğneler, çektirmenin kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi 6-8 mm konikliğe ve 1 μm'den daha az uca sahiptir (Şekil 1D).
  6. Ayak hava pompasını kullanarak iğnenin iç basıncını 40 psi'de tutun. Mikroskop altında ince bir kontrol düğmesi kullanarak iğne ucunun konumunu ayarlayın ve iğnenin ucunun taşlama plakasına temas etmesini sağlayın.
  7. 3-5 sn öğütün. İğne ucundan küçük hava kabarcıkları çıktığında iğneyi boşaltın (Şekil 1E).
    NOT: Taşlama işleminde, bir hava pompası kullanmak öğütme çözeltisinin sifonlanmasını önler.
  8. Öğütülmüş iğneleri bir saklama kutusuna koyun.
    NOT: Mümkün olduğunca taze öğütülmüş iğneler kullanın, ancak öğütülmüş iğneler mikroenjeksiyondan önce en az birkaç hafta saklama kutusunda saklanabilir.

4. Plazmitleri yüklemek için pipetlerin hazırlanması

  1. 200 μL'lik bir pipeti bir alkol brülörünün dış alevi ile ısıtın.
  2. Erimeye başladığında pipeti gerin.
  3. Gerilmiş pipetin kapalı ucunu makasla kesin ve gerilmiş pipet daha sonra DNA'yı bir öğütülmüş iğneye yüklemeye hazırdır.
    NOT: Alternatif olarak, öğütülmüş iğneleri doldurmak için son derece uzun ve ince uçlar ticari olarak temin edilebilir.
  4. Bu pipetleri otoklavlanmış plastik bir kutuya yerleştirin.

5. Embriyoların toplanması

  1. Yumurtadan çıktıktan 3 gün sonra phiC31 integraz eksprese eden ve attP2 yerleştirme bölgesini taşıyan sinekleri (vas-phiC31; + ; attP2) 50 flakondan toplayın ve bir kafese (φ 90 mm x 150 mm) aktarın. Her bir üzüm agar tabağının ortasına biraz taze maya ezmesi ekleyin18.
  2. 2-4 kafes sinek hazırlayın. Kafesleri ve plakaları 25 °C'de tutun ve plakaları 2-4 gün boyunca her gün değiştirin.
    NOT: Bu çalışma, birinci kromozomdaki vas-phiC31 transgenini (Stok # 36313, Bloomington Drosophila Stok Merkezi) ve üçüncü kromozomdaki attP2 transgenini (Stok # 36313, Bloomington Drosophila Stok Merkezi) birleştirdi. Elde edilen stok (vas-phiC31; + ; attP2) bu protokolde kullanılır. Maya salçası günlük olarak hazırlanmalı ve sineklere taze maya ezmesi verilmelidir. Kafeslerde kalan embriyolardan kurtulmak için değiştirilen kafeslerin temizlenmesi ve kurutulması gerekir.
  3. Mikroenjeksiyon günü, sabahları kafesleri ve plakaları değiştirin. Daha sonra her 30 dakikada bir plakları değiştirin ve bu plaklardan embriyoları toplayın. Tüm kafesleri ve plakaları oda sıcaklığında (RT) değiştirin ve ardından kafesleri ve plakaları 25 °C'de tutun.
    NOT: Bazı protokoller, yumurtlama için kafesleri ve plakaları 18 °C'de inkübe etmeyi tercih eder. Mikroenjeksiyon için ihtiyaç duyulan embriyo sayısına bağlıdır.

6. Dekoryonlu embriyolar

  1. 60 mL çamaşır suyu (34-46 g/L aktif klor içeriği içeren) ve 140 mL çift damıtılmış suyu karıştırarak% 30 çamaşır suyu hazırlayın.
  2. Üzüm suyu agar plakalarında kalan sinekleri bir fırça veya forseps ile çıkarın ve embriyoları çift damıtılmış su ile bir hücre süzgecine durulayın.
  3. Embriyoların bulunduğu hücre süzgecini kağıt mendil ile kurulayın.
  4. %30 çamaşır suyu içeren bir Petri kabına koyun ve hücre süzgecini elle veya yatay bir çalkalayıcıyla 60 rpm'de 1,5 dakika döndürün.
    NOT: Durulama kritik bir adımdır. Durulama süresi yeterince uzun değilse, embriyonun kabuğu tamamen çıkmaz. Durulama süresinin çok uzun olması embriyonun yumuşamasına ve kolayca kırılmasına neden olur. Hücre süzgeci tamamen %30'luk ağartıcıya batırılmalıdır. Çamaşır suyunun neden olduğu yaralanmaları önlemek için bir çift lastik eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.
  5. Kalan ağartıcıyı çıkarmak için embriyoları laboratuvar plastik yıkama şişesinde saklanan çift damıtılmış su ile 2 dakika durulayın. Diziliş için yüzen embriyoları seçin.

7. Embriyoların sıralanması

  1. Katı üzüm suyu agarını bir bıçak kullanarak uzun şeritler halinde kesin.
    NOT: Beyaz embriyoları sıralamayı kolaylaştırmak için mor üzüm suyu kullanın.
  2. Embriyoları bir boya fırçası kullanarak uzun bir şerit üzerine aktarın.
  3. Yaklaşık 60 embriyoyu, arka kısımları şeridin dışına bakacak şekilde uzun bir şeridin kenarı boyunca bir diseksiyon iğnesi ile hizalayın. 5 dakika içinde yaklaşık 60 embriyoyu sıralayın.
    NOT: Mikropil, embriyonun ön kutbunda, spermin oositi döllemek için girdiği koni şeklinde bir çıkıntıdır. Bu nedenle, embriyonun ön kutbundaki koni şeklindeki çıkıntıya dayanarak, dekoryonlu embriyonun arka tarafını belirlemek kolaydır.
  4. Lamelin kenarı boyunca (18 mm x 18 mm) uzunlamasına 18 mm çift taraflı bir bant yerleştirin ve kağıt desteğini çıkarın. Lameli hizalanmış embriyoların üzerine hafifçe bastırın. Embriyoların bandın ortasına yapıştırıldığından emin olun.

8. Kuruyan embriyolar

  1. Lameli sıralanmış embriyolarla birlikte kurutucu içeren bir kutuya yerleştirin. Kuruma süresi sıcaklık ve neme bağlı olarak değişir.
    NOT: Kuruma süresi mikroenjeksiyon için kritiktir ve deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Kuruma süresi genellikle yaz aylarında 9-10 dk, kış aylarında ise 17-18 dk'dır.
  2. Embriyoları halokarbon yağı ile örtün.
    NOT: Embriyoların üzerine çok fazla yağ damlatmayın, çünkü fazla yağ yapıştırıcıdan taşabilir. Halokarbon yağı 700 ve halokarbon yağı 27'nin hacim oranı 1:3'tür.

9. Embriyoların mikroenjekte edilmesi

  1. Gerilmiş pipeti kullanarak iğneye 2 μL DNA yükleyin. İğnede kabarcık olmadığından emin olun. İğneyi mikromanipülatörün iğne tutucusuna yerleştirin.
  2. Halokarbon yağı ile kaplanmış hizalanmış embriyoları ters çevrilmiş bir mikroskop altına yerleştirin. Embriyoların arka uçlarının iğneye baktığından emin olun.
  3. İğneyi embriyolara yaklaştırmak için mikromanipülatörü kullanın. İğneyi temizleyin. İğneden çıkan bir damla sıvının göründüğünden emin olun. 300 hPa enjeksiyon basıncından ve 20 hPa denge basıncından başlayarak, sıvı damlasının optimum boyutunu sağlamak için enjeksiyon basıncını ve denge basıncını ayarlayın.
  4. İğneyi embriyoların arka uçlarına sokmak için mikromanipülatörü kullanın ve DNA'yı enjekte etmek için mikroenjektöre bağlı ayak kumandasını kullanın (Şekil 2). Küçük bir hale görünüyorsa, DNA başarıyla embriyoya enjekte edilir.
    NOT: Enjeksiyon için çok çekirdekli embriyoları seçin ve "temizle" düğmesini kullanarak eski embriyoları öldürün. Enjeksiyondan sonra büyük miktarda sitoplazma sızarsa, embriyolar az kurutulur. Enjeksiyondan sonra sadece az miktarda sitoplazma sızarsa veya hiç sızmazsa, enjeksiyonların başarılı olduğu kabul edilir. Embriyoların üçte birinden fazlası enjeksiyondan sonra sitoplazma sızdırırsa, kuruma süresini 1-2 dakika uzatın. Embriyoların üçte birinden fazlası fazla kurutulmuşsa, kuruma süresini 1-2 dakika kısaltın.
  5. İğneyi embriyodan çıkarın. İğneyi bir sonraki embriyonun arka ucuna hareket ettirin. Yukarıdaki adımları tekrarlayın.
  6. Enjekte edilen embriyoları bir agar plakasına koyun. Plakayı 18-20 °C'de bir odaya yerleştirin. Ertesi gün, plakayı 25 °Csıcaklıkta ve% 50 -% 60 nemde bir inkübatöre aktarın ve 1 gün inkübe edin.
    NOT: Enjeksiyondan sonra, gelişimlerini yavaşlatmak, plazmit DNA'nın Drosophila genomuna entegrasyonunu kolaylaştırmak ve enjekte edilen embriyoların hayatta kalma oranını artırmak için embriyoları 18-20 ° C'lik bir sıcaklıkta tutun.

10. Larvaların toplanması

  1. Bir şişedeki yiyecekleri kazımak ve gevşetmek için bir diseksiyon iğnesi kullanın. Yiyecekleri birkaç damla damıtılmış su ile sağlayın.
    NOT: Larvaların boğulmasını önlemek için damıtılmış suyun yiyeceğe emilmesine izin verin.
  2. Plakaları inkübatörden çıkarın.
  3. Yumurtadan çıkan larvaları stereo mikroskop altında bir boya fırçası ile toplayın ve bunları şişeye aktarın.
  4. Şişeyi 25 °Csıcaklıkta ve% 50 -% 60 nemdebir inkübatöre yerleştirin.

11. Transgenik sineklerin elde edilmesi

  1. Flakon 10 gün boyunca 25 ° C'deinkübe edildikten sonra yumurtadan çıkan sinekleri toplayın.
  2. Tek bir erkek sineği TM2/TM6C Sb1 Tb1 dengeleyicilerinin üç bakire dişi sineğine çaprazlayın ve tek bir dişi sineği TM2/TM6C Sb1 Tb1 dengeleyicilerinin üç erkek sineğine çaprazlayın.
  3. Haçları 25 °C sıcaklıkta ve% 50 -% 60 nemde bir inkübatöre yerleştirin.
  4. Turuncu gözlü sinekler için dölleri tarayın. Bunlar transgenik sineklerdir (Şekil 3A-C).
    NOT: attP2 yerleştirme sahasında transgenin bir kopyasını taşıyan sineklerin turuncu gözleri vardır.
  5. Bir stok oluşturmak için tek bir turuncu gözlü erkek sineği TM2/TM6C Sb1 Tb1 dengeleyicilerin üç bakire dişi sineğine çaprazlayın.
    NOT: İlk kromozomdaki phiC31 transgenini çaprazlamak için birden fazla nesil çaprazlamanın kurulması gerekir.

Sonuçlar

Bir enjeksiyon iğnesinin ucu, bir iğneli öğütücü ile eğimlendirilir (Şekil 1). Bir saatte 50-60 iğne eğim verilebilir. DNA, çekirdeklerin ortak bir sitoplazmayı paylaştığı blastoderm öncesi veya sinsityal blastoderm aşamasında bir embriyonun arkasına mikroenjekte edilir (Şekil 2A). Bir embriyonun arka tarafı, embriyonun ön tarafındaki mikropil'e bağlı olarak kolayca yerleştirilebilir (Şekil 2A). Hücresel blastoderm ve gastrulasyon aşamalarındaki embriyolar enjeksiyon için kullanılamaz, çünkü bu aşamalarda her çekirdek bir hücre zarı ile çevrilidir ve bu nedenle transgenik sinek elde etme şansı neredeyse sıfırdır (Şekil 2B). Aşırı kurumuş embriyolar delindiğinde deforme olur ve mikroenjeksiyon için kullanılamaz (Şekil 2C). Az kurutulmuş embriyolar, iğne ile dürtüldüğünde büyük miktarda sitoplazma ekstrüde edebilir (Şekil 2D), bu da embriyoların daha düşük bir hayatta kalma oranına neden olur. Uygun şekilde kurutulan embriyolar, enjekte edildiğinde az miktarda sitoplazmayı dışarı sızdırabilir veya sızdırmayabilir (Şekil 2E).

Bu protokolde embriyo mikroenjeksiyonu için kullanılan ve phiC31 integrazı eksprese eden ve attP2 yerleştirme bölgesini taşıyan Drosophila hattı beyaz gözlüdür (Şekil 3A) ve bu genotipin yaşlı sinekleri, özellikle gözde eksprese edilen birikmiş kırmızı floresan proteinden kaynaklanan pembe gözlere sahiptir (Şekil 3B). Drosophila'da transgenez için seçici bir belirteç olarak mini beyaz geni kullanıyoruz ve transgenik sinekler açık sarıdan kırmızıya kadar değişen göz rengiyle tanımlanıyor. attP2 yerleştirme bölgesinde bir transgen taşıyan transgenik sineklerin turuncu gözleri vardır (Şekil 3C), bu da transgen taşımayan sineklerden kolayca ayırt edilebilir.

figure-results-1
Şekil 1: İğnelerin taşlanması. (A) İğneye hava basıncı uygulamak için manometreli bir ayak hava pompası kullanılır. (B) Bir iğne, bir taşlama plakası yüzeyine 35°'lik bir açıyla bir iğneli öğütücü üzerine monte edilir. (C) İğne ucunu taşlama plakası yüzeyinin hemen üzerine yerleştirmek için kaba bir ayar düğmesi kullanın, ardından ucu eğim vermeye başlamak için ince bir ayar düğmesi kullanın. (D) Çekilen bir iğnenin ucu mikroskop altındadır. Ölçek çubukları = 10 μm. (E) Eğimli bir iğne mikroskop altındadır. İğnenin eğimli ucu bir okla gösterilir. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Mikroenjeksiyona uygun Drosophila embriyoları. (A) Blastoderm öncesi veya sinsityal blastoderm aşamasında bir Drosophila embriyosu, kırmızı bir elips ile gösterilen embriyonun arka kutbuna enjekte edilebilir. Embriyonun ön kutbundaki mikropil bir okla gösterilir. (B) Hücresel blastoderm aşamasındaki bir Drosophila embriyosu mikroenjeksiyon için kullanılamaz. (C) Aşırı kurumuş bir embriyo deforme olmuş görünür. (D) Bir embriyonun yetersiz kuruması, enjeksiyondan sonra büyük miktarda sitoplazmik sızıntıya yol açar. (E) Başarılı bir enjeksiyon için az miktarda sitoplazma sızabilir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: attP2 yerleştirme bölgesinde bir transgen taşıyan transgenik Drosophila'nın göz rengi. (A) phiC31 integrazı (vas-phiC31; + ; attP2) ifade eden attP2 enjeksiyon çizgisinin beyaz bir gözü vardır. Gözde spesifik olarak eksprese edilen RFP, phiC31 transgeni için seçici bir belirteç olarak kullanılır. (B) phiC31 integrazı eksprese eden eski attP2 enjeksiyon hattı, gözde biriken RFP proteininden kaynaklanan pembe bir göze sahiptir. (C) attP2 yerleştirme alanına entegre edilmiş bir transgen taşıyan sineklerin turuncu bir gözü vardır. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: 100 farklı plazmitin embriyo mikroenjeksiyonundan kaynaklanan Drosophila'da transgenez. Embriyolara 20 ng/μL ile 1683 ng/μL arasında değişen çeşitli konsantrasyonlarda toplam 100 farklı plazmit enjekte edildi ve 100 plazmitin 85'i için transgenik sinekler elde edildi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonunun etkinliği. Embriyolara toplam 120 farklı plazmit enjekte edildi ve 120 plazmitin 101'i için transgenik sinekler elde edildi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, Drosophila'da transgenez için embriyo mikroenjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz. phiC31 aracılı bölgeye özgü transgenez için, her plazmit için 120-140 embriyo enjekte ettik ve plazmitlerin yaklaşık %85'i için en az bir transgenik hat elde ettik (Ek Tablo 2). Deneyimlerimize göre, bir plazmit miniprep kiti ile izole edilen plazmit DNA, Drosophila'da transgenez için yeterlidir. 20 ng/μL ila 1683 ng/μL arasında değişen plazmit DNA konsantrasyonları, transgenezin başarı oranı üzerinde belirgin bir etkiye sahip olmayabilir, çünkü bunların çoğu transgenik sinekler üretebilir (Ek Tablo 1).

Enjeksiyon iğnelerinin hazırlanması verimli embriyo mikroenjeksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bir Enjeksiyon iğnesi, bir iğne çektirmesi tarafından çekildikten sonra kapatılır. Drosophila'da rutin phiC31 aracılı transgenez için, bir iğnenin ucu genellikle bir lamel17 ile kırılır. Bununla birlikte, rastgele kırılan iğneler genellikle embriyo mikroenjeksiyonu için uygun değildir, çünkü tıkanabilirler veya büyük miktarda sitoplazma sızıntısına neden olabilirler ve bu nedenle enjeksiyon sırasında yenisiyle değiştirilmeleri gerekebilir. Uçları bir öğütücü tarafından eğim verilen enjeksiyon iğneleri genellikle tıkanmaz veya büyük sitoplazmik sızıntıya neden olmaz, bu da iğne değiştirme sıklığını azaltır. Taşlama çözeltisinin, taşlama sırasında uç açıldıktan sonra bir iğnenin eğimli ucuna girebileceğini fark ettik. İğneye girdikten sonra, öğütme çözeltisi doğal olarak hızlı bir şekilde kurumaz. Öğütme çözeltisinin sifonlanmasını önlemek için, bir basınç göstergesi olan bir ayak hava pompasına bir enjeksiyon iğnesi bağlarız. İğnenin ucunu taşlarken, iğneye hava basıncı uygulamak için hava pompasını kullanıyoruz ve bu sayede öğütme solüsyonunun eğimli uca girmesi engellenerek eğimli iğnenin hemen kullanılması sağlanıyor. Birlikte, manometreli ayak hava pompası, özellikle çok sayıda plazmit için Drosophila'da transgenezi hızlandırmaya yardımcı olmalıdır.

Embriyoların blastoderm öncesi veya sinsityal blastoderm aşamasında tanımlanması mikroenjeksiyon19,20 için kritik öneme sahiptir, çünkü daha sonraki aşamalarda embriyoların enjekte edilmesi zar zor transgenik sinekler üretir. 10 günlükten küçük sinekler, yaşlılardan daha fazla yumurta bırakma eğiliminde oldukları için yumurtlamak için kullanılır. Embriyoların dekoryonlanması sürecinde, ağartma işlemini ve embriyoların çift damıtılmış suyla durulamasını basitleştirmek için bir hücre süzgeci kullanılır. Embriyo durulamasından sonra, yüzen embriyolar yumurta kabuklarının iyi muamele edildiğini ve sonraki mikroenjeksiyon için kullanılabileceğini gösterir. Embriyoların hem dekoryonasyon hem de kuruma süresi mikroenjeksiyon için kritik öneme sahiptir ve uzun süreli dekoryonasyon veya kuruma süresi embriyoları öldürebileceğinden deneysel olarak optimize edilmelidir. Dekoryonasyon ve kuruma süresi, bir yerden bir yere ve zaman zaman değişen sıcaklık ve nemden etkilenir ve embriyonik kuluçka hızına göre buna göre ayarlanmalıdır.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Çalışma, Güney Çin Üniversitesi Üst Düzey Yetenekler için Bilimsel Araştırma Fonu tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 ve mu; m Hücre SüzgeciNEST258367
3M çift taraflı yapıştırıcı3M415
Borosilikat camSUTTERB100-75-10
Elmas aşındırıcı plakaSUTTER104E
ALEVLI/KAHVERENGİ Mikropipet ÇektirmeSUTTERP-1000
Basınç göstergeli ayak hava pompasıShenfengSF8705D
Halokarbon yağı 27SigmaH8773
Halokarbon yağı 700SigmaH8898
Ters mikroskopNikonECLIPSE Ts2R
Mikroenjeksiyon pompasıeppendorfFemtoJet 4i
MikromanipülatöreppendorfTransferMan 4r
Mikropipet BevelerSUTTERBV-10
Mikroskop kapak camları (18 mm x 18 mm)CITOLAS10211818C
Mikroskop slaytları (25 mm x 75 mm)CITOLAS188105W
Petri kabı (90 mm x 15 mm)LAIBOER4190152
Photo-Flo 200Kodak1026269
QIAprep Spin Miniprep KitiQiagen27106
Stereo MikroskopNikonSMZ745

Kaynaklar

  1. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  2. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
  3. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  4. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  5. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
  6. Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
  7. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  8. Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), Bethesda. 1095-1102 (2012).
  9. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
  10. Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598(2022).
  11. Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), Bethesda. 022(2023).
  12. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  13. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  14. Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  15. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
  16. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  17. Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
  18. Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
  19. Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  20. Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila TransgeneziPhiC31 ntegrazTransgenik SineklerMikroenjeksiyon nelerine BilemeDekoriyon ProtokolHalokarbon Yanverted MikroskopMikromanip lat r

İlgili makaleler