Yöntem makalesi

Fare Pankreas Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66690

⸱

21 Haziran 2024

 ,  ,  ,  , 
1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

Bu makalede

Özet

Bu protokol, fare endotel hücrelerinin tüm pankreastan izolasyonunu tanımlar.

Özet

Pankreas, kısmen insülin ve glukagon gibi metabolik hormonların yanı sıra sindirim enzimlerinin üretilmesi nedeniyle vücuttaki metabolik dengeyi korumak için hayati bir organdır. Pankreas aynı zamanda oldukça vaskülarize bir organdır ve karmaşık pankreas kılcal damar ağı tarafından kolaylaştırılan bir özelliktir. Bu geniş kılcal damar ağı, pankreas gelişimi ve fonksiyonu için önemli olan yüksek oranda fenestre endotel hücrelerinden (EC'ler) oluşur. Buna göre, EC'lerin işlev bozukluğu, diyabet ve kanser gibi hastalıklarda pankreasın işlev bozukluğuna katkıda bulunabilir. Bu nedenle, pankreas EC'lerinin (pEC'ler) işlevini araştırmak sadece pankreas biyolojisini anlamak için değil, aynı zamanda patolojilerini geliştirmek için de önemlidir. Fare modelleri, metabolik ve kardiyovasküler hastalıkları incelemek için değerli araçlardır. Bununla birlikte, nispeten küçük EC popülasyonu ve asiner dokudan potansiyel olarak salınan ve hücre hasarına ve dolayısıyla düşük verime yol açabilen bol miktarda sindirim enzimi nedeniyle fare pEC'lerinin izolasyonu için açıklanan yeterli ayrıntıya sahip yerleşik bir protokol yoktur. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, fare pEC'lerini zenginleştirmek ve geri kazanmak için nazik fiziksel ve kimyasal ayrışma ve antikor aracılı seçimi birleştiren bir protokol geliştirdik. Burada sunulan protokol, tüm fare pankreasından sağlam ve canlı EC'leri çıkarmak için sağlam bir yöntem sağlar. Bu protokol, birden fazla aşağı akış tahlili için uygundur ve çeşitli fare modellerine uygulanabilir.

Giriş

Metabolik kontrol ve homeostazın anahtarı olan pankreas, oldukça vaskülarize bir organdır. Pankreas, sırasıyla kan şekeri ve sindirim enzimlerinin düzenlenmesini kontrol eden hem endokrin hem de ekzokrin fonksiyonlara sahiptir. Bu iki bölme, oksijen, hormon ve enzimlerin değişimini ve taşınmasını kolaylaştıran geniş pankreas kan damarları ağı ile birbirine bağlanır. Kritik olarak, bu yoğun kılcal damar ağı, pankreas içinde glukagon salgılayan alfa (α) hücreleri, insülin salgılayan beta (β) hücreleri ve somatostatin salgılayan delta (δ) hücrelerindenoluşan, endokrin işlevinden sorumlu bir hormon düzenleyici hücre kümesi olan Langerhans Adacığı'na nüfuz eder 1,2. Adacıklar pankreas kütlesinin sadece %1-2'sini oluşturmasına rağmen, toplam kan akışının %20'sini alırlar3 ve bu da adacık damar sisteminin önemini vurgulamaktadır. Pankreas kılcal damarları esas olarak mural perisitlerle çevrili yüksek oranda fenestre endotel hücrelerinden (EC'ler) oluşur. Bu kılcal EC'ler adacık gelişimi, olgunlaşması ve (dis)fonksiyonunda hayati bir rol oynar ve çeşitli endo- ve ekzokrin hücrelerle yakın çapraz ilişkiler oluşturur4 (Şekil 1).

Pankreas adacık disfonksiyonunun neden olduğu en yaygın durumlar olan Tip 1 ve Tip 2 diyabette endotel disfonksiyonu gözlenmiştir 5,6. Diyabette hem adacık mikrovasküler yoğunluğu hem de morfolojisi değiştirilebilir7. Ayrıca, diyabet olarak da ortaya çıkabilen oldukça agresif bir tümör olan pankreas kanseri, zayıf perfüzyon ile yüksek mikrovasküler yoğunluk ile karakterizedir8. EC'lerin hem normal hem de hastalıklı pankreas dokusundaki önemli yapısal ve fonksiyonel rolleri göz önüne alındığında, sağlığı veya hastalıkları yönlendiren mekanizmaları ortaya çıkarmak için pEC'lerin gelişim, fizyoloji ve patolojideki incelemelerine uygun bir ihtiyaç vardır.

EC'lerin farklı murinlerden (ör.beyin 9,10, akciğer11, kalp12, karaciğer13, iskelet kasları14 ve yağ dokuları15) ve insandan (ör.beyin16, viseral yağ dokusu17,18, periferik sinirler19, akciğer20,21,22 ve mezenterik arter23) izolasyonu için çok sayıda protokol geliştirilmiştir) dokular. Bu protokoller tipik olarak enzimatik sindirimlerin kullanımını içerir (ör., kollajenaz, tripsin24, dispas 24,25 ve liberase26), ardından antikor bazlı bir zenginleştirme aşaması gelir. Ayrıca, bu protokoller, 37 ° C'de kuvvetli ajitasyon ile yüksek konsantrasyonlarda enzimlerde uzun süreli sindirime dayanma eğilimindedir (Tablo 1). Pankreasın çok sayıda endojen sindirim enzimi barındırması da dahil olmak üzere benzersiz özellikleri nedeniyle, bu mevcut protokoller pEC'leri izole etmek için doğrudan uygulanamaz. İlk olarak, pankreasın hücre dışı matriks (ECM) bileşimi diğer dokulardan farklıdır. Kollajenaz EC izolasyonu için yaygın olarak kullanılırken, farklı dokuya özgü ayrışma yeteneklerine sahip birden fazla alt tip vardır, bu nedenle optimizasyon gerektirir. İkincisi ve pEC izolasyonu için çok önemli olan pankreas endojen enzimlerinin salınması ve aktivasyonu, izolasyon sürecini önemli ölçüde engelleyebilir. Bu amaçla, daha fazla hücre hasarına neden olabilen ve düşük hücre canlılığı ile sonuçlanabilen ve genel olarak iyileşmeyi etkileyebilecek ekzokrin asiner hücrelerin (zimojenlerin, proteazların ve RNaz27'nin birincil kaynağı) yırtılmasını en aza indirmek için dikkatli olunmalıdır 27,28,29.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, mevcut EC izolasyon protokollerinden yöntemler uyarladık ve fare pankreaslarından EC izolasyonu için uygun yeni bir protokol oluşturduk. Spesifik olarak, burada kollajenaz Tip I (tipik olarak akciğer EC izolasyonu için uygulanır), daha düşük sindirim sıcaklıkları ve ajitasyon olmadan (pankreas zimojenlerinin aktivasyonunu önlemek için) ve DNaz30,31,32 takviyesi (DNA kaynaklı apoptozu önlemek ve hücre canlılığını iyileştirmek için) ve CD3133 için bir antikor kullanan bir iş akışını (Şekil 2) açıklıyoruz (PECAM1, bir pan-EC işaretleyicisi). Açıklanan protokol, gen ekspresyonu profili oluşturma ve protein tahlilleri için kullanılabilen fare pankreasından izole edilen EC popülasyonları üretir.

Protokol

Doku izolasyonu, City of Hope (Duarte, California, ABD) Beckman Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış çalışma protokolü #17010 kapsamında gerçekleştirildi. Burada Tie-2CreERT2 kullanıyoruz; 8 - 12 haftalıkken C57BL/6 arka planda Rosa26-TdTomato fare serisi. Bu satırda, EC'ler daha önce tarif edildiği gibi tamoksifen ile indüklendiğinde TdTomato ile etiketlenir34. Bununla birlikte, bu protokol, farklı genotiplere ve genetik geçmişlere sahip her yaştan yetişkin fare için uyarlanabilir.

1. Doku toplanması (tahmini süre: 1-2 saat)

NOT: Tahmini süre 15 dakika/hayvandır, ayrışma numuneleri başına en fazla 3 hayvan toplanması önerilir.

  1. Hayvanları aşırı dozda karbondioksit (CO2) ile ötenazi yapın, ardından ölümün ikincil teyidi yapılır. Diseksiyondan önce, tüm vücuda% 70 etanol (EtOH) püskürtün ve çalışma alanını tamamen dezenfekte edin.
  2. Pimleri kullanarak uzuvları gerin ve sabitleyin. Cerrahi makas kullanarak, alt karın bölgesinden başlayıp torasik bölgeye doğru uzanan cilt ve karın zarı boyunca küçük bir orta hat kesisi yapın.
  3. Diyaframı keserek göğüs kafesini ortaya çıkarın ve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kaldırın.
  4. Kalbin sol ventrikülüne buz gibi steril PBS içeren bir şırıngaya bağlı bir iğne (25G-30G) yerleştirin.
  5. PBS'yi kalbe 5-10 mL / dk hızında enjekte ederek perfüzyonu başlatın. 10 mL enjekte ettikten sonra veya karaciğer ve böbrekler renksiz hale gelene kadar durun.
  6. Perfüzyondan sonra, pankreası (midenin altında ve duodenuma bağlı)35 (Şekil 3A) bulun ve diseksiyon makası ve forseps kullanarak dikkatlice çıkarın.
  7. İzole edildikten sonra, pankreası 10 mL buz gibi soğuk PBS + 0.2 mg / mL tripsin inhibitörü içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın, buz üzerinde tutun (Şekil 3B).
    NOT: En fazla 3 fareden alınan pankreas bu adımda havuzlanabilir ve 1 tüpe aktarılabilir. Numuneler en fazla 2 saat buz üzerinde tutulabilir.

2. Kollajenaz hazırlama (tahmini süre: 15-30 dk)

  1. Çözeltileri ve tamponları aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
    1. Ayrışma çözeltisi: Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS 1x (Ca2 +, Mg2 +; Malzeme Tablosuna bakınız) ve 0.001 U / mL DNaz I + 0.2 mg / mL Tripsin inhibitöründe 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona 50 mL tüpe kollajenaz Tip I ekleyin.
    2. Ayrışma durdurma çözeltisi: Fosfat tamponlu salin ekleyin (PBS 1x, Ca2 + olmadan, Mg2 +; bu protokoldeki diğer tüm PBS için aynı; Malzeme Tablosuna bakınız),% 5 Sığır Serum Albümini (BSA), 0.001 U / mL DNaz I veya DMEM +% 10 FBS + 0.001 MU / mL DNaz I.
    3. Yıkama tamponu: PBS 1x,% 0.5 Sığır Serum Albümini (BSA), 0.001 U / mL DNaz I + 0.05 mg / mL Tripsin İnhibitörü ekleyin.
  2. Tamponları tamamen çözün ve 0,22 μm'lik bir filtreden süzün. Kenara koyun ve buzun üzerinde tutun.

3. Sindirim (tahmini süre: 40 dk-1 saat)

  1. Pankreası buz gibi soğuk PBS'den çıkarın ve buzun üzerine Petri kabına yerleştirin. Fazla dokuyu (örn. dalak, yağ, döküntüler) cerrahi makas ve cımbızla dikkatlice çıkarın (Şekil 3C).
    NOT: Fazla lipit doku sindirimini engelleyebileceğinden yağın alınması çok önemlidir.
  2. Kesilmiş fare pankreasını 1 mL ayrışma solüsyonu içeren 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  3. Tüpü buz üzerinde tutun ve pankreas dokularını diseksiyon makasıyla 0,5 mm veya 1 mm gibi ince pipetlenebilir parçalar halinde kıyın. Lizatı 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun.
  4. Başlangıçta pankreas dokusunu kıymak için kullanılan 5 mL'lik tüpe ek pankreas ekleyin ve ek 1 mL kollajenaz ekleyin. Birden fazla pankreas hazırlığı için gerektiği kadar tekrarlayın.
  5. Artık pankreas dokusunu çıkarmak için 5 mL'lik tüpe 2 mL kollajenaz çözeltisi ekleyin ve 50 mL'lik tüpe aktarın. Toplam kollajenaz hacmi 3 pankreas için 5 mL veya tek bir pankreas için 3 mL olmalıdır.
  6. Tüm numuneler mekanik ayrışmaya tabi tutulduktan sonra, homojenize doku lizatlarını içeren 50 mL'lik tüpleri 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın ve 10 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu işlem sırasında doku karışımını kuvvetlice çalkalamayın veya girdaplamayın, çünkü bu, asiner dokuların yırtılmasına ve bol miktarda endojen enzimlerin ve DNA'nın salınmasına neden olabilir.
  7. Tüpleri su banyosundan çıkarın ve iyice karıştırmak için hafifçe döndürün ve 10 dakika daha su banyosunda bırakın. (Toplam süre: 20 dakika).
    NOT: Aşırı sindirimi önlemek için 37 °C su banyosunda 30 dakikayı aşmayın.
  8. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin ve homojenatın yerçekimi ile çökelmesine izin verin. Yerleştikten sonra, süpernatanı 70 μm'lik bir filtreden aktarın ve 5 mL ayrışma durdurma çözeltisi ekleyin.
  9. Kalan pelete 1 mL daha ayrışma solüsyonu ekleyin ve 18G'lik bir iğne ile ezin.
  10. Kalan homojenatı filtreden geçirin ve ilave 5 mL ayrışma durdurma solüsyonu ile yıkayın.
  11. 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da sıkma hücresi süspansiyonu. Süpernatanı aspirasyonla tamamen çıkarın ve hücre peletini buz üzerinde tutun.
  12. Hücre peletini 1 mL yıkama tamponu ile yeniden süspanse edin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  13. Yeniden süspanse hücre peletinden (10 μL) küçük bir alikot alın ve bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak ve canlılığı ölçmek için 1: 1 oranında tripan mavisi ile karıştırın.

4. Endotel hücresi (EC) zenginleştirmesi (tahmini süre: 2-3 saat)

  1. Sayılan her 1 x 107 hücre için 1 μL anti-CD31-biyotin antikoru ekleyin ve bir döndürücü üzerinde 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin (3 pankreas başına yaklaşık 5 μL).
  2. 20 μL anti-biyotin mikro boncuk ekleyin ve bir tüp döndürücü üzerinde 4 ° C'de 40 dakika inkübe edin.
  3. Kolon ayırıcı tutucu ile manyetik bir stand kurun ve kolonu uygulayın. Sütunu 3 mL yıkama tamponu ile dengeleyin.
  4. Kolona numune ekleyin ve toplam 9 mL yıkama tamponu ile yıkayın.
    NOT: Hücre konsantrasyonu yüksekse, hücreleri ayrı bir tüpte ek 2 mL yıkama tamponu ile seyreltin. Kolonun tıkanmasını önlemek için kolona bir seferde 1 mL numune ekleyin.
  5. Kolonu kolon tutucusundan çıkarın ve 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Sütuna 5 mL yıkama tamponu ekleyin. Kolondaki hücreleri aşağı itmek ve elüsyon (zenginleştirilmiş EC içeren) toplamak için piston kullanın.
  6. Akış ve elüsyon/EC fraksiyonunu 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'de aşağı döndürün. Hücreleri sayın ve adım 3.13'teki gibi canlılığı ölçün.
  7. Akış ve EC fraksiyonlarının qPCR'si aracılığıyla EC zenginleştirmesini doğrulayın. Endokrin hücreler için genel bir belirteç olarak NK6 Homeobox 1'i (Nkx6.1) ve EC33 için bir belirteç olarak trombosit ve endotel hücre adezyon molekülünü (Pecam1) kullanın. Gen ekspresyonu normalizasyonu için dahili kontrol olarak 36B4 (Rplp0, asidik ribozomal fosfoprotein p0) kullanın.
    NOT: Toplanan örnekler bu adımda protein veya RNA analizleri için kullanılabilir.

5. PEC'lerin kültürlenmesi

  1. M199 ortamını hazırlayın. M199 medium'u %20 fetal sığır serumu (FBS) ve %0.1 Penisilin-Streptomisin nihai konsantrasyonuna kadar destekleyin.
  2. 60 mm'lik bir hücre kültürü plakasını kollajen Tip I (0.1 M asetik asit içinde 1 mg / mL) ile kaplayın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
  3. Kollajen Tip I'i çıkarın ve plakayı iki kez 1X PBS ile durulayın. 2 mL hazırlanmış M199 Besiyeri ekleyin ve hücre kültürü plakasını 5 dakika boyunca standart hücre kültürü inkübatörüne (%5 CO2, 37 ° C) yerleştirin.
  4. Hücreler izole edildikten sonra, izole edilmiş hücreleri önceden ısıtılmış M199 hücre kültürü plakasına ekleyin. Hücreleri yaklaşık 14 gün kültür koşullarında tutun ve her 2-3 günde bir ortam değiştirin.

Sonuçlar

Bu protokolü takiben, 3 fare pankreasını bir araya getirirken yaklaşık 2 x 106 canlı hücre ve tek bir fare pankreasından 750.000 hücre elde edilebilir. EC'nin zenginleştirilmesini doğrulamak için aşağıdaki analizleri gerçekleştirdik: 1) kantitatif PCR: akış (FT) örnekleriyle karşılaştırıldığında (yani, CD31 olmayan antikora bağlı fraksiyonlar), EC fraksiyonları önemli ölçüde daha yüksek Pecam1 seviyelerine sahipti (CD31'i kodlayan) ve Kdr (VEGFR2'yi kodlayan), iki EC işaretleyici geni33 ve pankreas endokrin hücrelerinde bir transkripsiyon faktörü olan NK6 homeobox 1'in (Nkx6.1) daha düşük seviyeleri (Şekil 4A)); 2) batı lekeleme: Üç preparattan (pEC-1-3) EC ile zenginleştirilmiş numuneler, beklenen boyutta (~ 130 kDa) güçlü CD31 sinyalleri gösterdi. Karşılaştırıldığında, giriş ve FT örnekleri minimum CD31 sinyali gösterdi. Pozitif bir kontrol olarak, bir pEC hücre hattı olan MS1 hücrelerinin lizatları da güçlü CD31 sinyali gösterdi (Şekil 4B); 3) tripan mavisi boyama: izole hücrelerin canlılığının yaklaşık% 50 olduğunu bulduk (Şekil 4C); 4) yayınlanmış bir protokolü takip eden akış sitometrisi15 : canlı hücre popülasyonu üzerinde geçit oluşturarak (Şekil 4D

Vasküler yapı çalışması ve hücresel etkileşim analizi için adacık içi EC'leri gösteren pankreas diyagramı.

Tek hücreli pankreas hazırlama diyagramı; santrifüjleme, CD31-biyotin etiketleme, akış analizi.

Biyolojik araştırmalarda pankreas hasadı, izolasyonu ve kesilme sürecini gösteren doku diseksiyonu.

Gen ekspresyonu, CD31 analizi, DAPI, hücre sıralama, floresan ve akım sitometrisi sonuçları.
<

İmmünofloresan mikroskobu CD31 / CD144 / DAPI, Cdh5, Pecam1'in UMAP gen ekspresyon analizi.

Tartışma

Bu makalede, pEC'lerin zenginleştirilmesi ve yalıtılması için bir protokol sunuyoruz. Diğer doku veya organlardan önceki EC izolasyon protokollerine benzer şekilde, bu protokol fiziksel ayrışma, enzimatik sindirim ve antikor bazlı EC zenginleştirme olmak üzere üç ana süreçten oluşur. Pankreasın işlenmesindeki benzersiz zorlukları ele almak için, protokolümüzde birkaç önemli uyarlama ve kritik adım tanıttık: 1) kısa bir kuluçka süresi ile nazik bir tek adımlı kollajenaz sindirimi, 2) DNA kontaminasyonunu ve endojen enzim sindirimini en aza indirmek için daha yüksek konsantrasyonda DNaz ve bir tripsin inhibitörünün takviyesi antikor bağlanmasına müdahale edebilir ve böylece EC zenginleşmesini ve canlılığını azaltabilir ve 3) sindirim adımından sonra hücre sayımı nasıl yapılacağını ayarlamak için EC zenginleştirmesini optimize etmek için numuneye çok fazla antikor eklenir. Bu protokolü optimize etme sürecinde, önceki çalışmalarda kullanılan diğer enzimleri, örneğin tripsin28, kollajenaz Tip IV31 ve diğer sindirim sıcaklıklarını, örneğin 4 ° C'yi ve farklı inkübasyon sürelerini test ettik (Tablo 1). Fare pEC izolasyonu için en uygun koşul olarak 37 ° C'de 20 dakika kollajenaz Tip I'i bulduk ve bunu burada kullandık. Perfüzyon sırasında bir antikoagülanın eklenmesi genel hücre canlılığını artırabilirken, tipik antikoagülasyon ajanı, örneğin EDTA veya Heparin, hücre ayrışması için kollajenaz ve qPCR'de kullanılan ters transkriptaz gibi belirli enzimlerin aktivitesine müdahale edebilir. Bu antikoagülanların beklenmedik/istenmeyen etkilerini önlemek için perfüzyon için PBS (Ca2 + ve Mg2 + olmadan) kullanılır.

EC popülasyonunu bütün fare pankreaslarından zenginleştirmek için hem adacık içi EC'leri hem de ekzokrin dokulardaki EC'leri içerecek ve daha yüksek bir verim sağlayacak bir protokol geliştirmeye odaklandık. Mevcut protokolde, ayrışma aşaması sırasında 3 hayvanı bir araya getirdik ve ortalama olarak yaklaşık 2.0 x 106 canlı hücre ile tek hücreli bir süspansiyon elde ettik. Ayrıca tek fare pankreasından örnekleri test ettik ve yaklaşık 750.000 hücre elde edilebiliyor. Tek bir hayvanı işlemek için ayarlama yaparken, daha az ayrışma çözeltisinin (pankreas başına 3 mL ayrışma) kullanılması gerektiğini belirtmek gerekir. Protokoldeki çok önemli bir adım, pankreasa bağlı kalan yağların tamamen kesilmesi ve uzaklaştırılmasıdır (Şekil 3B). Kollajenaz sindirimindeki yağ dokusu kontaminasyonu, pankreas tek hücre ayrışma adımına müdahale edecek ve sonraki zenginleştirme adımlarında hücre canlılığını azaltacaktır38. Ayrıca, pEC'leri zenginleştirmek için bir pan-EC yüzey işaretleyicisi olan PECAM1/CD31'i kullandık. PECAM1 / CD31 antikoru kullanarak, gen ekspresyon analizi ile ortaya çıkan EC fraksiyonlarını önemli ölçüde zenginleştirebildik. Bu protokolün geliştirilmesinde, ECS13'ü izole etmek için yaygın olarak kullanılan CD144 antikorunun faydasını da test ettik. Ancak, pEC'leri zenginleştiremedik (veriler gösterilmemiştir). Şaşırtıcı bir şekilde, immünofloresan boyama, CD31'in pankreas dokusundaki tüm EC'lerde eksprese edilmesine rağmen, CD144 antikorunun sadece adacık içi EC'leri boyadığı görülmüştür (Şekil 5A). Ek olarak, C57BL/6 farelerinden (GSE128565)37 izole edilen adacıklardan halka açık tek hücreli RNA-seq verilerini analiz ettik ve adacık EC'lerinin yaklaşık %50'sinin hem Cdh5 (VE-Cad) hem de Pecam1 ekspresyonunu gösterdiğini, ancak geri kalan adacık EC'lerinin sadece Cdh5 veya Pecam1 eksprese ettiğini bulduk (Şekil 5B). Bu nedenle, CD31 antikorlarının pEC izolasyonu için daha uygun olduğunu ve CD144 antikorunun bu amaç için kullanılmasının gelecekteki araştırmaları garanti ettiğini düşünüyoruz. Ayrıca, iki aşamalı antikor bağlanma adımını tekil bir adıma basitleştirebilen manyetik boncuklarla konjuge edilmiş ticari olarak temin edilebilen anti-CD31 vardır.

Gösterildiği gibi, izole EC fraksiyonunu doğrulamak için qPCR, immünoblotlama, akış sitometrisi ve immünofloresan boyama gerçekleştirdik. Bu fraksiyonların (sc)RNA-seq ve kütle spektrometresi gibi diğer tahlillere tabi tutulabileceği düşünülebilir. Bu protokolün bir sınırlaması, sağlam bir alt kültür elde edemememiz ve fonksiyonel tahliller yapamamamızdır. İzole fare EC'lerinin alt kültürünün zorlu olduğu gösterildiğinden, bu gelecekteki çabaları garanti eden bir alandır. Bunu ele almanın bir yolu, birincil hücreleri ölümsüzleştirmek için kullanılan büyük T antijeninin tanıtılması olabilir39.

Son zamanlardaki gelişmeler ve scRNA diziliminin uygulanması, pankreas hücrelerinin40 ve özellikle adacık hücrelerinin41 yüksek çözünürlüklü profilinin çıkarılmasını sağlamıştır. Bununla birlikte, mevcut çalışmaların çoğu endokrin hücre popülasyonlarına odaklanmış ve EC'leri verimli bir şekilde tutmayan doku ayrışma protokollerini kullanmıştır. Sonuç olarak, EC fraksiyonları genellikle kıt olur ve yakalanan tüm hücre popülasyonlarında sadece %3-5'i oluşturur42,43,44. Yeni bir protokol, iki aşamalı enzimatik sindirim ve deaktivasyon ve floresanla aktive edilmiş bir hücre sıralama adımı kullanır ve tüm pankreas hücre popülasyonunun %12'sinde EC'leri alır45. Bu protokolü tamamlayıcı olarak protokolümüz, EC'lerin çalışmanın odak noktası olması durumunda daha uygun maliyetli ve teknik olarak daha az zahmetli olabilecek basitleştirilmiş bir iş akışı sağlar. Bu protokol sadece fare pankreasında test edilmiş olsa da, EC'leri insan pankreası da dahil olmak üzere diğer organizmalardan izole etmek için ölçeklendirilebilir ve uyarlanabilir.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, City of Hope'tan Dr. Brian Armstrong'a ve Riverside'daki California Üniversitesi'nden Mindy Rodriguez'e teknik yardım için teşekkür ediyor. Bu çalışma kısmen NIH (R01 HL145170'den ZBC'ye), Ella Fitzgerald Vakfı'ndan (ZBC'ye), City of Hope (Arthur Riggs Diyabet Metabolizma ve Araştırma Enstitüsü İnovasyon Ödülü) ve California Rejeneratif Tıp Enstitüsü hibesi EDU4-12772'den (AT'ye) alınan hibelerle finanse edilmiştir. Bu yayında bildirilen araştırmalar, NIH Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından P30CA033572 numaralı ödül altında desteklenen Işık Mikroskobu ve Dijital Görüntüleme'de gerçekleştirilen çalışmaları içeriyordu. Şekil 1 ve Şekil 2 BioRender ile yapılmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL eppendorfUSA Scientific1615-5500
10 cm çanakGenesee Scientific25-202
25G iğnelerBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 mL eppendorfThermo Fisher 
6 kuyulu plakaGreiner Bio-One07-000-208
70 & m süzgeçFisher22-363-548
Anti-CD31-biotinMiltenyi BiotechREA784
Sığır serum albümini ısı şoku ile tedavi edilmişFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
SantrifüjEppendorf
Kollajen Tip 1, baldır derisindenSigma Aldrich & nbsp;C9791Protokoldeki ek reaktif
Kollajenaz Tip 1 Worthington BioLS004197
Kontes Otomatik Hücre SayacıThermo Fisher 
DAPITermo Balıkçı D1306immünofloresan
Tek Kullanımlık Güvenlik NeşterleriMyco Enstrümantasyon6008TR-10
DNAse I  Roche260913 
D-PBS (Ca2+,Mg2+)Termo Balıkçı 
Etanol FisherBP2818-4
Fetal sığır serumuFisher10437028
İnkübatörü37 ° C'de Tutuldu; C %5 CO2
>LS SütunlarıMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand ile QuadroMACS Ayırıcı Miltenyi Biotech130-042-303
Orta 199Sigma Aldrich M2520-10X
Mikroboncuk anti-biyotinMiltenyi Biotech130-090-485
MikroskopLeicaHücre morfolojisini değerlendirmek için
Moleküler Sınıf SuCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital çalkalayıcı Eppendorf
PECAM1 (CD31) AntikoruAbcamab56299immünofloresan
PECAM1 (CD31) AntikorR& D SystemsAF3628
Fosfat Tamponlu Salin (10X) (Ca2 + yok, Mg2 + yok)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 İleri fareIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese fare IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr İleri fare IDTTCCAGAATCCTTCCATGC
Astar Kdr Ters fareIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
Astar Nkx6.1 Ters fare IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Astar Nxk6.1 İleri fareIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
Astar PECAM1 İleri fareIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Astar PECAM1 Ters fareIDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo Fisher AM9780
RNaz içermeyen suTakaraRR036B
Steril 12" uzun forsepsFST91100-16
Steril ince forsepsFST11050-10
Steril ince makasFST14061-11
Doku Kültürü Kapları 2cmGenesee Scientific25-260
TRIzol reaktifiFisher15596018
Tripsin
Tripsin MaviRoche10109886001
Tween-20
VE-Cadherin AntikoruAbcamab33168immünofloresan
Su banyosu
1428230014080055 İnhibitörü MT25900CI Corning &

Kaynaklar

  1. Ballian, N., Brunicardi, F. C. Islet vasculature as a regulator of endocrine pancreas function. World J Surg. 31 (4), 705-714 (2007).
  2. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metab. 27 (3), 630-644 (2018).
  3. Lifson, N., Lassa, C. V., Dixit, P. K. Relation between blood flow and morphology in islet organ of rat pancreas. Am J Physiol. 249, 1 Pt 1 E43-E48 (1985).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 667170(2021).
  5. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  6. Granlund, L., Hedin, A., Korsgren, O., Skog, O., Lundberg, M. Altered microvasculature in pancreatic islets from subjects with type 1 diabetes. PLoS One. 17 (10), e0276942(2022).
  7. Dai, C., et al. Pancreatic islet vasculature adapts to insulin resistance through dilation and not angiogenesis. Diabetes. 62 (12), 4144-4153 (2013).
  8. Nishikawa, Y., Tsuji, Y., Isoda, H., Kodama, Y., Chiba, T. Perfusion in the tissue surrounding pancreatic cancer and the patient's prognosis. Biomed Res Int. 2014, 648021(2014).
  9. Conchinha, N. V., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Brain, chord, lung, and muscle. STAR Protoc. 2 (3), 100508(2021).
  10. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  11. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Sci Rep. 9 (1), 1458(2019).
  12. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. 2 (2), 100489(2021).
  13. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  14. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  15. Tang, X., et al. Suppression of endothelial ago1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  16. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  17. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  18. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: Differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  19. Domer, P., et al. Rapid and efficient immunomagnetic isolation of endothelial cells from human peripheral nerves. Sci Rep. 11 (1), 1951(2021).
  20. Comhair, S. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 46 (6), 723-730 (2012).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: Isolation, culture, and characterization. Microvasc Res. 46 (1), 89-102 (1993).
  22. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulm Circ. 7 (1), 108-116 (2017).
  23. Malhi, N. K., et al. Isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level. J Vis Exp. (181), e63307(2022).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of liberase hi and collagenase nb1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19 (1), 3-8 (2010).
  26. Waise, S., et al. An optimised tissue disaggregation and data processing pipeline for characterising fibroblast phenotypes using single-cell rna sequencing. Sci Rep. 9 (1), 9580(2019).
  27. Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol. 63 (3), 1037-1056 (1974).
  28. Li, D., et al. Complete disassociation of adult pancreas into viable single cells through cold trypsin-edta digestion. J Zhejiang Univ Sci B. 14 (7), 596-603 (2013).
  29. Ji, B., Gaiser, S., Chen, X., Ernst, S. A., Logsdon, C. D. Intracellular trypsin induces pancreatic acinar cell death but not nf-kappab activation. J Biol Chem. 284 (26), 17488-17498 (2009).
  30. Mao, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the mouse pancreas: Characteristic features of pancreatic ductal cells in chronic pancreatitis. Genes (Basel). 13 (6), 1015(2022).
  31. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell rna sequencing. STAR Protoc. 1 (3), 100144(2020).
  32. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nat Commun. 11 (1), 4516(2020).
  33. Park, S., Dimaio, T. A., Scheef, E. A., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Pecam-1 regulates proangiogenic properties of endothelial cells through modulation of cell-cell and cell-matrix interactions. Am J Physiol Cell Physiol. 299 (6), C1468-C1484 (2010).
  34. Kim, Y. W., et al. Integration of single-cell transcriptomes and biological function reveals distinct behavioral patterns in bone marrow endothelium. Nat Commun. 13 (1), 7235(2022).
  35. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  36. Malhi, N. K., et al. Serine-arginine-rich protein kinase-1 inhibition for the treatment of diabetic retinopathy. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 322 (6), H1014-H1027 (2022).
  37. Sachs, S., et al. Targeted pharmacological therapy restores beta-cell function for diabetes remission. Nat Metab. 2 (2), 192-209 (2020).
  38. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plast Reconstr Surg. 136 (2), 189-199 (2015).
  39. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic h-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (3), 861-866 (1997).
  40. Muraro, M. J., et al. A single-cell transcriptome atlas of the human pancreas. Cell Syst. 3 (4), 385-394 (2016).
  41. Segerstolpe, A., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metab. 24 (4), 593-607 (2016).
  42. Kang, R. B., et al. Single-nucleus rna sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes beta-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
  43. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Res. 27 (2), 208-222 (2017).
  44. Fasolino, M., et al. Single-cell multi-omics analysis of human pancreatic islets reveals novel cellular states in type 1 diabetes. Nat Metab. 4 (2), 284-299 (2022).
  45. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), e64871(2023).
  46. Castillo, J. J., et al. Islet amyloid polypeptide aggregation exerts cytotoxic and proinflammatory effects on the islet vasculature in mice. Diabetologia. 65 (10), 1687-1700 (2022).
  47. Tremblay, J. R., et al. Rare, tightly-bound, multi-cellular clusters in the pancreatic ducts of adult mice function like progenitor cells and survive and proliferate after acinar cell injury. Stem Cells. 42 (4), 385-401 (2024).
  48. Zook, H. N., et al. Activation of ductal progenitor-like cells from adult human pancreas requires extracellular matrix protein signaling. iScience. 27 (3), 109237(2024).
  49. Sordi, V., et al. Establishment, characterization and long-term culture of human endocrine pancreas-derived microvascular endothelial cells. Cytotherapy. 19 (1), 141-152 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare PankreasıEndotelyal Hücre İzolasyonuManyetik Hücre AyırımıNazik DisosiyasyonHücre Yüzey BelirteçleriTek Hücre SekanslamaPankreatik VaskülatürCD31 AntikoruWestern Blotting
Fare Pankreas Endotel Hücrelerinin İzolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.