Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kranial Levator Auris Longus İskelet Kasının Kombine İn Vivo Elektroporasyonu ve Kısa Süreli Reinnervasyonu

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66706

⸱

1 Kasım 2024

 ,  ,  ,  , 
1Neuromuscular Studies Lab (NeSt Lab), Institute of Anatomy, Histology, and Pathology, Faculty of Medicine, Universidad Austral de Chile, 2Faculty of Odontology and Rehabilitation Sciences, Universidad San Sebastian, 3Department of Cell Biology, Faculty of Biological Sciences, Universidad de Concepcion

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, kraniyal levator auris longus (LAL) kasının in vivo elektroporasyonu ve denervasyonunu birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu prosedür, kas kaynaklı proteinlerin nöromüsküler sinapsın rejenerasyonundaki potansiyel rolünün incelenmesini sağlar.

Özet

Nöromüsküler kavşak (NMJ), birçok organizmanın koordineli hareketine izin vermek için iskelet kası liflerinin kasılmasını kontrol eden periferik sinapstır. NMJ'de, bir presinaptik motor akson terminali bir kas postsinaptik alanına temas eder ve terminal Schwann hücreleri tarafından kaplanır. NMJ'nin bütünlüğü ve işlevi, yaşlanma, nöromüsküler hastalıklar ve travmatik yaralanmalar dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında tehlikeye girer. Kas kaynaklı proteinlerin NMJ bakımı ve rejenerasyonuna potansiyel katkısını analiz etmek için, mekanik sinir yaralanmasından sonra kraniyal levator auris longus (LAL) kasının denervasyonu ile in vivo bir gen transfer stratejisi birleştirilmiştir. Önceki bulgular, kontrol floresan proteinlerinin zorla ekspresyonunun NMJ organizasyonunu veya nörotransmisyonu değiştirmediğini göstermiştir. Bu prosedür, LAL kasının in vivo elektroporasyonunun ayrıntılı bir yöntemini tanımlamayı ve ardından kraniyal kasları innerve eden fasiyal sinirin spesifik dalının transeksiyonu veya ezilmesi, sırasıyla NMJ denervasyonu ve reinnervasyona yol açmayı amaçlamaktadır. Bu deneysel stratejilerin uygun LAL kasında kombinasyonu, kısa süreli NMJ reinnervasyonu bağlamında kas proteini aşırı ekspresyonunun veya susturulmasının potansiyel katkısını incelemek için etkili bir yöntem oluşturur.

Giriş

Nöromüsküler kavşak (NMJ), kas kasılmasını ve dolaylı olarak organizmaların koordineli hareketini kontrol eden periferik sinapstır1. Presinaptik motor akson terminali, asetilkolin reseptörleri (AChR'ler) ile zenginleştirilmiş bir kas postsinaptik alanı ve akson terminali 2,3,4'ü kaplayan miyelinik olmayan terminal Schwann hücreleri tarafından oluşturulur. Travmatik periferik sinir hasarı, hastalık veya farmakolojik girişime bağlı NMJ denervasyonu üzerine kasılma kas aktivitesi kaybolur 5,6. Bazı izin verilen mikro ortamlar zamanında ve verimli fonksiyonel iyileşmeye izin verdiğinden, rejenerasyon sürecine yardımcı olabilecek proteinlerin araştırılması kalıcı bir gerekliliktir. Burada, sinir yaralanmasından sonra NMJ'nin kısa süreli rejenerasyonunda kas protein ekspresyonunun manipüle edilmesinin potansiyel rolünü spesifik olarak değerlendirmek için iki prosedür birleştirilmiştir.

Kafatasının sırt yüzeyinde yer alan levator auris longus (LAL) kası, kulak kepçesinin hareketini kontrol eden ince ve düz bir kastır. LAL kası, her biri iki veya üç kat kas lifi içeren rostral ve kaudal bantlardan oluşur 7,8. Fasiyal sinirin posterior auriküler dalı, LAL kasını innerve eder ve beş rostral (R1-R5) ve iki kaudal (C1-C2) innervasyon bölgesinden oluşan iyi tanımlanmış bir innervasyon paterni oluşturur 8,9,10. LAL, yüzeysel olarak maruz kalan ve kolayca erişilebilen bir kastır, bu nedenle kullanımı minimal invaziv prosedürler gerektirir. Bu, gerçek zamanlı mikroskopi, ilaç dağıtımı ve ayrıca hem in vivo hem de ex vivo olarak tam kas preparatlarının müdahalesi kullanılarak NMJ'nin görselleştirilmesine izin verir 11,12. Toplamda, bu özellikler LAL kasını NMJ davranışını ve işlevini incelemek için mükemmel bir model haline getirir10,13.

İn vivo elektroporasyon, her ikisi de bir elektrik alanı14,15 indüklendikten sonra üretilen, hücre zarlarının geçici geçirgenliği ve hücreler içindeki DNA'nın hareketliliği yoluyla eksojen DNA'nın dokuya dahil edilmesine izin veren bir gen transfer tekniğidir. Bu prosedür lokaldir ve hayvanın gelişiminin herhangi bir aşamasında gerçekleştirilebilir. LAL kasının benzersiz özellikleri göz önüne alındığında, in vivo elektroporasyonu, minimal invaziv, yüksek verimli ve hızlı bir prosedürü16 temsil eder ve elektroporasyondan iki veya üç gün sonra sağlam protein ekspresyonunu gözlemlemeyi mümkün kılar.

Fasiyal sinir ezme prosedürü, çeşitli avantajlar sunduğu için araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır 5,17,18. Bu protokol daha önce, yüz felcini önlemek için LAL kası da dahil olmak üzere kraniyal kasları innerve eden fasiyal sinirin arka kulak dalını spesifik olarak hedef alacak şekilde modifiye edilmiştir; Sonuç olarak, fareler ameliyattan sonra özel bir bakıma ihtiyaç duymazlar (örneğin, göz kırpma refleksinin kaybı için kayganlaştırıcı göz merhemi). LAL kasındaki NMJ reinnervasyonu, yaralanmadan 7-9 gün sonrabaşladığından, 6, reinnervasyonun sinir yaralanmasından yaklaşık üç hafta sonra meydana geldiği arka bacak kaslarını denerve etmek için siyatik sinirin yaygın olarak kullanılan sinir ezilme yaralanması modeline kıyasla iyi bir kısa süreli reinnervasyon modelidir18.

LAL kasında in vivo elektroporasyon ve fasiyal sinir hasarının kombinasyonu, araştırmacıların, immünohistokimyasal, histolojik ve fonksiyonel testler dahil olmak üzere çok çeşitli teknikler aracılığıyla, kısa ve uzun vadeli morfolojik etkiler 6,16 dahil olmak üzere, NMJ rejenerasyonunun farklı zamanlarında sinaptik bileşenlerin kas kaynaklı protein modülasyonuna karşı davranışını değerlendirmelerini sağlayacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Şili, Universidad Austral de Chile'deki Biyoetik Komitesi (protokol No. 503/2023) tarafından onaylanmıştır ve Şili Ulusal Araştırma ve Geliştirme Ajansı (ANID) Biyoetik Komitesi tarafından belirlenen normların yanı sıra Avrupa Konseyi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı Direktifi'nin yönergelerini takip etmiştir. Bu çalışmada her iki cinsiyetten (30-45 g) yetişkin (3-6 aylık) CF-1 fareleri kullanılmıştır. Ötenazi, inhalan anestezik aşırı doz ve ardından kan kaybı ile gerçekleştirildi. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. İn vivo LAL kas elektroporasyonu

  1. Hazırlık
    1. Fareyi, 0,8 L/dk oksijen ile %2,5 izofloran soluma altında (kurumsal olarak onaylanmış protokollere göre) akrilik bir indüksiyon odasında nazikçe sakinleştirin. Bundan sonra, diseksiyon stereomikroskobu altında bir inhalasyon anestezi makinesine bağlı bir burun tüpü maskesi kullanarak fare sedasyonunu koruyun.
      NOT: Prosedüre başlamadan önce farenin uyku modunda olduğundan emin olun; Bir ayağınızı forseps ile hafifçe sıkarak farenin dokunma refleksini test edin (anesteziyi indükledikten sonra bu adımı her seferinde yapın).
    2. Kafatasının sagital sütürü seviyesindeki servikal alanı antiseptik klorheksidin glukonat %2 ile dezenfekte edin ve DNA plazmidinin kas yüzeyine erişimini kolaylaştırmak için bir Hamilton şırıngası kullanarak PBS'ye 20 μL 2 mg / mL hyaluronidaz enjekte edin.
    3. İzofloran akışını kapatın ve farenin 1 dakika boyunca saf oksijen solumasına izin verin.
    4. Uygun Meloksikam dozunu hesaplamak için fareyi tartın (bkz. adım 1.3.2.).
    5. Anesteziden kurtulmak için hayvanı boş bir kafese (herhangi bir yatak takımı olmadan) yerleştirin.
    6. Hayvanı 30 dakika boyunca normal barınağına geri getirin16.
  2. Ameliyat prosedürü
    1. Fareyi% 2.5 izofloranın 0.8 L / dk oksijen karışımı ile solunmasıyla (kurumsal olarak onaylanmış protokollere göre) yeniden uyuşturun ve diseksiyon stereomikroskobu altında bir inhalasyon anestezi makinesi kullanarak cerrahi prosedür boyunca sedasyonda tutun.
    2. Çift kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak servikal bölgeyi tıraş edin ve 3 kez klorheksidin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.
    3. Kafatasının sagital dikişi üzerinden 8 mm'lik bir kesi yapın ve makas/forseps kullanarak cildin hemen altında bulunan yağ ve bağ dokusunu nazikçe çıkararak LAL kasını ortaya çıkarın.
      NOT: LAL kası, cilt kesisinden sonra kraniyal bölgedeki en yüzeysel kastır. Orta kafatasından her bir kulak kepçesinedoğru çapraz olarak uzanan kas liflerinin oryantasyonu ile kolayca tanınır 8,16.
    4. Bir Hamilton şırıngası kullanarak, PBS'de ticari olarak elde edilen DNA'nın 10 μL'sini (0.8-1 μg / μL) kas boyunca dağılmış olan fasyaya enjekte edin ve bir baloncuk oluşturun.
    5. İki altın iğne elektrodunu 5 mm aralıklarla, paralel ve kas liflerinin üzerine, LAL kasının tüm uzunluğunu kaplayacak şekilde yerleştirin (Şekil 1A).
    6. Bir elektroporatör kullanarak, 1 Hz frekansında her biri 20 ms süreli 100 V/cm değerinde beş darbe üretin.
    7. Prosedürü kontralateral LAL kasında tekrarlayın (1.2.4-1.2.6 adımlarını tekrarlayın).
  3. Sütür ve iyileşme
    1. Sütür (5/0 gerinim boyutu, HR15 iğnesi) emilebilir poliglikolik asit ipliği ile cilt.
    2. Ameliyat sonrası ağrıyı azaltmak için analjezik Meloksikam'ı 1-2 mg / kg ağırlığındaki dozlarda deri altına enjekte edin.
    3. İzofloran akışını kapatın ve farenin 1 dakika boyunca saf oksijen solumasına izin verin.
    4. Anesteziden kurtulmak için hayvanı boş bir kafese (herhangi bir yatak takımı olmadan) yerleştirin.
    5. Hayvanı normal yuvasına geri koyun ve ameliyattan sonra 2 gün veya iyileşene kadar izleyin. Ağrı veya stres belirtilerini izleyin, daha önce açıklanan insancıl son nokta kriterlerini göz önünde bulundurarak farklı parametrelerin her biri için puanlar tahsis edin19.
      NOT: Ameliyat sırasında vücut sıcaklığının düşmesini önlemek için fareyi cerrahi ped ile kaplı ısıtılmış bir pedin içine yerleştirin. Cerrahi işlem için 30 dakikadan fazla zaman ayırmamaya çalışın, böylece farenin aşırı anestezi nedeniyle ölmesini önleyin. Eksprese edilen protein düşük floresan seviyeleri veriyorsa, 1:5 oranında (izleyici: ilgilenilen DNA) bir izleyici (örneğin, tdTomato veya GFP) ile birlikte elektroporasyon yapılması önerilir.

2. Sinir yaralanmasına bağlı denervasyonu ezmek

NOT: Bu protokol, daha önce açıklanan bir protokol17'nin bir modifikasyonudur. Bu prosedürü elektroporasyondan en az 3 gün farkla gerçekleştirin. Araştırma sorularına bağlı olarak, bu prosedür elektroporasyondan önce veya sonra gerçekleştirilebilir.

  1. Anestezi ve hayvan konumlandırma
    1. Hayvan sedasyonunu, 0,8 L / dak oksijen ile% 2,5 izofloran inhalasyonu altında akrilik bir indüksiyon odasında gerçekleştirin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
    2. Meloksikam dozunu hesaplamak için fareyi tartın (bkz. adım 2.3.2.).
    3. Diseksiyon stereomikroskobu altında bir inhalasyon anestezi makinesine bağlı bir burun tüpü maskesi ile fare sedasyonunu koruyun.
    4. Fareyi sol tarafına yerleştirin (sağ LAL kasını denerve etmek için). Kulak kepçesinin arka bölgesini ortaya çıkarmak için sağ kulağı buruna doğru bantlayın.
  2. Ameliyat prosedürü
    1. Kulak kepçesinin arka bölgesini çift kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin ve 3 kez klorheksidin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.
    2. Arka kulak damarını bulun ve yaylı makasla ciltte kaudal olarak 2 mm uzaklıkta, yaklaşık 5 mm'lik bir kesi yapın. Kan damarlarını ve/veya kas dokusunu kesmekten kaçının.
    3. Yağ ve bağ dokularını forseps ve makasla kesin. Omurga aksesuar sinirini bulun; digastrik kasın göbeğini ve kıkırdaklı işitsel kanalı (yarı saydam beyazımsı doku) bulana kadar devam edin (Şekil 2A).
    4. Digastrik kasın hemen altındaki fasiyal sinir dallanmasının başlangıcını bulun.
    5. Posterior auriküler dalı (fasiyal sinirin en dorsal dalı) takip edin ve doğrudan sinir manipülasyonundan dikkatlice kaçınarak onu çevreleyen bağ dokusunu nazikçe çıkarın.
    6. Fasiyal sinirin arka kulak dalını 30 saniye boyunca ezin, 45° açılı uçlu bir forseps ile sinire sabit baskı uygulayın.
  3. Sütür ve iyileşme
    1. Sütür (5/0 gerinim boyutu, HR15 iğnesi) emilebilir poliglikolik asit ipliği ile cilt.
    2. Ameliyat sonrası ağrıyı azaltmak için analjezik Meloksikam'ı 1-2 mg / kg ağırlığındaki dozlarda deri altına enjekte edin.
    3. Bandı kulaktan çıkarın, izofloran akışını kapatın ve farenin 1 dakika boyunca saf oksijen solumasına izin verin.
    4. Anesteziden kurtulmak için hayvanı boş bir kafese (herhangi bir yatak takımı olmadan) yerleştirin.
    5. Fareyi normal yuvasına geri koyun ve ameliyattan sonra 2 gün veya iyileşene kadar izleyin.
    6. İyileştikten sonra, fareyi etkilenen kulağın hareketindeki başarısızlıklar açısından verimli denervasyonun bir işareti olarak inceleyin.
      NOT: Şam kontrol hayvanlarında, deride bir kesi yapın, fasiyal siniri doğrudan dokunmadan açığa çıkarın ve ardından dikin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

tdTomato proteini20'nin yüksek floresan kuantum verimi, onu elektroporasyon verimliliği için uygun bir izleyici yapar. Bu nedenle, in vivo elektroporasyon ile LAL kaslarında tdTomato proteininin ekspresyonu değerlendirildi (Şekil 1). LAL kasları elektroporasyondan 21 gün sonra diseke edildi. Tam montaj preparatları, LAL kasının iki innervasyon bölgesi ile ince kaudal bandını (cLAL, camgöbeği poligonu) ve beş innervasyon bölgesi 8,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İn vivo kas elektroporasyonu ve denervasyonunun kombinasyonu, NMJ4'te rejeneratif bir nişi araştırmak için değerli bir deneysel yaklaşımdır. LAL kası yüzeysel olarak açığa çıktığından, bu kombine prosedürler, protein ekspresyonunu veya aktivitesini etkileyebilecek probların veya ilaçların verilmesi ile kolayca tamamlanabilir12. Ek olarak, raportör genlerin LAL kasına elektroporasyonu, sinir hasarı ve / veya NMJ rejenerasyonu bağlam...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma hakkındaki yararlı tartışma ve yorumları için NeSt Lab üyelerinin son derece işbirlikçi ve teşvik edici ortamına teşekkür ederiz. NeSt Lab'daki çalışmalar şu anda FONDECYT 1221213 tarafından finanse edilmektedir. Şekil 1A'daki şema BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
#5/45 Dumont forseps Güzel Bilim Araçları 11251-35Kullanmadan önce sterilize edin
anti 2H3DSHBSeyreltik 1: 300
anti S100 Kullanıma HazırDakoIR504Seyreltik 1: 5
anti SV2DSHBSeyreltik 1: 50
Klorheksidin glukonat %2DifenPharma
Soğuk ışık diseksiyon stereomikroskopMoticModel SMZ-171
DAPIInvitrogenD1306Seyreltik 1: 100
Dumont #5SF ForsepsGüzel Bilim Araçları 11252-00Dumont Mini Forseps kullanmadan önce sterilize edin
– Stil 5Güzel Bilim Araçları 11200-14Kullanmadan önce sterilize edin
ECM 830 elektroporatörBTX Harvard Aparatı
Altın iğne tipi elektrotlar Genetrodes, BTX45-011410 mm düz
Hamilton şırınga Hamilton80400
HyaluronidazSigma-AldrichH3884
İnhalasyon anestezi makinesiSciVerma ScientificM3000 Masa Üstü
İzofluranBaxter218-082
FarelerInstituto de Salud Publica - ŞiliYetişkin (3-6 aylık) CF-1 fareleri, her iki cinsiyetten (30-45 g) 
Tıraşbıçakları Schick
Suture Glicosorb 5/0TAGUMGS0812. JEmilebilir poliglikolik asit ipliği 
tdDomates plazmidiAddgene54642tdCMV promotörü
Tramadol hidroklorür kontrolü altında domates plazmidi %5 (Triamcol)Drag Pharma
Vannas BaharMakası Güzel Bilim Araçları 91500-09Kullanmadan önce sterilize edin
WGA Alexa Fluor 488InvitrogenW7024Seyreltik
&alfa;-BTX Alexa Fluor 488 InvitrogenB13422Seyreltik 1: 500

Kaynaklar

  1. Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
  2. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  3. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions. Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
  4. Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse. Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).
  5. Kobayashi, J., et al. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).
  6. Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations. BMC Biol. 20 (1), 158(2022).
  7. Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
  8. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).
  9. Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).
  10. Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
  11. Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J Vis Exp. (55), e3124(2011).
  12. Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses. Sci Rep. 11 (1), 17285(2021).
  13. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, Pt 4 1081-1101 (2012).
  14. Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage. Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).
  15. Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp. (32), e1520(2009).
  16. Ojeda, J., et al. The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse. Front Cell Neurosci. 14, 225(2020).
  17. Olmstead, D. N., et al. Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury. J Vis Exp. (96), e52382(2015).
  18. Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).
  19. Lloyd, M., Wolfensohn, S. Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints. Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).
  20. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  21. Perez, V., et al. The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147(2019).
  22. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).
  23. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  24. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biol. 6 (12), 160240(2016).
  25. Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
  26. Sakuma, M., et al. Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure. Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).
  27. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  28. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).
  29. Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
  30. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
  31. Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).
  32. Pérez-García, M. J., Burden, S. J. Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice. Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).
  33. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nöromüsküler BileşkeKas DenervasyonuSinir Reinnervasyonuİskelet Kası RejenerasyonuGen TransferiKonfokal MikroskopiKas Proteini Aşırı EkspresyonuFasiyal Sinir Yaralanması
Kranial Levator Auris Longus İskelet Kasının Kombine İn Vivo Elektroporasyonu ve Kısa Süreli Reinnervasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.