Protokol, kemirgen kalplerindeki karmaşık kardiyak yapıları araştırmak için uyarlanmış doku temizleme yöntemleriyle birlikte gelişmiş ışık tabakası mikroskobunu kullanır ve kardiyak morfogenezin anlaşılması ve yeniden şekillenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kemirgen kalplerinde kalp yapısını ortaya çıkarmak için ışıklı tabaka görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Işık tabakası mikroskobu (LSM), kalbin karmaşık üç boyutlu (3D) yapısını anlamada çok önemli bir rol oynar ve temel kardiyak fizyoloji ve patolojik yanıtlar hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu vesileyle, fare modellerinde kalbin mikro mimarisini aydınlatmak için LSM tekniğinin geliştirilmesini ve uygulanmasını inceliyoruz. Metodoloji, özelleştirilmiş bir LSM sistemini doku temizleme teknikleriyle bütünleştirerek hacimsel görüntüleme için kardiyak dokulardaki ışık saçılımını azaltır. Konvansiyonel LSM'nin görüntü birleştirme ve çoklu görüntüleme evrişim giderme yaklaşımlarıyla kombinasyonu, tüm kalbin yakalanmasına olanak tanır. Eksenel çözünürlük ve görüş alanı (FOV) arasındaki doğal dengeyi ele almak için, odak dışı ışığı en aza indirmek ve kalbi yayılma yönü boyunca eşit şekilde aydınlatmak için eksenel olarak süpürülmüş bir ışık tabakası mikroskobu (ASLM) yöntemini daha da tanıtıyoruz. Bu arada, iDISCO gibi doku temizleme yöntemleri, ışık penetrasyonunu artırarak derin yapıların görselleştirilmesini kolaylaştırır ve tüm kalp boyunca miyokardın kapsamlı bir şekilde incelenmesini sağlar. Önerilen LSM ve doku temizleme yöntemlerinin kombinasyonu, araştırmacılar için kemirgen kalplerindeki kardiyak yapıların çözülmesinde umut verici bir platform sunmakta ve kardiyak morfogenezin anlaşılması ve yeniden şekillenmesinin anlaşılması için büyük bir potansiyele sahiptir.
Giriş
Kalp yetmezliği, esas olarak olgun kardiyomiyositlerin rejeneratif kapasitesinin olmaması nedeniyle dünya çapında önde gelen mortalite nedeni olmaya devam etmektedir1. Kalbin karmaşık mimarisi, işlevinde çok önemli bir rol oynar ve gelişimsel süreçler hakkında bilgi sağlar. Kardiyak yapının derinlemesine anlaşılması, miyokard enfarktüsüne yanıt olarak kardiyak morfogenezin temel süreçlerini ve yeniden şekillenmeyi aydınlatmak için gereklidir. Son gelişmeler, yenidoğan farelerin yaralanma sonrası kardiyak fonksiyonu eski haline getirebildiğini, yetişkin farelerin ise bu tür rejeneratif kapasiteden yoksun olduğunu göstermiştir2. Bu, fare modellerinde yapısal ve işlevsel anormalliklerle ilişkili ipuçlarını araştırmak için bir temel oluşturur. Konfokal mikroskopi gibi geleneksel görüntüleme yöntemlerinin, kısıtlı penetrasyon derinliği, yavaş nokta tarama şeması ve lazer ışığına uzun süre maruz kalmaktan kaynaklanan foto hasar gibi teknik sınırlamaları vardır. Bunlar, sağlam kalbin kapsamlı üç boyutlu (3D) görüntülenmesini engeller. Bu bağlamda, ışık tabakası mikroskobu (LSM), yüksek hızlı görüntüleme, azaltılmış foto hasarı ve olağanüstü optik kesit alma yeteneklerinin avantajlarını sunan güçlü bir çözüm olarak ortaya çıkmaktadır 3,4,5. LSM'nin benzersiz özellikleri, onu geleneksel tekniklerin sınırlamalarının üstesinden gelmek için umut verici bir yöntem olarak konumlandırmakta ve kardiyak gelişim ve yeniden modelleme süreçlerine benzeri görülmemiş bir bakış açısı sağlamaktadır 6,7,8.
Bu protokolde, gelişmiş LSM'yi uyarlanmış doku temizleme yaklaşımları9 ile birleştiren, spesifik etiketleme ve mekanik kesitlere ihtiyaç duymadan tüm fare kalplerinin görüntülenmesine olanak tanıyan bir görüntüleme stratejisi sunuyoruz. Ayrıca, eksenel çözünürlüğü iyileştirmek için geleneksel LSM görüntülemenin çoklu görüntü evrişimbozukluğu 10 veya eksenel olarak süpürülmüş ışık tabakası mikroskobu (ASLM) teknikleri 11,12,13,14,15 ile geliştirilebileceğini öneriyoruz. Ek olarak, görüntü birleştirmenin bu yöntemlerden herhangi biriyle entegrasyonu, uzamsal çözünürlük ve görüş alanı (FOV) arasındaki dengenin etkili bir şekilde üstesinden gelebilir ve böylece yetişkin fare kalplerinin görüntülenmesini ilerletebilir. Hidrofobik, hidrofilik ve hidrojel bazlı yöntemler dahil olmak üzere çok sayıda doku temizleme yaklaşımının dahil edilmesi, tüm kalbin morfolojisini yakalamak için daha derin ışık penetrasyonu sağlar 16,17,18,19.
Çoklu temizleme yöntemleri mevcut LSM sistemleriyle uyumlu olsa da, amaç, lipitleri kırılma indisine yakından uyan bir ortamla değiştirerek foton saçılımını en aza indirmek ve kalp gibi dokularda ışık penetrasyonunu artırmaktır. iDISCO, temsilci20,21 olarak seçildi ve hızlı işlemesi ve yüksek şeffaflığı nedeniyle bu protokolde otofloresan görüntüleme için uyarlandı (Şekil 1A). Toplu olarak, gelişmiş LSM yaklaşımının doku temizleme teknikleriyle entegrasyonu, kemirgen kalplerindeki karmaşık kardiyak anatomiyi çözmek için umut verici bir çerçeve sunar ve kardiyak morfogenez ve patogenez anlayışımızı ilerletmek için önemli bir potansiyele sahiptir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan protokolleri ve deneyleri, Dallas Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ndeki Texas Üniversitesi'nin gözetimi altında onaylanmış ve yürütülmüştür (IACUC # 21-03). Bu çalışmada, doğum sonrası 1. günde (P1) yenidoğanlar ve 8 haftalık yetişkinler dahil olmak üzere C57BL6 fareleri kullanılmıştır. Erkekler ve kadınlar arasında fark gözlenmedi. Tüm veri toplama ve görüntü işleme, açık kaynaklı yazılım veya araştırma veya eğitim lisanslarına sahip platformlar kullanılarak gerçekleştirildi. Kaynaklar, makul talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.
1. Numune hazırlama ve doku temizleme (6 - 10 gün)
- Doku temizleme işlemine başlamadan önce doku temizleme yöntemi için gerekli olan Malzeme Tablosundaki tüm kimyasal çözeltileri hazırlayın.
NOT: Uygun kişisel koruyucu ekipman giyerken, özellikle toksik kimyasallarla çalışırken, tüm prosedürleri çeker ocakta gerçekleştirin. - Tüm kalp toplama için P1 ve 8 hafta gibi istenen zaman noktalarında bir CO2 odasına yerleştirerek hayvanları CO2 ile ötenazi yapın ve yeni izole edilmiş kalbi oda sıcaklığında (RT) 0.2 M KCl'ye daldırın ve diyastol16'da tutuklayın.
- Kardiyak anatomiyi 4 ° C'de korumak için gece boyunca bir külbütör üzerinde hafif çalkalama ile 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) içine daldırarak kalbi sabitleyin, Tablo 1'e bakın.
DİKKAT: PFA toksik bir kimyasaldır ve çeker ocak altında yapılmalıdır. - Kalbi RT'de 1x PBS ile 30 dakika, 3x yıkayın.
NOT: İsteğe bağlı: Aşağıda açıklandığı gibi 2. adımda özel yapım LSM sistemi için bir kalp düzeneği oluşturmak üzere kalbi agaroz jele gömün.- Agarozu PBS içinde çözerek% 1'lik agaroz çözeltisini hazırlayın ve karışımı tamamen çözünene kadar mikrodalgada ısıtın. Çözelti 40 °C'ye kadar soğuyana kadar bir alt tabaka oluşturmak için çözeltiyi bir kalıba dökün.
- Kalbi kalıba yerleştirin ve kalıbı katılaşana kadar agaroz jel ile doldurun. Görüntülemedeki artefaktları en aza indirmek için agaroz jeldeki kabarcıkları ortadan kaldırın.
NOT: Numunenin gömülmesi, montaj sırasında kalp anatomisine zarar verme riskini azaltır.
DİKKAT: Düşük erime noktalı agaroz kullanın ve numuneyi yüksek sıcaklıklara maruz bırakma riskini azaltmak için kalbi doğrudan ısıtılmış agarozun içine yerleştirmekten kaçının.
- Deiyonize su ile karıştırılmış metanol gradyanlarını kullanarak kalbi kurutun (Şekil 1B), Tablo 1'de
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
LSM'nin, parlak alan ve nokta tarama teknikleri gibi diğer optik görüntüleme yöntemlerinin aksine minimum foto hasar riski, yüksek uzamsal çözünürlük ve optik kesitleme riski nedeniyle31,32,33,34,35,36,37 kardiyak çalışmaları teşvik ettiği gösterilmiştir 6,8,38,39,40
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Görüntüleme, hesaplama ve doku temizleme yöntemlerinin ilerlemesi, kardiyak yapı ve fonksiyonu kapsamlı bir şekilde araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlamıştır. Bu, sağlam bir kemirgen kalp modeli kullanarak kardiyak morfogenez ve patogenez anlayışımızı derinleştirmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Benzer bir yaklaşım40,41,42,43 kullanan zebra balığı kalbi üzerinde yapılan in vivo çalışmaların aksine, gelişmiş LSM tekniklerinin ve doku...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Dr. Eric Olson'un UT Southwestern Tıp Merkezi'ndeki grubuna hayvan modellerini cömertçe paylaştıkları için minnettarlığımızı ifade ediyoruz. UT Dallas'taki D-incubator üyeleri tarafından sağlanan tüm yapıcı yorumları takdir ediyoruz. Bu çalışma NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) ve UT Dallas STARS programı (YD) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1% agaroz< / güçlü > | |||
| Düşük erime noktalı agaroz | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deiyonize su | - | < | |
| güçlü > doku temizleme kimyasalları & nbsp; | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimetilsikloheksanmetilamin, cis ve trans | karışımı Sigma-Aldrich | 118184 | |
| DER ve ticaret; 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| DER ve ticaret; 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzil eter (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Diklorometan (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Floresan boncuklar | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hidrojen peroksit (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehit (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potasyum Klorür (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Yazılım ve algoritmalar | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hö rl ve diğerleri22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin ve diğerleri20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Özelleştirilmiş hafif levha sisteminin temel bileşenleri | |||
| 0.63 - 6.3X Zoom gövde | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Aydınlatma objektifi | Nikon | MRH00105 | |
| 1X algılama objektifi | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Lazer | Laserglow Teknolojileri | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS lazer | Laserglow Teknolojileri | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 ve ince; nm DPSS lazer | Laserglow Teknolojileri | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC konektörü | Ulusal Enstrüman | BNC-2110 | |
| Silindirik lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Kontrol Cihazı, 4 eksen | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Kablosu | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Sürücüsü | Optotune | EL-E-4i | |
| Filtre | Chroma | ET525/30 | |
| Filtre | Chroma | ET585-40 | |
| Filtre | Chroma | ET645-75 | |
| Filtre tekerleği ve nbsp; | Deklanşör Enstrümanı | LAMBDA 10-B | |
| Motorlu çeviri aşaması | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorlu çeviri aşaması | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorlu çeviri aşaması | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI çok işlevli G/Ç | Ulusal Enstrüman | PCIe-6363 | |
| sCMOS kamera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Step motor | Pololu | 1474 | |
| Tüp lens | Olympus | MVX-TLU |
Kaynaklar
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73(2021).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002(2018).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396(2018).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209(2017).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
- Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
- Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
- Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924(2018).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
- Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795(2021).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278(2023).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821(2020).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769(2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
- Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149(2014).
- Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
- Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
- Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
- Sands, G. B., et al. It's clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
- Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 323, H257(2022).
- Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754(2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
- Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
- Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112(2023).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
- Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263(2024).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807(2021).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271(2018).
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
- Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
- Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678(2017).
- Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101(2019).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072(2017).
- Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36(2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
