Yöntem makalesi

Farede Naif CD4+ T Hücrelerinin Patojenik Th17 Hücrelerine İn Vitro Farklılaşması

3.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66718

⸱

25 Ekim 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, Department of Critical Care Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Department of Pathogenic Biology and Immunology, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, School of Medicine, Southeast University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, naif CD4+ T hücrelerinin in vitro olarak patojenik Th17 hücrelerine farklılaşmasını tanımlar. Spesifik olarak, çok parametreli akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, bu farklılaşma yöntemi kullanılarak saf CD4+ T hücrelerinden %90 saflıkta patojenik Th4 hücreleri elde edilebilir.

Özet

Laboratuvar ortamında T hücresi farklılaşma teknikleri, CD4+ T hücrelerinin hem fonksiyonel hem de mekanik araştırmaları için gereklidir. Patojenik Th17 hücreleri, son zamanlarda multipl skleroz (MS), romatoid artrit, akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), sepsis ve diğer otoimmün bozukluklar dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, şu anda bilinen in vitro farklılaşma protokolleri, indüksiyon verimliliği genellikle% 50'nin altında olan patojenik Th17 hücrelerinin yüksek saflığına ulaşmada zorluk çekmektedir, bu da in vitro deneylerde önemli bir zorluktur. Bu protokolde, fare dalaklarından izole edilen naif CD4+ T hücrelerini doğrudan patojenik Th17 hücrelerine ayırmak için kullanılan patojenik Th17 hücreleri için geliştirilmiş bir in vitro kültür ve farklılaşma protokolü öneriyoruz. Bu protokol, splenosit izolasyonu, naif CD4+ T hücrelerinin saflaştırılması ve patojenik Th17 hücrelerinin farklılaşması hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar. Bu protokol sayesinde, birçok hücresel deneyin temel ihtiyaçlarını karşılayan patojenik Th17 hücreleri için yaklaşık% 90'lık bir farklılaşma saflığı elde edebiliriz.

Giriş

Timustan ayrıldıktan sonra, naif CD4 + T lenfositleri ikincil lenfoid organlardan geçer. Homolog antijenleri saf CD4+ T hücrelerine ileten antijen sunan hücreler, onları aktive eder ve sonunda son derece özelleşmiş T yardımcı (Th) hücre soylarının üretimiyle sonuçlanan bir dizi farklılaşma programı başlatır1. İnterlökin 17 (IL-17) üretimi, pro-inflamatuar Th hücrelerinin2 bir alt popülasyonu olan Th17 hücrelerini karakterize eder. Th17 hücreleri, konakçının hücre dışı patojenlere karşı savunmasında ve otoimmün üveit ve multipl skleroz gibi birçok otoimmün hastalığın patogenezinde rol oynar. T hücresi reseptörleri ve sitokinleri IL-6 ve dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β) gelen sinyaller, sinyal dönüştürücüsünün fosforilasyonu ve transkripsiyon aktivatörünün (STAT) fosforilasyonu yoluyla saf T hücrelerinin Th17 hücrelerine farklılaşmasını indükler33. STAT3, IL-23 ve IL-21 4,5'in aracılık ettiği sinyalleme yoluyla pozitif bir geri besleme döngüsünde daha da yükseltilir. STAT3'ün fosforilasyonu, Th17 hücrelerinde IL-17A, IL-17F, IL-21 ve IL-22'nin sitokin profilini düzenleyen ana anahtarlar olarak işlev gören RORγt ve RORα transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu indükleyebilir6. Bununla birlikte, IL-6 ve TGF-β ile indüklenen Th17 hücrelerinin,TGF-β 7,8'in yokluğunda IL-23 ile ko-stimülasyon veya IL-6, IL-1β ve IL-23'ün ayrı ayrı ko-stimülasyonunu gerektiren otoimmün hastalıkları tetiklemek için yetersiz olduğu bildirilmiştir.

Deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) etkili bir şekilde indükleyemeyen Th17 alt grupları bazen patojenik olmayan Th17 olarak adlandırılırken, EAE'yi indükleyebilen Th17 alt grupları patojenik Th179 olarak bilinir. Mevcut çalışmalar, patojenik Th17 ve patojenik olmayan Th17'nin çekirdek transkripsiyon faktörü RORγt'u birlikte eksprese etmesine rağmen, IL-17A ve pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar özellikler üretme yeteneğinde büyük farklılıklar olduğunu göstermiştir10. Th17'nin ortak karakteristik transkripsiyon faktörleri olan RORγt, CCR6, STAT4 ve RUNX4'ün yüksek ekspresyonuna ek olarak, patojenik Th17 hücreleri, Th1 hücre alt kümelerinin özelliklerine sahip TBX21, IFN-γ ve CXCR3 gibi hastalıkla ilgili ek gen sinyal ekspresyon özellikleri de gösterir. Patojenik Th17 hücreleri yüksek düzeyde granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), IFN-γ, TNF-α ve diğer sitokinleri salgılayabilir11,12. Patojenik olmayan Th17 hücrelerinin fenotipi kararsızdır ve sadece CD3 ve sitokin IL-2'nin uyarılması altında bu hücrelerin bazıları patojenik Th17 hücrelerine farklılaşabilir. Bu nedenle, romatoid artrit, multipl skleroz ve akut solunum sıkıntısı sendromu gibi yaygın klinik hastalık modellerinde, patojenik Th17 hücreleri öncelikle patojenik etkiler gösterir.

Patojenik ve patojenik olmayan Th17 hücreleri, farklı sitokinlerin etkisi altında in vitro olarak farklılaşabilir. Son yıllarda, çeşitli çalışmalar, farklı tip ve konsantrasyonlarda sitokin kullanarak Th17 hücrelerinin farklılaşmasını indüklemek için yöntemler önermiştir. Th17 hücreleri, IL-6, IL-1β ve IL-23 13,14,15,16'nın bir kombinasyonu ile uyarılır. Th17 hücre farklılaşması için gerekli iki sitokin olan IL-6 ve TGF-β'nin, Rorc gen lokusu17'de korunmuş kodlamayan iki DNA dizisi ile etkileşime girerek RORγt ve Th17 hücre farklılaşmasının ekspresyonunu sinerjik olarak düzenlediği kanıtlanmıştır. Patojenik Th17 hücrelerinin stabil fazı esas olarak IL-2318,19 tarafından korunur. IL-23, reseptörüne bağlanır ve JAK-STAT sinyal yolu20'yi aktive eder, böylece Jak2 ve Tyk2'nin fosforilasyonuna neden olur ve STAT1, STAT3, STAT4 ve STAT5'in fosforilasyonunu teşvik eder. IL-4 ve IFN-γ bu yolun negatif düzenleyicileridir. Bununla birlikte, çalışmalar, IL-1β'nin, Th17 hücre fenotipi21'in stabilitesini korumak için mTOR yolu yoluyla Rorα ve Rorγt'un transkripsiyonunu pozitif olarak düzenleyebileceğini göstermiştir.

Çok sayıda çalışmanın heterojenliği nedeniyle, kontrol22 olarak en son araştırmalardan patojenik ve patojenik olmayan Th17 hücreleri için indüksiyon protokollerini seçtik. Sonuçlar, her şeyin bu protokole göre yapıldığını varsayarsak, patojenik Th17 üretme koşulu altında 5 günlük kültürden sonra, hayatta kalan hücrelerin% 90'ından fazlasının patojenik Th17 hücreleri olabileceğini göstermektedir.

Protokol

Güneydoğu Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Kurumsal İnceleme Komitesi, bu çalışmada ayrıntılı olarak açıklanan ve hem yerel hem de kurumsal ofis standartlarına uygun olarak yürütülen tüm hayvan çalışmalarını onayladı. Dalak örnekleri C57BL6/J farelerden alındı. Yaşları 5 ila 8 hafta arasında değişen hem dişi hem de erkek fareler bu çalışmaya dahil edildi. Kültür ortamı ve tampon 4 ° C'de 1 aya kadar saklandı. Cerrahi aletler kullanılmadan önce otoklavlandı. Cildin, gözlerin ve giysilerin reaktiflerle kirlenmesini önlemek için lateks eldiven ve maske kullanın; Cilt ve gözler için bol su veya tuzlu su kullanın.

1. 24 oyuklu doku kültürü plakasının anti-CD3 ile önceden kaplanması

  1. Anti-CD3'ü steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) veya RPMI 1640 ortamında 1 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
  2. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasını 1 mL anti-CD3 çözeltisi (1 μg / mL) ile iyice doldurun; Daha sonra kuyuyu parafilm ile örtün.
  3. Anti-CD3 kaplı plakayı buzdolabında (2 °C-8 °C) 16 saat bekletin veya 37 °C'de bir hücre inkübatöründe 2-3 saat tutun.

2. Fare dalak izolasyonu ve dalak tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

  1. % 3 izofluran ile C57BL / 6J'de tam anestezi indükleyin ve% 100 karbondioksiti 2 dakika soluyarak ötenazi yapın. Farelerin ölümünden hemen sonra, kontaminasyonu önlemek için dezenfeksiyon için% 75 etanole batırın.
  2. Fareyi temiz bir bankın üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin, karnın orta hattı boyunca kesin ve karın yapılarını katman katman ayırın. Büyük omentumu ve mideyi cımbızla nazikçe açın, dalağı gastroplenik ligament ile nazikçe dışarı çekin ve sağlam bir dalak elde etmek için dalağı çevre dokulardan ve bağlardan kör bir şekilde ayırın (dalağın ezilmesini veya yırtılmasını önlemek için dikkatli olun).
    NOT: Steril bir durumu korumak için, steril süper temiz bir tezgahta aşağıdaki işlem gerçekleştirilir.
  3. 70 μm'lik bir hücre filtresini 100 mm'lik steril bir kültür kabına yerleştirin, dalağı hücre süzgecine ekleyin ve bir şırınga pistonu ile ezin. Aynı zamanda, tüm hücreleri filtreden kültür kabına itmek için 5-8 mL homojenat yıkama sıvısı ekleyin.
    NOT: Lenfosit ayırma sıvısı kitinin bileşimi Malzeme Tablosunda görülebilir.
  4. Süzüntüyü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  5. Hücre peletini, lenfosit ayırma kiti veya PBS veya RPMI 1640 ortamı ile sağlanan numune seyreltici ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunun hücre konsantrasyonunu 2 × 108-1 × 109 hücre / mL'ye ayarlayın.
    NOT: Tipik olarak, bir dalak için 4-6 mL numune seyreltici gereklidir.
  6. Bir santrifüj tüpünde, doku tek hücreli süspansiyonu ile aynı miktarda lenfosit ayırma çözeltisi alın. Tek hücreli süspansiyonu lenfosit ayırma solüsyonunun yüzeyine dikkatlice pipetleyin ve 800 × g, 25 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjün Hızlanma ve Yavaşlamasını uygun bir aralığa ayarlayın (örneğin, normal 3 ila 1 vites varsa 9'e ayarlayın).
    NOT: Lenfosit ayırma çözeltisi 3 mL'den az olmamalıdır.
  7. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüpündeki dört katmanı yukarıdan aşağıya doğru gözlemleyin. İlk katman, numune seyrelticisine karşılık gelir, ardından halka şeklindeki süt beyazı lenfosit tabakası gelir. Üçüncü katman ayırma sıvısıdır ve dördüncü katman kırmızı kan hücrelerinden oluşur.
  8. Halka şeklindeki süt beyazı lenfosit tabakasının ikinci tabakasını başka bir santrifüj tüpüne dikkatlice çekmek için bir pipet kullanın ve hücreleri karıştırmak için santrifüj tüpüne 10 mL temizleme solüsyonu ekleyin.
  9. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre sayımı için hücre peletini yeniden süspanse etmek için 10 mL RPMI 1640 ortamı kullanın.

3. Manyetik boncukların negatif seçimine dayalı olarak saf CD4 + T hücrelerinin saflaştırılması

NOT: El değmemiş ve yüksek oranda saflaştırılmış naif CD4 + T hücrelerini (CD4 + CD44lowCD62Lhigh) immünmanyetik negatif seçim ile fare splenositlerinden izole edin.

  1. Numuneyi 0.1-2 mL hacim aralığında 1 × 108 hücre/mL olacak şekilde hazırlayın.
  2. 50 μL / mL sıçan serumu ekleyin ve numuneyi 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    NOT: Naif CD4 T hücre sıralama kitinin bileşimi Malzeme Tablosunda görülebilir.
  3. Numuneye 50 μL/mL İzolasyon Kokteyli ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 7,5 dakika inkübe edin.
  4. Numuneye 50 μL/mL Tükenme Kokteyli ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2,5 dakika inkübe edin.
  5. Eşit dağılmayı sağlamak için manyetik boncukları girdaplayın. Numuneye 75 μL/mL manyetik boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2,5 dakika inkübe edin.
    NOT: Parçacıklar eşit olarak dağılmış görünmelidir; Vorteksleme süresi 30 saniyeden az olmamalıdır.
  6. Numuneyi RPMI 1640 orta ile 2,5 mL'lik bir nihai hacme kadar doldurun. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek birkaç kez karıştırın.
  7. Tüpü (kapaksız) mıknatısın içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 2,5 dakika inkübe edin.
  8. Mıknatısı kaldırarak, mıknatısı ve tüpü tek bir sürekli hareketle ters çevirin vezenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu yeni bir tüpe dökün.
    NOT: Tüpü ve mıknatısı dik konuma getirmeden önce 2-3 saniye ters çevirin. Tüpün ağzında kalabilecek hiçbir damlayı rahatsız etmeyin.
  9. Bir hemositometre kullanarak hücre numarasını belirleyin.
  10. İzolasyondan önce ve sonra naif CD4 + T hücreleri için akış sitometrik analizi yapın (Şekil 1).
  11. Hücreleri yeni bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  12. Hücreleri 200-500 μL RPMI 1640 ortamında (% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş) yeniden süspanse edin. Her 1 mL hücre kültürü için (ör., ~ 106 hücre / mL), 2 μL lökosit aktivasyon kokteyli ekleyin ve karıştırın. Hücreleri bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de ve 4-6 saat boyunca doymuş nemde kültürleyin.
    NOT: Hücreler her 1-2 saatte bir girdaplandı.
  13. Hücreleri 400 × g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücreleri 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Hücrelere 1 μL Fc bloker ekleyin (ör., ~ 106 hücre / mL). Hücreleri 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
  14. Hücreleri bir kez 1 mL PBS ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyerek yıkayın. Süpernatanı atın ve hücreleri 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
  15. Antikor kokteyli ekleyin (Sabitlenebilir Canlı Boya, 1:1.000; anti-CD4, 1:200; anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) ve hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 15-20 dakika inkübe edin.
  16. Hücreleri 2 x 1 mL PBS ile yıkayın ve ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
  17. Süpernatanı atın, hücreleri 250 μL sabit tamponda yeniden süspanse edin ve karanlıkta 4 ° C'de 40-60 dakika inkübe edin.
    NOT: Düzeltme tamponu, geçirgenleştirme seyrelticisi ile seyreltilmesi gereken 3x stok çözeltisi olan Foxp4/transkripsiyon faktörü boyama tamponu ile sağlanır.
  18. Hücreleri 300 × g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyerek hücreleri 2x yıkamak için 1 mL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin.
  19. Süpernatanı atın, hücreleri 200 μL geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin ve antikoru (Foxp3 [nükleer], 1:200) hücrelere ekleyin. Fiksasyon ve membran yırtılmasından sonra, hücre-antikor karışımlarını karanlıkta 40-60 dakika inkübe edin ve ara sıra 4 ° C'de kısa süreler boyunca çalkalayın.
    NOT: Geçirgenleştirme/Yıkama solüsyonu, PBS ile kullanılmadan önce seyreltilmesi gereken 10x stok solüsyonudur.

4. Patojenik Th17 hücrelerinin in vitro indüksiyonu

  1. Kullanmadan önce steril PBS'yi önceden kaplanmış 24 oyuklu plakalardan çıkarın.
  2. Th17 hücre kültürü ortamı (Tablo 1) ve Th0 hücre kültürü ortamı (Tablo 1), klasik patojenik olmayan Th17 kültür ortamı (Tablo 1) ve klasik patojenik Th17 kültür ortamı (Tablo 1) dahil olmak üzere kültür için kontrast ortamı kullanın. Zenginleştirilmiş saf CD4 + T hücrelerini yeniden süspanse edin ve aynı 24 oyuklu plakada (anti-CD3 ile önceden kaplanmış) farklı oyuklara dağıtın, konsantrasyonu 4 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın, her kuyucukta 1 mL ortam ile.
  3. Her oyuğa 1 μL / mL anti-CD28 çözeltisi (son konsantrasyon: orta ila 2 μg / mL ile seyreltilmiş) ekleyin. Hücreleri 5 gün boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin.
  4. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için dikkatlice pipetleyerek hücre kültürü süpernatan ortamını kültür ortamıyla (Th0, patojenik olmayan Th17, klasik patojenik Th17 ve objektif Th17) değiştirin, hücreleri içeren ortamın yarısını atın ve ardından 2. günde atılan hacmine eşit yeni ortam ekleyin. 4. günde tekrarlayın.
  5. Hücreleri 5. günde optik mikroskop altında gözlemleyin (Şekil 2). Her gruptan hücre süpernatantlarını toplayın ve -80 °C'de dondurarak saklayın.

5. Patojenik Th17 ve Th0 hücre farklılaşması için akış sitometrik analizi

  1. Kültürün başlamasından 5 gün sonra tüm hücreleri (kuyu başına) hasat edin. 3.12-3.15 adımlarını gerçekleştirin.
  2. Bir antikor kokteyli ekleyin (Sabitlenebilir Canlılık Boyası, 1:1.000; anti-CD4, 1:200) ve hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 15-20 dakika inkübe edin.
  3. 3.17-3.19 adımlarını gerçekleştirin.
  4. Süpernatanı atın, hücreleri 200 μL geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin ve antikor kokteylini ekleyin (IL-17A [hücre içi], 1:200; RORγT [nükleer], 1:200) hücrelere. Fiksasyon ve membran yırtılmasından sonra, hücre-antikor karışımlarını karanlıkta 40-60 dakika inkübe edin ve ara sıra 4 ° C'de kısa süreler boyunca çalkalayın.
  5. Hücreleri 2x yıkamak için 1 mL 1x Geçirgenleştirme / Yıkama solüsyonu ekleyin, hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin; Ardından, süpernatanı atın.
  6. Hücreleri bir akış sitometresinde inceleyin ve yazılımı kullanarak verileri analiz edin (Şekil 3).
    1. Akış sitometresini açın ve kendi kendine başlayan temizleme ve kalibrasyon işlemini açın.
    2. Bu deneyde kullanılan lazer kanalını seçin ve boş bir tüp, tek lekeli tüpler ve numune tüpleri ayarlayın.
    3. Boş tüp seçeneğine tıklayın ve makinede test edin; Voltajı, hücre olayı mümkün olduğunca toplama kutusunun merkezinde olacak şekilde ayarlayın.
    4. Tek lekeli tüp hücrelerini toplayın ve floresan antikorun doğru şekilde eklendiğini doğrulamak için ilgili kanalların spektral tespitini gerçekleştirin.
    5. Karışımı kaldır düğmesine tıklayın ve makinenin spektral telafisini otomatik olarak ayarlamasına izin verin. Diğer akış sitometrisi cihazlarında, floresan telafisini normal şekilde ayarlayın.
    6. Her örnek tüp hücresini toplayın, veri formatını FCS dosyaları olarak kaydedin ve dışa aktarın. İlgili akış sitometrisi veri analizi yazılımında analiz edin ve çizin.
      1. Ana hücre popülasyonunu daire içine alın ve FSC-H ve FSC-A'nın çapraz daire kapılarından olası hücre adezyonlarını ortadan kaldırın.
      2. Canlı hücreleri FVS negatif daire alanına göre daire içine alın; daha sonra, CD4 + hücre popülasyonunu daire içine alın.
      3. Yatay ekseni IL-17 A ve dikey ekseni RORγT olarak çapraz geçit oluşturun; Q2 alanındaki çift pozitif seçilim Th17 hücre popülasyonudur.

6. Farklı ortamlar tarafından indüklenen IL-17A sekresyonunun tespiti için enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)

  1. Bölüm 4.5'te toplanan donmuş hücre süpernatantlarını çözün.
  2. 100 μL seyreltilmiş standart, boş ve numune ekleyin. Plakayı örtmek için kapatıcıyı kullanın ve 37 °C'de 90 dakika inkübe edin.
    NOT: Solüsyonları mikro ELISA plakasının dibine iç duvara dokunmadan veya herhangi bir köpürmeye neden olmadan iyice ekleyin.
  3. Sıvıyı her bir kuyucuktan boşaltın ve hemen 100 μL Biyotinillenmiş Tespit Antikoru çalışma solüsyonu ekleyin. Plakayı kaplamak için yeni bir sızdırmazlık maddesi kullanın ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
  4. Çözeltiyi boşaltın ve her oyuğa 350 μL yıkama tamponu ekleyin. 1 dakika sonra, çözeltiyi her bir oyuktan aspire edin veya boşaltın ve temiz emici kağıda vurarak kurulayın. Bu yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
  5. Her kuyucuğa 100 μL yaban turpu peroksidaz Konjugat çalışma çözeltisi ekleyin. Plakayı kaplamak için yeni bir sızdırmazlık maddesi kullanın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  6. Çözeltiyi her bir oyuktan boşaltın ve yıkama işlemini adım 6.4'te açıklandığı gibi 5 kez tekrarlayın.
  7. Her bir oyuka 90 μL Substrat Reaktifi ekleyin ve plakayı ışıktan koruyarak yeni bir sızdırmazlık maddesi ile 37 °C'de yaklaşık 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Reaksiyon süresi, gerçek renk değişimine göre değiştirilebilir ancak 30 dakikayı geçmemelidir. OD ölçümünden önce mikroplaka okuyucunun ~ 15 dakika ısınmasına izin verin.
  8. Substrat çözeltisi ile aynı sırayla 50 μL / kuyu Durdurma Çözeltisi ekleyin.
  9. 450 nm'ye ayarlanmış bir mikroplaka okuyucu ile her bir kuyucuğun optik yoğunluğunu (OD değeri) bir kerede belirleyin.
  10. Standart numuneler için OD değerlerini elde edin ve numunelerin kuyucuklarını çoğaltın ve düzeltilmiş değerleri elde etmek için boş kuyuların OD değerlerini çıkarın. Ardından, apsis olarak konsantrasyon ve ordinat olarak OD değeri ile doğrusal montaj gerçekleştirin. Takılan denkleme dayanarak, numune kuyucukları için IL-17A konsantrasyon değerlerini hesaplayın.
    NOT: 4 günlük farklılaşmadan sonra, her grubun süpernatantındaki IL-17A içeriği Şekil 4'te gösterilmiştir. Montaj yöntemi, Orgin21 yazılımına atıfta bulunabilir. Bu deneyden elde edilen standart eğrininR2 değeri 0.9946'dır.

7. Kantitatif PCR (qPCR) yoluyla imza gen ekspresyon testleri ile T hücresi farklılaşması

NOT: Boyaların ve fiksasyon/yırtılma etkilerine bağlı akış sitometrisi instabilitesi olasılığını dışlamak için, patojenik Th17'nin transkripsiyonel düzeyde farklılaşma etkisini aydınlatmak için qPCR ile karakteristik genlerin ekspresyonunu tespit ettik.

  1. T hücre kültürünün sonundaki hücre sayısını ölçün. Hücreleri 1.5 mL'lik santrifüj tüplerinde toplayın ve 400 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüm süpernatantları dikkatlice atın.
  2. RNA ekstraksiyonu
    NOT: Ekstraksiyon işlemi, RNA enzim kontaminasyonunu önlemek için çeker ocakta veya ultra temiz bir tezgahta gerçekleştirilmelidir.
    1. Numune tüpüne (adım 7.1) 500 μL Lizis Tamponu (örn. 1-2 × 106 hücreye) ekleyin, hemen çalkalayın ve hücre kütlesi kalmayana kadar karıştırın ve 1 dakika bekletin.
    2. Karışımı bir toplama tüpüne yerleştirilen adsorpsiyon kolonuna ekleyin, 30 saniye boyunca 13.400 × g'da santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
    3. İlk kez kullanmadan önce Yıkama Tamponu şişesine belirtilen miktarda mutlak etanol ekleyin. Adsorpsiyon kolonuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin, 30 saniye boyunca 13.400 × g'da santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
    4. Adım 7.2.3'te yıkamayı tekrarlayın.
    5. Adsorpsiyon sütunu RA'yı boş toplama tüpüne yerleştirin ve durulama solüsyonunu çıkarmak için 13.400 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Durulama çözeltisindeki artık etanolün aşağı akış reaksiyonunu engellemesini önlemek için durulama çözeltisi çıkarılmalıdır.
    6. Adsorpsiyon kolonunu RA'yı çıkarın ve temiz bir RNaz içermeyen santrifüj tüpüne yerleştirin. Adsorpsiyon membranının ortasına 50 μL RNaz içermeyen H2O ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika bekletin ve 9.600 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
  3. RNA'nın saflığını ve konsantrasyonunu ölçün.
  4. Kit üreticisinin talimatlarını izleyerek cDNA'nın ilk zincirini sentezleyin.
    1. Genomik DNA'yı çıkarın. Ekstrakte edilen şablon RNA'nın 500 ng'sini RNaz içermeyen bir santrifüj tüpünde alın; bir karışım oluşturmak için RNaz içermeyen ddH2O ve 4x gDNA karışımı ekleyin. Bir pipetle nazikçe karıştırın ve 2 dakika boyunca 42 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
      NOT: Reaksiyon karışımının miktarı ve eklenen miktar RNA konsantrasyonu ile ilgilidir; Talimatlara ayrıntılı olarak bakın. Bu deneyde 20 μL'lik reaksiyon sistemi kullanılmıştır.
    2. Önceki adımın reaksiyon tüpüne doğrudan 5x ters transkripsiyon reaksiyon sistemi ekleyin. Önceki adımdan 4 μL ters transkripsiyon reaksiyon sistemi ve 16 μL karışım alın ve bir pipetle hafifçe karıştırın.
      NOT: Ters transkripsiyon sistemi, doğrudan yapılandırılmış bir ters transkripsiyon sistemi olan gerekli tüm ters transkriptazı içerir.
    3. Ters transkripsiyon reaksiyonunu ayarlayın: 37 °C 15 dakika, 85 °C, 5 sn ve son olarak 4 °C'ye soğutun.
  5. Üreticinin talimatlarına göre PCR reaksiyonunu ayarlayın.
    1. qPCR tüpüne 10 μL 2x PCR reaksiyon enzimi karışımı, 0.4 μL primer 1, 0.4 μL primer 2, 0.4 μL 50x ROX Referans Boya 1, 2 μL şablon cDNA ve 6.8 μL ddH2Oekleyin 20 μL'lik bir karışım hazırlamak için.
    2. Aşağıdaki ayarları kullanarak gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR cihazında PCR gerçekleştirin: aşama 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; aşama 2, önce 95 °C, 10 sn, sonra 60 °C, 30 sn, Tekrar x 40; aşama 3, önce 95 °C, 15 sn, sonraki 60 °C, 60 sn, son olarak 95 °C, 15 sn, Tekrar x 1.
      NOT: 4 günlük farklılaşmadan sonra, saf CD4 + T hücrelerinde Il17a, Il17f, Rora ve Il23r'nin nispi ekspresyon seviyeleri Şekil 5'te gösterilmiştir.

Sonuçlar

Protokolümüz, patojenik Th17 hücre farklılaşması ile ilgili daha önceki araştırmalara dayanarak geliştirilmiştir. Deneyin ilk adımı, manyetik boncuk ayıklama ile dalaktan izole edilen naif CD4+ T hücrelerinin saflığını tespit etmektir, bu da sonraki patojenik Th17 hücre farklılaşmasının başarısının temelini oluşturur. Naif CD4+ T hücrelerinin saflığı, CD62L23 ve CD4424 yüzey belirteçleri kullanılarak tespit edilirken, FOXP325 , Treg hücrelerinin bir belirteci olarak kullanıldı. Treg hücrelerinin içeriğinin sıralamadan sonra önemli ölçüde azaldığını ve saf CD4 + T hücrelerinin saflığının en az% 95'e ulaşabileceğini bulduk (Şekil 1). Patojenik Th17 hücrelerinin farklılaşmasını karşılaştırmak için, naif CD4 + T hücreleri toplam 5 gün boyunca Th0 ortamı (Tablo 1) ve Th17 farklılaşma ortamı (Tablo 1) ile kültürlendi. T hücrelerinin hem Th0 hem de Th17 ortamında küme büyümesi gösterdiği bulunmuştur (Şekil 2).

Daha sonra, hücreler sabitlendi, geçirgen hale getirildi ve akış sitometrisine dayalı olarak farklılaşmış CD4 + T hücrelerinde çeşitli sitokinlere karşı antikorlarla etiketlendi. IL17A26 ve RORγT27'yi Th17 hücre farklılaşmasının ayırt edici sitokinleri olarak inceledik ve naif CD4+

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

Tartışma

Bu prosedür, patojenik Th17 hücrelerinin in vitro üretimi için farelerin splenik naif CD4 + T hücrelerinin sayısını artırmak için verimli bir yol sundu. Bildirilen diğer Th17 hücre kültürü ortamlarından daha fazla sitokin kullanmamıza rağmen, patojenik Th17 hücrelerinin büyüme koşullarını optimize etmeye kararlıyız. Uyarılmış farklılaştırma protokolümüzün daha da optimize edilmesini düşünüyoruz.

Burada, ayırt edici sitokinlerin üretimini incelemek için basitçe akış sitometrisi ve qPCR kullandık. Birkaç küçük değişiklikle, bu yaklaşım hücre proliferasyonu gibi diğer fonksiyon testleri için de kullanılabilir.

Fare dalağı lenfositlerini izole etmek için Çin yapımı bir lenfosit izolasyon kiti kullandık çünkü etkili ve zaman kazandırıyor. Diğer markalara dayalı lenfosit ayırma çözümleri, fare dalağı lenfositlerini farklı adımlarla ayırma amacına da ulaşabilir. Diğer bir yöntem, elde edilen dalak hücresi süspansiyonunun kırmızı kan hücrelerini doğrudan parçalamaktır; Bununla birlikte, dalak kırmızı kan hücrelerinin genellikle bir kerede parçalanamadığını bulduk.

Bu protokolün yürütülmesi sırasında bazı sorunlar ortaya çıkabilir. İlk olarak, manyetik boncuk ayıklama ile elde edilen saf CD4 + T hücrelerinin sayısı çok düşük olabilir (protokol adımı 3). Bu, organları kırma işleminin yetersiz olmasına bağlanabilir. Organın uygun şekilde homojenize edildiğinden emin olmak önemlidir. Homojenizasyon işlemi sırasında durulama sıklığının arttırılması geri kazanım oranını artıracaktır. Daha fazla sayıda splenic naif CD4 + T hücresi elde etmek için, daha genç fareler (6-10 haftalık) kullanmanızı öneririz. Dalak lenfositlerini ayırmak için çeşitli yöntemler mevcuttur ve verim kullanılan ayırma sıvısına bağlı olarak değişebilir. Evrensel olarak onaylanmış bir ayırma sıvısı kullanılması ve lenfosit tabakasını mümkün olduğunca çıkarmaya çalışılması önerilir.

İkincisi, akış sitometrisindeki CD4 + T hücrelerinin oranı %<80 olabilir (protokol aşaması 5). Bu sorunun olası bir nedeni, ek antikor kokteyli ve manyetik boncuklarınkinden daha büyük bir hücre sayısına neden olan yanlış bir splenosit sayısı olabilir. Naif CD4 + T hücresi saflaştırmasının etkinliğini artırmak için hücre sayımı kesin olmalıdır. Ek olarak, bu protokolün önerdiğinden %10 daha fazla antikor kokteyli ve manyetik boncuk kullanılabilir. Son olarak, saf CD4 + T hücreleri sıralandıktan hemen sonra akış sitometrisi yapılabilir.

Üçüncüsü, kültür sırasında çok sayıda T hücresi kümesi oluşmayabilir ve hücrelerin çoğu T hücrelerinin farklılaşması sırasında ölmüş olabilir (protokol aşaması 4). Bu sorunun olası nedeni, tohumlamadan önce saf CD4 + T hücreleri için hücre sayılarının yanlış belirlenmesi ve bunun sonucunda düşük hücre yoğunluğu olması olabilir. 48 oyuklu bir plakada her bir kuyucuk için yaklaşık 4 ×10 5 hücre/mL istenen hücre yoğunluğunu elde etmek için daha doğru bir sayım yönteminin benimsenmesi önerilir. Başka bir olası neden, yanlış sıcaklık veya CO2 konsantrasyonu gibi CO2 inkübatörü ile ilgili teknik sorunlar olabilir. Son olarak, hücre kültürü ortamını değiştirirken aşırı kuvvet potansiyel olarak hücre ölümüne neden olabilir.

Dördüncüsü, imza sitokin genlerinin nispi ekspresyon seviyeleri düşük olabilir (protokol aşaması 7). Ekstrakte edilen RNA'nın gerçekliğini sağlamak için, 100 ng/mL'den daha yüksek bir nano damlacık tespit konsantrasyonu kullanılması önerilir. Konsantrasyondaki azalmanın potansiyel nedeni, toplanan hücrelerin büyük bir kısmının ölmüş veya ölüm sürecinde olması gibi kültürlenmiş hücrelerin sağlıksız doğası olabilir. Gerçek RNA konsantrasyonunu elde etmek için, hücre kültürü sırasında zayıf büyümeye yol açabilecek durumu çözmek gerekir. Bu endişenin arkasındaki alternatif bir neden, muhtemelen süpernatan imhası sırasında kasıtsız hücre kaybı nedeniyle, RNA ekstraksiyonu sırasında elde edilen aşırı düşük nihai hücre sayısı olabilir. Tek adımlı RNA ekstraksiyon kitleri gibi gelişmiş RNA ekstraksiyon tekniklerinin kullanılması avantajlı olabilir. Nanodrop ile ölçülen ideal OD260/OD280 oranı 1.9-2.1 aralığında olmalıdır. Aşırı düşük bir oran durumunda, protein kontaminasyonu bir olasılık haline gelir. RNaz içermeyen tampon yıkama sıklığının arttırılması bu sorunun hafifletilmesine yardımcı olabilir. Tersine, alışılmadık derecede düşük bir oran, potansiyel RNA bozulması anlamına gelir. Bu sorunu önlemek için, RNaz içermeyen su kullanılması ve RNase dekontaminasyonu amacıyla 1,5 mL'lik tüplerin kullanılması önerilir.

Sonuç olarak, mevcut protokol, in vitro olarak patojenik Th17 hücrelerine farklılaşmak için saf CD4 + T hücrelerini doğrudan indüklemek için yeni hücre kültürü ortamının kullanımını açıklamaktadır. Doğrudan ayırma ile karşılaştırıldığında, bu yöntemin daha doğrudan, ucuz ve daha verimli olduğuna şüphe yoktur. Ortamın konfigürasyonu da çok basittir, böylece yapılandırılmış Th17 hücreleri sonraki deneyler için daha sezgisel olarak kullanılabilir ve birçok hastalığın incelenmesi için çok iyi bir hücre modeli sağlar.

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalenin yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (No.2022YFC2304604), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No.81971812), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No.82272235), Jiangsu Eyaleti Sağlık Komisyonu Bilim Vakfı (No. ZDB2020009), Jiangsu Eyaleti Anahtar araştırma, geliştirme Programı (Sosyal Kalkınma) Özel Projesi (No.BE2021734), Bilim ve Teknoloji Bakanlığı Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (No.2020YFC083700), Jiangsu İl Kritik Bakım Tıbbı Anahtar Laboratuvarı (BM2020004), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81930058), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82171717), Merkez Üniversiteler Temel Araştırma Fonları (2242022K4007) anahtar projesi, ve Jiangsu İl Doğa Bilimleri Vakfı Genel Projesi (BK20211170).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antikorlar< / güçlü >
sıçan anti-fare CD62L, BV650, klon MEL-14, 1:200 seyreltmeBDCat # 564108; RRID: AB_2738597
Sıçan monoklonal anti-CD4, FITC, klon RM4-5, 1:200 seyreltmeBioLegendCat # 100509; RRID: AB_312712
Sıçan monoklonal anti-IL-17A, PE, klon TC11-18H10.1, 1:200 seyreltmeBioLegendCat # 506903; RRID: AB_ 315463
Sıçan monoklonal anti fare/insan CD44, APC, klon IM&, 1:200 seyreltmeBioLegendCat#103012; RRID: AB_312963
Sıçan monoklonal anti-ROR ve gama; T, APC, klon B2D, 1:200 seyreltmeInvitrogen Cat# 17-6981-80; RRID: AB_2573253
Sıçan monoklonal FOXP3 antikoru, PE, klon FJK-16'lar, 1:200 seyreltmeInvitrogenCat # 12-5773-82; RRID: AB_465936
< güçlü > Kimyasallar, peptitler ve rekombinant proteinler< / güçlü>
Anti-Fare CD3 SAFIRE saflaştırılmışbiyogemlerCat#05112-25
Anti-Fare CD28 SAFIRE saflaştırılmışbiyogemlerCat#10312-25
Anti-Fare IFN gamabiyogemleriCat#80822-25
Anti-Fare IL-4biyogemlerKedi # 81112-25
EtanolXilong bilimselKedi # 64-17-5
Fetal sığır serumuGibcoCat # 10437-028
FcR Engelleme reaktifiMiltenyi BiotecCat # 130-092-575
GlutaMAX takviyesigibcoCat # 35050079
Fare rIL-1 betaÇin Biyolojik Kedi# 50101-MNAE
Fare rIL-6Çin Biyolojik Kedi# 50136-MNAE
Fare rIL-23Çin BiyolojikKedi # CT028-M08H
Fare TGF beta 1Çin Biyolojik Kedi# 50698-M08H
PBSProcellKedi #
Rekombinant Murin IL-2peprotechCat # 212-12
RPMI 1640 L-glutamin ileGibcoCat # 11875-119
Penisilin-streptomisin çözeltisiGibcoCat # 15070063
β-merkaptoetanolSigma-AldrichCat # M6250-100ML
güçlü > kritik ticari tahliller< / güçlü >
Hayvan Organı Lenfosit Ayırma Çözeltisi KitiTbdscienceCat # TBD0018SOPHayvan dalak dokusu lenfosit ayırma sıvısı, doku örneği seyreltici (kedi no. 2010C1119), numune temizleme solüsyonu (cat no. 2010X1118), numune yıkama solüsyonu (cat no. TBTDM-W), doku homojenat yıkama sıvısı (F2013TBD)
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Yüksek ROX Önceden Karıştırılmış)VazymeCat#Q341-02https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.
Fiksasyon / geçirgenlik KonsantresiinvitrojenCat # 00-5123-43
Fiksasyon / Geçirgenlik SeyrelticiinvitrojenCat # 00-5223-56
Sabitlenebilir Canlılık Boyası EF506invitrogenCat # 65-0866
HiScript II Q RT SuperMix qPCR için (+gDNA sileceği)VazymeCat # R223-01https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.
Lökosit Aktivasyon KokteyliBDKedi # 550583
Fare IL-17A (Interlökin 17A) ELISA KitiElabscience®Kedi # E-EL-M0047
Naï ve CD4+ T hücreleri izolasyon kiti, fareSTEMCELLCat # 19765EasySep kiti, fare CD4+ T hücre izolasyon kokteyli [kedi no. 19852C.1], fare hafızası T hücresi tükenme kokteyli [kedi no. 18766C], streptavidin RapidSphered 50001 [kedi no. 50001], normal sıçan serumu [kedi no. 13551]); sadece sıçan serumunu -20 ° C'de saklayın; C; 2-8 ° C'de saklanacak diğer bileşenler.
Geçirgenlik TamponuinvitrojenKedi # 00-8333-56
SPARKeasy Hücre RNA KitiSparkjadeCat # AC0205-Bhttps://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
Deneysel modeller: Organizmalar / suşlar < / güçlü >
Fare: C57BL / 6GempharmatechCat # 000013
Oligonükleotidler
Fare Il17a Problu TaqMan primerleriribobioNA
Mouse Il17f TaqMan primerleri probluribobioNA
Mouse Il23r TaqMan primerleri probluribobioNA
Mouse Rora TaqMan problu primerlerribobioNA
β-aktin TaqMan primerleri prob ile ribobioNA
strong>Yazılım ve algoritmalar
Cytek AuroraCytekhttps://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1Ağaç Yıldızıhttps://www.flowjo.com
GraphPad prizma 9GraphPad Yazılımhttps://www.graphpad-prism.cn
< güçlü>Diğer
1 mL şırıngaNazikçeNA
1.5 mL Santrifüj tüpleriEppendorfCat # MCT-150-C
5 mL Yuvarlak tabanlı tüplerCorningCat # 352235
15 mL Santrifüj tüpleriNESTCat # 601052
48 Kuyulu doku kültürü plakası (düzleştirilmiş alt)CorningCat#3548
50 mL Santrifüj tüpleriNESTCat#602052
70 & mikro; m Hücre süzgeciBiosharpCat # BS-70-XBS
96 kuyulu Süpürgesiz qPCR PlakalarıVIOX scientificCat # V4801-M
100 mm Petri kabıCorningCat # 430167
SantrifüjEppendorf5425R
Hücre kültürü CO2 inkübatörüThermo FisherHEPA Class100
Cytek AuroraCytekNA
diseksiyon makasıRWDS12003-09
HemositometreAlphaCellCat # J633201
NanoDrop 2000 SpektrofotometreThermo FisherND-2000
Gerçek Zamanlı PCR SistemiRocheLightCycler96
Cerrahi cımbızRWDF12005-10
Termal döngüleyiciBio-RadC1000 Dokunmatik
PB180327 <<

Kaynaklar

  1. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  2. Bhaumik, S., Basu, R. Cellular and molecular dynamics of Th17 differentiation and its developmental plasticity in the intestinal immune response. Front Immunol. 8, 254(2017).
  3. Bettelli, E., Korn, T., Oukka, M., Kuchroo, V. K. Induction and effector functions of T(H)17 cells. Nature. 453 (7198), 1051-1057 (2008).
  4. Korn, T., et al. IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells. Nature. 448 (7152), 484-487 (2007).
  5. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).
  6. Yang, X. O., et al. T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and ROR gamma. Immunity. 28 (1), 29-39 (2008).
  7. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
  8. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  9. McGeachy, M. J., et al. The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo. Nat Immunol. 10 (3), 314-324 (2009).
  10. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323 (2021).
  11. Ramesh, R., et al. Pro-inflammatory human Th17 cells selectively express P-glycoprotein and are refractory to glucocorticoids. J Exp Med. 211 (1), 89-104 (2014).
  12. Basdeo, S. A., et al. Ex-Th17 (nonclassical Th1) cells are functionally distinct from classical Th1 and Th17 cells and are not constrained by regulatory T cells. J Immunol. 198 (6), 2249-2259 (2017).
  13. Cua, D. J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421 (6924), 744-748 (2003).
  14. Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182 (10), 5904-5908 (2009).
  15. Jäger, A., Dardalhon, V., Sobel, R. A., Bettelli, E., Kuchroo, V. K. Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes. J Immunol. 183 (11), 7169-7177 (2009).
  16. Lee, Y., Collins, M., Kuchroo, V. K. Unexpected targets and triggers of autoimmunity. J Clin Immunol. 34, Suppl 1 (0 1) S56-S60 (2014).
  17. Chang, D., et al. The conserved non-coding aequences CNS6 and CNS9 control cytokine-induced Rorc transcription during T helper 17 cell differentiation. Immunity. 53 (3), 614-626 (2020).
  18. Bunte, K., Beikler, T. Th17 cells and the IL-23/IL-17 axis in the pathogenesis of periodontitis and immune-mediated inflammatory diseases. Int J Mol Sci. 20 (14), 3394(2019).
  19. Zhao, Y., Liu, Z., Qin, L., Wang, T., Bai, O. Insights into the mechanisms of Th17 differentiation and the Yin-Yang of Th17 cells in human diseases. Mol Immunol. 134, 109-117 (2021).
  20. Berghmans, N., et al. Interferon-γ orchestrates the number and function of Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Interferon Cytokine Res. 31 (7), 575-587 (2011).
  21. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic Th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  22. Du, L., et al. Growth hormone releasing hormone signaling promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation. Nat Commun. 14 (1), 3298(2023).
  23. Ernst, D. N., Weigle, W. O., Noonan, D. J., McQuitty, D. N., Hobbs, M. V. The age-associated increase in IFN-gamma synthesis by mouse CD8+ T cells correlates with shifts in the frequencies of cell subsets defined by membrane CD44, CD45RB, 3G11, and MEL-14 expression. J Immunol. 151 (2), 575-587 (1993).
  24. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  25. El-Hindi, K., et al. T-cell-specific CerS4 depletion prolonged inflammation and enhanced tumor burden in the AOM/DSS-induced CAC model. Int J Mol Sci. 23 (3), 1866(2022).
  26. Cooney, L. A., Towery, K., Endres, J., Fox, D. A. Sensitivity and resistance to regulation by IL-4 during Th17 maturation. J Immunol. 187 (9), 4440-4450 (2011).
  27. Zhu, X., et al. A novel interleukin-2-based fusion molecule, HCW9302, differentially promotes regulatory T cell expansion to treat atherosclerosis in mice. Front Immunol. 14, 1114802(2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Th17 H cre DiferansiyasyonuFare Splenosit zolasyonuManyetik Boncukla Ay rmaAk SitometrisiH cre K lt r BesiyeriOtoimm n Hastal k ModelleriLenfosit Ay r m

İlgili makaleler