Yöntem makalesi

Longa Orta Serebral Arter Oklüzyon Yönteminin Tam Reperfüzyon için Optimizasyonu

DOI:

10.3791/66720

⸱

22 Kasım 2024

 ,  , 
1Department of Histology and Embryology, University of Zagreb School of Medicine, 2Croatian institute for brain research, University of Zagreb School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, araştırmacıların modifiye Longa eksternal karotis arter yöntemini kullanarak fareler üzerinde orta serebral arter oklüzyon prosedürünü gerçekleştirmeleri için adım adım bir kılavuz sunar. Bu makalede sunulan modifikasyonlar orta serebral arter oklüzyonunun doğruluğunu arttırmayı ve tam reperfüzyonu sağlamayı amaçlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orta serebral arter oklüzyon modeli, iskemik inmeyi incelemek için birincil hayvan modeli olarak hizmet eder. Otuz yılı aşkın bir süredir araştırmalarda kullanılmasına rağmen, standardizasyonu yetersiz kalmaktadır. Ağırlıklı olarak sıçanlar ve fareler üzerinde gerçekleştirilen prosedür, farelerin daha küçük ve daha kırılgan doğası nedeniyle zorluklar doğurmaktadır. Koizumi ortak karotis arter yönteminden farklı olarak, Longa eksternal karotis arter, iskemi sonrası tam reperfüzyon sağlayan tek intraluminal filament inme modelidir. Bu husus, reperfüzyon fenomenini araştıran çalışmalar için kritik öneme sahiptir. Bu makalede gösterilen cerrahi modifikasyonlar, iskemik faz boyunca ve reperfüzyon başlangıcından sonra ana karotis arterden sürekli kan akışını sağlar. Bu modifikasyonların amacı, iskemi döneminde orta serebral arterin proksimalindeki dallarda perfüzyonu kesintisiz tutarak orta serebral arteri seçici olarak tıkamaktır. Ayrıca, reperfüzyonun başlangıcı anidir ve hassas bir şekilde kontrol edilebilir, böylece insan tıbbında endovasküler trombektomi daha doğru bir şekilde modellenir. Bu kapsamlı video makalesini sunmadaki amacımız, yeni cerrahların eğitimini kolaylaştırmak ve bilim camiasında cerrahi prosedürlerin standardizasyonunu teşvik etmektir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnme, ikinci önde gelen ölüm nedeni ve üçüncü önde gelen ölüm ve sakatlık nedeni olarak yer almaktadır1. Nedeni olarak, inme iskemik veya hemorajik olabilir, iskemik inme klinik uygulamada önemli ölçüde daha yaygındır. İskemik inme, beyin dokusuna kan sağlayan bir arterdeki tıkanıklıktan kaynaklanır ve iskemi, hücre ölümü ve iltihaplanmaya yol açar. Tromboliz ve mekanik trombektomi gibi reperfüzyon tedavilerinin ortaya çıkmasından bu yana, inme tedavisinde büyük ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, tüm reperfüzyon tedavileri, yaygın olarak reperfüzyon hasarı2 olarak adlandırılan duruma neden olarak hastanın durumunu daha da kötüleştirme riski taşır. Reperfüzyon hasarının kesin mekanizması belirsizliğini korumaktadır ve olası nedenleri ve önleyici tedbirleri belirlemek klinik öncesi çalışmalara bağlıdır. Bu amaçla, iskemik inmeyi takip eden reperfüzyon hasarı için uygun bir hayvan modeli geliştirmek çok önemlidir.

Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO), iskemik inmeyi incelemek için en sık kullanılan hayvan modelidir. Ağırlıklı olarak kemirgenlerde yapılır ve şu ana kadar bilimsel literatürde açıklanan birçok farklı varyanta sahiptir 3,4. Ortak karotis arter (CCA) ve eksternal karotis arter (ECA) varyantları olarak bilinen iki ana tip, Koizumi ve Longa, filament yerleştirilmesi için arteriyotomi bölgesine göre teknik olarak farklılık gösterir 5,6. Son makalemizde, vasküler perfüzyonun in vivo izlenmesiyle, yalnızca Longa yönteminin gerçekten bir beyin iskemisi/reperfüzyon modeli7 olarak kabul edilebileceğini gösterdik. Prosedür, filamentin ECA'ya yerleştirilmesini, ICA boyunca ilerletilmesini ve beyin dokusu iskemisini indüklemek için orta serebral arterin (MCA) dallanma noktasında sabitlenmesini içerir. Önceden belirlenmiş bir iskemi dönemini takiben, filamentin geri çekilmesi, geçici beyin iskemisini simüle ederek reperfüzyona izin verir. İnme başlangıcından sonra, araştırmada kullanılan birincil sonuç değişkeni, çoğunlukla ex vivo histoloji veya in vivo beyin taramaları kullanılarak ölçülebilen enfarktüslü lezyonun hacmidir. MCAO modellerindeki zorluklar, varyantlar arası, operatörler arası ve denekler arası varyanslara atfedilen düşük tekrarlanabilirlik etrafında dönmektedir ve ikincisi klinik öncesi inme araştırmalarında önemli bir sınırlama oluşturmaktadır4.

Ayrıca, kemirgenlerde MCAO'yu takip eden enfarktüslü bölgeler, kemirgen beyninin boyutuna göre çok büyüktür. Ek olarak, beynin hipokampal arka bölgeleri, bu bölgeler esas olarak MCA8'den değil, posterior serebral arterden (PCA) gelen kan akışına bağlı olmasına rağmen, sıklıkla enfarktüs hacmine alınır. Literatürde anlatılan hem Koizumi hem de Longa yöntemlerinde olduğu gibi, farelerde Willis çemberinin tam olmayan açıklığı nedeniyle CCA iskemi döneminde bağlı tutulur ve bu da amaçlanandan çok daha geniş bir bölgede iskemi indüksiyonuna yol açar 5,6,9. İskemi döneminden sonra CCA'nın tekrar açıldığı veya onarıldığı yöntemlerde bile, olağan 30-60 dakikalık iskemi MCA olmayan bölgelerde geri dönüşümsüz doku hasarı ile sonuçlanır10. Ayrıca, beklentilerin aksine, önceki araştırmalar, bir filamentin silikon kaplamasının uzunluğunun lezyon boyutu11 üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermiştir. Bununla birlikte, filamentin silikon kaplama uzunluğunun seçimi, oklüzyon periyodu sırasında yalnızca bağlı CCA'ya sahip modellerde ele alındı.

Bu yöntemin amacı, iskemi döneminde CCA'dan kesintisiz kan akışını sağlamak için farelerde Longa MCAO yöntemini değiştirmek, böylece MCAO'nun seçiciliğini arttırmak ve işlemden sonra enfarktüslü bölgenin tam reperfüzyonunu sağlamaktı. Bu modifikasyonlar, mortalite oranını düşürerek ve denekler arası varyansı azaltarak farelerde iskemi-reperfüzyon hasarını araştıran uzunlamasına çalışmalara büyük fayda sağlayacaktır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan işleme ve prosedürleri, Zagreb Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Lisans Komitesi ve Hırvatistan Cumhuriyeti Tarım Bakanlığı'nın bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması için Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Deneysel prosedürler, Avrupa Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi (Direktif 2010/63/EU) ile uyumlu olan Hırvatistan Hayvanları Koruma Yasası (NN 102/17, 32/19), Hayvanları Koruma Yasası Değişiklikleri (NN 37/13) ve Bilimsel Amaçlarla Kullanılan Hayvanların Korunmasına İlişkin Kılavuz İlkelerine (NN 55/13) göre gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvanın ve cerrahi alanın hazırlanması

  1. Hayvanı bir nakavt kutusuna yerleştirin ve bir oksijen / nitrojen karışımında (1: 2 oranında) %5 hacimde izofluran kullanarak anestezi uygulayın.
  2. Hayvanın bilinç durumunu ve solunum frekansını görsel olarak inceledikten sonra, onu bir laboratuvar terazisine getirin ve tartın.
  3. Uygun anestezi derinliğini sağlamak için alt ekstremitenin interdigital derisini sıkıştırarak refleksi kontrol edin.
  4. Hayvanı ısıtılmış ameliyat masasına yerleştirin ve burnunu anestezi maskesine getirin. İlk ameliyat masası sıcaklığını 36 °C'ye ayarlayın ve hayvanın vücut sıcaklığını 37 °C'de tutacak şekilde ayarlayın (sonraki adımlarda tanıtılan bir rektal prob ile ölçülür). Diğer tüm adımlar boyunca, hayvanın solunum hızını 100 nefes / dk'da tutmak için izofluranın hacim fraksiyonunu ayarlayın.
    NOT: Hayvanla doğrudan temas eden tüm yüzeyler ve malzemeler işlemden önce iyice dezenfekte edilmelidir.
  5. Dehidrasyondan ve izofluran gazından korumak için hayvanın gözlerine göz merhemi sürün.
  6. Hayvanı sırt üstü çevirin ve altına cerrahi banttan yapılmış küçük bir yastık koyarak boynunu uzatın.
  7. Cerrahi bant kullanarak hayvanın uzuvlarını yerine sabitleyin. Yanlışlıkla omuz eklemi çıkığına neden olmamak için ön ayakları çok fazla uzatmamaya özen gösterin.
  8. Rektal probu petrol beyazı jöle kullanarak yağlayın ve sürekli vücut ısısı ölçümü için rektuma yerleştirin. Cerrahi bant kullanarak probu kuyrukla birlikte yerine sabitleyin.
  9. İşlem sırasında hayvanı iyi nemlendirmek ve analjezi altında tutmak için intraperitoneal olarak ameliyat öncesi salin ve buprenorfin enjeksiyonu (0.5 mg / kg) uygulayın.
  10. Kablosuz bir hayvan kesme makinesi kullanarak hayvanın boyun bölgesindeki kürkünü tıraş edin. Cerrahi bant parçaları kullanarak tüm traşlı kürkleri toplayın. Ek olarak, bölgeyi kürkten tamamen arındırmak için bir usturayla tıraş edin.
  11. Ölçülen hayvanın ağırlığına ve/veya yaşına göre bir MCAO filamenti seçin. Kabından çıkarın ve görünür bir yerde bir Petri kabına koyun. Filamentin silikon kısmını temiz ve tozsuz tutmak için üzerine bir damla tuzlu su sürün.
    NOT: Filamentin silikon kaplamasının kalınlığı, 12-16 haftalık bir fare söz konusu olduğunda üreticinin resmi tavsiyelerine göre seçilmelidir. Ek olarak, silikon kaplamanın uzunluğu, tıkanacak sulama alanının boyutuna bağlı olarak önceden dikkatlice planlanmalıdır (bkz. Tartışma).
  12. Ameliyat masasının üzerine temiz bir cerrahi örtü yerleştirin.
  13. Hayvanın traşlı derisine bir damla Betadine uygulayın. Dezenfektanı içten dışa dairesel bir şekilde cilde sürmek için pamuklu çubuk kullanın. Daha sonra, etanole batırılmış bir pamuklu çubukla aynı şeyi yapın. Her tekrarlama için yeni bir çift steril pamuklu çubukla bu adımı 3 kez tekrarlayın.
  14. Lokal yara analjezisi için gelecekteki insizyon bölgesinin dezenfekte edilmiş bölgesine bir miktar lidokain jeli uygulayın.

2. İskemi indüksiyon cerrahisi

  1. Bir neşter kullanarak dezenfekte edilmiş cilt üzerinde ilk kesi yapın. Cerrahi yaranın iyileşmesini kolaylaştırmak için cilt kesi vuruşlarının sayısını minimumda tutun.
    NOT: Tüm aletler daha önce sterilize edilmiş olmalıdır. Okuyucu, steril veya cerrahi eldiven kullanımı için kurumsal yönergelerine başvurmalıdır.
  2. Tip 7 ve 5 forseps kullanarak yüzeysel fasyayı yırtın ve tükürük bezlerini alttaki dokudan ayırın.
    NOT: Her zaman kapalı forsepslerle ilerleyin ve dokuyu uzaklaştırmak için hareket ederken uzatın. Bu sayede anatomik boşluklar minimal doku travması ile geçilebilmektedir.
  3. Tükürük bezlerinin sonraki adımlara müdahale etmediğinden emin olurken tel toplayıcıyı başlangıç konumuna yerleştirin.
  4. Tip 7 forseps kullanarak derin boyun fasyasını çıkarın ve ekartörü yeniden konumlandırmak için sternokleidomastoid kasları karotis bölgesinden ayırın.
  5. Karotis bölgesine erişim sağlamak için ekartörü sternokleidomastoid kasların altına ulaşacak şekilde yeniden konumlandırın.
  6. Karotis bölgesine net bir görsel ve daha kolay bir yaklaşım sağlamak için omohyoid kasını rezeke edin.
  7. Karotis arteri ve dallarını, karotis fasyasında bir arada tutulan karotis ven ve vagus sinirinden kurtarın.
    NOT: Vagus sinirine zarar vermemek veya önemli bir kanamaya neden olmamak için bu fasyanın dikkatlice çıkarılması gerekir.
    1. Karotis fasyasını karotis triadının yan tarafında sıkıştırın ve arteri, siniri, damarı ve çevresindeki tüm kan damarı dallarını görsel olarak tanımlamak için hafifçe yanal olarak çekin.
    2. Fasyayı yanlamasına çekerken, Tip 5 forseps kullanarak, CCA'yı komşu sinir ve toplardamardan dallanma noktasına ve CCA'nın üzerinden geçen üst tiroid toplardamarına kadar ayırın.
    3. CCA'nın alt kısmını, kavisli Tip 7 forseps kullanarak alttaki doku ve fasyadan tamamen ayırın ve sonraki adımlarda klemplemeye hazır olduğundan emin olun.
    4. CCA dallanma noktasının üzerindeki bölgede kraniyal olarak ilerleyerek, iki forseps kullanarak karotis fasyasını yırtın.
    5. Benzer şekilde, ECA ve iç karotis arteri (ICA) sırasıyla fasya ve çevresindeki dokudan hassas bir şekilde ayırmak için karotis fasyasının gevşek ucunu medial ve lateral olarak çekin.
    6. ECA ve ICA'yı kavisli Tip 7 forseps kullanarak alttaki dokudan serbest bırakın.
  8. CCA, ilgili iki dalı ile dikkatlice hazırlanırken, ECA'yı kavisli tip 7 forseps kullanarak kaldırın ve N0 tipi kendiliğinden kapanan forseps ile sıkıştırın.
  9. N0 tipi kendiliğinden kapanan forsepsleri ameliyat masasına dikkatlice indirin.
    NOT: ECA'nın sıkıştırma noktasını yeniden konumlandırmak için bazen tutamağı hafifçe serbest bırakmak ve ECA dallanma noktasını kaudal olarak itmek gerekir. Bu noktada, ECA kenetlemesi ile dallanma noktası arasında 1 mm'den fazla ECA kalmasını sağlamak önemlidir.
  10. ECA, N0 tipi cımbızla kenetlenip güvenli bir şekilde tutulduğunda, ECA'nın arkasına iki örgülü ipek iplik yerleştirin.
    NOT: Kraniyal iplik, ligasyon düğümünü oluşturacaktır ve sıkıştırma bölgesinden kraniyal olarak yerleştirilmelidir.
  11. Kalıcı olduğu için kraniyal ipliği tamamen bağlayın ve fazla ipliği makas kullanarak kesin.
  12. Kuyruk ipliğini gevşek bir sabitleme düğümüne bağlayın.
    NOT: MCAO filamentinin geçmesi için ECA dallanma noktasına yakın konulmalı ve gevşek tutulmalıdır.
  13. Vasküler mikroklipler kullanarak, arteriyotomiden sonra kanamayı önlemek için CCA ve ICA'yı kapatın.
    NOT: CCA'ya uygulanan mikroklipsin yeterince güçlü bir tutuşa sahip olduğundan emin olmak çok önemlidir, çünkü CCA titreşimli yüksek verimli bir arterdir ve bunun yapılmaması, sonraki adımlarda hayvanın bol miktarda kanamasına ve ölümüne neden olabilir.
  14. Mikro yaylı makas kullanarak, ECA sıkıştırma bölgesinin hemen altında küçük bir arteriyotomi yapın.
    NOT: Arteriyotominin, filamentin silikon kısmının içeri girmesi için yeterince büyük olması, ancak N0 tipi forsepslerin tuttuğu gerilimi tehlikeye atmamak için ECA çevresinin yarısından daha büyük olmaması gerekir.
  15. ECA'nınkiyle eşleşen bir açıyla, filamenti CCA'ya proksimal yönde arteriyotomi bölgesine yerleştirin, ECA'nın dallanma bölgesindeki gevşek sabitleme düğümünden geçin ve filament ile CCA'nın lümenine yapışın.
  16. Filamentin silikon kısmının etrafındaki sabitleme düğümünü sıkın.
    NOT: Filament son manevranın yarısında ECA'dan kayma eğiliminde olduğundan ve bu noktada tekrar yerine koymak çok zor olduğundan, bu noktada çok dikkatli olunması gerekir.
  17. ICA mikro klipsini dikkatlice açın ve çıkarın.
  18. Filament kısmen ECA'ya yerleştirilmiş ve sabitlenmiş durumdayken, tam bir arteriyotomi yapın, böylece ECA kütüğünü içindeki MCAO filamenti ile gevşetin. Bu noktada, N0 tipi kendiliğinden kapanan forsepsleri serbest bırakın ve çıkarın.
  19. Bir set tip 5 cımbız ile ECA kütüğünü sıkıca sıkıştırın ve hafifçe kaldırın. Kısmen yerleştirilmiş filamenti başka bir forseps ile tutarken, filamentin iç ucunu ICA'ya doğru yönlendirmek için ECA kütüğünü indirin ve hafifçe çekin. Filamentin silikon kısmını asla sıkıştırmayın.
  20. Forseps filamenti tutarak, filamenti ICA'dan İrade çemberine doğru yavaşça ilerletin.
    NOT: ICA'nın ilk dallanma noktası, aynı zamanda operatörün istenen MCA dallanma noktasını kaçırabileceği tek noktadır. Bu nedenle, filamenti MCA dallanma noktasına yönlendirmek için hafif bir yanal ilerleme açısı gereklidir. Hafif yanal ilerleme açısıyla, filament pterygopalatin arterden (PPA) uzağa doğru kıvrılır ve ilerleyen ucun Willis çemberine girme olasılığını artırır (Şekil 1).

figure-protocol-1
Şekil 1: Orta serebral arter oklüzyonu filamentinin pterygopalatin arter dallanma noktasını geçerek ilerlemesinin bir çizimi. Uygun filament ilerlemesi (solda), MCAO filamentinin ICA'nın yan duvarına dayanacak ve PPA dallanma noktasından uzağa doğru kıvrılacak şekilde yönlendirilmesiyle elde edilir. Bunun yapılmaması (sağda), filamentin PPA'ya girmesine ve darbeye neden olmamasına neden olabilir. İkinci durumda, filament gerektiği kadar ilerleyemeyecektir ve cerrah, ucu ICA dallanma noktasında görünür hale gelene kadar filamenti geri çekmeli ve filamenti tekrar ilerletmeye başlamalıdır. Yeşil renkli arterler, farelerde çoğunlukla patentsiz olan posterior komünikan arterleri (PcomA) temsil eder. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Dirençte ani bir artış hissedilene kadar MCAO filamentini Willis çemberi boyunca yavaşça ilerletin.
    NOT: Bu noktada, filamentin kalan uzunluğunu gözlemlemek önemlidir. Filament, yetişkin bir farede ICA dallanma noktasından en az 7 mm uzakta zahmetsizce ilerlemelidir.
  2. İskemi sırasında filamentin yer değiştirmediğinden emin olmak için sabitleme düğümünü sıkın.
  3. CCA klibini çıkarın ve saati not edin.
    NOT: Bu, iskemi başlangıcının başlangıcını işaret eder.
  4. MCAO filamentinin gevşek ucunu, karotis üçgeni ile ipsilateral sternokleidomastoid kas arasındaki oluğa paketleyin, böylece cerrahi yaradan dışarı çıkmaz.
  5. Tel ekartörü çıkarın ve cerrahi yaranın kenarlarını birbirine yaklaştırın. Dokunun anatomik konumuna dönmesi için ameliyat bölgesinin birkaç saniye oturmasına izin verin.
  6. İskemi döneminden sonra yaranın daha hızlı yeniden açılmasını kolaylaştırmak için cerrahi yarayı bant yara kapakları kullanarak kapatın.
    NOT: Bir araştırmacı iskemi döneminde hayvanın uyanmasına izin vermek isterse, yaranın zamansız bir şekilde yeniden açılmasını önlemek için yaranın dikilmesi önerilir.

3. İskemi dönemi

  1. MRI veya başka bir kantitatif perfüzyon ölçüm yöntemi kullanarak ameliyatın başarısını doğrulayın.
    NOT: MRG taraması yapılması durumunda, perfüzyon ağırlıklı görüntüleme (PWI) geniş MCA bölgesinde kritik iskemi göstermeli ve difüzyon ağırlıklı görüntüleme (DWI) hücre ödemine bağlı azalmış görünür difüzyon katsayısı (ADC) bölgesini özetlemelidir.
  2. İskemi dönemi sona erene kadar hayvanı temiz bir kafese koyun.

4. Filament çekme ameliyatı

  1. Ayrılan iskemi süresi sona ermeden yaklaşık 5 dakika önce, hayvanı yerleştirin ve tekrar ameliyat masasına sabitleyin.
  2. Bant yara kapaklarını çıkarın ve cerrahi yarayı tel ekartör ile tekrar açın.
  3. MCAO filamentinin gevşek ucunu çevreleyen dokudan ve sabitleyici düğüm ipliğinin uçlarından kurtarın.
  4. N0 tipi forsepslerle, üzerine gerginlik koymak için ECA kütüğünün kenarını ventral olarak sıkıştırın ve çekin. İlk cerrahi prosedüre benzer şekilde kıstırma forsepslerini dikkatlice aşağı indirin.
    NOT: Operatör, düğümün çözülememesine neden olacağından, sabitleme düğümünü sıkıştırmaktan kaçınmalıdır.
  5. CCA'yı bir mikrovasküler klipsle tekrar sıkıştırın.
  6. Tip 5 forseps kullanarak, filamentin çekilmesini sağlamak için sabitleme düğümünü gevşetin.
    NOT: Düğümü gevşetmeye başlamanın en iyi yolu, tek tek parçalara ayrılana kadar sıkıştırmaya devam etmek ve ardından iplik uçlarını düğüme doğru itmektir.
  7. Silikon parça ECA kütüğünden dışarı çıkmaya başlayana kadar MCAO filamentini yavaşça geri çekin. Filamentin tamamen çekilmesine hazırlanmak için sabitleme düğümünü hafifçe sıkın.
  8. Filamentin silikon ucuna yaklaştığında, sabitleme düğümünü MCAO filamentini dışarı itecek ve ECA kütüğünü tek bir manevrayla kapatacak şekilde sıkın. Filament dışarı çıktıktan sonra düğümü tamamen sıkın.
  9. Sıkıştırma forsepslerini CCA klipsi ile birlikte açın ve çıkarın.
    NOT: Bu, iskemi döneminin sonunu ve reperfüzyon sürecinin başlangıcını işaret eder.
  10. Tel ekartörü çıkarın ve cerrahi yaranın kenarlarını tekrar bir araya getirin.
  11. Ameliyat yarasını periferden başlayarak aşağıya doğru dikin, altta yatan herhangi bir doku görünmeden yarayı tamamen kapatın.
    NOT: Gerekli dikiş sayısı cerrahi yaranın boyutuna bağlıdır.
  12. Ameliyat bölgesini alkollü mendiller kullanarak temizleyin ve dezenfekte edin.

5. Ameliyat sonrası bakım

  1. Hayvanı temiz bir kafese koyun ve anesteziden kendiliğinden uyanmasına izin verin.
  2. Daha kolay ulaşılması için peletlenmiş yiyecekleri kafesin altına yerleştirin. İçme suyu kullanarak gıda peletlerini yumuşatın. Küçük bir Petri kabını içme suyuyla doldurun ve onu da kafesin tabanına getirin.
  3. Sonraki 48 saat içinde, intraperitoneal olarak her 24 saatte bir buprenorfin (0.5 mg / kg) ile 0.25 mL salin enjekte edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İntraoperatif veya postoperatif MRI taramaları, özellikle perfüzyon ağırlıklı görüntüleme (PWI) ve/veya difüzyon ağırlıklı görüntüleme (DWI) taramaları (Şekil 2) başarılı bir prosedürün kesin kanıtını sunabilir. İntraoperatif PWI, ipsilateral MCA bölgesinde kritik iskemiyi gösterir ve böylece filament yerleşiminin tam oklüzyon ile sonuçlandığını doğrular. Başarılı bir prosedürün postoperatif PWI'si, lezyon çekirdeğinde hiperperfüzyonun yanı sıra MCA bölgesi sınırlarında bir dereceye kadar reperfüzyon gösterir. İntraoperatif DAG lezyonları, intraoperatif PWI'de gözlenen iskemik bölgelere karşılık gelir. Postoperatif DAG lezyonları, lezyonun görünür difüzyon katsayısında önemli bir azalma ile birlikte iskemik lezyonun çekirdeğine doğru küçülme gösterir ve bu da onu intraoperatif DAG lezyonlarından ve çevresindeki reperfüze beyin dokusundan daha koyu hale getirir. Hem intraoperatif hem de postoperatif standart T2 anatomik taramaları, filament kaynaklı kanama meydana gelmedikçe tipik olarak kayda değer bir şey göstermez

(Şekil 3). Bu gibi durumlarda, PWI ve DWI taramaları eksik iskemi ortaya çıkarır veya hiç iskemi göstermez.

Reperfüzyon işlemi sonraki 48 saat içinde takip eder ve işlemden sonraki ikinci gün yapılan MRI taramalarında gerçekleştiği doğrulanır (Şekil 2, 2. günde CBF). PWI taramaları, lezyon çekirdeğinde hafif hiperperfüzyon ile lezyon bölgesinde tam reperfüzyon gösterir. DWI taramaları, beyin ödemi oluşumuna bağlı olarak düşük görünür difüzyon katsayılarının çoklu bölgelerini gösterir. T2 anatomik taramalar, hipokampus gibi MCA olmayan bölgelerin tutulumu olmaksızın, MCA bölgelerini saran ödemin hiperintens bölgelerini gösterir.

Uyandıktan sonra, hayvan akut inmenin açık belirtilerini gösterir. Yaygın davranışsal semptomlar arasında, lezyonun yan tarafında artan kas tonusu bulunur ve bu da hayvanın gövdesini bu yöne doğru esnetmesine neden olur. İpsilateral yönde daire çizmek ve dönmek de akut inmenin açık belirtileridir. Yürüyüş ataksisi sıklıkla hipokampusun iskemik lezyon hacmine katılımını önerir. Bununla birlikte, bu semptom, izofluran anestezi yan etkileri nedeniyle hiperakut fazda özgüllükten yoksun olabilir. İlerleyen günlerde, hayvan ipsilateral olarak ön bacak fleksiyonu geliştirmeli ve bıyık refleksi yokluğu ile birlikte postüral durumunun kötüleşmesi gerekir. Beyin ödemi nedeniyle ölüm oranı işlemden yaklaşık 3 gün sonra zirve yapar. Beyin ödemi çözülmeye başladıktan sonra kronik faz başlar. Bu süre zarfında, hayvan idrar tutma ile ortaya çıkabilir. Bu nedenle, hayvanı mesane sertliği açısından kontrol etmenin yanı sıra üretral çıkışta sağlam bir kapak olması önemlidir. Çoğu zaman, bu sorun idrara çıkmayı kolaylaştırmak için mesaneye hafifçe masaj yaparak çözülebilir. Kilo kurtarma belirtileri genellikle inme başlangıcından sonraki ilk 7 gün içinde ortaya çıkar.

figure-results-1
Şekil 2: MRI taramaları ile doğrulanmış tam reperfüzyonlu başarılı bir MCAO'nun temsili örneği. CBF, ADC ve T2w, sırasıyla serebral kan akış haritaları, görünür difüzyon katsayısı haritaları ve T2 ağırlıklı anatomik taramalar anlamına gelir. İntraOP, postop ve D02, iskemi başlangıcından sonra, reperfüzyon başlangıcından sonra ve MCAO'dan sonraki ikinci günde sırasıyla 3 farklı görüntüleme zaman noktasını ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 3: MCAO prosedürü sırasında filament kaynaklı bir kanamanın temsili MRI taramaları. CBF, ADC ve T2w, sırasıyla serebral kan akış haritaları, görünür difüzyon katsayısı haritaları ve T2 ağırlıklı anatomik taramalar anlamına gelir. İntraOP, postOP ve D02, sırasıyla iskemi başlangıcından sonra, reperfüzyon başlangıcından sonra ve MCAO'dan sonraki ikinci gün olmak üzere 3 farklı görüntüleme zaman noktasını ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 4: Orta serebral arter dalında uygun filament yerleşiminin bir gösterimi. Çoğu durumda, filamentin silikon kısmı (beyaz renkli), anterior serebral arterin (ACA) proksimal kısmına, MCA dallanma noktasından yaklaşık 2 mm daha fazla yerleşir. Normalde ACA beyin bölgesi farelerde etkilenmez, çünkü ACA kontralateral olanla tekil bir azygos ACA'ya katılır. Etkilenen arterler gri renkle gösterilir. Solda, iskemi döneminde CCA patentli olarak bırakılmıştır, böylece filamentin silikon kısmı ile tıkanan MCA'ya kadar tüm İKA dallarına kan sağlar. Sağda, iskemi döneminde CCA ligasyonunun tutulması dışında filament aynı şekilde konumlandırılmıştır. PcomA'nın (yeşil renkli) çoğu durumda patent olmaması nedeniyle, CCA ligasyonu tutulursa, inme seçici olmayan bir şekilde MCA, AchA, VTA, HTA ve PCA yoluyla ipsilateral hemisferin çoğunu sarar. Bu durumlarda, tıkalı PPA nedeniyle gözün akut enfarktüsü belirtileri (lökokori ve anizokori) de gözlenebilir. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MCAO, operatör için oldukça zorlu bir prosedürdür ve hayvan için zayıflatıcı bir prosedürdür. Bu nedenle, araştırmacıların inme şiddetini en aza indiren, prosedürel başarısızlığı azaltan ve işlem sonrası hayvanın refahını iyileştiren standart bir ameliyat prosedürüne sahip olmaları son derece önemlidir. Bu MCAO protokolü, bu prosedürü bir fare üzerinde gerçekleştirirken göz önünde bulundurulması gereken bazı önemli hususları vurgulamaktadır.

MCAO filamentinin seçimi, indüklenen inme lezyonunun boyutunu ve yerini etkiler ve bu nedenle bu prosedürde kritik bir adımdır11. Doccol'un öncülük ettiği gibi silikon kaplı filamentler, filament kaynaklı kanamaların görülme sıklığını azaltmada büyük bir sıçrama yapmıştır12. Bununla birlikte, silikon kaplı filamentler çok çeşitli boyut ve uzunluklarda gelir ve yeni araştırmacıların deney hayvanlarında MCAO için uygun olanları seçmeleri için bir zorluk teşkil eder. Filament üreticileri genellikle belirli bir hayvan ağırlığı için doğru filament çapını seçmek için yönergeler sağlarken, silikon kaplamanın uzunluğu operatörün kişisel tercihine bağlı olarak kabul edilir ve yalnızca operatörün becerisine göre seçilmelidir. Bu çalışmada, indüklenen inme lezyonunun sadece MCA sulama alanını kapsamasını sağlamak ve böylece tekrarlanabilirliği artırmak için silikon uzunluğunun en aza indirilmesini savunuyoruz. Şekil 4 , ilk intrakraniyal İKA dalı olan posterior serebral arterin (PCA), hipokampusun parçaları da dahil olmak üzere beynin arka bölgelerini beslediğini göstermektedir. Fareler üzerinde yapılan son mikro-BT çalışmaları, MCA13'ün dallanma noktasından önce ICA'dan kaynaklanan üç küçük dal daha tanımlamıştır. Hassas ve değişken hipotalamik arter (HTA), ventral tegmental arter (VTA) ve anterior koroid arter (AChA), dallanma sırasına göre, varyant içi ve denek içi değişkenliğe önemli ölçüde katkıda bulunur8. Ayrıca, mikro-BT çalışmaları, farelerde, MCA ve PCA dallanma noktalarından ortalama mesafenin, üretilen filamentlerin çoğunun silikon kaplama uzunluğundan önemli ölçüde daha kısa olan yaklaşık 1,7 mm olduğunu göstermiştir14. Bir operatörün filamenti ilerletirken aldığı tek geri bildirim, filament MCA dallanma noktasına ulaştığında dirençte ani bir artış olduğundan, filamentin silikon kaplamasının takip eden uzunluğu, MCA'ya ve silikon kaplamanın uzunluğuna bağlı olarak AChA, VTA, HTA ve hatta PCA'ya iskemiyi indükleyen şeydir. amaçlanan MCAO modelinin aksine değişkenlik sağlamak. Bu nedenle, tekrarlanabilirliği ve ameliyat sonrası hayvan iyilik halini korumak için amaç yalnızca MCA oklüzyonu olmalıdır. Doccol, 1 ila 2 mm arasında değişen silikon kaplamalara sahip MCAO filamentleri sunar, ancak deneyimlerimiz, 1-2 mm kaplamaların kullanılmasının genellikle felce neden olmadan sahte bir işlemle sonuçlandığını göstermektedir. İntraoperatif MRI taramaları, operatöre kritik dirençli geri bildirim sağlamadan önce filamentin MCA dallanma noktasının 2 mm ötesine anterior serebral artere (ACA) ilerlediğini ortaya koydu. Bu nedenle, MCAO filamentleri üzerindeki daha uzun silikon kaplamalara kıyasla inme lezyonlarında hipokampal tutulumu azaltan 2 ila 3 mm uzunluğunda silikon kaplamaların kullanılmasını şiddetle tavsiye ediyoruz.

Bu prosedürdeki ikinci kritik adım, MCA'nın tam oklüzyonunu sağlamak için MCAO filamentinin doğru yerleştirilmesidir. Yanlışlıkla ilk ICA dalı olan pterygopalatin artere (PPA) girmek, operatör için yaygın bir sorundur, çünkü MCAO filamentinin ilerlemesi sırasında yanlış bir dönüş yaptığına dair neredeyse hiç geri bildirim yoktur. Bu nedenle, filamentin silikon kaplı ucunun PPA'nın dallanma noktasından uzağa doğru kıvrılması ve ICA'nın intrakraniyal kısmına girme olasılığını artırması için hafif bir yanal ilerleme açısı öneririz. (Şekil 1) Protokol bölümünde belirtildiği gibi, filamentin yerleşiminin yeterli olup olmadığı sonucuna varmak için takip eden filamentin uzunluğunu gözlemlemek önemlidir. Filamentin ICA dallanma noktasından en az 7 mm boyunca yerleştirilemediği bir durumda, operatör filamenti geri çekmeli ve tekrarlamalıdır. Filament yerleştirme sırasında uygulanan herhangi bir gereksiz kuvvet, kanamaya ve başarısız bir prosedüre neden olabilir. Bu konuda, doğru filament yerleşimini doğrulamak için sürekli bir lazer-doppler perfüzyon ölçümü kullanılabilir.

İskemik dönem boyunca CCA'dan engelsiz kan akışının sağlanması bu protokoldeki bir diğer kritik adımdır. Bir farede tam bir Willis dairesini gösteren çoğu çizimin aksine, çalışmalar, posterior komünikan arterin (PcomA) farelerde çoğunlukla iki taraflı olarak patentli olmadığını ve iskemi döneminde CCA'nın kapalı kalması durumunda Willis çemberinin ipsilateral tarafını güvenilir bir şekilde sağlayamadığını göstermiştir15,16. Bu durumlarda, bir araştırmacı filamentin silikon kaplamasının doğru uzunluğunu dikkatli bir şekilde seçse bile, inme, PcomA açıklığına bağlı olarak tüm yarım küreyi veya sadece MCA bölgesini saracak ve inme boyutlarının hesaplanamayan varyansına yol açacaktır. Bu nedenle, prosedürü, operatörün tıkayıcı MCAO filamentini ayarladıktan hemen sonra CCA klipsini çıkardığı talimat adımını içerecek şekilde değiştirdik. Bu modifikasyonlar, ameliyatın hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini artırabilir ve aynı zamanda sonuçların heterojenliğini azaltabilir. Yöntemlerin standardizasyonu, başarı oranını ve karşılaştırılabilirliği ve sonuçların translatif potansiyelini daha da artıracaktır17.

Önerilen tekniğin en büyük sınırlaması, ECA'nın işlemden sonra bağlı kalmasıdır, bu da iyileşme sırasında hayvanın durumunu potansiyel olarak kötüleştirebilir18. Şimdiye kadar, prosedürün başarı oranını yeterince yüksek tutarken ECA'yı onarma çabalarında başarısız olduk. Bu, yöntemde gelecekteki iyileştirmeler için potansiyel bir nokta olmaya devam etmektedir. Ayrıca, CCA'nın klempli kaldığı süreyi en aza indirmek bir zorluktur, ancak inmede MCA olmayan bölgelerin işe alınmasını önlemek önemlidir. Bu, operatörler arası ve operatör içi bir varyans kaynağı sağlayabileceğinden, CCA klempleme süresinin ölçülmesi tavsiye edilir, bu da potansiyel olarak araştırmacıların strok boyutlarında gözlemlenen toplam varyansın en azından bir kısmını istatistiksel olarak açıklamasını sağlar. Öte yandan, operatör becerisi ve deneyimi, CCA ligatürünün süresinin ve genel prosedür süresininazaltılmasında çok önemli bir rol oynar 11.

Sunulan yöntem önemlidir, çünkü araştırmacıların MCA'yı seçici olarak tıkamasını sağlar, böylece reperfüzyonun başlangıcını ani ve yüksek derecede kontrol edilebilir hale getirir. Yöntem, endovasküler trombektomiyi ve müteakip reperfüzyon hasarını şu anda mevcut yöntemlerden daha doğru bir şekilde taklit ederek, tekrarlanabilir ve klinik olarak anlamlı bir hayvan iskemisi/reperfüzyon yaralanması modeli için ayrıntılar sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Yazarların bu çalışmada adı geçen ticari isimler ve ticari markalarla hiçbir ilişkisi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Hırvat Bilim Vakfı projesi BRADISCHEMIA (UIP-2017-05-8082) tarafından finanse edilmiştir; GA KK01.1.1.01.0007 Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu aracılığıyla ve Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu aracılığıyla Hibe Sözleşmesi No. kapsamında finanse edilmiştir. KK.01.1.1.07.0071, "SineMozak" projesi. Doktora öğrencileri Rok Ister ve Marta Pongrac'ın çalışmaları, Avrupa Birliği tarafından Avrupa Sosyal Fonu'ndan finanse edilen Hırvat Bilim Vakfı'nın "Genç araştırmacıların kariyer geliştirme projesi - doktora öğrencilerinin eğitimi" tarafından tam olarak desteklendi. Prosedür, genel bir kamera montajı kullanılarak cerrahi mikroskoba monte edilmiş bir Android akıllı telefon kullanılarak filme alındı. Video materyalleri düzenlendi ve Wondershare Filmora video editörü kullanılarak seslendirme kaydedildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Betadin kutanöz çözelti 10g/100mlAlkaloid ÜsküpN/A
Örgülü ipek sütürGüzel Bilim Araçları18020-60
Dafilon sütür 5/0 DS16B. BraunC0936154
Dolokain 20 mg/g jelJadran-Galenski LaboratorijN/A
Dumont #5 forsepsGüzel Bilim Araçları11251-202 adet
Dumont #7 forsepsGüzel Bilim Araçları11271-30
Dumont N0 kendiliğinden kapanan forsepsGüzel Bilim Araçları11480-11
Durapore Cerrahi Bant 1,25cm x 9,1m3M7100057169
Durapore Cerrahi Bant 2,5cm x 9,1m3M7100057168
Harici termostatPetnap1012536
Halsey iğne tutucularGüzel Bilim Araçları12500-12
Sıcak boncuk sterilizatörüGüzel Bilim Araçları18000-50
İris makasıGüzel Bilim Araçları14060-10
İzofluran USPPiramal yoğun bakımN/A
Lazer Doppler MonitörMoorMOORVMS-LDF2
Metal Pet Isı YastığıPetnap
Mikro Vannas yaylı makasGüzel Bilim Araçları15000-00
Mini-colibri ekartörGüzel Bilim Araçları17000-01
Recugel göz merhemiBausch & LombN/A
S & T B-1 gemi mikro kelepçesi Güzel Bilim Aletleri00396-012 adet
S& Forseps uygulayan T mikro kelepçeGüzel Bilim Araçları00071-14
Schwartz mikro serrafinlerGüzel Bilim Araçları18052-01
Stemi DV4 Spot stereo mikroskopZeiss000000-1018-453
Steri-Strip Takviyeli Yapıştırıcı Cilt Kapakları 3 mm x 75 mm3M7100236545
Düz doku forsepsGüzel Bilim Araçları11023-10
SZX Stand KoluOlympusSZ2-STS
Tec III 300 serisi kalibre edilmiş buharlaştırıcıBuharlaştırıcı Satış ve Servis a.ş.N/A
Üniversal Stand Tip 2OlympusSZ2-STU2
VetFlo Altı Kanallı Anestezi StandıKent ScientificVetFlo-1225O2/N2 karıştırma için modifiye
1012525 edilmiştir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feigin, V. L., et al. regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. Neurology. 20 (10), 1-26 (2021).
  2. Bai, J., Lyden, P. D. Revisiting cerebral postischemic reperfusion injury: New insights in understanding reperfusion failure, hemorrhage, and edema. Int J Stroke. 10 (2), 143-152 (2015).
  3. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  4. Hill, J. W., Nemoto, E. M. Transient middle cerebral artery occlusion with complete reperfusion in spontaneously hypertensive rats. MethodsX. 1, 283-291 (2014).
  5. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
  6. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  7. Justić, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow and Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).
  8. El Amki, M., et al. Hypothalamic, thalamic and hippocampal lesions in the mouse MCAO model: Potential involvement of deep cerebral arteries. J of Neurosci Methods. 254, 80-85 (2015).
  9. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J Vis Exp. (47), e2423(2011).
  10. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Gibson, C. L. Middle cerebral artery occlusion allowing reperfusion via common carotid artery repair in mice. J Vis Exp. (143), e58191(2019).
  11. Morris, G. P., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the longa and koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLoS One. 11 (2), e0148503(2016).
  12. Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).
  13. Guan, Y., et al. Effect of suture properties on stability of middle cerebral artery occlusion evaluated by synchrotron radiation angiography. Stroke. 43 (3), 888-891 (2012).
  14. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  15. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow and Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  16. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  17. Li, Y., et al. Distinctions between the Koizumi and Zea Longa methods for middle cerebral artery occlusion (MCAO) model: a systematic review and meta-analysis of rodent data. Sci Rep. 13 (1), 10247(2023).
  18. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament mcao model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Middle Cerebral ArteryIschemic Stroke ModelCerebral Artery OcclusionComplete ReperfusionExternal Carotid ArteryIntraluminal Filament ModelRodent Stroke ModelSurgical StandardizationPerfusion Weighted ImagingApparent Diffusion Coefficient

İlgili makaleler