Yöntem makalesi

Tek Hücreli Transkripsiyonel Seviyede İnce Bağırsak Epitelini Anlamak için İnsan Bağırsak Organoidlerini Kullanma

1.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66749

⸱

28 Haziran 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

Protokol, daha önce keşfedilmemiş bağırsak biyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlamak için insan bağırsak organoid teknolojisini tek hücreli transkriptomik analizle birleştirir.

Özet

Tek hücreli transkriptomik, insan vücudunun hücre biyolojisi anlayışımızda devrim yarattı. Son teknoloji insan ince bağırsak organoid kültürleri, hayvan modelleri ve klinik çalışmalar arasındaki boşluğu dolduran ex vivo model sistemleri sağlar. Tek hücreli transkriptomiklerin insan bağırsak organoid (HIO) modellerine uygulanması, daha önce tanınmayan hücre biyolojisini, biyokimyasını ve GI yolunun fizyolojisini ortaya çıkarmaktadır. Gelişmiş tek hücreli transkriptomik platformlar, cDNA kitaplıkları oluşturmak için mikroakışkan bölümleme ve barkodlama kullanır. Bu barkodlu cDNA'lar, yeni nesil dizileme platformları tarafından kolayca dizilenebilir ve haritalar oluşturmak için çeşitli görselleştirme araçları tarafından kullanılabilir. Burada, insan ince bağırsak HIO'larını farklı formatlarda kültürlemek ve ayırt etmek için yöntemleri ve tek hücreli transkripsiyonel profilleme platformlarında kullanıma uygun olan bu formatlardan canlı hücreleri izole etmek için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller ve prosedürler, çeşitli farklı ortamlar bağlamında transkripsiyonel düzeyde insan bağırsak epitelinin hücresel tepkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak için ince bağırsak HIO'larının kullanımını kolaylaştırır.

Giriş

İnce bağırsak epitelinin iki ayrı bölgesi vardır: bağırsak kök hücresini (ISC) barındıran kript ve salgı ve emici soyların farklılaşmış hücrelerinden oluşan villus. Bu karmaşıklığa ek olarak, ince bağırsak bölgeleri arasında benzersiz fonksiyonel özellikler sağlayan epitelin bölgesel özgüllüğü de vardır. Öncü çalışmalar, hem insan ince bağırsak kriptinin hem de villus bölgelerinin cerrahi dokulardan veya doku biyopsilerinden ex vivo olarak oluşturulabileceği kültür koşullarını oluşturmuştur1. Bu kültürler, hayvan çalışmaları ile klinik deneyler arasındaki boşluğu dolduruyor ve daha önce tanınmayan hücre biyolojisini, biyokimyasını ve gastrointestinal sistemin fizyolojisini ortaya çıkarıyor. HIO'lar, kök hücre canlılığını ve hücre dışı destek matrislerini destekleyen büyüme faktörlerine sahip bir ortam kullanılarak 3D küresel yapılar olarak yayılır. Bu koşullar, çoğunlukla progenitörlerden ve kök hücrelerden oluşan kript benzeri bir HIO modeli ile sonuçlanır. Büyüme faktörlerinin uzaklaştırılması, hücre proliferasyonu ve farklılaşması, polarizasyon, bariyer bütünlüğü, bölgesel spesifik özellikler ve uygun fizyolojik yanıtlar ile birlikte uygun oranlarda ISC farklılaşmasını (villus benzeri model) ve olgun bağırsak epitel hücrelerinin (goblet, enteroendokrin, tutam, enterosit) üretimini teşvik eder2. HIO kültürleri genetik olarak kararlıdır ve kript benzeri durumlarında süresiz olarak çoğaltılabilir. Bu kültürlerin apikal yüzeyine kolay erişim, tek katmanlı bir formatta büyümeye izin veren kültür koşulları ile sağlanır3. HIO'lar ayrıca genetik, yaş, cinsiyet, etnik köken ve hastalık durumu gibi konakçı bireysel değişkenliğin dikkate alınmasının biyolojik analizlere dahil edilmesine izin verir. Analitik ve fonksiyonel değerlendirme araçları, dönüştürülmüş hücre hatlarına odaklanan yaklaşımlarda kullanılanlarla aynıdır ve akış sitometrisi, mikroskopi, transkriptomik, proteomik ve metabolomik gibi çeşitli moleküler teknikleri içerir.

Tek hücreli transkriptomik, her hücre tipinin biyolojik bir sürece bireysel katkıları hakkında bilgi sağlayarak ince bağırsağın biyolojisi ve fizyolojisi hakkındaki anlayışımızda devrim yaratıyor. Bu teknolojiyi kullanan öncü çalışmalar, doğal insan bağırsağında bulunan hücre tiplerinin bir manzarasını sağlamıştır 4,5,6. Tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformları, tek tek hücrelerin transkripsiyonel manzarasının araştırılmasına izin vererek, hücre heterojenliğinin bilimsel araştırmaların ön saflarında yer almasına izin verir. Bazı tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformlarında, numune başına 10.000'e kadar hücreden elde edilen hücresel poliadenillenmiş mRNA'lardan cDNA kitaplıkları oluşturmak için mikroakışkan bölümleme ve barkodlama kullanılır. Bu platformda, tek hücreler, barkodlu oligonükleotidler, ters transkripsiyon reaktifleri ve yağ içeren damlacıklar, tek bir hücreden gelen tüm cDNA'ların aynı barkoda sahip olmasıyla sonuçlanan bir reaksiyon vezikülü oluşturur. Barkodlu cDNA'lar daha sonra yeni nesil dizileme kullanılarak verimli bir şekilde dizilenebilir. Oluşturulan veriler, barkodlu dizileri görselleştirme haritalarına ve tek hücreli transkripsiyonel profillere dönüştüren yazılım ve görselleştirme araçları aracılığıyla işlenebilir. Hücre popülasyonları, insan ince bağırsak epitelinin halka açık veri tabanları kullanılarak tanımlanabilir 4,5,6. Birçok çalışma, murin bağırsak organoidlerini tek hücre düzeyinde sorgulamak için bu platformu kullanmış olsa da, HIO'ların tek hücreli transkripsiyonel yanıtlarının analizi 7,8,9,10,11,12'nin gerisinde kalmıştır.

Burada, tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformlarında işlenmek üzere ince bağırsak HIO'larından canlı hücreleri izole etmek için adım adım bir kılavuz sunuyoruz (Şekil 1). Epitelyal farklılaşma için optimize edilmiş medya bileşenleriyle birlikte kültürleme ve farklılaşma kılavuzları sağlıyoruz. Üç farklı kültür formatı için hücre geri kazanım yöntemlerini özetliyoruz: plastik veya membran hücre kültürü ekleri üzerinde üç boyutlu (3D) ve tek katmanlı kültürler. Her kümede diferansiyel olarak ifade edilen genleri türetmek için açık kaynaklı yazılım kullanılarak elde edilen örnek kümeleme verileri sağlıyoruz.

Protokol

Burada kullanılan organoid hatlar, Teksas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Merkezi GEMS Core'dan elde edildi. Kısaca, başlangıçta organoid hatları oluşturmak için, donör doku örnekleri yıkandı ve bağırsak kriptlerini serbest bırakmak için enzimatik olarak sindirildi. Kriptler bir bazal membrana gömüldü ve bir ortamda kültürlendi. Baylor College of Medicine'deki Kurumsal İnceleme Kurulu, organoid hatlarının oluşturulduğu doku örneklerinin alınması için çalışma protokolünü onayladı ve bağışlanan dokudan organoid hatlarının oluşturulması için tüm donörlerden bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Farklılaşma için genişletmek için 3D HIO'ların geçirilmesi

  1. Bir P1000 pipeti ile 24 oyuklu plakalarda (katı bazal membranın etrafında) büyütülen organoid kuyularından ortamı çıkarın ve atın. Kuyuya 300 μL% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve bir P1000 pipeti ile 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek organoidleri mekanik olarak parçalayın.
  2. Plakayı 37 °C'de 4 dakika inkübe edin. Her oyuğa %10 FBS içeren büyüme faktörleri (CMGF-orta) içermeyen 500 μL tam ortam ekleyin (Tablo 1). Bir P1000 pipet ve pipet CMGF ortamı ve HIO karışımı, kuyuda 10 kez ileri geri kullanın. Tüm hacmi 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Birden fazla kuyudan geçişi aynı 15 mL'lik tüpte birleştirin. Tüp başına 10'dan fazla kuyu birleştirmeyin.
  3. 5 dakika boyunca 100 x g'da bir döner rotorlu santrifüj kullanarak hücreleri 4 °C'de döndürün. Peleti tüpün altında tutarak tüm ortamı çıkarın. Tüpü buz üzerinde tutun.
  4. Kaplanan HIO sayısı için gereken bazal membran miktarını hesaplayın ve soğuk P200 pipet uçları kullanarak HIO peletini 30 μL/kuyu bazal membranda yeniden süspanse edin. HIO bazal membran karışımını, soğuk P200 pipet uçları kullanarak 24 oyuklu bir plakanın ortasına bir damlacık şeklinde pipetleyin.
  5. Plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın. Bazal membranın 5-10 dakika katılaşmasına izin verin, ardından WNT, R-spondin, noggin, EGF ve ROCK inhibitörü (WRNE+Y; Tablo 1) 37 °C'lik bir inkübatörde her bir kuyuya ve kültüre. 7 gün boyunca her gün WRNE + Y ile kültürü yenileyin.
    NOT: Sağlıklı bir HIO, parlak tomurcuklanan bir epitel ile kistik bir şekle sahip olacaktır (Şekil 2). Kistin ortasındaki hücreler görüntülenemez. Sağlıksız bir HIO donuk görünecek ve sağlam bir ortası olan kalın bir epitele sahip olacaktır. En önemli özelliği parlak görünümüdür.

2. HIO farklılaşması: 3D formatı

  1. Kültürlemeden 1 hafta sonra 3 kuyu 3B farklılaştırılmış HIO için bir kuyu 3D HIO kullanın.
  2. Ortamı kuyulardan çıkarın. Bir P1000 pipeti kullanarak bazal membranı ve HIO'ları dağıtın ve oyuk başına soğuk 500 μL CMGF- ekleyin ve en az 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 5 dakika boyunca 100 x g'da bir döner rotor santrifüjü kullanarak HIO'ları 4 °C'de döndürün. Peleti tüpün dibinde tutarak tüm ortamı çıkarın.
  3. Kaplanan HIO'ların kuyusu başına 30 μL bazal membran ekleyin. 30 μL'lik bazal membran damlacığını HIO'larla 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna pipetleyin. 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. 500 μL WRNE+Y/Diff (50/50) ortam ekleyin.
  4. Ortamı 24 saat sonra 3 gün daha farklılaşma ortamına geçirin ve ortamı iki günde bir yenileyin. Teknik değişkenliği azaltmak için havuza numune başına 3 kuyu hazırlayın.

3. HIO farklılaşması: Tek katmanlı format

  1. Membran hücre kültürü eklerini veya 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarını soğuk H2O (1:30) ile seyreltilmiş 100 μL / kuyucuklu insan plasental kollajen IV (100mM asetik asit içinde 1 mg / ml) ile kaplayın. 37 ° C'de en az 1,5 saat veya en fazla gece boyunca inkübe edin. Membran hücre kültürü eki için, plakayı nemlendirmek için plaka boşluğuna steril H2O ekleyin; 96 oyuklu plaka için, kullanılmayan kuyucuklara steril H2O ekleyin.
  2. Ortamı çıkararak ve 500 μL / kuyu soğuk 0.5 mM EDTA (steril PBS'de 1:1000 seyreltilmiş 0.5 M EDTA) ekleyerek bazal membranı ve hücreleri geri kazanarak 7 gün boyunca WRNE'de kültürlenen 3D HIO'ları toplayın. Organoidleri ve çözeltiyi 5 kat yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P1000 pipeti kullanın ve 15 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüp başına 10'dan fazla organoid kuyusu toplamayın. 4 °C'de sallanan bir kova rotorunda 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    NOT: 96 oyuklu bir plaka üzerinde 3 kuyu hazırlamak için 1 kuyucuklu 3D HIO kullanın. 1 membran hücre kültürü eki hazırlamak için, 1 oyuklu 3D HIO kullanın (tek hücrelerin tohumlama yoğunluğu yaklaşık 1-2 x 105 hücre/96 oyuklu plaka için kuyu, 2.5-3 x 105 hücre/zar hücre kültürü eki için kuyucuktur).
  3. Peleti tüpün dibinde bırakarak 500 μL ortamı çıkarın. 500 μL% 0.05 Tripsin / 0.5 mM EDTA ekleyerek ve 37 ° C'de 4-5 dakika inkübe ederek HIO'ları ayırın. Bir P50 kullanarak ~1000x boyunca kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüpün yan tarafına pipetleyerek kabarcık yapmaktan kaçının.
  4. % 10 FBS içeren 1 mL CMGF ekleyerek tripsini inaktive edin. 40 μm'lik bir hücre süzgecini %10 FBS içeren 1 mL CMGF ile ıslatarak ve hücreleri hücre süzgecinin üstüne ekleyerek büyük sindirilmemiş hücre kümelerini filtreleyin. Hücrelerin süzgeçten geçmesine izin vermek için yerçekimini kullanın ve hücre kümeleri içeren hücre süzgecini atın.
  5. Hücreleri, oda sıcaklığında sallanan bir kova rotorunda 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek toplayın.
  6. Sıvıyı kollajen kaplı membran hücre kültürü ekinden veya 96 oyuklu plakadan çıkarın. HIO peletini 10 μM Y-27632 içeren 100 μL / oyuklu WRNE'de yeniden süspanse edin, daha sonra membran hücre kültürü ekinin üst bölmesine veya 96 oyuklu plakaya pipetleyin. Membran hücre kültürü eki için, kuyucuğun alt bölmesine 10 μM Y-27632 içeren 600 μL WRNE ekleyin.
  7. Ortamı 24 saat sonra membran hücre kültürü ekinin hem üst hem de alt kısmından veya 96 oyuklu plakadan çıkarın ve 5 gün boyunca farklılaşma ortamı ile değiştirin. Teknik değişkenliği azaltmak için havuza numune başına 3 kuyu hazırlayın.

4. Tek hücreli transkriptomikler için farklılaşmış 3D HIO'lardan tek hücreli süspansiyonların hazırlanması

  1. Enzimatik hücre sindirim reaktifini, 3D HIO sindiriminin başlamasından 30 dakika önce çözülmesi ve ısıtılması için bir CO2 inkübatörüne 37 ° C'de yerleştirin. Hücre sağlığını sağlamak için 10x'te parlak bir alan mikroskobu kullanarak HIO'ları kontrol edin.
  2. Ortamı kuyulardan çıkarın ve kuyucuklara 500 μL soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Bir P1000 pipet ve standart pipet uçları kullanarak hücreleri bazal zardan kurtarmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Replike kuyucukların kullanılması, yeterli hücre sayısını sağlar ve kuyudan kuyuya varyasyonu azaltır. Aşağıdaki adım 4.7'den önce kuyucukları birleştirmeyin.
  3. Hücre tüplerini buz üzerinde 10 dakika inkübe edin, her 5 dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri 4 ° C'de 400 x g'da 3 dakika santrifüjleme ile toplayın.
  4. Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek sıvıyı tüpten çıkarın. Hücreleri 500 μL önceden ısıtılmış enzimatik hücre sindirim reaktifi içinde yeniden süspanse edin. P1000 ile en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
  5. HIO'ları bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Her 10 dakikada bir, hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için bir P1000 pipet kullanarak tüm hacmi 10x pipetleyin. Hücre süspansiyonuna hava kabarcıkları sokmaktan kaçının.
  6. Hücreleri 4 ° C'de 400 x g'da 3 dakika boyunca peletleyin. Süpernatanı çıkarın, hücreleri 1 mL farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin ve buz üzerinde saklayın.
    NOT: Bu noktadan itibaren, HIO'lar her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.
  7. HIO'ların tek hücrelere ayrıldığından emin olmak için bir P50 kullanarak hücreleri hızlı bir şekilde 1000 kat yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre kaybına neden olacağı için bu adımda hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.
  8. P1000 pipet ucu kullanarak tüm hacmi 70 μm'lik bir süzgeçten süzün. Elüatı toplamak için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanın.
    NOT: Sindirim süresi yeterliyse filtre ucu tıkanmaz. Filtre tıkanırsa birden fazla filtre ucu kullanın; Sesi filtreden geçirmeye zorlamayın.
  9. 4.8 μm'lik bir süzgeçle 40. adımı tekrarlayın. Numuneleri buz üzerinde saklayın.
  10. 5 μL hücre süspansiyonuna 5 μL %0.4 tripan mavisi ekleyerek tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hücre sayma odasındaki canlı tek hücreleri sayın. Numuneyi gerektiği gibi 1000 hücre/μL'ye seyreltin. Hücre yoğunluğu 1000 hücre / μL'den azsa, hücreleri 4 ° C'de 400 x g'de 2 dakika boyunca pelet haline getirin, orijinal ortamı çıkarın ve hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Bu protokol tipik olarak 5 x 105-1 x 106 hücre verir.
    NOT: Yüksek kaliteli tek hücreli veriler için yüksek kaliteli bir süspansiyonun (%90 uygulanabilir ve %90 tek hücreli) hazırlanması çok önemlidir. Bununla birlikte, deneyimler, enfeksiyon veya küçük molekül uygulaması gibi tedavinin canlılığı etkilediği durumlarda% 75 kadar düşük bir canlılığın kabul edilebileceğini göstermektedir.
  11. Üreticinin protokollerine göre tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformları için DNA kitaplıkları hazırlayın. Verileri scRNAseq veri analiziiçin en iyi uygulama protokollerine göre işleyin 13,14.

5. Membran hücre kültürü ekinde farklılaştırılan HIO'lardan tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması

  1. Enzimatik hücre sindirim reaktifini, HIO membran hücre kültürü eki sindiriminin başlamasından 30 dakika önce çözülmesi ve ısıtılması için bir CO2 inkübatörüne 37 ° C'de yerleştirin. Önceden ısıtılmış enzimatik hücre sindirim reaktifini, 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 200 μL'lik alikotlara, zar hücre kültürü eki başına 1 tüpe bölün. Tüpleri kullanıma hazır olana kadar 37 °C inkübatörde saklayın.
  2. 5 mL PBS'ye 5 μL 0,5 M EDTA ekleyerek PBS-EDTA'yı hazırlayın. 500 μL PBS-EDTA'yı 24 oyuklu bir plakaya, zar hücre kültürü eki başına 1 oyuklu bir plakaya alikot edin.
  3. Hücreleri PBS-EDTA ile yıkayın: membran hücre kültürü eklerini büyüme ortamı içeren kuyucuklardan PBS-EDTA içeren kuyucuklara aktarın. Hücre kültürü ortamını apikal taraftan çıkarın ve 100 μL PBS-EDTA ile değiştirin. Hücre tabakasını rahatsız etmemeye özen gösterin.
  4. Membran hücre kültürü eklerinin apikal tarafına eklenen PBS-EDTA'yı hemen atın. Membran hücre kültürü ekini kuyudan çıkarın, kenarını bir kağıt havluya hafifçe dokundurarak kurulayın ve ardından tezgah üzerinde ters çevirin. Zarın iç çevresini keserek zarı ek parçadan çıkarmak için keskin bir neşter bıçağı kullanın. Kurumayı önlemek için hızlı çalışın.
  5. Membranı, enzimatik hücre sindirim reaktifi ile doldurulmuş önceden ısıtılmış 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için forseps kullanın ve zarın tamamen suya batırıldığından emin olun. Tüm ek membran hücre kültürü ekleri için tekrarlayın.
    NOT: Enzimatik hücre sindirim reaktifinin hacminin 500 μL'ye çıkarılması, yoğun tek tabakaların ayrılmasına yardımcı olabilir.
  6. Bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de membranlı tüpleri inkübe ederek hücreleri ayırın. Her 10 dakikada bir 200 μL'lik bir pipetle tüm hacmi 5x olacak şekilde toplam 30 dakika boyunca nazikçe pipetleyerek karıştırın. Canlılığı korumak için kabarcıklardan ve zarın emilmesinden kaçının.
  7. Tek hücrelerin yüzdesini kalitatif olarak değerlendirerek ayrışmayı değerlendirmek için her 10 dakikada bir küçük bir hücre alikotunu (1-2 μL) bir cam slayta aktarın. HIO tipine bağlı olarak %80 ila %90 tek hücre elde etmek ek pipetleme ile 50 dakikaya kadar sürebilir. Özellikle ayrışması zor hücreler için ayrışmayı teşvik etmek için karıştırma adımları sırasında zarı bir pipet ucuyla nazikçe kazıyın, ancak kazıma canlılığı etkileyebilir.
  8. Tek bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde (toplam 600 μL) koşul başına 3 çoğaltma kuyusunu birleştirin. 400 μL hücre kültürü ortamı (fark) + 10 μM ROCKi (1 mL toplam hacim) ekleyin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın.
    NOT: Replike kuyucukların kullanılması, yeterli hücre sayısını sağlar ve kuyudan kuyuya varyasyonu azaltır. Kuyular bu adımda bir araya getirilmelidir.
  9. 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak tüm hacmi 70 μm'lik bir süzgeçten süzün. Akışı 1,5 mL'lik yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
    NOT: Sindirim süresi yeterliyse filtre ucu tıkanmaz. Filtre tıkanırsa birden fazla filtre ucu kullanın; Sesi zorlamayın.
  10. Adım 5.9'u 40 μm'lik bir süzgeçle tekrarlayın. Numuneleri buz üzerinde saklayın.
  11. 5 μL hücre süspansiyonuna 5 μL %0.4 tripan mavisi ekleyerek tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hücre sayma odasındaki canlı tek hücreleri sayın. Numuneyi gerektiği gibi 1000 hücre / μL'ye seyreltin. Hücre yoğunluğu 1000 hücre / μL'den azsa, hücreleri peletlemek için 4 ° C'de 400 x g'de 2 dakika döndürün, orijinal ortamı çıkarın ve istenen hücre yoğunluğunda WRNE + Y'de yeniden süspanse edin. Bu protokol tipik olarak 4 x 105 - 6 x 105 hücre verir.
    NOT: Yüksek kaliteli tek hücreli veriler için yüksek kaliteli süspansiyonun (%90 uygulanabilir ve %90 tek hücreli) hazırlanması çok önemlidir. Bununla birlikte, deneyimler, enfeksiyon veya küçük molekül uygulaması gibi tedavinin canlılığı etkilediği durumlarda% 75 kadar düşük bir canlılığın kabul edilebileceğini göstermektedir.
  12. Üreticinin protokollerine göre tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformları için DNA kitaplıkları hazırlayın. Verileri scRNAseq veri analiziiçin en iyi uygulama protokollerine göre işleyin 13,14.

6. 96 oyuklu tek tabakalar olarak farklılaştırılan HIO'lardan tek hücreli süspansiyonların hazırlanması

  1. Enzimatik hücre sindirim reaktifini, tek katmanlı HIO sindiriminin başlamasından 30 dakika önce çözülmesi ve ısıtılması için bir CO2 inkübatörüne 37 ° C'ye yerleştirin.
  2. 5 mL PBS'ye 5 μL 0,5 M EDTA ekleyerek PBS-EDTA'yı hazırlayın. Hücre kültürü ortamını 96 oyuklu plakadan atın ve 100 μL PBS-EDTA ile değiştirin. Hücre tabakasını rahatsız etmemeye özen gösterin.
  3. Hücreleri ayırın: PBS-EDTA'yı atın ve her oyuğa 100 μL ılık enzimatik hücre sindirim reaktifi ekleyin. Plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'ye yerleştirin ve 20-30 dakika boyunca her 10 dakikada bir 200 μL'lik bir pipet ucuyla tüm hacmi 5x hafifçe pipetleyerek karıştırın. Canlılığı korumak için baloncuklardan kaçının.
    NOT: Enzimatik hücre sindirim reaktifinin hacminin 500 μL'ye çıkarılması, yoğun tek tabakaların ayrılmasına yardımcı olabilir.
  4. Ayrışmayı değerlendirmek için her 10 dakikada bir küçük bir hücre alikotunu (1-2 μL) bir cam slayta aktarın. HIO tipine bağlı olarak% 80 -% 90 tek hücre elde etmek 50 dakika kadar sürebilir. Özellikle ayrışması zor hücreler için ayrışmayı teşvik etmek için karıştırma adımları sırasında plakayı bir pipet ucuyla nazikçe kazıyın; Bununla birlikte, kazıma canlılığı etkileyebilir.
  5. Tek bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde (toplam 300 μL) koşul başına 3 çoğaltma kuyusunu birleştirin. 700 μL hücre kültürü ortamı (fark) + 10 uM ROCKi (1 mL toplam hacim) ekleyin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın.
    NOT: Çoğaltılmış kuyuların kullanılması, yeterli hücre sayısını sağlar ve kuyudan kuyuya varyasyonu azaltır.
  6. 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak tüm hacmi 70 μm'lik bir süzgeçten süzün. Akışı 1,5 mL'lik yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
    NOT: Enzimatik hücre sindirim reaktifi sindirim süresi yeterliyse filtre ucu tıkanmaz. Filtre tıkanırsa birden fazla filtre ucu kullanın; Sesi zorlamayın.
  7. Adım 6.6'yı 40 μm'lik bir süzgeçle tekrarlayın. Numuneleri buz üzerinde saklayın.
  8. 5 μL hücre süspansiyonuna 5 μL %0.4 tripan mavisi ekleyerek tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hücre sayma odasındaki canlı tek hücreleri sayın. Gerektiği gibi 1000 hücre / μL'ye seyreltin. Hücre yoğunluğu 1000 hücre / μL'den azsa, hücreleri peletlemek için 400 x g 4 ° C'de 2 dakika döndürün, orijinal ortamı çıkarın ve istenen hücre yoğunluğunda hücre kültürü ortamı + ROCKi'de yeniden süspanse edin. Bu protokol tipik olarak 2 x 105 - 6 x 105 hücre verir.
    NOT: Yüksek kaliteli tek hücreli veriler için yüksek kaliteli süspansiyonun (%90 uygulanabilir ve %90 tek hücreli) hazırlanması çok önemlidir. Bununla birlikte, deneyimler, enfeksiyon veya küçük molekül uygulaması gibi tedavinin canlılığı etkilediği durumlarda% 75 kadar düşük bir canlılığın kabul edilebileceğini göstermektedir.
  9. DNA kütüphanelerini tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformu üreticisinin protokollerine göre hazırlayın. Verileri scRNAseq veri analiziiçin en iyi uygulama protokollerine göre işleyin 13,14.

Sonuçlar

Tek hücreli süspansiyonlar, yeterli hücre verimini sağlamak ve kuyudan kuyuya varyasyonu azaltmak için 2-3 kuyulu membran hücre kültürü eki, tek tabaka ve 3D HIO'lardan toplandı. Tek hücre kütüphaneleri, tek hücreli transkripsiyonel profilleme platformuna özgü reaktifler kullanılarak hazırlandı. ve 30.000 okuma/hücre olan yeni nesil bir sıralama platformunda eşleştirilmiş uç okumalarla sıralanır. Okumalar, tek hücreli genomik için analitik araçlar kullanılarak haritalandı, sayıldı ve analiz edildi. % 20'den fazla mitokondriyal okumaya sahip veya 200'den az sayılan gene sahip düşük kaliteli hücreler analizden çıkarıldı. Hücrelerin kalitesini değerlendirmek için, hücre başına genlerin, UMI'lerin ve mitokondriyal okuma yüzdesinin sayısını çizdik (Şekil 3); yüksek kaliteli hücreler yaklaşık 3500 gen, 15.000 UMI ve mitokondriyal okuma içerir. Filtrelemeyi takiben, HIO büyüme formatına bağlı olarak 4000 ila 9500 tek hücre elde ettik. Denetimsiz kümeleme ve UMAP boyut azaltma, emici enterositler ve salgı hücreleri dahil olmak üzere beklenen hücre tiplerini temsil eden farklı kümeleri tanımladı (Şekil 4).

figure-results-1
Şekil 1: Protokol adımlarının ana hatları. HIO'ları farklı formatlarda tek hücreli veri iş akışına kaplamanın ana adımlarını özetleyen şemalar. Bu görüntü Biorender kullanılarak oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Parlak alan görüntüleri. İşlemeye hazır HIO'lar, 5X büyütmede parlak alan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Solda, 3D organoidler; orta, 96 oyuklu plaka; Doğru, Transwell. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Verilerin kalite kontrolü. 96 oyuklu plakalar üzerinde tek tabakalar olarak büyütülen jejunal HIO'lardan izole edilen analiz edilen tek hücrelerin örnek ölçümleri. Keman grafikleri, hücre başına gen sayısını (nFeature_RNA), UMI'leri (nCount_RNA) ve mitokondriyal okuma yüzdesini (percent.mt) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Analiz edilen tek hücrelerin UMAP'leri. (A) 96 oyuklu plakalarda büyütülen farklılaşmış jejunal HIO'lardan toplam 9952 tek hücre izole edildi. (B) Membran hücre kültürü eklerinde büyütülen farklılaşmış jejunal HIO'lardan toplam 5623 tek hücre izole edildi. (C) Diferansiye ileal 3D HIO'lardan toplam 4402 tek hücre izole edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

WRNE Büyüme OrtamıFarklılaşma ortamı
ParçaHacimSon KonsantrasyonL-WRN şartlandırılmış ortam, Nikotinamid ve SB202190 içermeyen WRNE ortamı
*Y-27632 (5 mM) isteğe bağlı200 μL10 μM
A 83-01 (500 μM)100 μL500 deniz mili
İleri düzey DMEM/F1245 mL
B27 Sertifikası2 mL
EGF (50 μg/mL)100 μL50 ng/mL
Gastrin (10 μM)100 μL10 nM
GlutaMax (100X)1 mL
HEPES 1 M1 mL
L-WRN Con- Medya50 mL~P
N21 mL
N-Asetilsistein (500 mM)100 μL500 μM
Nikotinamid 1 M1 mL10 milyon
SB202190 (10 mM)100 μL10 μM
Toplam Hacim100 mL
CMGF- Orta
İleri düzey DMEM/F12500 mL
Glutamax (Glutamaks)5 mL100 kat
1 M Hepes5 mL

Tablo 1: Kullanılan çeşitli ortamların bileşimi.

Tartışma

Tek hücreli genomik platformlar kullanılarak, bağırsak epitelini modelleyen doku türevli HIO kültürleri gibi karmaşık biyolojik sistemler, genel biyolojik yanıtabireysel hücresel katkılar sağlamak için parçalanabilir 4,5,6. Hücresel heterojenlik ve nadir hücre popülasyonları da tanımlanabilir ve sorgulanabilir. Tek hücreli transkriptomik tabanlı platformlar kullanılarak çıktıyı en üst düzeye çıkarmak için hücresel girişin optimize edilmesi gerekir. Burada, aşağı yönde yüksek kaliteli transkriptomik veri elde etme olasılığını artıracak son derece uygulanabilir ve kaliteli tek hücreli süspansiyonlar sağlayacak protokolleri açıklıyoruz. Protokole aşinalık son derece önemlidir ve kütüphane hazırlığına devam etmeden önce birkaç uygulama çalışmasının yapılması önerilir. Hücrelerin kütüphane hazırlığı için kullanılmasından önce canlı tek hücre süspansiyonlarının tekrarlanabilir başarısı önerilmektedir. Protokolün uygulanma hızı son derece önemlidir, çünkü hız, uygulanabilirlik sonuçlarıyla doğru orantılıdır. Buna dayanarak, bir seferde işlenen numune sayısının sınırlandırılması tavsiye edilir. Sorun giderme konusunda yardım almak için bu protokolleri başlatmadan önce kitaplıkları hazırlayacak varlıkla arabirim oluşturulması önerilir.

HIO canlılığı, dizileme için gönderilen DNA kütüphanesini doğrudan etkiler. HIO'nun hücre canlılığı, tek hücreli süspansiyonun hazırlanmasında ayrışma, santrifüjleme, tamponlar, pipetleme ve sayım doğruluğu dahil olmak üzere birkaç adıma bağlıdır. HIO'ları platform için hazırlamanın amacı, hücre canlılığının korunmasını numune kalitesi ile dengelemektir. Yüksek kaliteli veri elde etmek için kritik olan, hücresel agregaların, ölü hücrelerin, hücresel olmayan nükleik asitlerin ve ters transkripsiyonun biyokimyasal inhibitörlerinin en aza indirilmesidir. Ölen hücreler nükleik asit gürültüsünü artırır ve hücre topaklanmasına katkıda bulunur, bu da veri ve platform arızalarınayol açar 7,8,9,10,11,12. Uygun bir filtre boyutuyla filtreleme, büyük toplamaların kaldırılmasına ve veri kalitesinin artırılmasına yardımcı olabilir.

Tek hücreli süspansiyonlar hazırlanırken HIO hücre ölümünü en aza indirmek için çeşitli faktörlerin dikkate alınması gerekir. En az% 80 canlı hücre elde etmek gereklidir ve% >90 canlılık daha da arzu edilir. Çok sayıda canlı olmayan hücreye sahip numuneler, sütun bazlı mikro boncuklar gibi ölü hücreleri uzaklaştırmak için stratejiler kullanılarak iyileştirilebilir, ancak bunlar, işleme sırasındaki kayıp nedeniyle daha fazla başlangıç hücresi ve daha büyük numune hacimleri gerektirir. HIO'lar tamponlara karşı özellikle hassastır ve belirli tamponlarda RT'de çok uzun süre bırakılırsa hücre ölümüne uğrar. Organoid besiyeri, en az miktarda hücre kaybı ve agrega oluşumu ile sonuçlanır. Pipetleme, ayrışma sırasında HIO canlılığını da etkileyebilir. Düzenli delik uçları organoidleri keserek tek hücreli süspansiyonlara ayrışmaya yardımcı olabilir; bununla birlikte, normal bir delik ucuyla çok hızlı pipetleme, kesme kuvvetlerinden kaynaklanan HIO hücresi hasarına neden olabilir. Geniş delikli uçlarla yavaş pipetleme, HIO hücreleri üzerindeki stresi en aza indirir ve aşağı akıştaki canlı hücre sayılarını büyük ölçüde iyileştirir. Santrifüjleme, yıkama ve yeniden askıya alma, HIO tek hücre süspansiyonlarının kalitesini etkileyebilecek diğer faktörlerdir. Sallanan kova santrifüjü, HIO hücrelerinin daha nazik peletlenmesine neden olur, bu da hücre kaybını en aza indirirken daha az sayıda ölü hücre ile sonuçlanır. Son olarak, konsantrasyonu belirlemek için sayım doğruluğu, maksimum hücre sayısının kütüphane sentezi platformuna ulaşmasını sağlamak için çok önemlidir. Bu ayrıntılara dikkat edilmesi, izolasyon işlemi sırasında HIO hücreleri üzerindeki stresin en aza indirilmesine neden olacak ve işlemden sonra en yüksek veri geri dönüş olasılığını sağlayacaktır.

Tek hücreli transkriptomik, tek hücre düzeyinde biyolojik profilleri ve yanıtlarıincelemek için güçlü bir araç olmasına rağmen, insan bağırsak organoid kültürlerini analiz etmek için teknolojiyi uygularken dikkate alınması gereken birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, kütüphane hazırlama ve sıralama sırasında ortaya çıkan teknik değişkenlik veya numune hazırlamadan kaynaklanan toplu etkiler nedeniyle önemli transkripsiyonel farklılıklar olabilir. Ek olarak, dizileme, genler veya hücreler arasında eşit olmayan dizileme derinliğinin olduğu durumlarda kapsama yanlılığına neden olabilir. Bu, düşük ifade edilen genleri tespit ederken veya nadir hücre popülasyonlarını tanımlarken zorluklara neden olur. İkincisi, organoid kültürlerin hücresel ve transkripsiyonel heterojenliği ve doğal bağırsak epiteli ile karşılaştırıldığında daha az farklılaşmış bir hücresel profil nedeniyle hücre tiplerinin tanımlanması zor olabilir. Transkripsiyonel yanıtları fonksiyonel fenotiplere bağlamak da bir zorluktur ve diğer yaklaşımlar veya tahliller kullanılarak ek doğrulama gerektirir. Üçüncüsü, bu yaklaşım, hücrelerin mekansal bağlamının veya zamansal dinamiklerinin dikkate alınmasını içermez. Ayrışma prosedürü, transkripsiyonel verilerden hücre-hücre etkileşimlerini çıkarma yeteneğini ortadan kaldırır. Biyolojik bir süreklilikten ziyade hücresel durumun zamanında yalnızca tek bir anlık görüntü sağlar. Son olarak, tek hücreli transkripsiyonel yaklaşımlar maliyetli olabilir ve özel hesaplama araçları ve biyoinformatik uzmanlığı gerektirebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, hücresel heterojenliği anlamak ve yeni hücre tiplerini tanımlamak için hala baskın bir son teknoloji araç olmaya devam etmektedir.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 hibeleri ve NASA İşbirliği Anlaşması Bildirimi/TRISH NNX16AO69A.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG914510 nM
%0.05 Tripsin-EDTAİnvitrojen25300054
%0.4 Tripan mavisiMillipore-SigmaT8154
0.5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca-Mg-Corning21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
24 kuyulu Nunclon delta yüzey doku kültürü kabıThermo Scientific142475
40 &mikro; m hücreli süzgeçFalcon352340
40 & m Flowmi uç süzgeciSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 & m Flowmi uç süzgeciSP Bel-Art LabwareH13680-0070
96 kuyulu plakaCorning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Teknolojileri7920
Gelişmiş DMEM/F12İnvitrogen12634-028
B27 takviyesiInvitrogen17504-0441X
Krom Sonraki GEM Tek Hücreli 3' GEM, Kütüphane & Jel Boncuk Kiti v3.110x GenomikPN-1000128
Kollajen IVSigma-AldrichC5533-5MG33 & mikro; g/mL
Corning Hücre Geri Kazanım Solüsyonu VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Canlandırıcı14190-1361X
GlutaMAX-ICanlandırıcı35050-0612 mM
HEPES 1MCanlandırıcı15630-08010 mM
L-WRN şartlandırılmış ortamATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, fenol içermeyenCorning356231
fare rekombinant EGFInvitrogenPMG8043 50 ng / mL
N2 takviyesiInvitrogen17502-0481X
N-AsetilsisteinSigma-AldrichA9165-5G500 & mikro; M
NikotinamidSigma-AldrichN063610 mM
SB202190Sigma-AldrichS706710 ve mikro; M
TranswellCorning3413
Y27632Kök Hücre Teknolojileri7230810 & mikro; M

Kaynaklar

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Blutt, S. E., et al. Gastrointestinal microphysiological systems. Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).
  3. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  4. Elmentaite, R., et al. Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).
  5. Hickey, J. W., et al. Organization of the human intestine at single-cell resolution. Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).
  6. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  7. Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).
  8. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).
  9. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).
  10. Beumer, J., et al. BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states. Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).
  11. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).
  12. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).
  13. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  14. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre Transkriptomi iOrganoid K lt rH cre DisosiasyonuTranskripsiyonel ProfillemeMikroak kan B l mlemeYeni Nesil DizilemeH cre Tipi Tan mlamaAyd nl k Alan Mikroskopisi

İlgili makaleler