Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

1.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66752

⸱

26 Nisan 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Mevcut çalışma, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını değerlendirmek ve bu hücrelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için protokoller göstermektedir.

Özet

Foliküler Yardımcı T (TFH) hücreleri, aynı kökenli B hücrelerinin yüksek afiniteli antikorlar üretmesine yardımcı olan ve böylece uzun süreli humoral bağışıklık sağlayan bağımsız bir CD4+ T hücre soyu olarak algılanır. Akut viral enfeksiyon sırasında, virüse özgü TFH hücrelerinin kader taahhüdü erken enfeksiyon fazında belirlenir ve erken diferansiye TFH hücrelerinin araştırılması, T hücresine bağımlı humoral bağışıklığın anlaşılmasında ve aşı tasarımının optimize edilmesinde çok önemlidir. Çalışmada, akut lenfositik koriomenenjit virüsü (LCMV) enfeksiyonunun bir fare modeli ve LCMV glikoprotein epitopu I-AbGP66-77'yi spesifik olarak tanıyan CD4 + T hücrelerine sahip TCR-transgenik SMARTA (SM) faresi kullanılarak, akış sitometrisi boyamalarına dayalı olarak virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader taahhüdüne erişmek için prosedürleri tanımladık. Ayrıca, SM CD4 + T hücrelerinin retroviral transdüksiyonundan yararlanılarak, erken farklılaşmış virüse özgü TFH hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle etmek için yöntemler de sağlanmaktadır. Bu nedenle, bu yöntemler, virüse özgü TFH hücrelerinin erken bağlılığının altında yatan mekanizma(lar)ı araştıran çalışmalara yardımcı olacaktır.

Giriş

Farklı patojenler veya tehditlerle karşılaşan saf CD4 + T hücreleri, özel işlevlere sahip çeşitli yardımcı T (TH ) hücre alt kümelerine farklılaşarak bağışıklık tepkilerini uyarlar1. Akut viral enfeksiyon senaryosunda, naif CD4+ T hücrelerinin büyük bir kısmı, B hücrelerine yardım sağlayan foliküler yardımcı T (TFH) hücrelerine farklılaşır 2,3. Diğer CD4 + T H hücre alt kümelerinden farklı olarak (örneğin, TH1, TH2, TH9 ve TH17 hücreleri), TFH hücreleri, B hücresi homing kemokin CXCL13 için kemokin reseptörü olan önemli bir CXCR5 seviyesini eksprese eder ve TFH hücrelerinin B hücresi foliküllerine göç etmesini sağlar. B hücre foliküllerinde, TFH hücreleri, germinal merkez reaksiyonlarını başlatmada ve sürdürmede aynı kökenli B hücrelerine yardımcı olur, böylece hızlı yüksek afiniteli antikor üretimi ve uzun süreli humoral hafızasağlar 2,3.

Akut viral enfeksiyon üzerine, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader taahhüdü 72 saat 4,5 içinde gerçekleşir ve TFH hücresi kader kararlarını yöneten "ana düzenleyici" olarak görev yapan transkripsiyonel baskılayıcı B hücreli lenfoma-6 (Bcl-6)5,6,7,8 tarafından kontrol edilir. Bcl-6 eksikliği, TFH hücre farklılaşmasını ciddi şekilde köreltirken, ektopik Bcl-6 ekspresyonu, TFH hücre kaderi bağlılığını önemli ölçüde arttırır. Bcl-6'ya ek olarak, erken TFH hücre kaderi taahhüdünün talimatında birden fazla molekül yer alır. Transkripsiyon faktörleri TCF-1 ve LEF-1, Bcl-6 9,10,11'in indüksiyonu yoluyla TFH hücre farklılaşmasını başlatır. Blimp1'in hem Bcl-6 hem de TCF-1 tarafından inhibisyonu, erken TFH hücre kader taahhüdü11,12 için gereklidir. Erken TFH hücre farklılaşması için STAT1 ve STAT3 de gereklidir13. Ayrıca, histon metiltransferaz EZH214,15 ve m6A metiltransferaz METTL316 ile yapılan epigenetik modifikasyonlar, TFH hücre transkripsiyonel programlarını (özellikle Bcl6 ve Tcf7) stabilize etmeye ve böylece erken TFH hücre kader bağlılığını artırmaya yardımcı olur. Yukarıda bahsedilen moleküller ve diğerleri de dahil olmak üzere, başka bir yerdeözetlenen ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, erken TFH hücre kaderi bağlılığının transkripsiyonel ve epigenetik düzenlemelerini anlamada ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, daha önce bilinmeyen moleküller öğrenilmeyi beklemektedir.

Akut lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) enfeksiyonunun fare modelinde, LCMV glikoprotein epitopu I-AbGP66-77'yi spesifik olarak tanıyan evlat edinilmiş konjenik TCR-transgenik SMARTA (SM) CD4 + T hücreleri, viral enfeksiyon sırasında TFH veya TH1 hücre farklılaşmasına uğrar. Bu TFH / TH1 çatallanma farklılaşma modeli, virüse özgü TFH hücrelerinin biyolojisini incelemede SM / akut LCMV enfeksiyon modelinin ilerlemesini destekler. Gerçekten de, SM / akut LCMV enfeksiyon modeli, TFH hücre araştırma alanında yaygın olarak kullanılmaktadır ve TFH hücre biyolojisindeki kilometre taşı keşiflerinde çok önemli bir rol oynamıştır. Bu, yukarıda bahsedilen Bcl-6'nın TFH hücrelerinin 5,6 soy tanımlayıcı transkripsiyon faktörü olarak tanımlanmasını ve ayrıca diğer önemli transkripsiyonel faktörleri (örneğin, Blimp-16, TCF-1 / LEF 9,10,11, STAT1 / STAT313, STAT517, KLF218 ve Itch19) TFH hücre farklılaşmasına, transkripsiyon sonrası düzenlemelere ( örneğin, METTL316 ve miR-17 ~ 9220) TFH hücre farklılaşması, TFH hücre hafızası ve plastisite21,22 ve TFH hücrelerini hedefleyen rasyonel aşılama stratejileri (örneğin, selenyum23).

Mevcut çalışma, (1) erken farklılaşmış TFH hücrelerine erişmek için uygun akut LCMV ile enfekte SM kimera fare modelinin oluşturulması, (2) erken farklılaşmış TFH hücrelerine ilişkin moleküllerin akış sitometrisi boyamalarının yürütülmesi ve (3) SM CD4 + 'da retroviral vektör tabanlı gen manipülasyonu gerçekleştirme dahil olmak üzere, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader taahhüdüne erişmek için tekrarlanabilir yöntemleri açıklamaktadır T hücreleri. Bu yöntemler, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını araştıran çalışmalar için faydalı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan prosedürler izlenerek gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada aşağıdaki fare suşları kullanılmıştır: C57BL/6J (B6) fare (her iki cinsiyet), 6 ila 8 haftalık, 25-30 g ağırlığında; CD45.1+SM TCR transgenik fare (B6 CD45.1 × SM TCR transgenik), her iki cinsiyet, 6 ila 8 haftalık, 25-30 g ağırlığında; ve CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR transgenik fare (B6 CD45.1 × SM TCR transgenik × CXCR5-GFP knock-in), her iki cinsiyet, 6 ila 8 haftalık, 25-30 g ağırlığında. Transgenik türler, daha önce yayınlanmış bir raporun ardından üretildi24. Çalışmada kullanılan reaktiflerin, tamponların ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Evlat edinen transfer için CD45.1 + SM CD4 + T hücrelerinin toplanması

  1. Ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) gerekli sayıda 6 ila 8 haftalık CD45.1 + TCR transgenik SM fareleri24. Ötenazi yapılan farelerin periton duvarının solunda cerrahi makasla 1 inçlik bir kesi yapın, dalakları peritondan ayırın ve dalağın arkasındaki bağ dokusunu yırtın25,26.
  2. Her dalağı bir Petri kabı (60 mm × 15 mm) içindeki 70 μm'lik bir hücre süzgecine yerleştirin ve dalağı 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak 3 mL kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu ile öğütün.
    NOT: Sadece bağ dokusu kalana kadar dalağı öğütmek için şırınga pistonunun yuvarlak tarafını kullanın.
  3. 3 mL RBC lizis tamponunu seyreltmek için her tabağa 6 mL RPMI +% 2 FBS (% 2 RPMI) ekleyin. Hücre süspansiyonlarını tabaktan 15 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin. Çanağı ek olarak 3 mL %2 RPMI ile durulayın ve aynı konik tüpe aktarın.
  4. Hücre süspansiyonlarını 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon yoluyla atın. Hücreleri bir izolasyon tamponu ile yeniden askıya alın ve hücre yoğunluğunu mL başına ~ 1 × 108 hücre olarak ayarlayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
  5. CD4 + T hücrelerinin zenginleştirilmesi için izolasyon tamponunda CD8a, CD19, NK1.1, F4 / 80, CD11c ve Ter119'a karşı 1x biyotinile antikor kokteyli hazırlayın.
    NOT: Biyotinile antikorları, Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi belirtilen seyreltmede izolasyon tamponuna ekleyin. Antikor kokteylinin hacmini, adım 1.4'teki izolasyon tamponunun hacmiyle aynı tutun.
  6. Hücre süspansiyonlarını 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon yoluyla atın.
  7. Konik tüpte belirtilen 1x biyotinile antikor kokteyli ile hücre peletini yeniden süspanse edin.
  8. Konik boruyu 45 rpm'de 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıda buzun üzerine koyun.
  9. Biyotinile antikorlarla inkübasyon sırasında, üreticinin talimatlarına göre gerekli hacimde streptavidin kaplı boncuklar hazırlayın.
    NOT: Bir saf fareden alınan toplam splenositlerin 200 μL streptavidin kaplı boncuklara ihtiyacı vardır.
  10. Hücreleri 800 x g'da 8-10 mL izolasyon tamponu ile 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyerek yıkayın ve süpernatanı atın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
  11. Hazırlanmış streptavidin kaplı boncuklarla hücre peletini yeniden süspanse edin.
  12. Tüpü 45 rpm'de 40 dakika boyunca bir çalkalayıcıda buzun üzerine koyun.
  13. Ardından, tüm boncuklar manyetik tarafa monte edilene kadar tüpü 3-4 dakika manyetik bir stand üzerine koyun.
  14. Süpernatanı dikkatlice toplayın ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
  15. Hücre süspansiyonlarını 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon ile atın.
    NOT: CD4+ T hücresi zenginleştirmesi için, adım 1.5-1.15'te açıklanan CD4+ T hücresi zenginleştirme prosedürünün yerine kullanılabilecek başka ticari kitler de mevcuttur.
  16. Hücre peletini 2-3 mL% 2 RPMI ile yeniden süspanse edin. CD4 + T hücresi zenginleştirmesinin (CD4 ve Vα2) etkinliğinin ve hücre canlılığının akış sitometrisi analizi için 50 μL hücre süspansiyonunu aspire edin.
  17. Hücre süspansiyonlarını 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon ile atın. Hücre peletini RPMI ile yeniden askıya alın ve hücre yoğunluğunu mL başına 1 × 107 CD4 + Vα2 + SM hücresine ayarlayın. Tüpü buzun üzerine koyun ve bir sonraki adımda evlat edinen hücre transferine geçin.

2. Erken diferansiye SM T FH hücrelerine erişim için akut LCMV ile enfekte SM kimera fare modelinin oluşturulması

  1. İntravenöz enjeksiyon için kuyruk damarını genişletmek için 6 ila 8 haftalık C57BL / 6 alıcı fareleri kızılötesi bir lamba ile ısıtın.
  2. Adım 1.17'de hazırlanan 1 × 106 SM hücresi içeren 100 μL hücre süspansiyonunu bir insülin şırıngası ile aspire edin.
    NOT: Enjeksiyon hacmi her araştırmacı tarafından değiştirilmeli ve kurumsal ve yerel yasaların izin verdiği maksimum enjeksiyon hacmini aşmamalıdır.
  3. Fareleri bir fare sabitleyici ile yerinde tutun, kuyruğu düzeltin ve kuyruk damarını görünür hale getirmek için bir pamuk top kullanarak kuyruğu %75 etanol ile silin.
  4. İnsülin şırınga iğnesini kuyruk damarına yerleştirin ve hücre süspansiyonlarını düzgün ve yavaş bir şekilde enjekte edin. Ardından, alıcı farelerin gece boyunca dinlenmesine izin verin.
  5. Ertesi gün, 1 × 107 plak oluşturan birim / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için LCMV Armstrong virüs stoğunu RPMI ortamı ile seyreltin.
  6. 100 μL seyreltilmiş LCMV Armstrong solüsyonu (1 × 106 plak oluşturan birim içeren) alıcı farelerin kuyruk damarına enjekte edin.
    NOT: Her araştırmacı, önerilen bulaşıcı titreye kurumsal ve yerel yasalar tarafından izin verilip verilmediği konusunda dikkatli olmalıdır.

3. Erken diferansiye SM, T,FH hücrelerinin akış sitometrisi boyamaları

  1. Enfeksiyondan sonraki 3. günde adım 2.6'dan itibaren fareleri (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) feda edin ve dalaklardan lenfositleri adım 1'de açıklandığı gibi işleyin. Hücre yoğunluğunu mL başına yaklaşık 2 × 107 hücreye ayarlayın.
  2. Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya 50 μL hücre süspansiyonu (~ 1 × 106 hücre) yükleyin ve oyuk başına 150 μL boyama tamponu ile doldurun. Plakayı buzun üzerinde tutun.
  3. Saflaştırılmış sıçan anti-fare CXCR5 antikor kokteylini (yani, CXCR5 birincil antikoru) bir tüpteki her numune için 50 μL TFH hücre boyama tamponunda 1:50 seyreltmede hazırlayın. Tüpü iyice girdaplayın ve parçacıkları toplamak için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin. Tüpü buz üzerinde tutun.
  4. 96 oyuklu plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
  5. Adım 3.4'ü tekrarlayın ve hücreleri kuyucuk başına 50 μL CXCR5 birincil antikoru ile yeniden süspanse edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
  6. Biyotinile edilmiş keçi anti-sıçan antikor kokteylini (yani, CXCR5 ikincil antikoru) yeni bir tüpteki her numune için 50 μL TFH hücre boyama tamponunda 1:200 seyreltmede hazırlayın. Tüpü girdaplayın ve parçacıkları toplamak için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin. Tüpü buz üzerinde tutun.
  7. Plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
  8. Adım 3.7'yi iki kez tekrarlayın ve plakayı buz üzerinde tutun.
  9. Plakaya oyuk başına 50 μL CXCR5 ikincil antikoru ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  10. Floresan konjuge streptavidin (yani, CXCR5 üçüncül antikor) her numune için 50 μL TFH hücre boyama tamponunda 1:200 seyreltmede hazırlayın. Bu arada, yüzey belirteçlerine (örneğin, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 ve diğer ilgili moleküller) ve CXCR5 üçüncül antikoru ile birlikte ölü hücre boyasına karşı başka antikorlar ekleyin.
  11. Tüpü vorteksleyin ve parçacıkları toplamak için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin. Tüpü buz üzerinde tutun.
  12. Plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
  13. Adım 3.12'yi iki kez tekrarlayın ve plakayı buz üzerinde tutun.
  14. Plakaya her kuyucuk için 50 μL CXCR5 üçüncül antikor kokteyli ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve karanlıkta 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  15. Üreticinin talimatlarına göre her kuyucuk için 200 μL fiksasyon/geçirgenleştirme tamponu hazırlayın.
  16. Plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
  17. Adım 3.16'yı iki kez tekrarlayın ve plakayı karanlıkta buz üzerinde tutun.
  18. Her kuyucuğa 200 μL fiksasyon/geçirgenleştirme tamponu ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek ve oda sıcaklığında 30 dakika (karanlıkta) inkübe ederek iyice karıştırın.
    NOT: Geçirgenleştirme tamponunu (1x) üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
  19. Bcl-6, TCF-1, T-bet ve diğer ilgili moleküller dahil olmak üzere transkripsiyonel faktörlere karşı antikor kokteylini, yeni bir tüpteki her bir kuyucuk için 50 μL geçirgenlik tamponunda (1x) hazırlayın.
  20. Tüpü girdaplayın ve parçacıkları toplamak için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
  21. Plakayı 4 ° C'de 1 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın, plakayı kısaca girdaplayın ve kuyucuk başına 50 μL transkripsiyonel faktör antikor kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  22. Plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın, plakayı dekantasyon ile kısaca vorteksleyin ve oyuk başına 200 μL geçirgenlik tamponu (1x) ekleyin.
  23. Adım 3.22'yi tekrarlayın.
  24. Her bir oyuğa 200 μL boyama tamponu ekleyin, plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile atın ve plakayı kısaca girdaplayın.
  25. Her bir oyuktaki hücre peletini 200 μL boyama tamponu ile yeniden süspanse edin ve hücreleri anında akış sitometresi analizi için akış sitometri tüplerine aktarın.
    NOT: Alternatif olarak, numuneler her tüpe 200 μl %2 PFA eklenmesi ve karanlıkta 4 °C'de saklanması koşullarında 3 gün içinde tespit edilebilir.

4. Retrovirüs üretimi

  1. 293T hücrelerini (on geçişten az olan) DMEM% 10 ortamı ile 10 cm'lik bir kültür kabında 2-3 geçişlik bir süre boyunca yetiştirin.
  2. Hücreler% 90 birleşmeye ulaştığında, eski ortamı atın ve hücreleri PBS ile iki kez nazikçe yıkayın, ardından 1 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 mL% 0.25 Tripsin-EDTA kullanarak 293T hücrelerinin kısa bir tripsinizasyonu yapın.
  3. Hücreleri 2 mL önceden ısıtılmış %10 DMEM ortamında yeniden süspanse ederek, 15 mL'lik konik bir tüpe aktararak ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyerek sindirim sürecini durdurun.
  4. Süpernatanı atın ve 2 mL önceden ısıtılmış %10 DMEM ortamı ile kültür ortamını yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin.
  5. 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 2.5 mL% 10 DMEM ortamında 5 ×10 5 hücre hücre ve plaka sayısını ölçün.
    NOT: 293T hücrelerinin tabağa eşit şekilde yayılmasını sağlamak için tabağı hafifçe döndürün.
  6. 293T hücre birleşmesi %80'i aştığında, transfeksiyon reaktiflerini adım 4.7 ila 4.9'da açıklandığı gibi hazırlayın.
  7. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu için, steril 1,5 mL'lik bir tüpe 250 μL önceden ısıtılmış Opti-MEM ortamı ekleyin. Ardından, Opti-MEM ortamına 3 μg plazmit DNA (2 μg retroviral vektör ve 1 μg pCL-Eco içeren) ekleyin, ardından tam karıştırmayı sağlamak için yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme yapın.
    NOT: Bu çalışmada örnek olarak kullanılan retroviral vektörler, IRES-GFP'nin (MigR1-Bcl6) yukarı akışında Bcl6 CDS bölgesi ile MigR1 ve modifiye MigR1 vektörüdür.
  8. Daha sonra, karışıma 7,5 μL önceden ısıtılmış transfeksiyon reaktifi (ticari olarak elde edilir) ekleyin ve iyice karıştırmayı sağlamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
  9. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  10. Karışımı, 293T hücre kültürü yapılmış kuyucuğun farklı bölgelerine damla damla dağıtın, ardından karışımın eşit dağılımını sağlamak için kültür kabını ileri geri ve yan yana hareketlerle hafifçe sallayın.
  11. 293T hücrelerini% 5 CO2 içeren 37 ° C inkübatörde 72 saat inkübe edin.
  12. Bir floresan mikroskobu veya akış sitometrisi kullanarak transfekte edilmiş 293T hücrelerinde transfeksiyon etkinliğinin vekili olarak retroviral vektörün etiketini tespit edin.
    NOT: Örneğin, MigR1 vektör transfekte edilmiş 293T hücrelerinin önemli bir kısmında GFP floresan sinyalini doğruladık, bu da yüksek kaliteli transfeksiyon olduğunu düşündürdü.
  13. Hücre kültürü ortamını toplayın ve hücresel kalıntıları ortadan kaldırmak için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.500 × g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatant, -80 °C'de uzun süreli koruma için dikkatlice toplanmalı ve saklanmalı veya geçici olarak 4 °C'de tutulmalıdır.

5. SM CD4 + T hücrelerinin in vivo aktivasyonu, retrovirüs transdüksiyonu ve evlat edinici transferi

  1. 100 μL RPMI ortamı hacminde 200 μg LCMV GP61-77 peptid11,14 ile intravenöz olarak bir CD45.1+ SM faresine (6 ila 8 haftalık) enjekte edin.
    NOT: Enjeksiyon hacmi her araştırmacı tarafından değiştirilmeli ve kurum ve yerel yasaların izin verdiği maksimum enjeksiyon hacmini aşmamalıdır.
  2. Peptit enjeksiyonundan 16-18 saat sonra SM faresini ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Adım 1'de belirtilen prosedürleri izleyerek splenositleri edinin.
    NOT: Alternatif olarak, in vitro anti-CD3 / anti-CD28 stimülasyon yöntemi27,28, adım 5.1 ve 5.2'de açıklanan in vivo peptit stimülasyonu yerine SM CD4 + T hücrelerini aktive etmek için kullanılabilir.
  3. Splenositleri% 2 RPMI ile askıya alın ve hücre yoğunluğunu 15 mL'lik konik bir tüpte mL başına yaklaşık 1 ×10 8 hücreye ayarlayın. Tüpü buz üzerinde tutun.
  4. 50 μL hücre süspansiyonunu yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya dağıtın ve oyuk başına 150 μL boyama tamponu ile destekleyin.
  5. Hücreleri peletlemek için 96 oyuklu plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile dikkatlice çıkarın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
  6. Adım 5.5'i tekrarlayın ve SM CD4 + T hücrelerinin aktivasyon durumunu tespit etmek için hücreleri CD4, CD25 ve CD69 dahil olmak üzere 50 μL yüzey antikor kokteyli ile yeniden süspanse edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve karanlıkta 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  7. Her bir kuyucuğu 200 μL'ye kadar boyama tamponu ile doldurun, ardından plakayı 4 ° C'de 1 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dekantasyon ile atın ve plakayı kısaca girdaplayın.
  8. Adım 5.7'yi iki kez tekrarlayın.
  9. Hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve bunları bir akış sitometri tüpüne aktarın.
  10. SM CD4 + T hücrelerinin aktivasyon durumunu değerlendirmek için floresan konjuge antikor lekeli hücreleri bir akış sitometrisi ile analiz edin.
    NOT: Aktive edilmiş SM CD4 + T hücreleri, naif hücrelere kıyasla bol miktarda CD25 ve CD69 ekspresyonu sergiledi, böylece sonraki transdüksiyon prosedürlerini mümkün kıldı.
  11. 24 oyuklu bir plakaya kuyucuk başına 1 × 106 SM CD4 + T hücresi (adım 5.3'ten itibaren) ekleyin. Hücreleri 800 × g'da 4 °C'de 3 dakika boyunca döndürün, ardından ortamı dekantasyon ile dikkatlice çıkarın.
  12. Her bir oyuk için adım 4.13'te tarif edildiği gibi 1 mL retrovirüs ortamı ve 8 μg polibren ekleyin.
  13. Hücreleri 37 ° C'de 2 saat boyunca 800 × g'da döndürün.
  14. Retrovirüs ortamını pipetleme ile dikkatlice atın ve her oyuğa 10 ng/mL rekombinant murin IL-2 ile desteklenmiş 1 mL önceden ısıtılmış %10 RPMI ekleyin.
  15. Hücreleri% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde 48 saat inkübe edin.
  16. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 4 ° C'de 6 dakika boyunca 800 × g'da döndürün.
  17. Süpernatanı dekantasyon ile çıkarın ve 15 mL'lik bir konik tüpte mL başına 1 ×10 8 hücrelik bir hücre yoğunluğu elde etmek için hücreleri uygun bir hacim% 2 RPMI ile yeniden süspanse edin. Tüpü buz üzerinde tutun.
  18. 50 μL hücre süspansiyonunu yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya dağıtın ve oyuk başına 150 μL boyama tamponu ile destekleyin.
  19. Hücreleri peletlemek için 96 oyuklu plakayı 800 × g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dekantasyon ile dikkatlice çıkarın, plakayı kısaca girdaplayın ve oyuk başına 200 μL boyama tamponu ekleyin.
  20. Adım 5.19'u tekrarlayın ve hücreleri CD4, Vα2 ve vektör etiketi ile ilişkili antikor dahil olmak üzere 50 μL yüzey antikor kokteyli ile yeniden süspanse edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve karanlıkta 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  21. Her bir kuyucuğu 200 μL'ye kadar boyama tamponu ile doldurun, ardından plakanın 1 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjlenmesini izleyin. Süpernatanı dekantasyon ile atın ve plakayı kısaca girdaplayın.
  22. Adım 5.21'i iki kez tekrarlayın.
  23. Hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve bunları bir akış sitometri tüpüne aktarın.
  24. SM CD4 + T hücrelerinde transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için floresan konjuge antikor lekeli hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin.
    NOT: Verimli bir şekilde transdüksiyon yapan SM CD4 + T hücreleri, çalışmada GFP gibi retrovirüs etiketinin yüksek ekspresyonunu sergiledi.
  25. Hücre süspansiyonlarını adım 5.17'den itibaren 800 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon ile atın. RPMI ile hücre peletini yeniden süspanse edin ve hücre yoğunluğunu 1 × 107 CD4 + Vα2 + SM hücreleri / mL'ye ayarlayın.
  26. Adım 5.25'te 100 μL hücre süspansiyonunun intravenöz enjeksiyonu ile her bir C57BL / 6 alıcı fareye (6 ila 8 haftalık) toplam 1 × 106 CD45.1 + SM CD4 + T hücresi aktarın.
  27. Ertesi gün, C57BL / 6 alıcı fareleri intravenöz enjeksiyon yoluyla 1 × 106 plak oluşturan ünite LCMV Armstrong ile enfekte edin.

6. Erken akut LCMV enfeksiyonu aşamasında retrovirüs ile transdüksiyonlu SM TFH hücrelerinin akış sitometrisi analizi

  1. Enfeksiyondan sonraki 3. günde adım 5.25'ten itibaren C57BL / 6 farelerinden splenositleri alın.
  2. CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 ve diğer ilgili moleküller dahil olmak üzere yüzey belirteçlerinin akış sitometrisi boyamalarını adım 3'te açıklandığı gibi splenositlerde gerçekleştirin.
  3. Floresan proteinler tarafından etiketlenen retrovirüs ile transdüksiyona uğrayan SM CD4 + T hücrelerinde transkripsiyonel faktörlerin tespiti için, her bir oyuğa 200 μL% 2 PFA ekleyin ve karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. İlgili transkripsiyonel faktörlerin fiksasyon/geçirgenlik, akış sitometrisi boyaması ve adım 3'te açıklandığı gibi akış sitometrisi analizi gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Akut LCMV enfeksiyonu sırasında erken diferansiye virüse özgü TFH hücrelerinin özellikleri
Virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını araştırmak için, LCMV GP epitopu IAbGP66-77'yi spesifik olarak tanıyan naif konjenik SM CD4+ T hücreleri, CD45.2+ C57BL / 6 alıcılarına evlat edinerek aktarıldı. Ertesi gün, bu alıcılara intravenöz olarak yüksek dozda akut rezolüsyonlu LCMV Armstrong enjekte edildi (Şekil 1A...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

TFH hücreleri alanındaki araştırmalar, TFH hücrelerinin B hücrelerine yardımcı olmada özel işlevinin keşfedilmesinden bu yana vurgulanmıştır. Biriken çalışmalar, TFH hücre farklılaşmasının çok aşamalı ve çok faktörlü bir süreçolduğunu göstermiştir 30, burada TFH hücre kaderi taahhüdü erken evre5'te belirlenir. Bu nedenle, erken diferansiye TFH hücrelerinin altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması, TFH

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 32300785 - X.C.), Çin Ulusal Yenilikçi Yetenekler Doktora Sonrası Programı (No. BX20230449'den X.C.'ye) ve Ulusal Bilim ve Teknoloji Büyük Projesi (No. 2021YFC2300602'den L.Y.'ye).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTACorning25-052-CI
4 Paraformaldehit Fiks Çözeltisi,% 4 PFABeyotimeP0099-500mL
70 & mu; m hücre süzgeciMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-fare TCR V & alpha; 2 (klon B20.1)Biolegend1278121:200 seyreltme
Alexa Fluor 700 anti-fare CD45.1 (klon A20)Biolegend1107241:200 seyreltme
APC anti-fare CD25 (klon PC61)Biolegend1019101:200 seyreltme
B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) fareJackson Laboratuvarı002014
Kunduz Boncukları StreptavidinKunduz22321-10
Biotin anti-fare F4/80 Antikor (klon BM8)Biolegend1231061:200 seyreltme
Biotin Sıçan anti-fare CD11c (klon N418)Biolegend1173041:200 seyreltme
Biotin Sıçan anti-Fare CD19 (klon 6D5)Biolegend1155041:200 seyreltme
Biotin Sıçan anti-Fare CD8a (klon 53-6.7)Biolegend1007041:200 seyreltme
Biotin Sıçan anti-fare NK-1.1 (klon PK136)Biolegend1087041:200 seyreltme
Biotin Sıçan anti-fare TER-119 / Eritroid Hücreleri (klon TER-119)Biolegend1162041:200 seyreltme
sığır serum albümini, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (klon 4B10)Biolegend6448161:100 seyreltme
Brilliant Violet 605 anti-fare CD279 (PD-1) (klon 29F.1A12)Biolegend1352201:200 seyreltme
C57BL/6J (B6) fareJackson Laboratuvarı000664
CXCR5-GFP knock-in muhabir fareKurum içerisinde; CXCR5-GFP knock-in fare hattı, Cxcr5'in açık okuma çerçevesinden sonra bir IRES-GFP yapısının eklenmesiyle oluşturuldu.
DMEM %10 ortaDMEM ortamı %10 FBS
DMEM ortamıGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal sığır serumu, FBSSigmaF8318
FlowJo (sürüm 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon SetiInvitrogen00-5523-00Kit üç reaktif içerir: a. Fiksasyon/Geçirgenleştirme Konsantresi (4X); b. Fiksasyon / Geçirgenleştirme Seyrelticisi; c. Geçirgenleştirme Tamponu.
Keçi Anti-Sıçan IgG Antikoru (H + L), BiyotinileVektör laboratuvarlarıBA-9400-1.51:200 seyreltme
Invitrogen EVOS FL Otomatik Hücre Görüntüleme SistemiThermoFisher Bilimsel
İzolasyon tamponu%0,5 BSA ve 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptit içeren FACS tamponu (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke Kiti, 633 veya 635 nm uyarma içinYaşam TeknolojileriL101991:200 seyreltme
MigR1addgene# 27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM ortamıGibco31985070
pCL-Ecoaddgene# 12371
PE anti-fare CD69 (klon H1.2F3)Biolegend1045081:200 seyreltme
PE Fare anti-Bcl-6 (klon K112-91)BD Biosciences5615221:50 seyreltme
Fosfat tamponlu tuzlu su, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CXCR5 (klon 2G8)BD Biosciences5519611:50 seyreltme
Sıçan monoklonal PerCP anti-fare CD4 (klon RM4-5)Biolegend1005381:200 seyreltme
rekombinant murin IL-2Gibco212-12-1MG
Kırmızı Kan Hücresi Lizis TamponuBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 ortaSigmaR8758
RPMI %2RPMI 1640 %2 FBS
SMARTA (SM) TCR transgenik fareLaboratuvarımızdaki SM TCR transgenik hattı, Dr. Rafi Ahmed'in (Emory Üniversitesi) bir hediyesidir. Ek olarak, bu fare hattı Jackson Laboratuvarı'ndan da temin edilebilir (leke #: 030450).
%2 FBS ve %0.01 NaN3 içerenboyama tamponu
Streptavidin PE-Siyanin7eBioscience25-4317-821:200 seyreltme
TCF1 / TCF7 (C63D9) Tavşan mAb (Alexa Fluor 488 Konjugat) Hücre sinyalizasyon teknolojisi6444S1:400 seyreltme
TFH hücre boyama tamponu%1 BSA ve %2 fare serumu içeren FACS tamponu
TransIT-293 reaktifiMirus BioMIRUMIR2700
% içeren ortam PBS,

Kaynaklar

  1. O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  3. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
  4. Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
  5. Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
  6. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  7. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  8. Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  9. Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
  10. Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
  11. Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
  12. Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
  13. Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
  14. Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
  15. Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).
  16. Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).
  17. Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
  18. Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
  19. Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
  20. Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
  21. Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
  22. Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
  23. Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
  24. Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
  25. Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).
  26. Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).
  27. Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
  28. Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931(2021).
  29. He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
  30. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
  31. Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  32. Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
  33. Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).
  34. Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Foliküler Helper T HücreleriVirüse Özgü T HücreleriAkut LCMV EnfeksiyonuAkış SitometrisiRetroviral TransdüksiyonCD4 Pozitif T HücreleriErken T Hücresi DiferansiyasyonuBCL6 EkspresyonuT Hücresi Kader BelirlemesiAşı Tasarımı
Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.