Yöntem makalesi

Canlı Floresan Mikroskobu Kullanılarak İnsan Kolonik Organoidlerinde Sitokin ile İndüklenen Hücre Ölümünün Miktar Tayini

2.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66759

⸱

2 Ağustos 2024

 , 
1APC Microbiome Ireland, University College Cork, 2School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork

Bu makalede

Özet

Bu protokol, sitokinler gibi sitotoksik pertürbagenlere yanıt olarak insan kolonik organoidlerinde hücre ölümünü araştırmak ve ölçmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntemi tanımlar. Yaklaşım, sitotoksik uyaranlara tek organoid tepkileri ölçmek için bir floresan hücre ölüm boyası (SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası), canlı floresan mikroskobu ve açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı kullanır.

Özet

Ülseratif kolit (UC) ve Crohn hastalığı (CH) gibi inflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD) olan hastalarda bağırsak epitel hücresi (IEC) ölümü artmıştır. Bu, bağırsak bariyeri fonksiyonundaki kusurlara, inflamasyonun alevlenmesine ve hastalık immünopatogenezine katkıda bulunabilir. Sitokinler ve ölüm reseptör ligandları, IEC ölümündeki bu artıştan kısmen sorumludur. TNF-α ve IFN-γ gibi IBD ile ilgili sitokinler, hem bağımsız olarak hem de kombinasyon halinde IEC'lere karşı sitotoksiktir. Bu protokol, bir floresan hücre ölüm boyası (SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası), canlı floresan mikroskobu ve açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı kullanarak CD hastasından türetilen kolon organoidlerinde sitokin kaynaklı sitotoksisiteyi ölçmek için basit ve pratik bir testi tanımlar. Ayrıca, organoid sitotoksisiteye dayalı bir pertürbagen etkileşim katsayısını (CPI) hesaplamak için Bliss bağımsızlık matematiksel modelinin nasıl kullanılacağını da gösteriyoruz. CPI, sitokin kombinasyonları veya diğer pertürbaj türleri arasındaki etkileşimlerin antagonistik, katkı maddesi veya sinerjik olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, hasta kaynaklı kolonik organoidler kullanılarak sitokinlerin ve diğer pertürbagenlerin sitotoksik aktivitesini araştırmak için uygulanabilir.

Giriş

Bağırsak epiteli, bağırsak lümeninin içeriği ile alttaki dokular arasında fiziksel, yarı geçirgen bir bariyer oluşturur. Bu bariyeri etkili bir şekilde korumak için, bağırsak epitel hücreleri (IEC'ler), sürekli bir hücre ölümü ve rejenerasyon döngüsü ile son derece yüksek bir hücresel döngüye uğrar. Bununla birlikte, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gibi enflamatuar bozukluklar sırasında, daha yüksek seviyelerde anormal hücre ölümü meydana gelir1. Bu, bariyer fonksiyonunda ve bağışıklık sisteminin aktivasyonunda bir bozulmayı teşvik ederek daha fazla iltihabı tetikleyebilir. Bir IBD formu olan Crohn hastalığında (CH), sitokin sinyallemesinin artan IEC ölüm seviyelerine katkıda bulunduğu gösterilmiştir2. Sitokin sinyalinin IEC'lerin hücre ölümünü nasıl indüklediğini inceleyerek, IBD ve diğer bağırsak enflamatuar bozuklukları olan hastalar için daha iyi tedavilerin geliştirilebileceği umulmaktadır1.

Biyoloji ve ilaç hedefi keşif araştırmalarında, sinerjinin genellikle, bireysel uyaranların kombinasyonları ile tedavi edilen bir biyolojik sistemin, tek başına tek uyaranların birleşik ilave etkilerinden daha büyük bir kombinasyona yanıt göstermesi durumunda ortaya çıktığı anlaşılmaktadır. Sitokinler arasındaki sinerjik etkileşimler, doğuştan gelen antiviral tepkilerin yönlendirilmesinde iyi belgelenmiştir3. Sitokinlerin, IECS4 de dahil olmak üzere sinerjik olarak hücre ölümünü indüklediği bilinmektedir. Bununla birlikte, sinerjik sitotoksik sitokin sinyallemesinin IBD gibi bağırsak inflamatuar bozukluklarında oynadığı rol yeterince çalışılmamıştır.

İnsan bağırsak organoidleri, bağırsak epitel kök hücrelerinden üretilen in vitro olarak üretilen 3D mikro dokulardır. Bağırsak organoidleri, IBD'li hastalardan elde edilen bağırsak mukozal biyopsilerinden yetiştirilebilir ve hastalığın birçok özelliğini korur 5,6. Organoidlerin, bağırsak iltihabıbağlamında sitokin sitotoksisitesini incelemek için ideal bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır 7,8. Daha önce, grubumuz CD hastasından türetilen kolon organoidlerinde (kolonoidler) IBD ile ilişkili sitokinler IFN-γ ve TNF-α'nin sinerjik öldürme etkilerini karakterize etmiştir9,10. Bununla birlikte, bu sinerjik hücre ölümü biçimine aracılık etmede yer alan kesin mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Ayrıca, bağırsak inflamatuar bozuklukları ile ilgili potansiyel olarak daha birçok karakterize edilmemiş sitotoksik sitokin etkileşimi vardır.

Bağırsak organoidlerinde hücre ölümünü incelemek için çeşitli protokoller mevcuttur 10,11,12,13; Ancak, her birinin dezavantajları vardır. Bu tekniklerin bazıları sadece hücre canlılığını ölçer ve hücre ölümünü doğrudan ölçmez, tek organoid tepkileri değerlendiremez veya pahalı ekipman ve karmaşık protokoller gerektirir. Bağırsak organoidlerinde organoid hücre ölümünü ve pertürbagen etkileşimlerini ölçmek için sağlam ve basit metodolojilere ihtiyaç vardır. Sunduğumuz protokol, sitotoksik sitokinlere tek organoid yanıtları ölçmek için basit ve ucuz bir yaklaşımdır, ancak her türlü uyaran veya pertürbagen için kullanılabilir. Ayrıca, sitotoksik sitokin etkileşimlerini tanımlayan bir pertürbaj etkileşim katsayısını (CPI) hesaplamak için Bliss bağımsızlık sinerjisi modelinin nasıl kullanılacağını da gösteriyoruz.

Protokol

Kolon mukozal biyopsileri, bakım standardının bir parçası olarak rutin kolonoskopi yapılan ÇH'lı hastalardan toplandı. Hasta doku örneklerinin kullanımı ve bu örneklerden kolon organoid hatlarının oluşturulması için etik onay, Cork Eğitim Hastaneleri (CREC) Klinik Araştırma Etik Kurulu'ndan alınmıştır. Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Hasta biyopsileri ve kolonoidleri ile yapılan tüm doku kültürü çalışmaları, BSL2 güvenlik protokollerine uygun olarak bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir. Kullanmadan önce tüm plastik aşınmaların steril olduğundan emin olun. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, aletler ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

Grubumuzun kript izolasyonu ve organoid kültürü için kullandığı protokoller, yerleşik yöntemlerden 14,15,16 uyarlanmıştır ve daha önce yayınlanmıştır 9,10,17. Aşağıdaki protokol için kolonoidler Organoid Proliferasyon Ortamı kullanılarak kültürlendi (Tablo 1). Organoid Proliferasyon Ortamı kullanılarak büyütülen kolonoidler farklılaştırılmamış ve kolonik kök hücreler için zenginleştirilmiştir. Organoid Proliferasyon Ortamının birincil bileşeni, bağırsak kök hücre niş büyüme faktörleri Wnt-3A (W), R-spondin 3 ( R ) ve Noggin (N) 15'i içeren% 50 L-WRN şartlandırılmış ortamdır. Organoid Proliferasyon Ortamı, L-WRN şartlandırılmış ortam ve Serumsuz Ortam 1: 1'in birleştirilmesiyle hazırlanır, ardından nikotinamid ve kimyasal inhibitörler ile takviye edilir (Tablo 1).

1. Kolonik kript izolasyonu ve kolonoid kültürü

  1. 48 oyuklu bir mikrotitre plakasını 37 ° C'de,% 5 CO2'de kriptlerle tohumlamadan önce en az 72 saat önceden inkübe edin.
    NOT: Plakanın önceden inkübe edilmesi, tohumlama sırasında bazal membran ekstraktının (BME) polimerizasyonunu hızlandırır.
  2. Kriptlerin izolasyonundan önceki akşam BME'yi 4 °C'de buz üzerinde çözün.
  3. Kolon biyopsilerini 15 mL Biyopsi Toplama Ortamı (Tablo 1) içeren bir numune toplama tüpünde toplayın ve işlemeye hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.
  4. Bir pipet kullanarak mümkün olduğu kadar çok Biyopsi Toplama Ortamını dikkatlice çıkarın. Örnek tüpüne 2,5 μg/mL amfoterisin B ve 100 μg/mL gentamisin ile desteklenmiş 15 mL buz gibi DPBS ekleyerek biyopsileri yıkayın. Biyopsilerden herhangi bir mukoza veya kalıntıyı ayırmak için numune tüpünü kuvvetlice çalkalayın. Biyopsilerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verin ve bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla DPBS'yi dikkatlice çıkarın.
    1. Adım 1.4'ten itibaren yıkama prosedürünü iki kez (2x) tekrarlayın.
  5. Numune tüpüne 2.5 μg/mL amfoterisin B ve 200 μg/mL gentamisin ile takviye edilmiş 10 mL enzim içermeyen hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 30 rpm'de sallanarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  6. İnkübasyondan sonra, kolon kriptlerini serbest bırakmak için numune tüpünü elinizle kuvvetlice yan yana sallayın. Tüpü düşük güçlü bir ışık mikroskobu kullanarak inceleyin ve süspansiyon halinde serbest bırakılan kriptleri ve kript parçalarını arayın. Görünmüyorsa, tüpü sallayın ve tekrar kontrol edin; Kriptolar askıya alınmış olarak görülene kadar tekrarlayın.
  7. 50 mL'lik bir tüpe 70 μm'lik bir hücre süzgeci takın ve kript süspansiyonunu süzgeçten süzün. Boş numune tüpüne 10 mL buz gibi soğuk Organoid Yıkama Ortamı (Tablo 1) ekleyin, ortamı çıkarın ve hücre süzgecinden geçirin.
  8. Filtrelenmiş kriptleri iki adet 15 mL'lik tüpe (tüp başına 10 mL) aktarın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı her 15 mL'lik tüpten dikkatlice çıkarın, kript peletlerini 500 μL buz gibi soğuk Organoid Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin, kript solüsyonunu her iki 15 mL tüpten tek bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
  10. Süpernatanı mikrosantrifüj tüpünden dikkatlice çıkarın ve kript peletini 70 μL BME'de (oyuk başına 20 μL ve 10 μL ekstra ölü hacim) yeniden süspanse edin.
  11. Önceden inkübe edilmiş 48 oyuklu plakayı (adım 1.1) kullanarak, her bir kuyucuğun ortasına 20 μL BME/kript süspansiyonu tohumlayın (kuyucuk başına 1 BME kubbesi). Plakayı düzgün ve istikrarlı bir şekilde ters çevirin ve 37 °C, %5 CO2'de 20 dakika inkübe edin.
    NOT: Plakanın ters çevrilmesi, hücrelerin kuyunun plastik yüzeyine yapışmasını önler ve BME içinde dağılımlarını sağlar.
  12. Plakayı inkübatörden çıkarın. BME'nin tamamen polimerize olduğundan emin olun ve ardından kubbeleri 100 μg/mL geniş aralıklı bir antimikrobiyal reaktif ile desteklenmiş 350 μL önceden ısıtılmış Organoid Proliferasyon Ortamı ile kaplayın. Plakayı 37 °C, %5 CO2'de inkübe edin.
    NOT: Geniş kapsamlı antimikrobiyal reaktif, kolon biyopsileri ile ilişkili mukozal mikroplardan kontaminasyonu önlemek içindir. Sadece kript izolasyonunu takiben kültürün ilk haftası için gereklidir.
  13. Kültürün ilk haftası için geniş kapsamlı antimikrobiyal reaktif ile desteklenen, önceden ısıtılmış Organoid Proliferasyon Ortamı kullanarak ortamı haftada 2-3 kez değiştirin; Bu sürenin ardından reaktifi çıkarın.
  14. Kolonoid kültürü tamamen kurulduktan sonra (izolasyondan 1-2 hafta sonra), 10 μM ROCK-I/II inhibitörü Y-27632 ile takviye edilmiş enzimatik ayrışma reaktifini kullanarak kolonoidleri ayırın (kolonoid ayrışması ile ilgili tüm ayrıntılar için bölüm 2'ye bakınız).
    NOT: İlk iki pasaj (P0-1, P1-2) için, kolonoidler 1: 1/2 oranı kullanılarak genişletilmelidir; P2'den sonra, kolonoidler 1: 3/4 oranı kullanılarak geçilebilir.
  15. 1.11-1.13 adımlarını izleyerek kolonoidleri tohumlayın ve koruyun (Organoid Proliferasyon Ortamını geniş aralıklı antimikrobiyal reaktif ile takviye etmeyin).

2. Hücre ölümü testi için kolonoidlerin hazırlanması

NOT: Hücre ölümü test protokolünün tamamlanması 4 gün sürer (Şekil 1A).

  1. 48 oyuklu bir plaka formatı kullanarak kolonoidleri genişletin, oyuk başına 20 μL BME / kript süspansiyonu tohumlayın, 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin ve ortamı haftada 2-3 kez değiştirin (kuyu başına 350 μL).
  2. Hücre ölümü testi için hasattan yaklaşık 1 hafta önce kolonoidleri geçin. Kolonoidleri hasat etmeden önce, yüksek bir yoğunluğa (Şekil 1Bi) çoğaltıldıklarından, çaplarının yaklaşık 25-50 μm olduğundan ve aktif olarak çoğaldıklarından emin olun.
    NOT: Bu test için pasaj 3'ten pasaj 14'e kadar tutarlı sonuçlarla kolonoidler kullandık. Bununla birlikte, kolonoidlerin sitokinlere transkripsiyonel yanıtının kültür süresine bağlı olarak değişebileceği gösterilmiştir18. Bu temelde, 15. pasajdan sonra bu test için kolonoidlerin kullanılmamasını öneririz.
  3. 96 oyuklu mikrotitre plakalarını 37 ° C'de,% 5 CO2'de kolonoid hücrelerle tohumlamadan önce en az 72 saat önceden inkübe edin.
  4. Deneye başlamadan önceki akşam BME'yi 4 °C'de buz üzerinde çözdürün.
  5. 10 μM ROCK-I/II inhibitörü Y-27632 ile takviye ederek yeterli miktarda enzimatik ayrışma reaktifi (kolonoid oyuğu başına 500 μL) hazırlayın. Ortamı kolonoid içeren kuyucuklardan yavaşça çıkarın; Kolonoid kubbeye zarar vermemek için kuyu kenarından pipetleyin. Her oyuğa 300 μL enzimatik ayrışma reaktifi ekleyin.
    1. Her kuyucuk için, bir P1000 pipetinin ucuyla kuyu yüzeyini kazıyarak ve hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek kolonoid kubbeyi parçalayın; Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçınmaya çalışın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
      NOT: Bu 15 mL'lik tüp, 48 oyuklu plakanın 10 kuyusundan kolonoidleri toplamak için kullanılacaktır.
    2. Tüm kolonoid materyalin toplandığından ve aynı 15 mL'lik tüpe aktarıldığından emin olmak için aynı kuyuyu başka bir 200 μL enzimatik ayrışma reaktifi ile yıkayın. Hasat edilen genişlemiş kolonoidlerin her bir kuyusu için bu işlemi tekrarlayın ve bunları aynı tek 15 mL tüpte toplayın.
      NOT: Etkili ayrışma için, tüp başına maksimum 10 kuyu kolonoid toplanmalıdır. >10 kuyucuk topluyorsanız, toplanan kolonoidleri birden fazla 15 mL'lik tüpe eşit olarak bölün.
  6. 15 mL'lik tüpü, adım 2.5.2'den toplanan kolonoidlerle 37 ° C'de 5 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpü 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Tüpte yaklaşık 1.2 mL bırakarak süpernatanı nazikçe çıkarın.
    NOT: Bir sonraki adım, hızlı pipetleme kullanılarak kolonoidlerin fiziksel olarak ayrıştırılmasını gerektirir. Bunun etkili olması için, tüpte küçük bir hacimde hücre süspansiyonuna sahip olmanız gerekir - 15 mL'lik tüpte kalan 1.2 mL bu amaç için yeterlidir.
  7. Enzimatik ayrışma reaktifinin kalan 1.2 mL'sinde kolonoid peletini yeniden süspanse edin. 1.000 μL'ye ayarlanmış bir P1000 pipeti kullanarak, pipetin ucunu 15 mL'lik tüpün tabanının hemen üzerinde tutarak süspansiyona yerleştirin, ardından süspansiyonu ucun içine ve dışına hızla pipetleyin. Hızlı bir şekilde pipetlemek için, piston düğmesine ilk durma noktasına kadar hızlı bir şekilde basın, üst konumun yaklaşık yarısına gelene kadar düğmeyi bırakın ve tekrarlayın. Yaklaşık 10 saniye (30-40 inç) boyunca hızlı bir şekilde pipetleyin, ardından süspansiyonu tamamen yeniden süspanse edin ve pipetlemeyi tekrarlayın. 2-3 tur hızlı pipetleme yapın.
  8. Bütün kolonoid kalmadığını ve kolonoid fragmanlarının çoğunun yaklaşık 30-40 μm boyutunda olduğunu doğrulamak için numuneyi mikroskop altında kontrol edin (Şekil 1Bii).
  9. Numune daha fazla ayrışma gerektiriyorsa, 37 °C'deki su banyosunda 3 dakika daha inkübe edin, adım 2.7'deki pipetleme tekniğini tekrarlayın ve numuneyi mikroskop altında kontrol edin. Kolonoid fragmanlarının çoğu en uygun boyuta gelene kadar bu işlemi tekrarlayın.
    NOT: Kolonoidleri çok fazla ayırmamaya dikkat edin, çünkü bu aşırı hücre ölümüne, düşük kaplama verimliliğine ve cılız kolonoidlere neden olur.
  10. 15 mL'lik tüpe 10 mL buz gibi soğuk Organoid Yıkama Ortamı (Tablo 1) ekleyin. Tüpü 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın, 1 mL buz gibi soğuk Organoid Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ( kolonoid fragman tüpü olarak adlandırılır) aktarın.
  11. Kolonoid fragman tüpünün içeriğini pipetleme ile karıştırın ve 50 μL'lik bir numune alın; bu 50 μL'lik numuneyi yeni bir 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne (hücre sayım tüpü olarak adlandırılır) aktarın. Kolonoid fragman tüpünü bu noktadan adım 2.15'in tamamlanmasına kadar buz üzerinde saklayın.
  12. Hücre sayım tüpünü 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 10 μM ROCK-I/II inhibitörü Y-27632 ile takviye edilmiş 500 μL enzimatik ayrışma reaktifi içinde yeniden süspanse edin.
  13. Tek hücre sayım tüpünü 37 ° C'de 5 dakika su banyosunda inkübe edin. 400 μL'ye ayarlanmış bir P1000 pipeti kullanarak, numuneyi adım 2.7'de açıklandığı gibi pipetleyin ve tek hücreli bir süspansiyon olduğundan emin olmak için numuneyi mikroskop altında kontrol edin. Aksi takdirde, kolonoidler tek hücreli bir süspansiyona tamamen ayrışana kadar bu işlemi tekrarlayın.
  14. Tek hücre sayım tüpüne 1 mL Organoid Yıkama Ortamı ekleyin, 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Hücreleri 50 μL Organoid Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin ve ardından 50 μL tripan mavisi ekleyin.
  15. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 50 μL numunedeki hücre sayısını hesaplayın ve bunu kolonoid fragman tüpündeki hücrelerin konsantrasyonunu hesaplamak için kullanın.
  16. 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının oyuğu başına 0,5 ×10 4 kolonoid hücresinin tohumlanacağı deney için gerekli hücre süspansiyonu hacmini hesaplayın. Ölü hacmi hesaba katmak için bu hesaplanan hacme yaklaşık fazladan ekleyin. Bu toplam hacmi kolonoid fragman tüpünden (adım 2.11) yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    1. Kolonoid fragmanları içeren yeni 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve BME'de yeniden süspanse edin (0.5 × 104 hücre başına 10 μL BME kullanın).
      NOT: BME'nin fiziksel özellikleri (yüksek viskozite, sıcaklığa bağlı polimerizasyon) nedeniyle, pipetleme yoluyla önemli miktarda malzeme kaybedilebilir (ölü hacim).
  17. Kolonoid/BME süspansiyonunu içeren tüpü veya rezervuarı biyogüvenlik kabini içindeki steril bir kapta buz üzerine kurun.
    NOT: Tohumlama sırasında hücreleri buz üzerinde tutmak, hücre substratının erken polimerleşmesini önler.
  18. Önceden inkübe edilmiş 96 oyuklu bir mikrotitre plakası (adım 2.3'ten itibaren) kullanarak, oyuk başına 10 μL kolonoid / BME çözeltisini ters pipetleyin. Kuyu duvarına çarpmamak için ucu kuyu yüzeyinin hemen üzerine yerleştirdiğinizden ve merkeze pipetlediğinizden emin olun. Düzensiz tohumlamayı önlemek için kolonoid / BME süspansiyonunu düzenli olarak karıştırın.
    NOT: Mikrotitre plakasının dış kenar kuyularına kolonoid tohumlamayın.
    1. Pipeti ters çevirmek için:
      1. Pipeti ayarlayın ve ardından ilk durdurucuyu geçerek ikinci durdurucuya kadar piston düğmesine basın.
      2. Bu pozisyonu koruyarak, ucu kolonoid / BME süspansiyonuna daldırın ve pistonu yavaşça yukarı doğru bırakın.
      3. Piston düğmesine ilk durağa kadar nazikçe ve sabit bir şekilde basarak süspansiyonu dağıtın. Daha fazla kuyu ekiyorsanız, bu pozisyonu koruyun ve 2.18.1.2-2.18.1.3 adımlarını tekrarlayın.
      4. Bitirdikten sonra, piston düğmesine ikinci durdurucuya basarak kalan az miktarda süspansiyonu dışarı atın.
        NOT: BME'nin yüksek viskozitesi nedeniyle ters pipetleme tekniğini kullanmanızı öneririz.
  19. Plakayı düzgün ve istikrarlı bir şekilde ters çevirin ve 37 °C, %5 CO2'de 20 dakika inkübe edin.
  20. Plakayı inkübatörden çıkarın. BME'nin tamamen polimerize olduğundan emin olun ve ardından kubbeleri 200 μL önceden ısıtılmış Organoid Proliferasyon Ortamı ile kaplayın. Çevreleyen bir hendeğe sahip (buharlaşmayı azaltan) 96 oyuklu bir mikrotitre plakası kullanıyorsanız, her rezervuarı 2 mL Organoid Yıkama Ortamı ile doldurun.
  21. Kolonları 3 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin ve kolonoidlerin iyileştiğinden ve çoğaldığından emin olmak için günde bir kez mikroskobik olarak inceleyin.

3. Hücre ölümü testi için kolonoid tedavileri

  1. Önceden ısıtılmış Organoid Proliferasyon Ortamına floresan hücre ölüm boyası veya DMSO ekleyerek 2.5 μM'lik bir floresan hücre ölüm boyası çözeltisi (SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası) ve DMSO çözeltisi hazırlayın (Tablo 2).
    NOT: Floresan hücre ölüm boyası stoğunu ve seyreltilmiş çözeltiyi ışıktan koruyun. SYTOX Yeşil Nükleik Asit Lekesi DMSO'da çözündürülür; DMSO çözeltisi, çözücü etkilerini kontrol etmek için Boya Yok koşulunu hazırlamak için kullanılır.
  2. Tablo 2'de gösterildiği gibi tedavileri hazırlamak için 2.5 μM floresan hücre ölüm boyası ve DMSO çözeltisini adım 3.1'deki solüsyonu kullanın.
  3. Ortamı, plakayı eğerek ve kuyucukların kenarından pipetleyerek kolonoidlerle tohumlanmış 96 oyuklu mikrotitre plakasından nazikçe çıkarın; daha sonra, kuyucuk başına 200 μL tedavi ortamı ekleyin. Maksimum Toksisite koşul(lar)ı için ekstra PBS/BSA kontrol kuyularına sahip olduğunuzdan emin olun (plaka haritası için Tablo 2'ye bakın).
  4. Kolonoidleri, görüntüleme için hazır olana kadar gerekli tedavi zaman noktaları için 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin.
  5. Görüntülemeden en az 2 saat önce, steril hücre kültürü dereceli suda 'luk bir v/v Triton-X 100 çözeltisi hazırlayın ve Maksimum Toksisite koşul(lar)ı için 22 μL 'luk bir Triton-X 100 doğrudan kontrol kuyularının ortamına ekleyin.
    NOT: 'luk bir çözelti kullanmak, yüzey aktif maddenin yüksek viskozitesi nedeniyle oluşabilecek pipetleme hatalarını azaltır.

4. Görüntü edinme

  1. Kolonoidlerle tohumlanmış 96 oyuklu mikrotitre plakasını inkübatörden çıkarın ve dijital ters çevrilmiş epifloresan mikroskobu aşamasına aktarın. Plakanın oda sıcaklığına gelmesine izin verin.
  2. Maksimum Toksisite koşulu kolonoidlerinin mikroskop altında inceleyerek tamamen parçalandığını doğrulayın (Şekil 1, Biii).
  3. Uzun çalışma mesafeli 40x floresan objektif gibi uygun bir objektif seçin. Başlamadan önce mikroskobun görüntüleme ayarlarını optimize edin.
    1. İletim kanalını kullanarak, SYTOX pozitif hücrelere sahip bir kolonoide odaklanın, Yeşil Floresan Proteine (GFP) geçin
      kanalını (488 nm) açın ve arka planı en aza indirirken floresan sinyalini en üst düzeye çıkarmak için ışık yoğunluğunu ve maruz kalma süresini ayarlayın. Önce düşük bir ışık yoğunluğu deneyin, ardından pozlama süresini kademeli olarak artırın; Maruz kalma süresi pratik değilse, ışık yoğunluğunu biraz artırın.
      NOT: Işık yoğunluğu yerine maruz kalma süresinin arttırılması, numunelerin fototoksisitesini ve fotoağartılmasını azaltacaktır19. Numuneleri yalnızca gerektiğinde floresan ışığına maruz bırakın.
  4. GFP kanalı için optimize edilmiş görüntüleme ayarlarını kullanarak, numunelerin aşırı veya az pozlanmadığından emin olmak için Boya Yok ve Maksimum Toksisite koşullarını gözlemleyin. Sonlandırıldıktan sonra, görüntüleme ayarlarını koşullar arasında tutarlı tutun.
  5. Rastgele örnekleme yaklaşımı kullanarak görüntüler elde edin: bunu, kolonoid kubbeyi kaplayan sabit bir ızgara desenini izleyen görüş alanlarını (FOV'lar) seçerek yapın. En az 10 FOV'dan kolonoidlerin görüntülerini elde edin. Kolonoidin merkezi düzleminin odakta olduğundan emin olun ve hem iletim hem de GFP kanallarında görüntüler elde edin.
    1. Aşağıdaki dışlama ölçütlerini uygulayın.
      1. FOV'da kolonoid yoksa görüntü almayın.
      2. FOV'da bulunan aynı odak düzleminde üst üste binen yalnızca kolonoidler varsa görüntü almayın (Şekil 1, Biv).
      3. FOV'da yalnızca kolonoid kalıntısı varsa görüntü almayın (Şekil 1Bv). Analize kolonoid kalıntılarını dahil etmeyin.
  6. Görüntüleri taşınabilir ağ grafik formatında kaydedin ve dışa aktarın.
  7. Ek zaman noktaları görüntülüyorsa, kolonoidli 96 oyuklu mikrotitre plakasını 37 ° C,% 5 CO2'de inkübatöre geri koyun.

5. Görüntü analizi

  1. Fiji ImageJ'yi açın ve dosyaları ImageJ araç çubuğuna sürükleyip bırakarak veya Dosya | Dosyaları açın ve seçin. Açıldıktan sonra, Image| Yığınlar| Yığınlanacak görüntüler. Görüntü yığınını 8 bitlik dosya biçimine dönüştürmek için Görüntü| Türü| 8 bit.
  2. Her görüntü seti için, ImageJ araç çubuğundaki Freehand Seçimleri aracını tıklatın ve bilgisayar faresini kullanarak iletim görüntüsündeki ilgi alanını (ROI) manuel olarak seçin; ROI, kolonoidin çevresidir. Ardından, görüntü yığını arasında karşılık gelen GFP kanalı görüntüsüne geçiş yapın.
  3. Analiz Et| Ölçümleri ayarlayın; Ölçüleri Ayarla iletişim penceresinde, Ortalama Gri Değer'i işaretleyin ve diğer tüm kutuları işaretlemeden bırakın. GFP görüntüsü seçiliyken, Analiz Et | Ölçün. Görüntü yığınındaki her kolonoid için bu analizi tekrarlayın. Veri kümesi analiz edildikten sonra, Sonuçlar penceresindeki tüm verileri kopyalayın ve bunları bir elektronik tablo yazılım uygulamasına yapıştırın.

6.% maksimum toksisite hesaplaması

  1. Denklem (1)'i kullanarak her koşul için teknik kopya Ortalama Gri Değerlerin (MGV) ortalamasını hesaplayın.
    figure-protocol-1 (tedavi ortalaması A) = figure-protocol-2 (1)
  2. Denklem (2) kullanarak her koşulun ortalamasını Maksimum Toksisite koşulunun (MT) ortalamasına göre yüzde olarak ifade edin.
    %MTa = figure-protocol-3 (2)

7. TÜFE'nin hesaplanması

  1. Adım 6.1'de hesaplanan ortalama değerleri kullanarak verileri aşağıdaki gibi normalleştirin (NORM), her tedavi koşulundan ve Maksimum Toksisite (MT) koşulundan Tedavi Edilmemiş durumun (UT) ortalamasını çıkarın (sitokin tedavisinden bağımsız olarak meydana gelen arka plan hücre ölümünü çıkarmak için). Ardından, her bir tedavi koşulunu, denklem (3)'te gösterildiği gibi Maksimum Toksisite (MT) koşulunun arka plan çıkarılmış ortalamasına bölün.
    NORMA = figure-protocol-4 (3)
  2. Adım 7.1'de hesaplanan normalleştirilmiş değerleri 1'den çıkarın; Elde edilen değerler, tedaviden sonra hücre canlılığını (V) temsil eder (aşağıdaki denklem (4)'te olduğu gibi).
    VA = 1 −NORMA (4)
  3. Denklem (5) kullanarak pertürbagen etkileşim katsayısını (CPI) hesaplayın:
    TÜFE = figure-protocol-5 (5)
    A'nın ilk tedaviyi ifade ettiği yerde; B ikinci tedaviyi belirtir; Ve AB kombinasyon tedavisidir. CPI değerleri sinerjik (<1), toplamsal (=1) veya antagonistik (>1) ilişkileri gösterir.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, CD hastası kolonoidlerinin IBD ile ilişkili sitokinler IFN-γ ve TNF-α'nin primer epitel üzerindeki sitotoksik etkilerini incelemek için nasıl kullanılabileceğini gösterdik. Ticari olarak temin edilebilen bir floresan hücre ölüm boyası (SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası) kullandık, bu boya yalnızca daha sonra nükleik asitlere bağlanarak aktive edildiği bozulmuş bir hücre zarına sahip hücrelere girebilir. Kolonları sitokinler ve floresan hücre ölüm boyası ile birlikte tedavi ettik ve inverted epifloresan mikroskobu ile 8 saat ve 24 saatte canlı hücre görüntüleme gerçekleştirdik. 8 saatteki temsili iletim/floresan kaplama görüntüleri, yalnızca IFN-γ + TNF-α ile tedavi edilen kolonoidlerin floresan sinyali için pozitif olduğunu gösterir; bununla birlikte, sadece az sayıda floresan hücre vardır (Şekil 2A). Hücre ölümünün20 morfolojik bir göstergesi olan hücre kanaması, IFN-γ + TNF-α durumunda da gözlenebilir. 24 saatte, IFN-γ + TNF-α ile tedavi edilen kolonoidler, floresan sinyali için pozitif geniş bölgeler gösterir (Şekil 2A). Kolonoidin morfolojisinde de belirgin bir bozulma vardır - merkezi lümen artık görünmez ve epitel bariyeri tamamen bozulmuştur.

Hücre ölüm boyası sinyalini ölçmek için, her bir kolonoidin floresan yoğunluğunu hesaplamak için açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı kullandık. Daha sonra, her bir durumun ortalamasını Maksimum Toksisite tedavisinin yüzdesi olarak ifade ederek verileri normalleştirdik. 8 saatte, BSA kontrol kolonoidlerinde homeostatik veya arka plan hücre ölümü nispeten düşüktü (Maksimum Toksisitenin% 7.7'si) (Şekil 2B). Bu zaman noktasında hücre ölüm seviyelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik olmamıştır; bununla birlikte, TNF-α ile tedavi edilen koşullar sitotoksisitede küçük bir artış göstermiştir (Şekil 2B). 24 saat sonra, sitokin ile tedavi edilen tüm durumlar için hücre ölüm seviyeleri artmıştır. Bununla birlikte, zaman noktaları arasında BSA Kontrol koşulu için hücre ölümünde minimum değişiklik olmuştur (24 saatte Maksimum Toksisitenin% 7,5'i). IFN-γ + TNF-α ile tedavi edilen kolonoidler, BSA kontrolüne kıyasla hücre ölüm seviyelerinde en büyük artışa sahipti (Maksimum Toksisitenin% 29.4'ü). Kombine tedavi ile tek sitokin tedavileri (IFN-γ, TNF-α) arasındaki hücre ölümü seviyelerindeki fark oldukça anlamlıydı. Bu sonuçlar, 24 saatte IFN-γ ve TNF-α arasında sitotoksik bir sinerjik etkileşim olasılığını göstermektedir.

Sitokin tedavileri arasındaki sitotoksik etkileşimleri ölçmek ve sinerjik olup olmadıklarını belirlemek için CPI'yi kullandık. Sitokinler arasındaki etkileşimler, CPI değeri <1 olduğunda sinerjistik, =1 olduğunda katkı maddesi veya >1 olduğunda antagonistik olarak kabul edilir. Zaman noktası başına TÜFE değerlerini hesapladık (Şekil 2C). 8 saatte, TÜFE değeri hafif bir sinerjizm (0.99) gösterirken, TÜFE değeri 24 saatte (0.83) önemli ölçüde azaldı. Bu analiz, 24 saatte IFN-γ ve TNF-α arasındaki etkileşimin sinerjik olduğunu doğruladı. Ayrıca, bu bağlamda IFN-γ ve TNF-α arasındaki sinerjinin zamana bağlı olduğunu göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Deneysel iş akışı ve sorun giderme şeması. (A) Protokolün şematik genel bakışı. (B) Temsili resimler. (Bi) Bir test için geçmeden önce kültürün optimal yoğunluğunu ve kolonoidlerin optimal boyutunu gösteren ışık mikroskobu görüntüsü. Ölçek çubuğu = 500 μm. (Bii) Ayrışmadan sonra kolonoid fragmanlarının optimal boyutunu gösteren ışık mikroskobu görüntüsü; kırmızı ile vurgulanmış parçalar. Ölçek çubuğu = 100 μm. (Biii) MT tedavisi sonrası nekrotik kolonoid morfolojisinin ışık mikroskobu görüntüsü (Triton X-100 ile). Ölçek çubuğu = 25 μm. (Biv) Aynı odak düzleminde üst üste binen iki kolonoidin ışık mikroskobu görüntüsü. Ölçek çubuğu = 25 μm. (Bv) Geçişten sonra mevcut olan kolonoid hücre kalıntılarının ışık mikroskobu görüntüsü; enkaz kırmızı ile vurgulanmıştır. Ölçek çubuğu = 25 μm. Kısaltmalar: ROI = ilgi alanı; MFI = ortalama floresan yoğunluğu; MT = Maksimum Toksisite. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İnsan CD kolonoidlerinde sitokin kaynaklı hücre ölümünün kantitatif analizi. (A) 8 saat ve 24 saatte SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası (floresan hücre ölüm boyası) ve sitokinlerle tedavi edilen CD kolonoidlerinin temsili canlı mikroskopi görüntüleri; iletim ve GFP (yeşil renk) kanalları üst üste bindirilmiştir. Kolonlar şu şekilde tedavi edildi: 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/mL IFN-γ, 3) 10 ng/mL TNF-α, 4) 10 ng/mL IFN-γ + 10 ng/mL TNF-α. Ölçek çubukları = 25 μm. (B) 8 ve 24 saatte floresan hücre ölüm boyası ve sitokinlerle muamele edilen CD kolonoidlerinin kantitatif analizi; veriler MT koşulunun %'si olarak ifade edilir. N = 2 CD kolonoid çizgisi, koşul başına 11-16 kolonoid görüntülendi. (C) B, N = 2 CD kolonoid çizgisinden elde edilen veri seti kullanılarak zaman noktası başına hesaplanan TÜFE. Veriler SE ± anlamına gelir. B'de iki yönlü ANOVA analizi yapıldı ve ardından Bonferroni son testleri, *P < 0.05, ***P < 0.001 olarak test edildi. Kısaltmalar: CD = Crohn hastalığı; GFP = yeşil floresan proteini; CPI = pertürbagen etkileşim katsayısı; PBS = fosfat tamponlu salin; BSA = sığır serum albümini; TNF-α = tümör nekroz faktörü-alfa; IFN-γ = interferon-gama; MT = Maksimum Toksisite. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Protokol için kültür ortamının bileşimi. Organoid Proliferasyon Ortamını hazırlamak için, L-WRN şartlandırılmış ortamı ve Serumsuz Ortamı 1: 1 birleştirin, ardından takviyeleri ekleyin. Organoid Proliferasyon Ortamı hazırlandıktan sonraki 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Lütfen tüm ortamların 4 °C'de saklanması gerektiğini unutmayın. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Deneysel 96 oyuklu plaka yerleşimi ve sitokin tedavileri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bağırsak organoidlerinde hücre ölümünün kantitatif analizleri için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bağırsak organoid morfolojisinin bozulmasını ışık mikroskobu ile incelemek, sitotoksik maddelerin etkilerini ölçmek için basit bir yaklaşımdır11. Bununla birlikte, morfolojik değişiklikler hücre ölümünün doğrudan bir ölçümü değildir ve yöntem sadece yarı kantitatiftir. Başka bir yöntem, bir MTT veya ATP testi10,11 kullanarak organoid metabolik aktiviteyi değerlendirmektir. Bu tahlillerin yalnızca hücre canlılığındaki değişiklikleri belirleyebileceğini ve bir hücre ölümü tahlili ile doğrulanması gerektiğini belirtmek önemlidir. DNA bağlayıcı boyalar kullanılarak yapılan diğer florometrik hücre ölümü deneyleri bildirilmiştir12,13. Floresan mikroplaka okuyucu kullanan görüntüleme dışı bir yaklaşım mümkündür ve yüksek verimsağlar 12. Bununla birlikte, bu yöntem tüm bir kuyunun ortalama sinyalini ölçer ve bu da onu heterojen popülasyonlar için uygun hale getirmez. Ayrıca Z yükseklik ayarlı bir mikroplaka okuyucunun kullanılmasını gerektirir. Floresan görüntüleme tabanlı teknikler, tek organoid analizi için kullanılabilir ve hücresel/hücre altı ve morfolojik verileri yakalayabilir. Otomatik konfokal yüksek içerikli görüntüleme (HCI) sistemleri, yüksek aktarım hızıyla büyük miktarda veri üretebilir13. Ne yazık ki, konfokal HCI özel ekipmana ihtiyaç duyar, karmaşık protokoller kullanır, tipik olarak ticari görüntü analiz yazılımı gerektirir ve pahalıdır.

Birden fazla zaman noktasında kolonoid hücre ölümünün kantitatif analizi için protokolümüz basit, basit ve ucuzdur. Bununla birlikte, otomatik HCI ve plaka okuyucu sistemleriyle karşılaştırıldığında, zaman alıcıdır ve verimi azaltmıştır. Yöntemimizin bir diğer sınırlaması, konfokal mikroskopinin aksine geniş alan kullanımıdır. Konfokal mikroskopi, odak dışı sinyali azalttığı ve seri optik kesitler (Z-yığınları) elde edebildiği için organoidler gibi kalın 3D numuneleri görüntülemek için daha uygundur. Bununla birlikte, konfokal görüntüleme tipik olarak daha uzun çekim süreleri ve fototoksisiteyi/fotobleaching'i artıran yüksek yoğunluklu lazerler gerektirir. SYTOX Green gibi floresan hücre ölümü boyalarının yalnızca nekroz, geç apoptozla ilişkili ikincil nekroz, nekrotoz ve piroptoz21 gibi hücre zarı bütünlüğünün kaybolduğu hücre ölümü formlarını ölçmek için uygun olduğuna dikkat etmek çok önemlidir. Kaspaza bağımlı apoptoz gibi, hücre zarının en azından hücre ölümünün erken aşamalarında geçirimsiz kaldığı bazı düzenlenmiş hücre ölümü biçimleri vardır. Bununla birlikte, bu protokol, bir kaspaz 3/7 aktivite floresan raportörünün22 görüntülenmesini de içerecek şekilde kolayca değiştirilebilir. Bu, spesifik hücre ölümü modalitesini karakterize etmeye yardımcı olmak için ek veriler sağlayacaktır.

Protokolümüzü, daha önce CD hasta kaynaklı organoidlerde (2) bildirdiğimiz sitokinler IFN-γ ve TNF-α arasındaki sitotoksik sinerjik etkileşimi göstermek için kullandık 9,10. Bu sinerjizm formunun fizyolojik önemi, hemofagositik lenfohistiyositoz ve sepsis23'ün murin modellerinde de gösterilmiştir. Biyolojik ajanların kombinasyonları arasındaki sinerjiyi ölçmek için çeşitli matematiksel referans modelleri ve yaklaşımlar uygulanmıştır 24,25. Karmaşıklıkları, dikkate aldıkları faktörlerin sayısı ve bir etkileşimin sinerjik olduğunu düşünme eşiği açısından farklılık gösterirler24,25. Bazı modeller, test edilen biyolojik ajanlar hakkında önceden bilgi sahibi olmaya ihtiyaç duyar, ajanların aktivitesi hakkında belirli varsayımlarda bulunur ve her tek ve kombinasyon tedavisi için kapsamlı doz-yanıt eğrileri gerektirebilir25. Sinerjiyi ölçmek için seçtiğimiz yöntem, daha önce kemoterapi ilaç kombinasyonlarının kanser hücre hattı proliferasyonu26 üzerindeki inhibitör etkilerini ölçmek için kullanılan ilaç etkileşim katsayısı (CDI) modelinin bir modifikasyonudur. CDI bir Bliss bağımsızlık modelidir; iki perturbagenin tahmin edilen birleşik etkisini hesaplarken, Bliss bağımsızlığı, bunların ayrı yolları hedeflediklerini ve bağımsız etki mekanizmalarına sahip olduklarını varsayar27. Pertürbagenler arasındaki bir etkileşimin sinerjik olması için, gerçek birleşik etkinin tahmin edilen etkiden daha büyük olması gerekir. IFN-γ ve TNF-α'nin farklı reseptörlere ve aşağı akış sinyalizasyon bileşenlerine sahip olduğu bilindiğinden, bu model deney kurulumumuz için uygundur. Ayrıca, Bliss bağımsızlığı, sinerjizmi ölçmek için bir etkileşim katsayısının hesaplanmasına izin verir ve doz-yanıt veri kümeleri gerektirmez.

Bu protokol için en iyi sonuçları elde etmek için dikkate alınması gereken birkaç önemli faktör vardır. Kolonoidlerin yüksek bir yoğunluğa yayılması (Şekil 1Bi), çaplarının yaklaşık 25-50 μm olması ve hücreleri tohumlamaya çalışmadan önce aktif olarak çoğalmaları önemlidir. Tahliller için optimal olmayan kolonoid kültürlerinin kullanılması, yetersiz hücre sayısına, düşük kolonoid geri kazanımına ve tutarsız deneylere neden olabilir. Tekrarlanabilir sonuçlar için, kolonoidlerin yoğunluğunu deneyler arasında tutarlı bir şekilde tohumlamak da önemlidir. İnflamatuar sitokinlere in vitro yanıtın hücre tohumlama yoğunluğu28,29'dan etkilenebileceği daha önce gösterilmiştir. Diğer bir yaygın sorun, BME kubbesinde görüntülemeyi etkileyebilecek hava kabarcıklarının oluşmasıdır. Bu, ters pipetleme tekniği kullanılarak önlenebilir. Bu teknik aynı zamanda daha tutarlı tohumlama ile sonuçlanır.

Ayrıca, birden fazla zaman noktası görüntülüyorsanız, her zaman noktası için bir Maksimum Toksisite koşulu hazırlayın. İyonik olmayan bir yüzey aktif madde olan Triton-X 100, sitotoksisite deneyleri için yaygın olarak pozitif bir kontrol (Maksimum Toksisite koşulu) olarak kullanılır. Triton-X 100 ilavesi, kolonoidleri parçalayıp öldürerek floresan hücre ölüm boyasının hücrelere girmesine izin verir. Daha önceki bir zaman noktasından bir Maksimum Toksisite koşulunun kullanılması, floresan sinyalin zamanla bozulması nedeniyle verilerin yanlış ve tutarsız normalleştirilmesine neden olur.

Dikkate alınması gereken son bir nokta, kolonoid kültürü için kullanılan BME seçimidir. BME'nin birkaç ticari üreticisi vardır; ancak protokolümüz için sadece Malzeme Tablosunda yer alan markayı test ettik. Hasta kaynaklı pankreas kanseri organoidlerini kullanan yeni bir çalışma, BME'nin ticari kaynağının hücre proliferasyon oranlarını değiştirdiğini, ancak kemoterapi ilaçlarına veya gen ekspresyonuna yanıt üzerinde önemli bir etkisi olmadığını buldu30. Bunu göz önünde bulundurarak, protokolümüz için sonuç eğiliminin BME markaları arasında benzer olmasını bekliyoruz, ancak aynı markayı tutarlı bir şekilde kullanmanızı öneririz.

Bu protokolün, CD hastasından türetilmiş kolonoidler kullanılarak IFN-γ ve TNF-α kaynaklı hücre ölümünün analizi için nasıl kullanılabileceğini gösterdik. Hasta kaynaklı bağırsak organoidleri, TNF-α31'in sitotoksik etkilerine karşı artan duyarlılık da dahil olmak üzere hastalığın birçok özelliğini korudukları için CD'yi incelemek için güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, protokol, sitokinler dışındaki pertürbagenlerin veya kolorektal kanser gibi IBD dışındaki hastalık durumlarının sitotoksik etkilerini araştırmak için kolayca değiştirilebilir (protokolü IBD olmayan kolonoidler kullanarak başarıyla test ettik). Bu yöntemin hücre ölüm mekanizmaları, epitel bariyer fonksiyonu veya bağırsak mukozal immünolojisi ile ilgili herhangi bir araştırma alanı için yararlı olduğuna inanıyoruz.

Açıklamalar

K.N., çalışmanın tamamlandığı süre boyunca AbbVie Inc.'den araştırma fonu alıyordu. Bu finansman, APC Microbiome Ireland'a verilen bir araştırma merkezi konuşmacı ödülü (SFI-14 / SP / 2710) bağlamındaydı.

Teşekkürler

Yazarlar, hastalara bilgilendirilmiş onamları ve araştırma çalışmasına katılımları için ve klinik personele mükemmel yardımları için teşekkür eder. Şekil 1A , BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, İrlanda Bilim Vakfı'ndan alınan hibelerle desteklenmiştir - yani K.N.'ye bir kariyer geliştirme ödülü (CDA) (SFI-13 / CDA / 2171), bir araştırma merkezi hibesi (SFI-12 / RC / 2273) ve APC Microbiome Ireland'a bir araştırma merkezi konuştu ödülü (SFI-14 / SP / 2710). P.F. ayrıca SFI/20/RP/9007'den fon aldı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Gelişmiş DMEM/F12Gibco12634010
Amfoterisin B ÇözümüSigma-MerckA2942
A-83-01Sigma-MerckSML0788
BioRenderScience Suite Inc.YokBilimsel illüstrasyon yazılımı
Sığır Serumu AlbüminiSigma-MerckA2058Esasen IgG içermeyen, düşük endotoksin
B27 TakviyesiInvitrogen17504-044
CHIR-99021Sigma-MerckSML1046
Costar 48 kuyulu Clear TC ile muamele edilmiş Çoklu Kuyu Plakaları, Ayrı Ayrı Sarılmış, SterilCorning3548
Cultrex Bodrum Membran Özü, Tip 2, Pathclear R& D Systems3532-010-02Bodrum membran özütü
Dimetil sülfoksitSigma-MerckD2650
Dulbecco′ s Fosfat Tamponlu SalinSigma-MerckD8537
EVOS FL Dijital Ters Floresan MikroskobuInvitrogenAMF4300Dijital ters epifloresan mikroskobu
EVOS 40x Objektif, florit, LWD, faz kontrastıThermoFisher ScientificAMEP4683Uzun çalışma mesafesi 40x floresan objektif
Fiji/ImageJ (Windows sürümü)Açık kaynaklı yazılımN/AGörüntü analiz yazılımı
Fetal Sığır SerumuSigma-MerckF9665
Gentamisin ÇözeltisiSigma-MerckG1397
Nazik Hücre Ayrışma ReaktifiKÖK HÜCRE Teknolojileri100-0485Enzim içermeyen hücre ayrışma reaktifi
GlutaMAX-1Gibco35050061L-alanil-L-glutamin dipeptit takviyesi
GraphPad Prism 5 (Windows sürümü)DotmaticsN/AVeri grafik ve istatistik yazılımı
Greiner 15 mL Polipropilen Santrifüj Tüpü, Steril, konik tabanlı ve Vidalı KapakCruinn188261CI
HEPES 1 MGibco15630080
İnsan rekombinant EGF (hayvan içermez)PeprotechAF-100-15
N-AsetilsisteinSigma-MerckA9165
NikotinamidSigma-MerckN0636
NormocinInvivoGenant-nr-05Geniş ürün yelpazesi antimikrobiyal reaktif
Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta İşlemli, Düz TabanlıMikroplaka ThermoFisher Scientific15543115
N2 takviyesiInvitrogen17502-048
Rekombinant İnsan IFN-gama Proteini R& D Systems285-IFSteril filtreli %0.1 PBS/BSA
Rekombinant İnsan TNF-alfa ProteiniR& D Systems210-TASteril filtreli %0.1 PBS/BSA SB202190
Sigma-MerckS7067
Çıtçıtlı Kapaklı Düşük Tutmalı Mikrosantrifüj TüpleriThermoFisher Scientific3451
SYTOX Yeşil Nükleik Asit Lekesi - DMSOInvitrogenS7020Floresan hücre ölüm boyasında 5 mM Çözelti, ışıktan koruyun
Triton X-100Sigma-Merck93420
Tripan Blue çözeltisiSigma-MerckT8154
Tryple ExpressGibco12604013Enzimatik ayrışma reaktifi
Y-27632MedChemExpressHY-10071ROCK-I ve ROCK-II İnhibitörü

Kaynaklar

  1. Patankar, J. V., Becker, C. Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (9), 543-556 (2020).
  2. Zeissig, S., et al. Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn's disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment. Gut. 53 (9), 1295-1302 (2004).
  3. Bartee, E., Mcfadden, G. Cytokine synergy: An underappreciated contributor to innate anti-viral immunity. Cytokine. 63 (3), 237-240 (2013).
  4. Fish, S. M., Proujansky, R., Reenstra, W. W. Synergistic effects of interferon γ and tumour necrosis factor α on T84 cell function. Gut. 45 (2), 191-198 (1999).
  5. Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease. Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).
  6. Flood, P., Hanrahan, N., Nally, K., Melgar, S. Human intestinal organoids: Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology - current applications and limitations. Eur J Immunol. 54 (2), e2250248(2024).
  7. Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to t-cell-mediated tissue injury. Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).
  8. Lee, C., et al. Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids. J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).
  9. Woznicki, J. A., et al. TNF-α synergises with IFN-γ to induce caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent death of intestinal epithelial cells. Cell Death Dis. 12 (10), 864(2021).
  10. Flood, P., et al. DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).
  11. Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5 (5), e1228(2014).
  12. Bode, K. J., Mueller, S., Schweinlin, M., Metzger, M., Brunner, T. A fast and simple fluorometric method to detect cell death in 3D intestinal organoids. Biotechniques. 67 (1), 23-28 (2019).
  13. Mertens, S., et al. Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer. Cell Rep. 42 (4), 112324(2023).
  14. Vandussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  15. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  16. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  17. Woznicki, J. A., et al. Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells. Cell Death Dis. 11 (1), 68(2020).
  18. Edgar, R. D., et al. Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).
  19. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic. Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).
  20. Ziegler, U., Groscurth, P. Morphological features of cell death. News Physiol Sci. 19 (3), 124-128 (2004).
  21. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Res. 28 (1), 9-21 (2018).
  22. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  23. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  24. Geary, N. Understanding synergy. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (3), E237-E253 (2013).
  25. Duarte, D., Vale, N. Evaluation of synergism in drug combinations and reference models for future orientations in oncology. Curr Res Pharmacol Drug Discov. 3, 100110(2022).
  26. Wong, F. C., Woo, C. C., Hsu, A., Tan, B. K. The anti-cancer activities of Vernonia amygdalina extract in human breast cancer cell lines are mediated through caspase-dependent and p53-independent pathways. PLoS One. 8 (10), e78021(2013).
  27. Ryall, K. A., Tan, A. C. Systems biology approaches for advancing the discovery of effective drug combinations. J Cheminform. 7, 7(2015).
  28. Sukho, P., et al. Effect of cell seeding density and inflammatory cytokines on adipose tissue-derived stem cells: An in vitro study. Stem Cell Rev Rep. 13 (2), 267-277 (2017).
  29. Vaughan-Jackson, A., et al. Density dependent regulation of inflammatory responses in macrophages. Front Immunol. 13, 895488(2022).
  30. Lumibao, J. C., et al. The impact of extracellular matrix on the precision medicine utility of pancreatic cancer patient-derived organoids. bioRxiv. , 10.1101/2023.01.26.525757 (2023).
  31. Lee, C., et al. TNF-α induces LGR5+ stem cell dysfunction in patients with Crohn's disease. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (3), 789-808 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

nflamatuar Ba rsak Hastalntestinal Epitel H creleriTNF Alfanterferon GamaH cre l m NiceliklendirmesiImageJ AnaliziOrganoid Sitotoksisitesi
Canlı Floresan Mikroskobu Kullanılarak İnsan Kolonik Organoidlerinde Sitokin ile İndüklenen Hücre Ölümünün Miktar Tayini
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.