Yöntem makalesi

Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü Tekniği

2.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66765

⸱

31 Mayıs 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Department of Stomatology, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 3Department of Stomatology, Fujian People's Armed Police Corps Hospital

Bu makalede

Özet

Çene kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler, çeşitli farklılaşma, kendini yenileme ve immün modülasyonda önemli işlevlere sahiptir. Gen terapisi, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta öncü hücrelerin çok önemli bir rezervuarı olarak ortaya çıkmışlardır. Burada, sıçanlarda çene kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için benzersiz bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMMSC'ler), çok yönlü farklılaşma potansiyeline sahip bir kök hücre türüdür. Apendiküler kemiklerden türetilen BMMSC'lerle karşılaştırıldığında, çeneden türetilen BMMSC'ler daha fazla proliferatif ve osteojenik farklılaşma kabiliyetine sahiptir ve yavaş yavaş çene defekti onarımı için önemli tohum hücreleri haline gelir. Bununla birlikte, mandibula karmaşık bir kemik yapısına ve apendiküler kemiklerden daha az süngerimsi içeriğe sahiptir. Geleneksel yöntemler kullanılarak çok sayıda yüksek kaliteli çene kaynaklı mezenkimal kök hücre elde etmek zordur. Bu çalışma, sıçan çene kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin (JBMMSC'ler) izole edilmesi ve kültürlenmesi için 'saplılık üzerine niş temelli bir yaklaşım' sunmaktadır. Primer sıçan JBMMSC'leri, kemik dilimi sindirim yöntemi ile birlikte tüm kemik iliği yapışık yöntemi kullanılarak izole edildi ve kültürlendi. İzole edilen hücreler, hücre morfolojisi gözlemi, hücre yüzey belirteçlerinin tespiti ve çok yönlü farklılaşma indüksiyonu yoluyla JBMMSC'ler olarak tanımlandı. Bu yöntemle ekstrakte edilen hücreler 'fibroblast benzeri' bir iğ şekli sergiler. Hücreler uzun, iğ şeklinde ve fibroblast benzeridir. Akış sitometrisi analizi, bu hücrelerin CD29, CD44 ve CD90 için pozitif, ancak CD11b/c, CD34 ve CD45 için negatif olduğunu ve BMMSC'lerin özellikleriyle uyumlu olduğunu göstermektedir. Hücreler güçlü çoğalma kapasitesi gösterir ve osteojenik, adipojenik ve kondrojenik farklılaşmaya uğrayabilir. Bu çalışma, kısa sürede güçlü farklılaşma kabiliyetine sahip yeterli sayıda yüksek kaliteli JBMMSC elde etmek için etkili ve istikrarlı bir yöntem sağlar, bu da biyolojik fonksiyonun araştırılması, rejeneratif tıp ve ilgili klinik uygulamaların daha fazla çalışmasını kolaylaştırabilir.

Giriş

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) ilk olarak kemik iliğinde keşfedildi, bu da kültürde yapışkan koloniler oluşturma yeteneği ve güçlü osteojenik potansiyelgösterdi 1. Pittinger ve ark.2 ayrıca kemik, yağ ve kıkırdağa doğru çok yönlü farklılaşma potansiyellerini buldular. Farklı kaynaklardan elde edilen tüm mezenkimal kök hücreler çok yönlü farklılaşma potansiyeline sahip olsa da, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, diğer dokulardan türetilen mezenkimal kök hücrelere kıyasla en güçlü kondrojenik farklılaşma potansiyeline sahiptir ve bu da onları kemik dokusu mühendisliği için en iyi aday hücreler olarak kabul eder3. Bununla birlikte, birçok çalışma, farklı kökenlerden gelen BMMSC'lerin, osteojenik farklılaşma kabiliyeti ve hücresel proliferatif aktivitegibi bölgeye özgü özellikler ve özellikler sunduğunu kanıtlamıştır 4,5. Bu, çene ve apendiküler kemikler arasındaki farklı germ tabakalarına veya iliak krest6'ya bağlı olabilir.

Çene kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (JBMMSC'ler) nöroektodermin nöral krest hücrelerinden kaynaklanırken, femur kaynaklı BMMSC'ler mezodermden köken alır7. Uzun kemiklerden ve iliak tepeden türetilen BMMSC'lerle karşılaştırıldığında, JBMMSC'ler daha yüksek proliferasyon oranına, ALP aktivitesine ve osteojenik potansiyelesahiptir 8. Ayrıca, BMMSC'lerin doku ve organlardaki uygulama etkisi, farklı hücre tiplerine ve ortamlarına bağlı olarak değişebilir9. Çene defektlerinin onarımı esas olarak çene kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin elde edilmesine bağlıdır. Bu nedenle, JBMMSC'leri incelemek, çene kemiği dokusu mühendisliğindeki klinik uygulaması için deneysel bir temel sağlayabilir10. Bununla birlikte, temel araştırmalar ve klinik uygulamalar esas olarak apendiküler ve aksiyel kemiklerden türetilen BMMSC'lere odaklanmaktadır11. JBMMSC'ler üzerine yapılan araştırmalar sınırlıdır ve bunun nedeni mandibuladaki süngerimsi kemik içeriğinin düşük olması ve sıçanların çenelerinin daha az süngerimsi kemik içeriğine sahip olması olabilir12. Bu nedenle, BMMSC'lerin apendiküler kemiklerden veya iliak kretten izole edilmesinde yaygın olarak kullanılan sıradan kemik iliği yıkama yöntemini kullanarak çene kemiği kaynaklı mezenkimal kök hücreleri ayırmak zordur13. Hong ve ark.14 ve Cheng ve ark.15'in yöntemlerine dayanarak, yoğun kemik sindirimi ve kemik iliği yıkama yönteminin kombinasyonunun sıçan JBMMSC'lerini etkili bir şekilde izole edebileceğini varsaydık.

Bu çalışma, sıçan JBMMSC'lerini izole etmek için etkili bir yöntem oluşturmayı ve çene kemik dokusu mühendisliği için yeterli tohum hücresi kaynaklarını sağlamayı amaçlamaktadır.

Protokol

Protokol, Çin PLA Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı. Deney için on üç haftalık erkek Wistar sıçanları kullanıldı. Hayvanlar, reaktifler ve ekipmanla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney hazırlığı

  1. Oftalmik makas, cımbız ve kemik rongeurları dahil tüm cerrahi aletleri yüksek sıcaklık ve basınçta sterilize edin.
  2. Kültür ortamını önceden hazırlayın.
    1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren α-MEM tam ortamı hazırlayın.
    2. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.1 tip II kollajenaz hazırlayın.
    3. Tek kullanımlık steril 50 mL santrifüj tüpünde% 1 penisilin-streptomisin içeren 50 mL PBS hazırlayın.

2. Sıçan JBMMSC'lerinin izolasyonu ve yetiştirilmesi

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek sıçan mandibulasını izole edin:
    NOT: Numune sterilitesini korumak için, tüm metal cerrahi aletler kullanımdan önce en az üç saniye boyunca bir alkol lambası alevi üzerinde yüksek sıcaklıkta dezenfekte edilmelidir.
    1. Sıçanı intraperitoneal enjeksiyon ile% 2 pentobarbital sodyum (2 mL / kg) ile uyuşturun.
    2. Anestezi uygulanan sıçanı, solunum hızı azaldıktan ve kaslar tamamen gevşedikten sonra servikal vertebra çıkığı (kurumsal olarak onaylanmış protokollere izleyerek) ile sakrifiye edin.
    3. Fareyi dezenfekte etmek için 30 dakika boyunca% 75 etanole batırın ve ardından ultra temiz masaya aktarın.
    4. Fareyi tek kullanımlık steril bir beze veya steril bir kaba koyun ve sırtüstü pozisyonda tutun.
    5. Cildi ve kası angulus oris'ten ramus boyunca eklemlere kadar kesin ve ayırın ve ardından temporomandibular eklem diskini ve bilateral periferik bağları oftalmik makasla yatay olarak keserek kondili glenoid fossadan ayırın.
      NOT: Mandibulayı hareket ettirerek ve kondilin pozisyonunu dışarıdan gözlemleyerek temporomandibular eklemin pozisyonunu belirleyin.
    6. Alt kesici dişlerin bukkal tarafındaki vestibüler oluktan sol ve sağ taraflara doğru makas kullanarak lateral mandibula kaslarını ve bağ dokularını kesin ve ayırın.
    7. Mandibulanın lingual kaslarını lingual frenumdan mandibulanın arka bölgesine kesin.
    8. Mandibulayı kafatasından çıkarın.
    9. Alt kesici dişler arasındaki simfizi oftalmik makasla keserek mandibulayı ikiye bölün.
    10. Oftalmik makas ve forseps kullanarak mandibula üzerinde kalan bağlı kasları, fasyayı ve diğer yumuşak dokuları dikkatlice çıkarın.
  2. JBMMSC'leri izole edin.
    1. Rongeur gagasını kesici dişlerin ve birinci azı dişinin mezial kısmının birleştiği yere yerleştirin, alt kesici dişler ile mandibula arasındaki bağlantıyı rongeur ile kesin ve alt kesici dişleri tamamen çıkarın.
    2. Tüm azı dişlerini bir kemik rongeur ile çıkarın.
    3. Mandibular ramusu bir kemik rongeur ile çıkarın ve mandibulanın orta kısmını son azı dişinin16 distal kenarı boyunca ayırarak ilik boşluğunu ortaya çıkarın.
    4. α-MEM komple besiyerini 1 mL tek kullanımlık steril şırınga ile emdirin. İğneyi kemik iliği boşluğuna yerleştirin ve kemik iliğini, kemik beyazlaşana kadar α-MEM tam besiyeri ile kültür kabına tekrar tekrar yıkayın.
    5. Kemik iliği yıkama solüsyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı bir pipetle atın, hücreleri 10 mL α-MEM tam ortamla yeniden süspanse edin ve bunları 10 cm'lik yeni bir kültür kabına koyun.
    7. Yıkanmış mandibulayı bir rongeur ile 1-3 mm³ kemik dilimlerine bölün ve bunları 37 ° C'de 200 rpm / dak'lık bir çalkalayıcıda 90 dakika boyunca 3 mL% 0.1 tip II kollajenaz ile sindirin.
    8. Sindirilmiş mandibulayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    9. Hasat edilen hücreleri ve sindirilmiş kemik dilimlerini% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de α-MEM tam ortam ile kültürleyin.
    10. Kültür ortamının yarısını 72 saat sonra taze ortamla değiştirin ve ardından her 2 günde bir tamamen değiştirin.
      NOT: Kültür kabını ilk üç gün hareket ettirmeyin.
    11. Yapışık hücreleri% 80 -% 90 birleşme noktasına ulaştıklarında 1: 2 oranında geçirin. İkinci alt kültür sırasında kemik dilimlerini çıkarın. Deneyler için P2 veya P3 nesillerinin hücrelerini kullanın.

3. Hücre yüzey belirteçlerinin tanımlanması için akış sitometrisi

  1. Akış sitometrisi tamponunda P2 neslinin JBMMSC'lerini yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve konsantrasyonu 3 × 106 hücre / mL'ye ayarlayın.
  2. Her mikrosantrifüj tüpüne 100 μL hücre süspansiyonu ve 2 μL monoklonal antikor (CD11b / c, CD29, CD34, CD44, CD45 ve CD90) ekleyin. 4 °C'de 30 dakikainkübe edin 17,18.
  3. Numuneyi 200 μL akış sitometrisi tamponu ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında 250 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
  4. Her tüpe 100 μL akış sitometri tamponu ve 2 μL PE etiketli floresan ikincil antikor ekleyin. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Adım 3.3'ü tekrarlayın.
  6. JBMMSC'leri tüp başına 300-500 μL akış sitometri tamponunda yeniden süspanse edin.
  7. Bir akış sitometresi kullanarak akış sitometrik analizini gerçekleştirin.
    NOT: Spesifik olmayan antikor kombinasyonunun neden olduğu arka plan lekelenmesini ortadan kaldırmak için homolog antikorları negatif kontroller olarak kullanın.

4. Hücre proliferasyonunun belirlenmesi

  1. P3 neslinin JBMMSC'lerini, kuyu başına 5 × 103 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın.
  2. Her kuyucuğa 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin.
  3. 96 oyuklu plakayı 2 saat boyunca inkübatöre yerleştirin ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı (450 nm'de OD değeri) ölçün.
    NOT: Testi art arda yedi gün boyunca her gün aynı saatte gerçekleştirin.

5. Koloni oluşturma yeteneği

  1. 3. geçitten 1000 JBMMSC'yi 10 cm'lik kültür kaplarına tohumlayın ve 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürleyin.
  2. Kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin.
  3. 15 gün boyunca sürekli ekimden sonra kristal viyole boyama yapın.
  4. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca metanol ile sabitleyin ve 5 dakika boyunca% 2 kristal viyole ile boyayın.

6. JBMMSC'lerin çok soylu farklılaşması

NOT: Çok soylu farklılaşma için P3 neslinin JBMMSC'lerini kullanın. Kontrol grubu α-MEM tam besiyeri ile kültüre edildi.

  1. Osteojenik farklılaşma gerçekleştirin.
    1. Altı oyuklu bir plakada kuyucuk başına 1 ×10 5 JBMMSC aşılayın.
    2. Hücre birleşmesi% 70'e ulaştığında, ortamı osteojenik indüksiyon ortamına değiştirin.
      NOT: Osteojenik indüksiyon ortamını her 3 günde bir değiştirin.
    3. 7 günlük osteojenik indüksiyondan sonra Alkalin Fosfataz (ALP) boyaması yapın.
    4. Ortamı altı oyuklu plakadan çıkarın, hücreleri oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile 30 dakika sabitleyin ve ardından üç kez PBS ile yıkayın.
    5. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ALP boyama solüsyonu ile boyayın ve ışıktan koruyun.
    6. Boyama solüsyonu kalmayana kadar hücreleri durulayın ve numuneleri mikroskop altında gözlemleyin.
    7. 21 günlük osteojenik indüksiyondan sonra Alizarin kırmızı boyama yapın.
    8. Hücreleri 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitledikten sonra hücreleri 5 dakika boyunca Alizarin kırmızı boyama solüsyonu ile boyayın.
    9. Alizarin kırmızı boyama solüsyonu kalmayana kadar hücreleri PBS ile yıkayın.
    10. Mikroskop altında kalsiyum nodüllerinin sayısını gözlemleyin.
  2. Adipojenik farklılaşma gerçekleştirin.
    1. Altı oyuklu bir plakada kuyucuk başına 1 ×10 5 JBMMSC aşılayın.
    2. Hücre birleşmesi% 70'e ulaştığında, ortamı adipojenik indüksiyon ortamına değiştirin.
      NOT: Adipojenik indüksiyon ortamını her üç günde bir değiştirin.
    3. 14 günlük adipojenik indüksiyondan sonra yağ kırmızısı O boyaması yapın.
    4. Ortamı altı oyuklu plakadan çıkarın, hücreleri 20-30 dakika boyunca Yağ kırmızısı O sabitleme solüsyonu ile sabitleyin ve ardından üç kez PBS ile yıkayın.
    5. Sabitleme solüsyonunu çıkarın ve hücreleri iki kez damıtılmış suyla yıkayın.
    6. Hücreleri 20-30 saniye boyunca% 60 izopropanol içine daldırın.
    7. % 60 izopropanolü çıkarın ve hücreleri 20-30 dakika Yağ kırmızısı O boyası ile boyayın.
    8. Boyama solüsyonunu çıkarın, hücreleri 20-30 s% 60 izopropanol ile durulayın ve ardından damıtılmış suyla yıkayın.
    9. Çekirdeği hematoksilen çözeltisi ile 1-2 dakika boyayın.
    10. Hematoksilen çözeltisini çıkarın ve hücreleri 2-3 kez damıtılmış suyla yıkayın. Yağ kırmızısı O tamponunu 1 dakika ekleyin ve çıkarın.
    11. Mikroskop altında lipit damlacıklarının sayısını gözlemleyin.
  3. Kondrojenik farklılaşma gerçekleştirin.
    1. Altı oyuklu bir plakada kuyucuk başına 1 ×10 5 JBMMSC aşılayın.
    2. Hücre birleşmesi% 70'e ulaştığında, ortamı kondrojenik indüksiyon ortamına değiştirin.
      NOT: Kondrojenik indüksiyon ortamını her 3 günde bir değiştirin.
    3. 21 günlük kondrojenik indüksiyondan sonra Alcian mavisi boyama yapın.
    4. Ortamı altı oyuklu plakadan çıkarın, hücreleri oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile 30 dakika sabitleyin ve ardından üç kez PBS ile yıkayın.
    5. Hücreleri Alcian mavisi boyama ile 37 ° C'de 1 saat boyayın.
    6. Hücreleri boyama solüsyonu kalmayana kadar durulayın ve mikroskop altında gözlemleyin.

7. Gerçek zamanlı PCR

  1. RNA ekstraksiyon kitini kullanarak toplam RNA'yı çıkarın ve RNA konsantrasyonunu bir enzim işaretleyici ile ölçün (üreticinin talimatlarını izleyerek).
  2. 500 ng RNA19 kullanarak cDNA'yı sentezleyin.
  3. 1 μL cDNA, 3,5 μL çift damıtılmış su, 5 μL SYBR ve 0,5 μL primer karışımı (0,1 μM) içeren 10 μL qRT-PCR karışımı ile Gerçek zamanlı bir sistemde qRT-PCR gerçekleştirin.
    NOT: Primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir. Termal döngü koşulları şu şekildedir: 2 dakika boyunca 50 °C, 2 dakika boyunca 95 °C, ardından 15 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü, 2 dakika boyunca 60 °C ve ardından erime eğrisi için 60 °C'den 95 °C'ye 5 saniye boyunca 0,5 °C'lik artışlar.
  4. GAPDH'yi iç kontrol olarak kullanın16.

Sonuçlar

72 saatlik hücre inokülasyonundan sonra, çoğu hücre askıya alındı ve yuvarlak şekilliydi, çok azı duvara yapışmıştı (Şekil 1B). Beşinci günde, iğler veya fibroblast benzeri şekiller sergileyen yapışık hücre kolonileri ortaya çıktı (Şekil 1C

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

Tartışma

Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMMSC'ler), kemik iliğinde bulunan hematopoietik olmayan kök hücrelerin bir alt kümesini temsil eder ve kendini yenileme yetenekleri, çok yönlü farklılaşma potansiyelleri ve hematopoez için destekleyici işlevleri ile karakterize edilir. Bu hücreler, doku yenilenmesi, anjiyogenez ve hücresel aktivitelerin düzenlenmesi gibi çeşitli fizyolojik süreçlerde çok önemli roller oynar20. Sonuç olarak, BMMSC'ler doku onarımı ve rejeneratif mühendislikte optimal bir tohum hücresi kaynağı olarak sıklıkla kullanılmaktadır21.

İlk olarak 2005 yılında Matsubara ve ark.22 tarafından insan çene kemik iliği aspiratlarından izole edilen çene kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (JBMMSC'ler), diğer iskelet bölgelerine kıyasla çenenin benzersiz kökenlerine ve gelişim yollarına atfedilebilen belirgin farklılaşma özellikleri sergiler 4,23. Kraniofasiyal kemiği yöneten farklı gelişimsel ve patolojik mekanizmalar göz önüne alındığında, kraniyofasiyal kemik defektlerinin onarımında JBMMSC'lere öncelik verilmesi, homolog gelişimsel özellikleri nedeniyle zorunlu görünmektedir23. Ayrıca, JBMMSC'ler, ortak embriyonik doku kökenleri nedeniyle oral mikroçevre ile yüksek histouyumluluk sergiler24,25. Bu avantajlara rağmen, JBMMSC'ler için standartlaştırılmış ve güvenli bir izolasyon protokolü belirsizliğini korumaktadır ve JBMMSC'ler üzerine yapılan araştırmalar nispeten sınırlı kalmaktadır.

BMMSC'lerin izolasyonu ve kültivasyonu, immünomanyetik boncuk sıralama, akış sitometrisi sıralaması, yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ve tüm kemik iliği yapışık kültür26 dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan yöntemlerle şu anda standardizasyondan yoksundur. Bunlar arasında immünomanyetik boncuk yöntemi ve akış sitometrisi sıralama yöntemi, hücre yüzeyindeki spesifik antijenleri tanıyarak hücreleri izole eder. Bununla birlikte, bu yöntemler hantal işlemleri içerir, özel aletler gerektirir ve yüksek saflıkta hücreler vermesine rağmen hücre aktivitesini etkileyebilir27. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme yöntemi, hücreleri santrifüjleme ve tabakalaşma yoluyla ayırır, bu da hücre mikro ortamını değiştirebilen, daha yavaş hücre büyümesine ve hücresel yaşlanmanın artmasına neden olur28. Tersine, tüm kemik iliği yapışık kültür yöntemi, kemik iliğindeki farklı hücre tipleri arasında değişen yapışık yeteneklere bağlı olarak ortamı aralıklı olarak değiştirerek ve geçirerek BMMSC'leri ayırır ve saflaştırır. Bu yöntem hücrelere minimum zarar verir ve uygulanması kolaydır16.

Femur ile karşılaştırıldığında, çene boyut olarak daha küçüktür ve diş veya periodontal ligamentteki hücrelerden gelen girişimle daha dar bir kemik iliği boşluğuna sahiptir. Kemik iliği yıkama ve adezyon yöntemi, nispeten daha fazla miktarda kemik iliği gerektirir ve büyük hayvanlar ve insanlar için uygundur29. Geleneksel kemik iliği yıkama yöntemi uygulanarak ekstrakte edilen sıçanlarda JBMMSC'ler sayıca nadirdir, çoğalması yavaştır ve düşük kalitededir30,31. Kemik iliğindeki JBMMSC'lerin içeriği çok düşüktür ve esas olarak kompakt kemik ve endosteumda bulunurlar. Bu-Kyu Lee ve ark.32, JBMMSC'leri izole etmek için mandibular aspiratları kullanırken, mandibula için 10 mL ilik kanı için toplam aspirasyon süresi, iliak krest için olandan beş kat daha uzundu ve mandibuladan MSC'lerin ilk verimi, iliak krestten üç kat daha düşüktü. Kemik iliğinin tek başına yıkanması, kompakt kemik ve endosteumdaki hücreleri etkili bir şekilde izole edemez.

Son yıllarda, çalışmalar, kompakt kemiğin BMMSC'lerin yeni ve güvenilir bir kaynağı olduğunu bulmuş ve nispeten basit bir BMMSC izolasyon yöntemi olan kemik dilimi sindirme kültürü yöntemi33 türetilmiştir. Bu yöntemle izole edilen BMMSC'ler yüksek saflığasahiptir 34. Guo ve ark.35, kemik dilimi sindirme kültürü yöntemini kullanarak fare uyluk kemiğinden kemik mezenkimal kök hücrelerini başarıyla izole etmişlerdir. Yamazaet ark.12 ve Cheng ve ark.15 , fare mandibular kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonuna kemik dilimi sindirme kültürü yöntemini uyguladılar ve hücre proliferasyonu, immünofenotip ve çok soylu farklılaşma ile MSC özelliklerini doğruladılar. Bu deney, birincil sıçan JBMMSC'lerini izole etmek ve kültürlemek için yıkanmış tüm kemik iliği yapışması ve kemik dilimi sindiriminin bir kombinasyonunu kullandı. Kemik iliği, kemik iliğindeki orijinal hücresel bileşimi ve büyüme faktörlerini korumak için filtrasyon yapılmadan boşluktan iyice yıkandı. Daha sonra, kemik dilimleri küçük parçalar halinde kesildi ve hücrelerin kemik parçalarından çıkmasını kolaylaştırmak için tip II kollajenaz kullanılarak sindirildi. Son olarak, kemik dilimleri bir kültür kabına aşılandı ve hücrelerin kemik dilimlerinden dışarı çıkmasına izin vermek için kültürlendi. Kombinasyon yöntemi, birincil hücrenin kültür sisteminin aynı anda hematopoietik kök hücrelerin, süngerimsi kemiğin ve kortikal kemiğin bileşenlerini içermesini sağlar, bu da vücuttaki kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin mikro ortamını daha iyi simüle edebilir ve hücrelerin orijinal biyolojik özelliklerini korumak için daha elverişlidir. Bu nedenle bu yönteme "köklülük üzerine niş temelli bir yaklaşım" denir36. Luet ark.37 ayrıca BMMSC'lerin izolasyonunda kök hücre nişlerinin önemini vurguladı, ancak bunlar sadece kortikal kemik olmadan kemik iliğindeki mikro çevreyi içeriyordu. Bu yöntem farelerin çenesinden kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin izole edilmesinde başarıyla uygulanmıştır38.

Ayrıca, bu niş tabanlı yaklaşımla sıçan JBMMSC'lerini başarıyla izole ettik ve yetiştirdik. İlk olarak, izole edilen hücreler fibroblast benzeri bir şekil sergiledi ve in vitro olarak plastik kültür plakalarına yapıştırıldı. İkinci olarak, hücreler CD90, CD29 ve CD44 yüzey belirteçlerini pozitif olarak eksprese etti ve CD45, CD34 ve CD11b/c'yi negatif olarak eksprese etti. Üçüncüsü, hücreler osteositlere, adipositlere ve kondrositlere farklılaşabilir. Elde edilen hücreler, Uluslararası Hücresel TedaviDerneği 17 tarafından önerilen insan kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin tanımlanması için minimum kriterleri karşılayan iyi bir morfolojiye, hızlı bir proliferasyon hızına ve farklılaşma yeteneğine sahipti.

JBMMSC'lerin izolasyonu, insanlarda hücreleri izole etmek için geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Matsubara ve ark.22 , oral cerrahi sırasında insan alveolar kemik iliği örneklerinden JBMMSC'leri izole eden en erken kişilerdi. Mandibula aspirasyon işlemi sırasında bitişik dokuya hasar, oral bakteriyel kontaminasyona bağlı enfeksiyon vb. dahil olmak üzere olası komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Zong ve ark.39 , insan JBMMSC'leri elde etmek için süngerimsi kemik örneği parçalarının kemik iliği boşluğunu yıkadı. Park ve ark.40 , ardışık bir sindirim yöntemi kullanarak implant delme sırasında elde edilen alveolar kemik çiplerinden insan JBMMSC'lerini izole etti. Mason ve ark.41 , rutin dental implant yerleştirilen hastaların çene kemik iliği çekirdeklerinden ve aspiratlarından doğrudan izole edilmiş insan JBMMSC'leridir. Hücreleri aspiratlardan veya çekirdekten izole etmenin yüksek bir başarı oranı ve kombinasyonun daha yüksek bir başarı oranı vardı. Bununla birlikte, yukarıdaki yöntemler JBMMSC'leri insanlardan başarılı bir şekilde izole etmiş olsa da, yöntemler arasındaki etkinlik farklılıklarının karşılaştırılması gerekir. Şu anda, sunulan bu yöntem sadece farelerde ve sıçanlarda kullanılmıştır ve bu yöntemin insan JBMMSC'lerinin izolasyonuna uygulanmasına ilişkin herhangi bir araştırma yoktur. Bu yöntemin, özellikle insanlara uygulandığında sınırlamaları vardır. İlk olarak, kemik iliği yıkama ve kemik dilimi sindirimini birleştirmenin bu yöntemi nispeten karmaşıktır ve daha fazla adım gerektirir. İkincisi, karmaşık süreçler, protokol için kritik olan operasyonların sterilitesine daha fazla talep getirir. Üçüncüsü, insan çene kemiğinin tüm kemik iliği boşluğunu yıkamak imkansızdır, bu nedenle süngerimsi kemik parçalarının yıkanması gibi bazı eşdeğer yöntemlerin araştırılması gereklidir.

Özetle, bu çalışma, "kök hücre nişi" ilkesine dayalı olarak kemik iliği yıkama ve kemik dilimi sindiriminin bir kombinasyonunu kullanarak sıçan JBMMSC'lerini başarıyla izole etti ve kültürledi. Hücre tanımlama sonuçları, bu yöntemin yeterli ve yüksek saflıkta JBMMSC'leri izole edebildiğini ve özellikle büyük önem taşıyan kemik defekti onarımında çene kemiği dokusu mühendisliği için bol miktarda hücre kaynağı sağladığını doğruladı.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Askeri Komisyon Lojistik Departmanı (19BJZ22), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7232154) ve Dördüncü Mil Med Üniversitesi Sağlık Hizmetleri Projeleri (2021XB025) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alizarin Kırmızı S Çözeltisi% 0.2SolarbioG1450
BCIP / NBT Alkalin Fosfataz Renk Geliştirme KitiBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 Gerçek Zamanlı SistemBio-Rad
CCK8 KitiDujindoCK04
Hücre kültürü kabı 10 cmCorning353003
SantrifüjüEppendorf5810R
Santrifüj Tüpü 15 mL Corning430790
Santrifüj Tüpü 50 mL Corning430828
CO2 inkübatörüThermo Fisher3111
Sabit sıcaklık osilatörüShanghai Zhicheng Analiz Cihazı Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
Fetal sığır serumuBI04-001-1ACS
Akış sitometresiBDFACS C6 
Ters faz kontrast mikroskobuOlympusCKX41 
Mezenkimal Kök Hücre (Sıçan) Yüzey İşaretleyici Tespit Kiti OricellRAXMX-09011
Çok fonksiyonlu mikroplaka okuyucuBioTekSynergy LX Çok Modlu
Yağ Kırmızı O Leke KitiSolarbioG1262
Paraformaldehit %4SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
penisilin-streptomisin %0.25MACGENECC004
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher A25742
PrimeScript RT Master Karışımı TakaraRR036A Sıçan
Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Adipojenik Farklılaşma kitiOricellRAXMX-90031
Sıçan Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Kondrojenik Farklılaşma kitiOricellRAXMX-90041
Sıçan Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Osteojenik Farklılaşma kitiOricellRAXMD-90021
RNA ekstraksiyon kitiTIANGENDP419
Süper temiz tezgahBeijing Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.KLCZ-1220A
Tripsin-EDTA & nbsp;% 0.25MACGENECC012
Tip II kollajenazSolarbioC8150
Wistar sıçanPekin Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.
α-MEM kültür ortamı GibcoC12571500BT

Kaynaklar

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  3. Shao, J., Zhang, W., Yang, T. Using mesenchymal stem cells as a therapy for bone regeneration and repairing. Biol Res. 48, 62(2015).
  4. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. Long-bone marrow stromal cells. J Dent Res. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  5. Mendi, A., Ulutürk, H., Ataç, M. S., Yılmaz, D. Stem cells for the oromaxillofacial area: Could they be a promising source for regeneration in dentistry. Adv Exp Med Biol. 1144, 101-121 (2019).
  6. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The triple origin of skull in higher vertebrates: A study in quail-chick chimeras. Development. 117 (2), 409-429 (1993).
  7. Leucht, P., et al. Embryonic origin and hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135 (17), 2845-2854 (2008).
  8. Jeyaraman, M., et al. Is mandible derived mesenchymal stromal cells superior in proliferation and regeneration to long bone-derived mesenchymal stromal cells. World J Methodol. 13 (2), 10-17 (2023).
  9. Mouraret, S., et al. The potential for vertical bone regeneration via maxillary periosteal elevation. J Clin Peri.odontol. 41 (12), 1170-1177 (2014).
  10. Li, T. Q., Meng, X. B., Shi, Q., Zhang, T. Research progress in biological characteristics and influencing factors of jaw bone marrow mesenchymal stem cell. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 57 (1), 107-112 (2022).
  11. Arthur, A., Gronthos, S. Clinical application of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells to repair skeletal tissue. Int J Mol Sci. 21 (24), 9759(2020).
  12. Yamaza, T., et al. Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells. J Dent Res. 90 (3), 317-324 (2011).
  13. Chen, L., et al. Directional homing of glycosylation-modified bone marrow mesenchymal stem cells for bone defect repair. J Nanobiotechnology. 19 (1), 228(2021).
  14. Hong, Y., et al. Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats. J Vis Exp. (162), e61532(2020).
  15. Cheng, B., et al. Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 25 (1), 67-72 (2021).
  16. Lee, D. J., et al. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from rat mandible to regenerate critical sized calvarial defect. J Tissue Eng. 10, 2041731419830427(2019).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fathi, E., Mesbah-Namin, S. A., Vietor, I., Farahzadi, R. Mesenchymal stem cells cause induction of granulocyte differentiation of rat bone marrow c-kit(+) hematopoietic stem cells through jak3/stat3, erk, and pi3k signaling pathways. Iran J Basic Med Sci. 25 (10), 1222-1227 (2022).
  19. Xu, W., et al. Exosomes from microglia attenuate photoreceptor injury and neovascularization in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Ther Nucleic Acids. 16, 778-790 (2019).
  20. Chu, D. T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  21. Liu, Y., et al. Systemic infusion of mesenchymal stem cells improves cell-based bone regeneration via upregulation of regulatory T cells. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 498-509 (2015).
  22. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: Differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 20 (3), 399-409 (2005).
  23. Zhang, G., Li, Q., Yuan, Q., Zhang, S. Spatial distributions, characteristics, and applications of craniofacial stem cells. Stem Cells Int. 2020, 8868593(2020).
  24. Akintoye, S. O. The distinctive jaw and alveolar bone regeneration. Oral Dis. 24 (1-2), 49-51 (2018).
  25. Park, J. B., Kim, I., Lee, W., Kim, H. Evaluation of the regenerative capacity of stem cells combined with bone graft material and collagen matrix using a rabbit calvarial defect model. J Periodontal Implant Sci. 53 (6), 467-477 (2023).
  26. Ni, X., et al. Isolation, culture and identification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering. Materials Exp. 12, 817-822 (2022).
  27. Abdallah, B. M., Khattab, H. M. Recent approaches to isolating and culturing mouse bone marrowderived mesenchymal stromal stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (5), 599-607 (2021).
  28. Tan, S. L., Ahmad, T. S., Selvaratnam, L., Kamarul, T. Isolation, characterization and the multilineage differentiation potential of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Anat. 222 (4), 437-450 (2013).
  29. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).
  30. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: Basic science to clinical translation. Int J Biochem Cell Biol. 43 (3), 286-289 (2011).
  31. Liu, J., Watanabe, K., Dabdoub, S. M., Lee, B. S., Kim, D. G. Site-specific characteristics of bone and progenitor cells in control and ovariectomized rats. Bone. 163, 116501(2022).
  32. Lee, B. K., Choi, S. J., Mack, D., Oh, S. H. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 112 (6), e86-e93 (2011).
  33. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  34. Short, B. J., Brouard, N., Simmons, P. J. Prospective isolation of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Methods Mol Biol. 482, 259-268 (2009).
  35. Guo, Z., et al. In vitro characteristics and in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murine mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 24 (4), 992-1000 (2006).
  36. Pal, B., Das, B. In vitro culture of naïve human bone marrow mesenchymal stem cells: A stemness based approach. Front Cell Dev Biol. 5, 69(2017).
  37. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  38. Cao, W., et al. Mir-344d-3p regulates osteogenic and adipogenic differentiation of mouse mandibular bone marrow mesenchymal stem cells. PeerJ. 11, e14838(2023).
  39. Zong, C., Zhao, L., Huang, C., Chen, Y., Tian, L. Isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells from the human mandible. J Vis Exp. (182), e63811(2022).
  40. Park, J. C., et al. Acquisition of human alveolar bone-derived stromal cells using minimally irrigated implant osteotomy: In vitro and in vivo evaluations. J Clin Periodontol. 39 (5), 495-505 (2012).
  41. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

S an Mandibula zolasyonuKemik Kesiti SindirimiT m Kemik li iH cre Y zey MarkerlarAk SitometrisiOsteojenik DiferansiyasyonAdipojenik DiferansiyasyonKondrojenik Diferansiyasyon
Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü Tekniği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.