Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu

Süper kompleksler (SK'ler), bireysel solunum zinciri kompleksleri^arasındaki supramoleküler ilişkilerdir ^1,2. SC'lerin ilk tanımlanması ve bileşimlerinin Schägger ^2,3 grubu tarafından tanımlanmasından bu yana, daha sonra diğer gruplar tarafından onaylandığından, farklı stokiyometrilerde solunum kompleksleri I, III ve IV (SIRASIYLA CI, CIII ve CIV) içerdikleri tespit edilmiştir. İki ana SK popülasyonu tanımlanabilir, CI içerenler (ve tek başına CIII veya CIII ve CIV) ve çok yüksek moleküler ağırlığa sahip olanlar (MW, daha küçük SC için ~ 1.5 MDa'dan başlar: CI + CIII₂) ve CIII ve CIV içerenler ancak CI içermeyenler, çok daha küçük boyutlu olanlar (~ 680 kDa'lı CIII₂ + CIV gibi). Bu SC'ler, iç mitokondriyal zarda da farklı oranlarda serbest komplekslerle bir arada bulunur. Bu nedenle, CI çoğunlukla ilişkili formlarında bulunurken (yani, SC'lerde: sığır kalbinde ~% 80 ve birçok insan hücre tipinde% 90'dan fazla)³, CIV serbest formunda çok bol miktarda bulunur (sığır kalbinde% 80'den fazla), CIII daha dengeli bir dağılım gösterir (daha bol serbest formunda ~% 40, bir dimer olarak, sığır kalbinde).

Varlıkları artık genel olarak kabul edilse de, kesin rolleri hala tartışılmaktadır 4,5,6,7,8,9,10. Plastisite modeline göre, hücre tipine veya metabolik duruma bağlı olarak farklı oranlarda SK'ler ve bireysel kompleksler mevcut olabilir ^1,7,11. Düzeneğin bu dinamik doğası, hücrelerin çevresel değişikliklere yanıt olarak mevcut yakıtların kullanımını ve oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sisteminin verimliliğini düzenlemesine izin verecektir ^4,5,7. SK'ler ayrıca reaktif oksijen türlerinin üretim hızının kontrolüne katkıda bulunabilir ve bireysel komplekslerin stabilizasyonuna ve cirosuna katılabilir 4,12,13,14. SC montaj durumundaki modifikasyonlar, farklı fizyolojik ve patolojik durumlarla^15,16 ve yaşlanma süreci¹⁷ ile ilişkili olarak tanımlanmıştır.

Bu nedenle, SC modellerindeki değişiklikler, büyüme² için kullanılan karbon kaynağına bağlı olarak mayada ve glikoz galaktoz⁴ ile ikame edildiğinde kültürlenmiş memeli hücrelerinde tanımlanmıştır. Oruç tuttuktan sonra fare karaciğerinde⁸ ve mitokondriyal yağ asidi oksidasyonu^{bloke edildiğinde astrositlerde de değişiklikler bildirilmiştir 18}. Ek olarak, Barth sendromu¹⁹, kalp yetmezliği²⁰, çeşitli metabolik²¹ ve nörolojik 22,23,24 bozukluklarda ve farklı tümörlerde SK'lerde ve OXPHOS'ta bir azalma veya değişiklikler bulunmuştur 25,26,27,28. SK montajındaki ve seviyelerindeki bu değişikliklerin bu patolojik durumlarda birincil neden olup olmadığı veya ikincil etkileri temsil edip etmediği hala araştırılmaktadır^15,16. Farklı metodolojiler, SC'lerin montajı ve işlevi hakkında bilgi verebilir; Bunlar arasında aktivite ölçümleri ^8,29, ultrastrüktürel analiz^30,31 ve proteomik^32,33 yer alır. Giderek daha fazla kullanılan ve daha önce bahsedilen metodolojilerin bazıları için başlangıç noktası olan yararlı bir alternatif, Schägger'in grubu^34,35 tarafından bu amaç için geliştirilen Blue native (BN) elektroforezi ile SC montaj durumunun doğrudan belirlenmesidir.

Bu yaklaşım, mitokondriyal zarları elde etmek ve çözündürmek için tekrarlanabilir ve verimli prosedürler gerektirir ve jel içi aktivite analizi (IGA), ikinci boyut elektroforezi ve western blot (WB) gibi diğer tekniklerle tamamlanabilir. BN elektroforezi ile SK dinamiği üzerine yapılan çalışmalarda bir sınırlama, başlangıç hücrelerinin veya doku örneklerinin miktarı olabilir. SC montajı ve fonksiyonunun analizi için, Schägger'in grup yöntemlerinden uyarlanan, 20 mg kadar küçük bir dokudan başlayarak taze veya donmuş hücre veya doku örneklerine uygulanabilen bir dizi protokol sunuyoruz.

NOT: Tüm kültür ortamlarının ve tamponlarının bileşimi Tablo 1'de belirtilmiştir ve bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre kültüründen mitokondri izolasyonu

NOT: Test edilen minimum hücre hacmi ~ 30-50 μL paketlenmiş hücre olmuştur (adım 1.4). Bu, hücre tipine bağlı olarak yaklaşık olarak en az iki veya üç adet 100 mm'lik hücre kültürü plakasına veya birleşmenin %80-90'ında bir 150 mm'lik plakaya karşılık gelebilir (L929'dan türetilmiş hücrelerde 5 ×ila 10^{6 ila} 10⁷ hücre arasında veya MDA-MB-468). Verimli hücre kırılması kritik bir adımdır.

1. Yapışık hücreleri yaklaşık% 80 birleşim noktasına veya asılı hücreleri yeterli bir yoğunluğa kadar büyütün.
2. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile hasat edin (yapışmayan hücreler durumunda doğrudan hücre süspansiyonundan veya yapışık hücreler durumunda 1x PBS'de% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA'lık bir tripsin-EDTA çözeltisi ile standart tripsinizasyondan sonra).
3. Hücreleri 2x soğuk 1x PBS ile yıkayın ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyerek çökeltin.
   NOT: Bu noktadan itibaren tüm adımlar 4 °C'de gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle, tüm reaktifler soğuk olmalı ve hücre veya mitokondri içeren tüpler buz üzerinde tutulmalıdır.
4. İkinci santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın, hücre pelet hacmini (cpv) tahmin edin ve adım 1.8'de zar kırılmasını kolaylaştırmak için hücreleri en az 15 dakika boyunca -80 ° C'de dondurun.
   NOT: Protokol bu noktada durdurulabilir ve hücreler haftalarca -80 °C'de saklanabilir. Genellikle, konik tabanlı 10 veya 15 mL dereceli tüpler uygundur.
5. Hücrelerin buz üzerinde yavaşça çözülmesine izin verin.
6. Paketlenmiş hücre peletini cpv'nin 7 katına eşit bir hipotonik tampon hacminde (10 mM MOPS, 83 mM sükroz, pH 7.2) yeniden süspanse edin (ör., 700 μL tamponda 100 μL paketlenmiş hücre).
   NOT: Etkili patlamalar elde etmek için ses seviyesi yeterli olmalıdır (adım 1.8'deki NOT'a bakın).
7. Hücre süspansiyonunu uygun boyutta bir Potter-Dounce homojenizatöre aktarın ve hücreleri 2 dakika buzda inkübe ederek şişmesine izin verin. Örneğin, 700-800 μL'lik bir hücre süspansiyonu hacmi için 1 mL kapasiteli bir homojenizatör yeterlidir.
8. 600 rpm'de dönen motor tahrikli bir Teflon havaneli ile birleştirilmiş homojenizatörde sekiz ila on vuruş yaparak hücre zarlarını kırın.
   NOT: Vuruşları yaparken, zarları şişirmek ve kırılganlaştırmak için sırasıyla hipotonik ve donma etkileriyle birlikte hücre kırılma verimliliğini artıracak bir vakum oluşturmak önemlidir. İyi yapılırsa, homojenizatörü her vuruşta hızlı bir hareketle aşağı çekerken bir "pop" sesi duyulacaktır.
9. İzotonik bir ortam oluşturmak için hücre süspansiyonuna (cpv'nin 7 katı) (30 mM MOPS, 250 mM sükroz, pH 7.2) aynı hacimde hipertonik tampon ekleyin.
10. Homojenatı 10-15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 1.000 × g'da sabit bir rotorda 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Kırılmamış hücreleri içeren orijinal tüp bu amaç için kullanılabilir.
11. Mitokondriyal fraksiyonu içeren süpernatanı 1.5 mL polipropilen tüplere aktarın.
12. İSTEĞE BAĞLI: Mitokondri verimini artırmak için, peleti 1.10. adımdan itibaren tampon A'nın hücre pelet hacminin 7 katında (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M sükroz, pH 7.4) yukarı ve aşağı pipetleyerek ve 1.000 × g'da 5 ° C'de 4 dakika santrifüjleyerek yeniden süspanse edin. Adım 1.13'e geçmeden önce yeni süpernatanı bir öncekiyle birleştirin.
13. Mitokondriyal ham fraksiyonu toplamak için 16.000 × g'da 4 ° C'de 2 dakika boyunca bir mikrofüje santrifüjleyin.
14. Süpernatanı atın ve her mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 0.5 mL tampon A ile yeniden süspanse edin, iki tüpün içeriğini bir tüpte birleştirin ve adım 1.13'te açıklandığı gibi aynı koşullar altında santrifüjleyin. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.
15. Süpernatanı atın, son peleti 300 μL tampon A ile yeniden süspanse edin ve Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjleyin ve bölüm 3'e geçin.

2. Mitokondrinin az miktarda hayvan dokusundan izolasyonu

NOT: Bu protokolü belirli bir güvenle uygulamak için minimum doku miktarı, hücre tipine ve mitokondriyal bolluğuna bağlıdır, ancak çoğu durumda ~ 20-30 mg doku olabilir. Doku örnekleri taze materyal veya donmuş örnekler olabilir. İkinci durumda, işleme başlamadan önce numunelerin buz üzerine yerleştirilmiş homojenizasyon tamponunda çözülmesine izin verin.

1. Doku miktarını (mg) mümkün olduğunca yakın bir şekilde tartın veya tahmin edin.
2. Dokuyu bir makasla kesin ve küçük parçaların kaybolmamasına dikkat ederek bir süzgeç yardımıyla homojenizasyon tamponunda 3-4 yıkama yapın.
   NOT: Bu adım, iskelet kası veya kalp gibi dokularda, hücreleri homojenizasyon adımıyla doğrudan kolayca ayrıştırılabilen beyin veya daha yumuşak dokulardan daha önemlidir.
3. Taze homojenizasyon ortamı ekleyin (gram karaciğer başına 4 mL, gram kalp, kahverengi yağ dokusu (BAT) veya kas başına 10 mL ve gram beyin veya böbrek başına 5 mL; Tablo 1'deki her vaka için spesifik tampon bileşimine bakınız).
4. Tamponlu doku parçalarını homojenizatöre aktarın ve seçilen dokuya bağlı olarak optimum homojenizasyon ve mitokondri izolasyon protokolünü izleyin.
5. Mitokondrinin karaciğer, dalak ve böbrekten izolasyonu
   1. Elvehjem-Potter'da 600 rpm'de motor tahrikli Teflon tokmak ile dört ila altı yukarı ve aşağı vuruşla homojenize edin.
   2. Homojenize edilmiş dokuyu steril bir santrifüj tüpüne aktarın. 1.000 × g'da sallanan bir rotorda 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. 1,5 mL polipropilen tüpleri önceki adımda elde edilen süpernatan ile doldurun. 4 ° C'de bir mikrofüje 16.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin ve daha sonra daha önce açıklandığı gibi devam edin (adım 1.13 ila 1.15)
6. Kalp ve kas örneklerinden mitokondri izolasyonu
   1. Elvehjem-Potter'da 600 rpm'de motor tahrikli Teflon havaneli ile altı ila sekiz vuruşla homojenize edin. Homojenize edilmiş dokuyu steril bir santrifüj tüpüne aktarın.
   2. 1.000 × g'da sallanan bir rotorda 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı temiz 1,5 mL polipropilen tüplere dökün.
      NOT: Adım 2.6.2'de elde edilen peletin ikinci bir homojenizasyonu, mitokondriyal verimi artırmak için 4-5 ek vuruş ve 1/2 hacim homojenizasyon tamponu ile gerçekleştirilebilir. Yeni süpernatan (4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'da tekrar santrifüjlemeden sonra), adım 2.6.3'e geçmeden önce bir öncekiyle birleştirilebilir. Ham mitokondri verimini arttırmanın bir alternatifi, homojenizasyondan önce kalp ve kas dokusu örneklerinin tripsin çözeltisi içinde ayrıştırılmasıdır^36,37. Bu durumda, mitokondriyal zarlar digitonin ile çözündürülmeden önce tripsinin verimli bir şekilde inaktive edilmesi/uzaklaştırılması gerekir (adım 3.2).
   3. Ham mitokondriyal fraksiyonu elde etmek için 16.000 × g'da bir mikrofüje 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı atın ve her mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 0.5 mL tampon AT ile yeniden süspanse edin, iki tüpün içeriğini bir tüpte birleştirin ve adım 2.6.3'te açıklandığı gibi aynı koşullar altında santrifüjleyin. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.
   5. Süpernatanı atın, son peleti 300 μL tampon A (BSA yok) ile yeniden süspanse edin ve Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjleyin ve bölüm 3'e geçin.
7. Mitokondrinin beyinden izolasyonu
   1. Beynin parçalarını 10-15 vuruşla homojenize edin, manuel olarak sürülen bir cam tokmağı ile Doutence tipi bir cam homojenizatör kullanarak. Homojenize edilmiş dokuyu steril bir santrifüj tüpüne aktarın.
   2. 1.000 × g'da sallanan bir rotorda 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı temiz bir santrifüj tüpüne toplayın.
   4. Önceki santrifüjleme adımında elde edilen peleti, ilk homojenizasyonda kullanılan aynı hacimde AT ortamında yeniden süspanse edin. Adım 2.7.1'de açıklanan işlemi 5-10 geçiş kullanarak tekrarlayarak peleti yeniden homojenize edin ve süspansiyonu 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'da sallanan bir rotorda santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı çıkarın ve adım 2.7.3'te hazırlanan tüpe ekleyin. Ham mitokondriyal fraksiyonu elde etmek için sabit açılı bir rotorda 10.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   6. Süpernatanı atın ve peleti, ortamın AT ortamının ilk homojenizasyon hacminin (adım 2.7.1) 1/2'sine kadar yeniden süspanse edin. Mitokondriyal süspansiyonu temiz 1,5 mL polipropilen tüplere dağıtın ve 16.000 × g'da bir mikrofüjde 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin.
   7. Süpernatanı atın ve her mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 0.5 mL tampon AT ile yeniden süspanse edin, iki tüpün içeriğini bir tüpte birleştirin ve adım 2.7.6'da açıklandığı gibi aynı koşullar altında santrifüjleyin. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.
   8. Süpernatanı atın, son peleti 300 μL tampon A (BSA yok) ile yeniden süspanse edin ve Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjleyin ve bölüm 3'e geçin.
8. Mitokondrinin BAT'tan izolasyonu
   1. Elvehjem-Potter'da 600 rpm'de motor tahrikli bir Teflon tokmak ile sekiz ila on yukarı ve aşağı vuruşla homojenize edin. Homojenize edilmiş dokuyu steril bir santrifüj tüpüne aktarın.
   2. 1.000 × g'da sallanan bir rotorda 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. 1.5 mL polipropilen tüpleri, üst yağ tabakasından kaçınarak önceki adımda elde edilen süpernatan ile doldurun.
      NOT: Mitokondriyal verimi artırmak için adım 2.8.2'de elde edilen peletin ikinci bir homojenizasyonu gerçekleştirilebilir. Yeni süpernatan (4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'da tekrar santrifüjlemeden sonra), adım 2.8.4'e geçmeden önce bir öncekiyle birleştirilebilir.
   4. 16.000 × g'da 2 dakika, 4 °C'de bir mikrofüje 2 dakika santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı atın ve her mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 0.5 mL tampon AT2 ile yeniden süspanse edin, iki tüpün içeriğini bir tüpte birleştirin ve adım 2.8.4'te açıklandığı gibi aynı koşullar altında santrifüjleyin. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.
   6. Süpernatanı atın, son peleti 300 μL tampon A (BSA yok) ile yeniden süspanse edin ve Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjleyin ve bölüm 3'e geçin.

3. Blue Native analizi için numunelerin hazırlanması

1. Yaklaşık 10 mg / mL'lik bir protein konsantrasyonu elde etmek için mitokondriyal fraksiyonları (memeli hücre kültürlerinden veya dokularından elde edilen) BN numune tamponunda (50 mM NaCl, 50 mM İmidazol, 5 mM Aminokaproik asit, 4 mM PMSF) yeniden süspanse edin. Farklı numune türleri için beklenen verimler için Tablo 2'ye bakın.
2. 4 g digitonin/g mitokondriyal protein (adım 3.1'de hazırlanan 10 μL mitokondriyal süspansiyon için 4 μL digitonin% 10 stok) oranı elde etmek için digitonin (% 10 stok çözeltisi) ekleyerek mitokondriyal membranları çözündürün.
   NOT: Deterjan-protein oranı (g/g), tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için her numune türü için optimize edilmelidir; 2-8 g digitonin/g mitokondriyal proteinin çoğu doku için optimal olduğu bulunmuştur^34,35.
3. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Numuneleri buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
   NOT: Bu adımdan sonra, mitokondriyal süspansiyon daha net hale gelmelidir (opaktan yarı saydama geçiş); Aksi takdirde, deterjan miktarının doğru membran çözündürmesi için yetersiz olduğunu gösterebilir.
4. Çözünmeyen materyali çıkarmak için bir mikrofüjde (yaklaşık 20.000 × g ) 4 ° C'de 25 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin.
5. Süpernatanı yeni bir tüpte toplayın. Süpernatanınta, ilk yeniden süspansiyon hacminin 1 / 3'üne eşdeğer bir hacim% 5 G-250 (Coomassie Blue G-250 0.75 M aminokaproik asit içinde% 5) ekleyin (adım 3.1, bu, 1.6 g Coomassie / g proteinin nihai oranına karşılık gelir) ve pipetleme ile karıştırın.
6. Jeli yüklemeden önce buz üzerinde tutun veya alikotları -80 ° C'de dondurun.

4. Mavi Yerli jel elektroforezi

NOT: Elektroforez soğuk odada (4-8 °C) gerçekleştirilir. Soğuk oda tesisi yoksa, elektroforez tankına bir soğutma bloğu yerleştirilebilir. Ticari %3-13 doğal poliakrilamid jeller²⁹ kullanılır, ancak istenen gradyan konsantrasyonlarında ev yapımı jeller de kullanılabilir^38,39.

1. Üst ve alt bölmeleri sırasıyla soğuk katot A ve anot tamponları ile yükleyin. Alternatif olarak, üst hazneyi katot tamponu A ile dikkatlice doldurmadan önce numuneleri kuyucuklara yükleyin.
   NOT: Laboratuvarımızda ticari elektroforez tamponları kullanılmaktadır, ancak bunlar Tablo 1'de belirtildiği gibi hazırlanabilir.
2. 30 ila 100 μg arasında mitokondriyal protein yükleyin.
   NOT: Genellikle, 30-50 μg protein (WB için) veya 40-100 μg protein (IGA için) 10 şeritli bir jelde (0.5 x 0.15 cm oyuklar) kuyucuk başına yüklenir. Katot A tamponu, Coomassie Blue G-250 içerir ve numune yükleme için jel kuyucuklarının görülmesini zorlaştıran yoğun bir mavi renge sahiptir. Bu adım sırasında pipet ucunun yerleştirilmesine yardımcı olmak için, örneğin her bir kuyucuğun merkezini kırmızı bir işaretleyici ile işaretlemek uygundur. Doğal moleküler ağırlık belirteçleri, gradyan jellerin düzgün bir şekilde oluşturulduğunu ve komplekslerin ve SC modelinin doğru olduğunu doğrulamak için BN-PAGE tekniğini kurarken yararlı olabilir.
3. 80-100 V'ta 25-30 dakika ve ardından 160-180 V'ta çalıştırın, akımı 12 mA/jel ile sınırlayın, boya jelin dibine ulaşana kadar (toplamda ~ 125-165 dakika).
4. Jel içi aktivite testleri (IGA'lar) yapılacaksa, boya cephesi jelin ortasındayken (çalışmanın başlamasından ~ 1 saat sonra) katot tamponu A'yı katot tamponu B ile değiştirin.
   NOT: Jeller, G-250 boyasına bağlanmaları nedeniyle bazı bantlar görünür olduğundan (esas olarak kompleks V, ~ 600 kDa'lık bir MW'ye sahip "dahili" bir yapıcı olarak kabul edilebilir) çalışmadan hemen sonra herhangi bir lekelenme olmadan belgelenebilse de, genellikle, SC'ler ve bireysel kompleksler boyama veya IGA tahlilleri olmadan görünmez. IGA tahlillerinde veya WB için kullanılacak jeller lekelenmemeli veya sabitlenmemelidir.
5. Jeli kasetten sökün ve Coomassie mavisi boyama (bölüm 5), IGA analizi (bölüm 6) veya WB immünodetection (bölüm 7) ile devam edin.

5. Jel boyama

1. Jeli oda sıcaklığında (RT) 10-15 dakika boyunca Coomassie mavi boya solüsyonları kullanarak boyayın (Coomassie boyası R-250 % 40 metanol,% 10 asetik asit içinde% 0.25'te; 10-15 dakika lekeleyin).
2. RT'de %40 metanol ve %10 asetik asit içinde birkaç yıkama (tipik olarak 4-5 x 15 dakika) ile lekeyi çıkarın.
3. Jeli belgeleyin.

6. Jel aktivitesi (IGA) testlerinde

1. Elektroforez sona ermeden önce farklı solunum komplekslerinin analizi için IGA çözeltileri hazırlayın ve bunları karanlıkta tutun (örneğin koyu renkli plastik kutular kullanarak veya alüminyum folyo ile kaplayarak). Her bir tamponun bileşimi Tablo 1'de detaylandırılmıştır.
2. Kullanılacak jeli veya şeritleri, yerleştirmek için mümkün olduğunca küçük plastik bir kutuya yerleştirin.
3. Jeli kaplayacak kadar uygun çözelti ekleyin (sırasıyla 5 veya 10 jel şeridi için genellikle 5 veya 10 mL) ve RT'de hafifçe çalkalama (60-80 rpm) ve ışıktan uzakta inkübe edin.
   NOT: Kuluçka süresi, analiz edilecek komplekse ve yüklenen numunenin niteliğine ve miktarına bağlıdır; CI ve CIV, sonuç vermesi en kolay ve en hızlı olanlardır. Bu nedenle, CI aktivitesi genellikle birkaç dakika sonra görünür hale gelmeye başlarken, CII ve CIV'nin gözlemlenmesi için ~ 30 dakika ve CV ~ 1.5-2 saat gerekir. Reaksiyon her durumda saatlerce devam edebilir ve inkübasyonu soğuk bir odaya (4-6 °C), örneğin bir gece (AÇIK) inkübasyon için hareket ettirerek sinyal yoğunlaşma hızı azaltılabilir. CIII aktivitesi sadece berrak doğal elektroforez (CN) için çalışır, BN³⁴ için değil.
4. Uygun bantlar geliştiğinde, tahlil solüsyonlarını çıkararak, 2x'i damıtılmış suyla yıkayarak ve jeli %40 metanol artı %10 asetik asit (sadece metanol ile sabitlenen CV hariç) ile 30 dakika sabitleyerek reaksiyonları durdurun.
   1. IGA ile CI tespitinden sonra CIV aktivitesini analiz etmek için, jeli 2x'i damıtılmış suyla yıkayın, CI aktivitesini belgeleyin, jeli (sabitlemeden!) 50 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.2) 2x ile 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından kompleks IV bantları görünene kadar (genellikle RT veya 4 °C'de AÇIK inkübe ederek) tam CIV reaksiyon tamponu ile.
5. Jelleri belgeleyin.
   NOT: ATPaz aktivitesi için, geliştirilen bantlar beyaz olduğundan, jeli belgelerken, şeffaf bantların görünür olması için koyu bir arka plan üzerine yerleştirin.

7. Batı lekesi analizi

1. Transfer tamponunu Tablo 1'e göre hazırlayın ve elektroforezin sonuna kadar 4 °C'de tutun.
2. Jeli bir tepsiye yerleştirin ve transfer tamponu ekleyin. RT'de 10-15 dakika inkübe edin.
3. Jel ile aynı boyutta bir PVDF membran parçası kesin ve çalkalama altında 10 saniye boyunca metanol içinde etkinleştirin. Damıtılmış su ile birkaç kez yıkayın ve transfer tamponu ekleyin. Hafifçe çalkalayarak RT'de 10-15 dakika inkübe edin.
4. Transfer sandviçini aşağıdan yukarıya doğru, jel ve zar arasındaki kabarcıkları önleyerek aşağıdaki sırayla hazırlayın: kaset-sünger-leke kağıdının siyah tarafı-jel-zar-leke kağıdı- kasetin sünger berrak tarafı.
5. Kaseti kapatın ve kilitleyin ve sandviçi transfer için doğru yönde (siyah taraf negatif kutba doğru) transfer tankına koyun.
6. Transfer tankını transfer tamponu ile doldurun, tamponu çalkalamak için manyetik bir karıştırıcı ekleyin ve güç kaynağını 2 saat boyunca 80 V'ta veya 1 saat boyunca 100 V'a bağlayın. Transferi 4 ila 8 °C arasında (örneğin soğuk odada) ve transfer sisteminde bir soğutma bloğu ile gerçekleştirin.
7. Membranı alın ve tespit edilecek farklı solunum kompleksleri için spesifik antikorlar kullanarak standart bir western blot protokolü ile devam edin²⁹.

Yukarıda açıklanan protokollere göre elde edilen mitokondri verimleri, hücre hattı veya doku tipi, numunelerin doğası (yani taze veya donmuş dokular kullanılıyorsa) veya homojenizasyon işleminin verimliliği gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişir. Farklı hücre dizilerinden ve dokulardan beklenen mitokondri verimleri Tablo 2'de toplanmıştır. Mitokondriyal fraksiyonlar elde edildikten sonra, bir sonraki adım, ham mitokondriyal numunenin çözündürülmesi ve BN-PAGE ile elektroforetik ayrılmasından sonra gerçekleştirilen solunum SC modelinin analizidir ve ardından IGA analizi veya WB immün tespiti yapılır. Şekil 1 , çalışmadan hemen sonra boyanmamış jel şeritlerinin görünüşünü ve kültürlenmiş bir hücre hattının ve bir fare karaciğeri mitokondriyal örneğinin standart Coomassie boyamasından sonraki bantların modelini göstermektedir.

Şekil 2A,B'de, IGA tahlilleri kullanıldıktan sonra insan ve fare hücrelerindeki SC montaj modelleri arasında açık farklılıklar gözlemlenebilir. Bu nedenle, serbest kompleks I, fare hücrelerinde gözlenirken, insan mitokondrilerinde tespit edilemez. Kompleks IV-IGA modeli, Şekil 2A'da analiz edilen iki fare hücre hattı arasında farklılıklar sunarken, her iki insan hücre hattında da (Şekil 2B) çok benzerdir. Bu farklılıklar, BL6 hücrelerinin SCAF18'in mutant bir varyantını eksprese etmesinden kaynaklanmaktadır.

Küçük numunelerle çalışmak için burada açıklanan mitokondriyal izolasyon protokolü ile elde edilen SC modelleri, daha büyük numuneler için kullanılan "geleneksel" protokollere göre korunur. Bu, Şekil 2C'de, 1 ve 6 numaralı şeritlerin (3 g karaciğer ve 1.1 g BAT'tan geleneksel bir protokol kullanılarak mitokondriyal izolasyondan sonra elde edilir) sırasıyla 2 ve 5 numaralı şeritlerle (burada sunulan protokoller kullanılarak elde edilir) karşılaştırılmasıyla görülebilir. Plastisite modelinde önerildiği gibi, solunum komplekslerinin ve SK'lerin nispi oranı, hücre tipine ve metabolik duruma bağlı olarak değişir. Şekil 2C,D'de gösterildiği gibi, farklı dokular farklı SC montaj modelleri gösterir. Bu nedenle, beyin mitokondrileri diğer dokularla karşılaştırıldığında çok düşük seviyelerde serbest kompleks I ve daha yüksek oranda SK gösterir ve BAT, düşük CV seviyeleri (Şekil 2A) ve yüksek miktarda SC III + IV (Şekil 2D) ile karakterize edilir. Kalp mitokondrileri yüksek seviyelerde SK ve CV sunar. CV montaj modelleri, kültürlenmiş hücre hattı ile bir fare karaciğeri mitokondriyal örneği arasında çok benzerdir (Şekil 2E).

SC montajı, dalak kontrolü ve tümör hücrelerinden elde edilen iki örnek için Şekil 3'te gösterildiği gibi WB tarafından da analiz edilebilir. Bu durumda, 30-50 μg mitokondriyal protein, spesifik antikorlarla farklı kompleksleri ve SK'leri tespit etmek için genellikle yeterlidir. Şekil 4 , bu protokollerin uygulanması sırasında meydana gelebilecek bazı ana tuzakları göstermektedir. Yanlış jel gradyanları, jeldeki normalden daha yüksek akrilamid konsantrasyonu nedeniyle SC'lerin şeridin üst kısmındaki kuyuya yakın kaldığı Şekil 4A, şerit 1'deki gibi anormal ve istenmeyen göç modelleri üretebilir. Numunelerin, nispeten kısa süreler için bile, yüksek sıcaklıklarda (burada 37 °C ve 10 dakika boyunca 40 °C) inkübasyonu, SC'lerin ve CI'nin bozulmasına neden olur (Şekil 4A şeritleri 2-4). Aynı şekilde, deterjan-protein oranı, iyi sonuçlar ve yeterli jel çözünürlüğü için kritik öneme sahiptir. 2 g digitonin/g protein oranının altında, bant çözünürlüğü kademeli olarak azalır ve daha düşük konsantrasyonda (0.5 g/g) sadece SK'lere karşılık gelen alanda bir yayma görülebilir (Şekil 4B).

Şekil 1: Digitonin geçirgenliğine uğramış mitokondrinin bir kültür hücre hattından (L929Balbc) ve fare karaciğerinden BNGE tarafından ayrılmasından sonra mitokondriyal komplekslerin ve süper komplekslerin modeli. Soldaki şeritler (1 ve 2), koşudan hemen sonra lekelenmemiş jelin yalnızca CV'nin tespit edilebildiği yönünü temsil ederken, sağdaki şeritler (3 ve 4) Coomassie boyamadan sonraki bantların modelini gösterir. Kısaltmalar: BNGE = Blue Native jel elektroforezi; CV = karmaşık V; SC'ler = süper kompleksler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Farklı hücre hatlarından ve fare dokularından izole edilen mitokondrinin IGA analizi. (A,B) (A) fare veya (B) insan hücre hatlarından izole edilen mitokondrideki belirtilen komplekslerin jel içi aktivitesi. L929Balbc, daha önce tarif edildiği gibi Balb/cJ fare trombositlerinden mitokondrinin ρ°L929neo hücrelerine aktarılmasıyla laboratuvarımızda üretilen bir transmisyonondriyal hücre hattıdır40,41. BL6 fibroblastları, laboratuvarımızda bir BL6 faresinin kulak biyopsisinden üretilen ölümsüzleştirilmiş bir hücre dizisidir. (C) 3 g karaciğer (şerit 1) ve 1.1 g BAT (şerit 6) ile başlayan geleneksel bir yöntem veya burada sunulan ve tüm vakalarda yaklaşık 0.1 g doku ile başlayan protokol (şerit 2, karaciğer; şerit 3, kalp; şerit 4, beyin ve şerit 5 BAT) kullanılarak izole edilen fare mitokondrilerinden CI-IGA modelleri. (D) Fare karaciğeri, kalp, beyin ve BAT mitokondrisinde CIV-IGA paternleri (panel 2C, şerit 2-5'te gösterilen CI-IGA'dan sonra gerçekleştirilir). (E) Fare kültürlenmiş hücrelerinde ve karaciğerde analiz edilen CV-IGA aktivitesi. Şerit başına yaklaşık 60-75 μg mitokondriyal protein yüklendi. Kısaltmalar: IGA = jel içi aktivite; SC'ler = süper kompleksler; CI = kompleks I; BAT = kahverengi yağ dokusu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Dalak örneklerinde farklı mitokondriyal komplekslerin ve süper komplekslerin WB immün tespiti. Dalak kontrolü (Dalak M9) ve tümör (Tümör M9) örneklerinden elde edilen mitokondriyal komplekslerin ve SK'lerin Blue Native PAGE ayrılmasından sonra, bunlar bir PVDF membranına aktarıldı ve belirtilen CI, CIII, CIV ve CII alt birimlerini tanıyan antikorlarla sıralı olarak hibritleştirildi (sırasıyla paneller AD). Şerit başına yaklaşık 50 μg mitokondriyal protein yüklendi. Yıldız işaretleri, önceki bir batı lekesinden kalan sinyali gösterir. Kısaltmalar: SC = süper karmaşık; CI = kompleks I; CIII = kompleks III; CIV = karmaşık IV; CII = karmaşık II. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Blue-Native PAGE tarafından yapılan SC analizindeki tuzaklar. Farklı çözündürme koşulları altında (A) taze fare karaciğerinden ve (B) donmuş sıçan karaciğerinden izole edilen mitokondrinin CI IGA analizi. (A) Şerit 1, yanlış jel gradyan konsantrasyonu (normal %3-13 yerine %8-13). Şeritler 2-4, numuneler yüklemeden önce buz üzerinde 10 dakika veya sırasıyla 37 °C ve 40 °C'de inkübe edilir. (B) Çözündürme için farklı digitonin / protein oranları kullanılarak donmuş sıçan karaciğerinden elde edilen mitokondri CI için IGA'dan sonraki model. Kısaltmalar: SC = süper karmaşık; SAYFA = poliakrilamid jel elektroforezi; CI = kompleks I; IGA = jel içi aktivite. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tamponlar ve ortam bileşimi.

Tablo 2: Farklı hücre tiplerinden ve fare dokularından beklenen mitokondri verimleri. Kalp veya iskelet kasından elde edilen mitokondriyal fraksiyonlar, diğer dokulardan elde edilenlere göre daha saftır. Böylece jellere daha küçük miktarlar yüklenebilir (*).

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.