Otolog Kan Pıhtıları Kullanılarak Pulmoner Embolide Minimal İnvaziv Bir Sıçan Modelinin Oluşturulması

Özet

Otolog kan pıhtıları kullanılarak minimal invaziv bir sıçan pulmoner emboli modeli oluşturmak için ayrıntılı bir metodoloji açıklanmaktadır. Enfarktüslü alanı ölçmek ve pulmoner arteriyel ağacı görselleştirmek için ek yöntemler de sağlanmıştır.

Özet

Pulmoner emboli (PE), kardiyovasküler ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir ve önemli bir sosyoekonomik yüke neden olur. Her ne kadar güncel tedaviler öncelikle antikoagülasyon ve tromboliz üzerine odaklansa da, patofizyolojisinin daha iyi anlaşılmasına ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır. Hayvan modelleri, PE'nin anlaşılmasında ve hastalık için yeni tedavilerin geliştirilmesinde çok önemli bir rol oynamaktadır ve kemirgenler etik ve maliyet hususları nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, PE için mevcut kemirgen modelleri, tekrarlanabilirliği ve çapraz çalışma karşılaştırmalarını engelleyen standart prosedürlerin eksikliği ile sınırlıdır. Bu çalışma, otolog kan pıhtıları kullanılarak minimal invaziv bir sıçan PE modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. Model, minimal invaziv bir kan örnekleme tekniği, standart bir trombüs oluşturma prosedürü ve minimal invaziv ven erişimi içerir. Ek olarak, enfarktüslü alanların ölçülmesi ve pulmoner arteriyel ağacın görselleştirilmesi için protokoller sağlanmıştır. Bu prosedürler, PE ilerlemesini incelemek için kemirgen modellerinin güvenilirliğini artırmayı ve yeni tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Giriş

Pulmoner emboli (PE), hastane içi ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir ve kardiyovasküler ölümlerin en sık üçüncü nedenidir. Yüksek insidansına rağmen, önleme ve hızlı tanı hala zor olmaya devam etmektedir ^1,2. Antikoagülasyon ve trombolitik tedaviler PE tedavisinde kritik öneme sahiptir, ancak hastalık progresyonunun daha derin bir şekilde anlaşılması ve yeni terapötik yaklaşımlar hastalık yönetimini iyileştirmek için gereklidir³.

Modern biyomedikal araştırmalarda, hayvan modelleri insan hastalıklarının mekanizmalarının aydınlatılmasında ve yeni tedavilerin geliştirilmesinde çok önemli bir rol oynamaktadır ^4,5. Fareler, sıçanlar, hamsterlar ve tavşanlar, etik hususlar ve maliyet etkinliği nedeniyle PE modellemesinde sıklıkla kullanılmaktadır^6,7,8,9,10. PE modelleme yaklaşımları genellikle üç kategoriye ayrılır: in vivo trombüs oluşumu, in vitro kan pıhtısı enjeksiyonu ve trombotik olmayan partiküllerin uygulanması. Hayvan türlerinin seçimi ve modelleme tekniği, belirli araştırma hedefleri tarafından belirlenir, çünkü tek bir model tüm amaçlara uygun değildir. Örneğin, yeni trombolitik tedavileri keşfetmeye odaklanan çalışmalar genellikle trombotik olmayan parçacıklar yerine otolog kan pıhtılarını içeren modeller kullanır.

Kemirgenlerde PE modellemek için mevcut yöntemler, ayrıntılı, standartlaştırılmış metodolojilerin eksikliği nedeniyle zorluklarla karşı karşıyadır. Bu, kan örneklemesi, kan pıhtısı oluşumu ve müteakip embolizasyon gibi temel süreçleri etkiler ve bunların tümü, çalışmalarda tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Ek olarak, embolize alanı ölçme ve embolizasyon sonrası emboli dağılımını doğru bir şekilde haritalama yeteneğinde önemli bir boşluk vardır. Bu eksikliklerin ele alınması, PE araştırmalarında kemirgen modellerinin güvenilirliğini ve faydasını geliştirmek için çok önemlidir.

Bu çalışmada, otolog kan pıhtıları kullanılarak bir sıçan PE modeli oluşturmak için ayrıntılı protokoller anlatılmıştır. Bu model, minimal invaziv bir kan örnekleme tekniğine, standart bir trombüs oluşturma prosedürüne ve minimal invaziv ven erişimine sahiptir. Ek olarak, akciğerlerdeki enfarktüslü alanların ölçülmesi ve pulmoner arteriyel ağacın görselleştirilmesi için protokoller sağlanmıştır, bu da daha fazla araştırma keşfini kolaylaştırabilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Çin Tıp Bilimleri Akademisi ve Pekin Birliği Tıp Koleji Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir (onay numarası: IRM/2-1ACUC-2311-015). Bu çalışmada 6 haftalık ve yaklaşık 250 g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı. Hayvanlar, dengeli bir yemek diyetine ve suya ad libitum erişimi olan belirli bir patojen içermeyen ortamda barındırıldı. 22 °C ± 2 °C oda sıcaklığında 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında tutuldular. Hayvanların herhangi bir cerrahi işlem geçirmeden önce 1 hafta boyunca çevreye uyum sağlamalarına izin verildi. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Ekipman ve malzemeler

1. Anestezi ekipmanı: Küçük hayvanlar ve izofluran için bir gaz anestezi makinesi kullanın.
2. Cerrahi malzemeler: Pamuklu çubuklar, iyodofor dezenfektan, stereo mikroskop, tıraş makinesi, tıbbi bant, 27 G iğneli 1 mL şırınga, 5 mL şırınga, 10 mL şırınga, normal salin, gazlı bez, 8-0 hazırlayın naylon iplikler, dikiş iğneli 6-0 naylon iplik, mikro hemostatik kelepçeler, mikro cımbız ve ince makaslar.
3. Diğer malzemeler: Tıbbi şırıngalarla uyumlu 19 G ve 18 G dağıtım iğneleri, iç çapı 1,2 mm ve uzunluğu 10 cm olan bir silikon tüp, iç çapı 3,0 mm ve uzunluğu 20 cm olan bir infüzyon tüpü, 1,5 mL santrifüj tüpü, bir pipet ve pipet uçları edinin.
4. Kendi kendine yapılan trombüs jeneratörü ve kan pıhtısı enjektörü (Şekil 1): Trombüs jeneratörünü oluşturmak için silikon tüpü 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 19 G dağıtım iğnesine bağlayın. Pıhtı enjektörünü oluşturmak için infüzyon tüpünün bir ucunu 18 G dağıtım iğnesine bağlayın ve diğer ucunu 5 mL'lik bir şırıngaya takın.

2. Otolog kan pıhtısı hazırlığı

1. Anestezi
   1. Hayvanı anestezi indüksiyon odasına yerleştirin ve 2-3 dakika boyunca 2 L/dk akış hızında oda havası ile %4 izofluran karışımı uygulayın (kurumsal olarak onaylanmış protokollere göre).
   2. Hayvanı operasyon platformuna sırtüstü pozisyonda yerleştirin. 0,4 L / dak'lık bir akış hızında% 2,5 izofluran uygulayarak anesteziyi koruyun. Yeterli anestezinin sağlandığından emin olmak için pedal refleksini test edin.
   3. Her iki ön ayağı da vücuttan yatay olarak uzatın ve kasık bölgesini yeterince açığa çıkarmak için arka ayakları uzatın. Hayvanı tıbbi bant kullanarak bu pozisyonda sabitleyin (Şekil 2A).
2. Kraniyal vena kava (CVC) yoluyla kan örneklemesi
   1. Bir tıraş makinesi ve tüy dökücü krem kullanarak manubrium çevresindeki tüyleri alın. Cildi iyodofor ile dezenfekte edin.
   2. Şekil 27A'da gösterildiği gibi sol veya sağ CVC'yi delmek için 1 mL şırıngaya bağlı 8 G iğneyi dikey olarak 2 mm derinliğe sokun.
      NOT: CVC'nin gövde yüzeyi çıkıntısı, manubriumun 5 mm yanaldır. Her iki taraf da kullanılabilir ve seçim aşağıdaki adımları etkilemez.
   3. Şırıngayı tutun ve namlu içinde negatif basınç oluşturmak için pistonu yavaşça geri çekin. Kan akana kadar iğneyi yavaş yavaş geri çekin, ardından 0.3 mL kan toplanana kadar bu pozisyonu koruyun (Şekil 2B).
3. Kan pıhtısı hazırlığı
   1. Toplanan kanı 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne itin ve kabarcık oluşturmamaya dikkat edin.
   2. Kanı, kan sütunu 10 cm uzunluğunda olana kadar kendi kendine yapılan trombüs jeneratörünün silikon tüpüne çekin.
      NOT: Bu iki adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin, çünkü pıhtılaşma santrifüj tüpünde başlayacak ve yayılacak ve alınan kan pıhtılarının kalitesini düşürecektir.
   3. Kan tamamen tromboze olana kadar 30 dakika bekleyin. Bu süre zarfında, diğer hayvanlar için de aynı şekilde kan sütunları hazırlayın.
   4. Tromboze kan kolonunu normal salin içeren bir Petri kabına yıkayın ve trombüs kolonunu normal salin ile üç kez yıkayın (Şekil 2C).
   5. Trombüs kolonunu her biri 4 mm uzunluğunda tek tip kan pıhtıları halinde kesmek için ince makas kullanın (Şekil 2D). 2 mL normal salin ile önceden doldurulmuş kendi kendine yapılan enjektöre 10-20 pıhtı çekin.
      NOT: Kan pıhtılarının uzunluğu 1 cm'yi geçmemelidir, aksi takdirde sağ ventrikülde sıkışırlar.

3. Damar erişim hazırlığı

1. Yüzeysel epigastrik damarların açığa çıkarılması
   1. Hayvanı adım 2.1'de anlatıldığı gibi uyuşturun ve sabitleyin.
   2. Sol kasık bölgesini çevreleyen kılları tıraş edin. Bu bölgelere tüy dökücü krem sürün, 1 dakika bekleyin ve ardından kremi gazlı bezle silin. Cildi iyodofor ile dezenfekte edin.
   3. Kasık bölgesindeki yüzeysel epigastrik damarların orijininin üzerinde 5 mm'lik bir cilt kesisi yapın. Genellikle, yüzeysel epigastrik damarların kökeni, kasık bölgesinde küçük bir nabız atışı gözlemlenerek izlenebilir.
   4. 10x büyütmeli stereo mikroskop kullanarak, yüzeysel epigastrik damarları ortaya çıkarmak için ince bir deri altı yağ tabakasını ayırın (Şekil 3A).
2. Yüzeysel epigastrik venin izole edilmesi
   1. Yüzeysel epigastrik veni arter, sinir ve yağ dokusundan dikkatlice izole edin. Bunu hem proksimal olarak, femoral ven'e boşaldığı noktaya kadar hem de distal olarak ilk ven bifurkasyonuna kadar gerçekleştirin.
   2. Distal tarafı 8-0 ile bağlayın İpliği bir mikro kelepçe ile geçirin ve sıkıştırın. Proksimal tarafı 8-0 ile kontrol edin başka bir mikro kelepçeye bağlı iplik halkası (Şekil 3B).
   3. İzole edilmiş venin distal tarafında küçük bir enine kesi yapın. Kanamayı önlemek için proksimal tarafı kontrol edin. Damar lümeninde kalan kanı normal tuzlu su ile yıkayın. Damar temizlendikten sonra, venöz insizyonu büyütmek için mikro cımbız kullanın.

4. Embolizasyon

1. Damar kanülasyonu
   1. Kendi kendine yapılan enjektörün iğnesini damar kesisinden damar içine yavaşça sokun. Damardan kaymasını önlemek için iğneyi üçüncü bir kelepçe ile sabitleyin.
2. Embolizasyon prosedürü
   1. Az miktarda normal salin uygulamak için pistonu yavaşça itin. Damarın dirençsiz dolgunluğu, tıkasız damar girişini gösterir (Şekil 3D).
   2. Yüzeysel epigastrik ven erişimi yoluyla femoral ven içine pıhtıları uygulamak için pistonu itmeye devam edin. Embolizasyon hızını dakikada 5 embolide kontrol edin. Hayvanın solunumunu izleyin; Ortaya çıkan ve alevlenen nefes darlığı başarılı bir embolizasyonu gösterir.
   3. Önceden tanımlanmış miktarda kan pıhtısını enjekte ettikten sonra, iğneyi geri çekin ve yüzeysel epigastrik venin proksimal tarafını bağlayın.
   4. Kesiği dikin ve hayvanı ılık bir kutuya koyun. Uyandıktan sonra hayvanı kafesine aktarın.

5. Enfarktüslü alanın ölçülmesi

1. Ötenazi ve kardiyak perfüzyon
   1. 250 mL normal saline 25.000 U heparin sodyum ekleyin ve iyice karıştırın. Şişeyi bir infüzyon cihazına bağlayın ve şişeyi 80 cm yükseklikte baş aşağı asın. İnfüzyon cihazının valfini kapatın.
   2. Hayvanları aşırı dozda izofluran ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
   3. Kaburgaları büyük bir makasla kesin ve göğsü açın, akciğerlere ve büyük damarlara zarar vermekten kaçının.
   4. İnfüzyon cihazının iğnesini sol ventriküle yerleştirin. Heparinize tuzlu su infüzyonuna izin vermek için infüzyon cihazının valfini açın. Drenaja izin vermek için inferior vena kava'yı ve sol uzantıyı kesmek için makas kullanın. Perfüzyon hızını 50 mL / dk'da kontrol edin.
      NOT: Bu işlem sırasında normal akciğer dokusu beyaza dönerken embolize bölge paslı kalır.
   5. Heparinize salin ile perfüzyonu tamamladıktan sonra,% 4 paraformaldehit çözeltisi ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanarak pulmoner arter gövdesini sağ ventrikülden delin. Toplam 30 mL hacim boyunca akciğerlerden %4 paraformaldehit perfüzyonu yaparak akciğer dokusunu sabitleyin.
2. Enfarktüs Oranı adı verilen bir indeksin tanıtılması
   1. Fiksasyondan sonra akciğerleri, kalbi, soluk borusunu, yemek borusunu, timüsü ve büyük damarları bir bütün olarak omurga ve diyaframdan^{çıkarın 11}.
   2. Yemek borusu, timus ve yağ dokusunu ilk kütleden dikkatlice çıkarın, geriye sadece kalp, akciğerler ve büyük damarlar kalır.
   3. Kalan kısmı en az 48 saat boyunca yeterli hacimde% 4 paraformaldehit çözeltisine batırın.
   4. Tüm akciğerleri tartmak için analitik bir terazi kullanın. Akciğerlerin enfarktüslü kısmını ayırmak için ince makas kullanın ve enfarktüslü dokuyu aynı terazi ile tartın. Aşağıdaki denklemi kullanarak Enfarktüs Oranını hesaplayın:
      
      i enfarktüslü dokunun ağırlığıdır, w tüm akciğerlerin ağırlığıdır, i Enfarktüs Oranını temsil eder.
   5. Enfarktüslü alanı ölçtükten sonra, parafin gömme¹¹ için paraformaldehitle sabitlenmiş akciğer dokusunu kesin.

6. Pulmoner arteriyel ağacın görselleştirilmesi

1. Pulmoner arter dökümü
   1. Hayvana ötenazi yapın ve adım 5.1'de anlatıldığı gibi kardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
   2. Silikon döküm bileşiğine eşit miktarda (ağırlıkça) seyreltici ekleyin, karışımı karıştırın ve ardından kürleme maddesinin %5'ini (ağırlıkça veya hacimce) ekleyin. Karışımı tekrar karıştırın.
   3. Karışımın 1 mL'sini 1 mL'lik bir şırıngaya çekin, havayı boşaltın ve iğneyi sağ ventrikülden pulmoner arter gövdesine yerleştirin. Kaymayı ve geri akışı önlemek için iğneyi pulmoner artere sabitleyin.
   4. Silikon döküm karışımının pulmoner arter ağacını doldurmasına izin vermek için pistona hafifçe bastırın. Normal akciğer alanları döküm karışımı ile boyanırken, enfarktüslü alanlar paslı kırmızı kalır.
      NOT: Pulmoner arter alçısı sadece sağlam akciğer dokusuna uygulanmalıdır. Tipik olarak, döküm karışımının 0.6-0.8 mL'si pulmoner arteriyel ağacı doldurmak için yeterlidir. Döküm karışımının aşırı enjeksiyonu, pulmoner arter ağacının görselleştirilmesini etkileyen pulmoner ven dökümüne yol açabilir. Döküm karışımı, kürleme maddesi eklendikten sonra 20 dakika içinde kullanılmalıdır, çünkü bu sürenin ötesinde kristalleşecektir.
   5. Perfüzyon döküldükten sonra şırıngayı geri çekin, pulmoner arter gövdesini bağlayın ve adım 5.2'de açıklandığı gibi akciğerleri, kalbi ve büyük damarları çıkarın. Tüm kütleyi bir Petri kabına koyun ve döküm karışımının kristalleşmesini sağlamak için gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında saklayın.
2. Temizleme ve görselleştirme
   1. Kalbi ve büyük damarları akciğerlerden makasla çıkarın, ardından akciğer yüzeyindeki kürleme karışımı kalıntılarını temizleyin.

Sonuçlar

PE modelinin semptomları ve patolojisi
Embolizasyon sırasında, sıçanlar nefes darlığı yaşadı ve toraks genişlemiş dalgalanmalar gösterdi. Neredeyse tüm hayvanlar, 10 cm'den daha az kan pıhtılaşması uygulandığında pulmoner emboli atağından kurtuldu (modellenen 15 hayvandan 14'ü). Kafeslerine geri döndükten sonra, hayvanlar köşelere kıvrıldı ve yiyecek ve suya olan ilginin azaldığını gösterdi. Bununla birlikte, bu semptomlar hızlı bir şekilde düzeldi ve birkaç saat içinde hayvanlar normal şekilde davran...

Tartışma

Bu çalışmada, otolog kan pıhtıları kullanılarak minimal invaziv bir sıçan PE modeli başarıyla oluşturulmuştur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu modelleme prosedürü 30 dakika içinde tamamlanabilir. Model, patolojik incelemelerle doğrulandığı gibi klinik PE'nin temel özelliklerini etkili bir şekilde yakalar. Sonuç olarak, PE sonrası gelişen komplikasyonların hemodinamik değişikliklerini ve patogenezini aydınlatmak, yeni tanısal biyobelirteçler ve terapötik hedefler geliştirmek ve yeni anti-...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Analitik terazi	METTLER TOLEDO	MA55/A	Yok
Dağıtım iğnesi	Jinrong elektroniği	Yok	19 G ve 18 G
İnce makas	Daha güçlü	XGJ1300	Yok
Heparin sodyum tuzu	Solarbio	01-08-9041	140U/mg
İzofluran	RWD	R510-22-10	Yok
Metil salisilat	Macklin	M813577	AR,% 99
Mikro kelepçe	JZ	W40160	Yok
Mikro cımbız	Daha güçlü	XGN1310	Yok
Silikon döküm bileşiği	Flow Tech	MV-130	Yok
Sprague-Dawley sıçanları	Vital River	SD-IGS	Yok
Stereo mikroskop	Murzider	MSD204	Yok