Sağlıklı Domuzların Taze Dışkısından Bacitracin Üreten Bacillus licheniformis'in İzolasyonu, Saflaştırılması ve Tanımlanması

Özet

Bu protokol, sağlıklı domuz dışkısından basitrasin üreten Bacillus licheniformis'in izolasyonu, saflaştırılması ve tanımlanması için ayrıntılı sürecin eksiksiz ve kapsamlı bir tanımını sağlar.

Özet

Bacillus licheniformis ve bacitracin, tıp, kimya, su ürünleri yetiştiriciliği, tarım ve yan ürünler alanlarında büyük bir uygulama pazarına ve değerine sahiptir. Bu nedenle, yüksek basitrasin üretimi ile B. licheniformis seçimi büyük önem taşımaktadır. Bu deneysel protokolde, yüksek miktarda basitrasin içeren Bacillus , sağlıklı domuzların taze dışkısından izole edildi, saflaştırıldı ve tanımlandı. Sekonder metabolit basitrasin'in Micrococcus luteus üzerindeki inhibitör etkisi de test edildi. Basitrasinin kalitatif ve kantitatif tespiti için ince tabaka kromatografisi ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanıldı. B. licheniformis'in fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri ilgili kitlerle belirlendi. B. licheniformis'in filogenetik ilişkileri, gen dizisi tespiti kullanılarak belirlendi ve oluşturuldu. Bu protokol, B. licheniformis ve bacitracin'in fabrikalarda büyük ölçekli kullanımı için bir yöntem sağlayarak, hayvan taze dışkısından B . licheniformis'in standart izolasyonu, saflaştırılması ve tanımlanması sürecini birden fazla perspektiften tanımlar ve tanıtır.

Giriş

Bacillus licheniformis, Firmicutes familyasından su, toprak ve hayvan bağırsakları gibi çeşitli ortamlarda yaygın olarak bulunan bir Bacillus türüdür¹. B. licheniformis kısa ve sağlam çubuk benzeri bir yapıya sahiptir ve ayrı ayrı hareket eder². Koloni neredeyse yuvarlak ve donuktur, merkezi bir çıkıntı ve grimsi beyaz^3'ün düzgün kenarları vardır. Güçlü büyüme ve üreme kabiliyetine sahiptir ve monosakkaritler, polisakkaritler, ketoz ve organik asitler gibi çeşitli karbon kaynaklarından besinleri emebilir ve kullanabilir⁴. Büyüme ve gelişmenin sonraki aşamasında, B. licheniformis uykuda olan sporlar şeklinde bulunabilir ve basitrasin, likenisin ve yüzey aktif madde gibi antibakteriyel maddeler üretebilir. Ayrıca beslenme yetersizliğine ve aşırı dış ortama da direnebilir⁵. Belirgin bir kodon tercihi yoktur ve verimli salgı sistemi, Bacillus subtilis^6'nın iki katı olan B. licheniformis'in heterolog protein salgılanmasını belirler. Genellikle proteaz, amilaz ve selülaz⁷ gibi enzim preparatları üretmek için kullanılır. Endojen toksinlerin içermemesi nedeniyle, gıda için güvenli bir tür olarak onaylanmıştır ve EFSA⁸ tarafından QPS'de listelenmiştir. Bu nedenle, su ürünleri yetiştiriciliği, tarım, gıda, biyotıp ve ilaç endüstrilerinde geniş bir uygulama yelpazesine sahip olan biyoaktif bileşik üretimi de dahil olmak üzere çeşitli potansiyel kullanımlar vardır. Ayrıca, B. licheniformis, hayvanları üretim performansını iyileştirmek, bağırsak florası dengesini iyileştirmek ve hastalıkları önlemek için teşvik edebilen hayvan bağırsak florasının önemli bir bileşenidir. B. licheniformis ATCC14580'in tüm genomu 2004 yılında analiz edildi ve transkripsiyon translasyonu, protein katlanması ve salgılama mekanizmasının arka plan bilgileri yavaş yavaş anlaşıldı⁹. Bu genetik bilgi, onu moleküler düzeyde genetik modifikasyon için elverişli hale getirerek, B. licheniformis'in büyük ölçekli üretimini kolaylaştırmaya katkıda bulunur.

Basitrasin, B. subtilis ve B. licheniformis'te ikincil metabolizma ile ribozomal olmayan peptit sentetaz tarafından üretilen dodekasiklik bir peptit antibiyotiktir. Basitrasin, her bileşen arasında bir veya iki amino asidin farklılık gösterdiği basitrasin A, B ve C gibi çeşitli bileşenlerden oluşan bir karışımdır; bunlar arasında basitrasin A en güçlü biyolojik aktiviteye^{sahiptir 10}. Basitrasin, hücre duvarı oluşumunu inhibe ederek ve zar bağlayıcı proteinlerle etkileşime girerek Staphylococcus ve Micrococcus luteus gibi gram pozitif bakterileri ve bazı gram negatif bakterileri inhibe edebilir¹¹. Bu arada, basitrasin güvenli ve stabildir, ilaç direnci üretmek kolay değildir ve diğer antibakteriyel ilaçlarla uyumlu olabilir¹². Bu nedenle, basitrasin tıbbi ve veterinerlik uygulamalarında kullanılır. Ayrıca hızlı eliminasyon oranı ve düşük emilim oranı nedeniyle hayvan yemi için katkı maddesi olarak da kullanılabilir¹³.

B. licheniformis bağırsağı kolonize edebilir ve gastrointestinal mikroçevreyi iyileştirebilir. Farklı hayvanların gastrointestinal sistemindeki farklı kaynaklardan elde edilen Bacillus'un yapışma ve üreme yeteneği ve ilgili fizyolojik işlevleri farklıdır. Domuzdan elde edilen B. licheniformis , domuzların ve diğer çiftlik hayvanlarının bağırsaklarında kolonizasyona daha elverişlidir. Bağırsak probiyotiklerinin nispi bolluğu ile konakçı^14'ün sağlık durumu arasında yakın bir ilişki vardır. Sütten kesilmiş domuz yavrularında B. licheniformis karışımı ile diyet takviyesi, mikrobiyota bileşimini ve metabolik aktiviteyi değiştirerek bağırsak ekosistemini iyileştirir ve ayrıca bağırsak mukozasını etkiler¹⁵. Hayvan dışkısı, hayvan bağırsak florasının türünü ve miktarını yansıtabilir. Bu protokol, basitrasin üreten Bacillus spp.'nin sağlıklı domuz dışkısından izolasyonunu ve saflaştırılmasını açıklar. Dışkı, karma yemle beslenmeyen ve domuz çiftliklerinde mükemmel üretim performansına sahip Taihu domuzlarından elde edilir. İzolatlar, morfolojik özelliklerine, fizikokimyasal özelliklerine ve biyokimyasal tanımlamalarına dayanarak B. licheniformis olarak tanımlandı.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Nanjing Tech Üniversitesi Etik Kurulu tarafından belgelenmiş ve onaylanmıştır. Dışkı, profesyonel ve standart domuz çiftliklerinde yetiştirilen yaklaşık 2 yaşındaki Taihu domuzlarından elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız).

1. Medyanın hazırlanması

1. Luria-Bertani (LB) sıvı ortam: Konik bir şişeye 10 g NaCl, 5 g maya özü tozu ve 10 g tripton ekleyin, 1 L'ye damıtılmış su ekleyin, karıştırın ve bir cam çubukla çözün. 100 mL orta suyu 500 mL'lik konik bir şişeye aktarın ve nefes alabilen sızdırmazlık filmi ile sıkıca bağlayın. Otoklavda 121 °C'de 20 dakika sterilize edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. LB katı ortam: Konik bir şişeye 10 g NaCl, 5 g maya özü tozu, 10 g tripton, 20 g agar tozu ekleyin, 1 L'ye damıtılmış su ekleyin, bir cam çubukla çözün ve nefes alabilen bir sızdırmazlık filmi ile sıkıca bağlayın. 121 °C'de otoklavda 20 dakika sterilize edin. Ortam 50 °C'ye soğutulduğunda, ortamın 20 mL'sini Petri kaplarına dökün, soğumalarını bekleyin ve ardından baş aşağı saklayın.
3. Basitrasin fermantasyon ortamı: 500 mL'lik konik bir şişeye 8 g soya küspesi, 4 g çözünür nişasta, 0.1 g (_NH4)₂SO₄, 0.6 g_CaCO3 ve 100 mL damıtılmış su ekleyin, iyice çözünmesi için bir cam çubukla karıştırın ve nefes alabilen bir sızdırmazlık filmi ile sıkıca bağlayın. Otoklavda 121 °C'de 20 dakika sterilize edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
4. M. luteus süspansiyonu: Bir M. luteus halkası seçin ve adım 1.2'de hazırlanan bir LB kültür plakasına aşılayın (bkz. Malzeme Tablosu). 16 saat boyunca 37 ° C'de sabit sıcaklıktaki bir inkübatörde kültür (Malzeme Tablosuna bakınız). Tabağa 5 mL normal salin ekleyin ve kolonileri çıkarmak için hafifçe çalkalayın. OD600'ü ölçün ve OD600 0.3-0.7 ile bir süspansiyon elde etmek için çözeltiyi bir test tüpünde seyreltin. M. luteus'un süspansiyonunu daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
5. Antibakteriyel aktivite test ortamı: Adım 1.4'te hazırlanan 1 mL M. luteus süspansiyonunu, adım 1.2'de hazırlanan 100 mL sıvı LB katı ortama ekleyin ve hafifçe çalkalayın. M . luteus içeren bu çözeltiden hemen 5 mL alın ve LB kültür plakasına eşit şekilde yayın.

2. Bacillus'un sağlıklı domuzların taze dışkısından izolasyonu ve saflaştırılması

1. 150 mL'lik bir erlenmeyer şişesine 9 mL normal salin ve 1.0 g taze domuz dışkısı ekleyin. Manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın ( Malzeme Tablosuna bakın) oda sıcaklığında 60 rpm/dk'da 15 dakika.
2. Spor üretmeyen bakterileri öldürmek için dışkı ekstraktını 80 °C termostatlı bir su banyosuna ( Malzeme Tablosuna bakınız) 20 dakika koyun.
3. Süspansiyonu 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde 100 mL LB sıvı ortama ekleyin ve 8 saat boyunca 37 ° C'de 180 rpm / dk'da bir çalkalayıcıda kültürleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
4. Kültürlenmiş bakteri çözeltisinin normal tuzlu su ile ^{10-1 ila 10-8} arasında seri seyreltmesini gerçekleştirin. Tek tek LB kültür plakalarına 0.1 mL ^10-6, ^10-7 ve ^10-8 bakteri seyreltici uygulayın ve kurumaya bırakın. 10 dakika sonra, plakaları 48 saat boyunca 37 ° C'de sabit sıcaklıktaki bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin.
5. B. licheniformis'e (kremsi beyaz renk, yumuşak kıvam, mukoid görünüm, dışbükey ve düz yükseklik ve düzensiz şekil)¹⁶benzeyen kolonileri seçmek için aşılama halkasını kullanın ve bunları adım 1.5'te hazırlanan antibakteriyel aktivite test ortamı üzerinde zikzak bir desen kullanarak çizin (bkz. Şekil 1).
6. Plakaları 37 °C'de 48 saat boyunca inkübatöre koyun ve koloninin etrafında bir inhibisyon bölgesi olup olmadığını gözlemleyin.

3. M. luteus aktivitesinin inhibisyonu için tarama

1. Bir inhibitör bölge oluşturan tek bir koloni seçin ve 100 mL LB sıvı ortama ekleyin, çalkalayıcıda 37 ° C'de ve 180 rpm / dak'da 12 saat boyunca kültürleyin.
2. Kültür ortamının 5 mL'sini adım 1.3'te hazırlanan basitrasin fermantasyon ortamına aşılayın ve 37 ° C'de 48 saat boyunca kültürleyin.
3. Fermantasyon suyunu bir santrifüj tüpünde toplayın ve 15 dakika boyunca 4 ° C'de 13.400 x g'da santrifüjleyin ve ardından 0.22 μm mikro gözenekli filtre membranı kullanarak filtreleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
4. Taze bir antibakteriyel aktivite testi orta plakasına bir Oxford kabı ekleyin ve ardından Oxford kabına 50 μL süzüntü (fermantasyon süpernatanı) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). 12 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde kültür. İnkübasyondan sonra, inhibitör bölgenin çapını sürmeli bir kumpas ile ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
5. Sonraki deneyler için suşları ve 15 mm'den daha büyük bir inhibitör bölge çapına sahip karşılık gelen fermantasyon süpernatantını seçin.

4. İnce tabaka kromatografisi ile basitrasin tanımlaması

1. 60 mg basitrasin standardı ekleyin ve 6.0 mg / mL basitrasin çözeltisi yapmak için 10 mL hacimsel bir şişede% 1 EDTA-2Na içinde çözün ( Malzeme Tablosuna bakınız).
2. 1 mL fermantasyon süpernatanı% 1 EDTA-2Na ile 10 mL'ye seyreltin. Aktif silika jel ince tabaka plakası üzerinde 5 μL numune ve 5 μL basitrasin standart çözeltisini noktalayın (bkz. Malzeme Tablosu).
3. Kromatografik tanka 100 mL n-bütanol-asetik asit-su-piridin-etanol (60:15:10:6:5) ekleyin (bkz. İnce tabaka silika jel plakasını kromatografik tanka yerleştirin. Üzerini örtüp oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
4. Silika jel ince tabaka plakasını çıkarın, %1 ninhidrin içeren bütanol-piridin solüsyonunu (99:1) püskürtün ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kahverengimsi kırmızı lekeler görünene kadar 105 °C'de 5 dakika ısıtın. Standart ve numune için R_f'yi (Tutma Faktörü Değeri) aşağıdaki formüle göre hesaplayın:
   R_f = Nokta hareket mesafesi/Solvent seyahat mesafesi.

5. HPLC ile basitrasin tespiti

1. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 0.3 mL fermantasyon süpernatanı ve 1.2 mL %50 etanol ekleyin, elle 5 dakika çalkalayın ve 4 ° C'de 12 saat bekletin.
2. 15 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin ve 0,22 μm mikro gözenekli filtre membranı ile S1 olarak etiketlenmiş bir numune şişesine süzün (bkz. Malzeme Tablosu).
3. Basitrasin ana çözeltisinin hazırlanması: 240 U / mL basitrasin ana çözeltisi hazırlamak için 100 mL'lik hacimsel bir şişeye 0.4 g basitrasin standardı (60 U / mg; Malzeme Tablosuna bakınız), 100 mL 40 g / L EDTA-2Na (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
4. Sırasıyla A1, B1, C1, D1 ve E1 etiketli test tüplerine 3 mL basitrasin ana çözeltisi ve 21, 9, 3, 1 ve 0 mL ultra saf su ekleyin. 0,22 μm mikro gözenekli filtre membranı ile filtrasyondan sonra, filtratı A2, B2, C2, D2 ve E2 etiketli numune şişelerine koyun.
   NOT: Basitrasin standart çözeltisinin konsantrasyonları 30, 60, 120, 180 ve 240 U/mL'dir.
5. A2, B2, C2, D2, E2 ve S1'i HPLC cihazının test tepsisine yerleştirin. 1000 mL 50 mM/L amonyum format ve 1000 mL asetonitril'i mobil faz tepsisine yerleştirin ve bunları sırasıyla mobil faz A ve B olarak ayarlayın.
   NOT: Amonyum formatın pH'ı formik asit ile 4.0'a ayarlanmalıdır.
6. C18 (5 μm, 4.6 mm x 250 mm) HPLC sütununu sütunda belirtilen yönde takın ( bkz.
7. Mobil faz parametrelerini 0 dk, %77 A ve %23 B olarak ayarlayın; 30 dk, %70 A ve %30 B; 40 dk, %60 A ve %40 B; 50 dk, %60 A ve %40 B; 51 dk, %77 A ve %23 B; 58 dk, %77 A ve %23 B. Numune boyutunu 100 μL olarak ayarlayın; Akış hızı, 1.0 mL/dak; Kolon sıcaklığı, 30 °C.
8. Programı çalıştırmak için Çalıştır düğmesine tıklayın.

6. Morfolojik tanımlama

1. Suşu bir LB kültür plakası üzerinde en yüksek basitrasin titresi ile seyreltin ve kaplayın ve 37 ° C'de 48 saat boyunca bir inkübatörde kültürleyin. Aşağıda anlatıldığı gibi koloni morfolojisini boyayın ve gözlemleyin.
2. Slayta bir damla steril arıtılmış su ekleyin, az miktarda koloni toplayın ve su damlasına ekleyin. Eşit şekilde sürün, slaytın doğal olarak kurumasını bekleyin ve ardından bir alevin üzerine sabitleyin.
3. Numuneyi lekelemek için 1 dakika kristal viyole ekleyin ve ardından musluk suyuyla durulayın. Numuneyi lekelemek için 1 dakika iyot ekleyin ve ardından damıtılmış su ile durulayın.
4. % 95 alkol ekleyin, rengi gidermek için slaytı 1 dakika sallayın ve ardından damıtılmış suyla durulayın.
5. Numuneyi lekelemek için 1 dakika safran ekleyin ve ardından damıtılmış su ile durulayın. Slaytın doğal olarak kurumasını bekleyin ve koloni morfolojisini yağa daldırılarak mikroskop altında gözlemleyin (bkz. Malzeme Tablosu).

7. Fizyolojik ve biyokimyasal tanımlama

1. Test tüpüne 2 mL steril salin ekleyin ve bakteriyel süspansiyon elde etmek için bir aşılama halkası kullanarak plakadan tek bir koloniyi steril salin çözeltisine aşılayın.
2. Bacillus biyokimyasal tanımlama şeridinde V-P, sitrat, jelatin, %7 sodyum klorür, pH 5.7, nitrat indirgeme ve nişasta hidrolizini ölçmek için her deliğe 100 μL bakteri süspansiyonu ekleyin (bkz.
3. Başka bir tek koloni seçmek için aşılama halkasını kullanın ve bunları Bacillus biyokimyasal tanımlama şeridinin anaerobik büyüme biyokimyasal tüpü üzerindeki zikzak şeklinde çizin.
4. Diğer kolonileri seçmek için aşılama halkasını kullanın ve Bacillus biyokimyasal tanımlama şeridinde propiyonat, D-ksiloz, L-arabinoz ve D-mannitol tanımlaması için gözeneklere dikey olarak delin.

8. Suş gen dizisinin belirlenmesi

1. Bir bakteri DNA ekstraksiyon kiti kullanarak suşun DNA'sını çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız): 5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 2 mL tohum sıvısı ekleyin ve 1 dakika boyunca 11.500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve pelete 110 μL tampon (20 mM Tris, pH8.0; 2 mM Na_2-EDTA ve% 1.2 Triton içeren) ve 70 μL 50 mg / mL lizozim çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
2. 15 saniye boyunca 4 μL 100 mg / mL RNase A ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. 20 μL proteinaz K çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.
3. 220 μL tampon GB ekleyin, pelet askıya alınana kadar 15 saniye çalkalayın, çözeltiyi berraklaştırmak için 10 dakika boyunca 70 ° C'ye yerleştirin ve tüp duvarındaki su boncuklarını çıkarmak için kısa bir dönüş yapın.
4. 220 μL susuz etanol ekleyin, 15 saniye boyunca tamamen şoklayın, kısa ayırma. Çözeltiyi ve flokülasyon çökeltisini toplama tüpünün adsorpsiyon sütunu CB3'e aktarın, 30 saniye boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
5. Adsorpsiyon kolonuna 500 μL tampon GD ekleyin, 13.400 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Kolona 600 μL PW ekleyin, 13.400 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
6. Adsorpsiyon kolonunu toplama tüpüne geri koyun, 13.400 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
7. Adsorpsiyon kolonunu kuruması için 10 dakika oda sıcaklığında yerleştirin. Kolonu santrifüj tüpüne aktarın ve adsorpsiyon membranının ortasına 100 μL elüsyon tamponu TE ekleyin.
8. Akışı santrifüj tüpüne toplamak için oda sıcaklığında 5 dakika bekletin ve 13.400 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
9. 0.1 mL'lik bir PCR tüpüne 25 μL 2x ana karışım (Malzeme Tablosuna bakınız), adım 8.8'de elde edilen 2.5 μL DNA örneği, 2 μL 27F ileri astar, 2 μL 1492R ters astar ve 18.5 μL çift damıtılmış H₂O ekleyin.
   NOT: Primerlerin gen dizileri 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ve 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3''dür.
10. PCR tüpünü aşağıdaki koşullar altında PCR makinesine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın): 95 °C'de 10 dakika ön denatürasyon, 95 °C'de 30 s denatürasyon, 55 °C'de 30 s tavlama, 72 °C'de 90 s uzatma, 72 °C'de 7 dakika uzatma. 32x için denatürasyon, tavlama ve uzatma üç adımlı döngüyü çalıştırın.
11. Üründen 5 μL alın ve 30 dakika boyunca 120 V'ta% 1 agaroz jel ile elektroforez yapın.
    1. 500 mg agarozu 50 mL 1x TAE tamponunda çözün. Agaroz tamamen eriyene kadar çözeltiyi mikrodalgada 1-2 dakika ısıtın. 5 μL DNA boyama boyası ekleyin, ardından bir jel tepsiye dökün ve orifis plakasını yerleştirin. Katılaşana kadar oda sıcaklığında 30 dakika bekletin; jeli elektroforez tankına koyun ve jeli daldırmak için 1x TAE tamponu ekleyin. İlk oyuklara 2 μL 2 kb DNA merdiveni (10 mg/μL) ve jel içinde kalan kuyucuklara 1 μL yükleme boyası ile karıştırılmış 5 μL PCR ürünü ekleyin.
12. Jeli jel görüntüleme sistemine yerleştirin ve bir resim çekin. DNA şeritlerini ultraviyole ışık altında hızlı bir şekilde kesin ve tartın.
13. Bir mikrosantrifüj tüpüne şeritler ekleyin ve eşit hacimde PN çözeltisi ekleyin. Jel tamamen eriyene kadar tüpü 50 ° C'de su banyosunda tutun.
14. Adsorpsiyon kolonuna CA2'ye 500 μL denge sıvısı BL ekleyin, 1 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
15. Çözünmüş jel çözeltisini adsorpsiyon sütunu CA2'ye ekleyin ve 2 dakika oda sıcaklığında bekletin, 30 saniye boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
16. Adsorpsiyon kolonuna CA2 600 μL PW ekleyin, 1 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve 1x tekrarlayın.
17. Adsorpsiyon kolonunu CA2'yi bir toplama tüpüne yerleştirin, 13.400 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
18. Adsorpsiyon kolonunu CA2'yi iyice kuruması için 10 dakika oda sıcaklığında yerleştirin ve ardından temiz bir santrifüj tüpüne koyun.
19. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca süspanse edilen adsorpsiyon filmine 50 μL elüsyon tamponu EB ekleyin ve DNA çözeltisini 2 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
    NOT: Yukarıda belirtilen çözeltiler veya reaktifler Saflaştırma Kitine dahildir (Malzeme Tablosuna bakın).
    1. Toplanan DNA solüsyonunu dizileme için profesyonel bir dizileme şirketine gönderin (Malzeme Tablosuna bakınız). NCBI'nin GenBank veritabanında Blast ile sıralama sonuçlarını karşılaştırın. Dizi homolojisine göre, suşların tür ilişkilerini belirlemek için farklı suşlar seçin ve MEGA-X'te Maksimum Olabilirlik yöntemiyle filogenetik ağaçlar oluşturun.

Sonuçlar

Bu deneyde, 1001'den 1048'e kadar numaralandırılmış sağlıklı domuzların taze dışkısından 48 Bacillus suşu izole edildi. Bunlar arasında, 15 suş M. luteus'a karşı antibakteriyel aktiviteye sahipti. 15 suştan, basitrasin titreleri, Tablo 1'de gösterildiği gibi yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ölçüldü. Bunlar arasında, B. licheniformis No. 1026, 456.35 ± 21.75 U/mL ile en yüksek basitrasin titresine sahipti, bu nedenle sonraki deneyler için No. 1026 seçildi.

TLC ile tanımlama sonuçları Şekil 2A'da gösterilmektedir. 1026 No'lu suşun fermantasyon suyundaki ana noktaların konumu ve basitrasin standart çözeltisi aynıydı ve R_f değeri 0.61 idi. HPLC analizi için, basitrasinin standart eğri denklemi y = 50.287x - 250.55 ve korelasyon katsayısı R² = 0.9968'dir (Şekil 2B). Fermantasyon süpernatantının pik zamanı basitrasin standardı ile tutarlıydı (Şekil 2C), bu nedenle bakteriyostatik madde basitrasin olarak tanımlandı ve basitrasin titresi 456.35 ± 21.75 U/mL idi.

1026 numaralı suşun kolonisi, Şekil 3A'da gösterildiği gibi 12 saat boyunca LB ortamında kültürlendi. Koloni, tam çıkıntıları ve düzgün kenarları olan su damlacıkları şeklinde yuvarlak ve şeffaftı. 12 saatten 24 saate kadar, bakteriler büyümenin sonraki aşamalarına girdi. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, koloniler erik şeklinde yayılmış, merkez kıvrımlı ve renk yavaş yavaş süt beyazına kadar derinleşmiştir. B. licheniformis^16'nın koloni morfolojisinin tanımı ile tutarlıdır. Kenarında şeffaf bir mukus vardı. Gram boyamadan sonra, Şekil 3C'de gösterildiği gibi mikroskop altında 1026 numaralı suş gözlendi. Hücreler, Gram pozitif bakterileri gösteren mor çubuklardı.

Tablo 2'de gösterildiği gibi, 1026 numaralı suş anaerobik bir ortamda büyüyebilir. Suş, V-P testi, sitrat kullanımı, nitrat indirgeme ve nişasta hidrolizi için pozitif test edildi. Tür, karbon kaynaklarının çoğunu ayrıştırmayı ve kullanmayı başardı. B. licheniformis ile aynı fizyolojik ve biyokimyasal özelliklere sahipti.

1026 numaralı suşun 16S rDNA fragman boyutu yaklaşık 1400 bp boyutundaydı (Şekil 4A). 1026 numaralı suşun sıralama sonuçları, GenBank'taki B. licheniformis DSM 13'ünkine% 99.58 benzerlik gösterdi. Filogenetik ağaç daha sonra Şekil 4B'de gösterildiği gibi inşa edildi. B. licheniformis DSM 13'ün evrimsel dal uzunluğu 0.000'dir, bu da onun B. licheniformis olduğunu gösterir.

1026 numaralı suşun morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerine ve 16S rDNA gen dizisinin homoloji analizine dayanarak, 1026 numaralı suş B. licheniformis olarak tanımlandı.

Şekil 1: Suş aşılamasının şematik diyagramı. Aşılama halkası, kolonileri seçmek ve bunları antibakteriyel aktivite test ortamı üzerinde zikzak şeklinde işaretlemek için kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bakteriyostatik maddelerin tanımlanması. (A) İnce tabaka kromatografisi. (B) Basitrasinin HPLC standart eğrisi. (C) HPLC kromatogramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 1026 No'lu suşun morfolojik özellikleri ve Gram boyaması. (A) 12 saat ve (B) 24 saatte koloni morfolojisi. (C) Gram boyama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: 1026 No'lu suşun moleküler biyolojik tanımlaması. (A) NO. 1026 16S rDNA suşunun gen amplifikasyonu. (B) 1026 numaralı suşun filogenetik ağacı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

HAYIR.	Basitrasin titresi (U/mL)	HAYIR.	Basitrasin titresi (U/mL)
1003	423.57±18.62	1021	317.46±13.46
1004	325.82±13.23	1026	456.35±21.75
1009	326.26±14.52	1027	435.57±19.18
1011	376.65±16.11	1030	382.48±17.64
1015	325.27±12.37	1031	215.37±11.73
1016	256.56±15.37	1039	353.67±16.16
1017	352.47±16.47	1041	342.36±14.36
1018	328.73±16.12

Tablo 1: Antibakteriyel aktivite suşlarının basitrasin titresi.

Eşya	Sonuç -ları	Eşya	Sonuç -ları
Anaerobik büyüme testi	+	D-mannitol testi	+
V.P tahlili	+	Jelatin testi	+
Sitrat kullanım testi	+	%7 NaCl testi	+
Propiyonat testi	+	pH5.7 testi	+
D-ksiloz testi	+	Nitrat indirgeme testi	+
L-arabinoz	+	Nişasta hidroliz testi	+

Tablo 2: 1026 nolu suşun fizyolojik ve biyokimyasal tanımlaması.

Tartışma

B. licheniformis, basit kültür koşulları ve hızlı şeker tüketimi ile hızla büyür ve olgun fermantasyon teknolojisi, endüstriyel üretim maliyetlerinden tasarruf etmede yardımcı olur¹³. B. licheniformis ve salgıları olan bacitracin'in geniş uygulaması, umut verici piyasa değerini belirlemiştir. Tarımda, B. licheniformis, toprak verimliliğini artırarak, kök gelişimini teşvik ederek ve organik maddenin bozulmasına yardımcı olarak bitki büyümesini ve besin alımını iyileştirmek için bir biyogübre olarak kullanılır¹⁵. Endüstriyel enzim üretimi için B. licheniformis, proteazlar, amilazlar, selülazlar ve lipazlar gibi bir dizi enzim üretir ve bu da gıda işleme, deterjan üretimi, deri işleme ve tekstil endüstrisindeki yeri doldurulamaz piyasa değerini belirler¹⁶. B. licheniformis ve bacitracin'in üstün antibakteriyel farmakolojik aktivitesi göz önüne alındığında, tıp alanında bakteri ve mantarların neden olduğu çeşitli bulaşıcı hastalıkları tedavi etmek için kullanılmıştır¹. Bu arada, bitkisel bitkilerin büyümesinin yanı sıra bitkilerde farmakolojik olarak aktif bileşenlerin birikimi göz önüne alındığında, B. licheniformis, Rhodiola türevi salidrosid^17,18 gibi bileşiklerin üretimi için yararlı olmasının yanı sıra bitki büyümesinin potansiyel bir arttırıcısıdır. B. licheniformis ve bacitracin'in yukarıdaki avantajları, onları endüstri, tarım, su ürünleri yetiştiriciliği, biyoteknoloji ve tıp endüstrilerinde yaygın olarak faydalı kılmaktadır. Bu nedenle, B. licheniformis'in yüksek miktarda basitrasin ile ayrılması ve saflaştırılması, müteakip büyük ölçekli üretim ve uygulamanın sağlanmasında belirleyici bir faktördür.

Basitrasin kimyasal sentez ile hazırlanabilse de, adımlar zahmetlidir ve birçok yan ürün vardır. Endüstride, basitrasin esas olarak B. licheniformis tarafından fermente edilen mısır unu ve soya fasulyesi küspesinin ikincil metabolik süreci ile üretilir. Basitrasinin modern endüstriyel üretiminde, yüksek maliyet ve düşük verim, daha fazla uygulanmasını engellemektedir¹⁰. Bu nedenle, yüksek verimli basitrasin suşlarının taranması ve hammaddelerin kullanım oranının iyileştirilmesi, basitrasin üretimini iyileştirmenin anahtarıdır.

Şu anda, yüksek verimli basitrasin suşlarının ıslahı, esas olarak topraktan ve diğer ortamlardan doğal ıslah, mevcut basitrasin üreten suşlar kullanılarak mutasyon ıslahı veya genetik mühendisliğine dayalı ıslah yoluyla yapılmaktadır. Doğal ıslah işlemi basittir ve elenen suşlar istikrarlı üretim kapasitesine sahiptir, ancak süreç uzun zaman alır ve iş yükü büyüktür. Mutasyon ıslahı yüksek bir mutasyon oranına sahiptir ve üreme süresini kısaltır, ancak mutasyon sonraki nesillerde istikrarlı bir şekilde kalıtılamayabilir¹⁶. Genetik mühendisliğine dayalı ıslah, yüksek verimli suşlar elde etmek için daha hedeflidir¹⁰, ancak eksojen genlerin tanıtılmasından kaynaklanan güvenlik endişeleri vardır. Sağlıklı yetişkin hayvan dışkısı, flora dengesini koruyabilen bol miktarda probiyotik kaynak içerir.

Bu yazıda, B. licheniformis'in aşırı ortamlarda hareketsiz sporlar üretme özelliklerine dayalı^{olarak 19}, ısıya dayanıklı spor üretmeyen bakteri ve mantarları öldürmek için sağlıklı domuz dışkısı seyreltmesi yüksek sıcaklıktaki bir ortama yerleştirildi. M. luteus , büyümenin geç aşamasında B. licheniformis tarafından bakteriyostatik peptitlerin üretimine duyarlı olduğundan ve kolay gözlem için sarı bir pigment ürettiğinden, inhibisyon bölgesi değerlendirmesine dayalı olarak antibakteriyel aktiviteyi taramak için kullanılır. Koloni morfolojisine benzer koloni morfolojisine göre, hücre morfolojisi kısa çubuk şeklindedir, Gram pozitif, B. licheniformis'in fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, 16 s RNA, B. licheniformis ile yakından ilişkilidir, böylece 1026 numaralı suşun B. licheniformis olduğunu belirlemek için. Bakteriyostatik madde TLC ve HPLC ile basitrasin olarak tanımlandı. Böylece basitrasin üreten B. licheniformis elde edildi. Bu yöntemin de tarama sürecinin uzun sürmesi ve operasyonun biraz tecrübe gerektirmesi gibi eksiklikleri vardır.

Özetle, bu deneysel protokol, geniş bir uygulama beklentisine ve paha biçilmez bir piyasa değerine sahip olan basitrasin üreten B. licheniformis'in edinimi ve rutin laboratuvar tanımlama sürecini kapsamlı ve ayrıntılı bir şekilde tanıttı²⁰. Bu yöntemler basit, uygulanabilir ve uygulanması kolaydır ve şüphesiz B. licheniformis'in büyük ölçekli üretimi için etkili bir referans olacaktır. Bu makale aynı zamanda diğer antimikrobiyal peptitler için suşların üretimi için bir tarama fikri sunmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2 & kez; Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, Çin	P252-01
2kb DNA İşaretleyici	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Pekin, Çin	BM121-01
Asetonitril	Şangay Aladdin Biyokimyasal Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	A104443
Agar tozu	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	A104062
Amonyum sülfat ((NH4< / sub>)2< / sub>SO4< / sub>)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Şangay, Çin	10002917
Otoklav sterilizatörü	Zealway Instrument Inc., Xiamen, Çin	GI36DWS
Bacillus biyokimyasal tanımlama şeridi	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Çin	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	B65740
Bakteri DNA Ekstraksiyon Kiti	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pekin, Çin	DP209
Nefes alabilen sızdırmazlık filmi	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Butanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	B433378
C18 (5 μ m, 4.6 ve kez; 250 mm) HPLC sütunu	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, Çin	C1805-462510
Kalsiyum karbonat (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Şangay, Çin	10005717
Santrifüj	New Brunswick Scientific Co., Inc., İngiltere	5452
Kromatografik tank	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, Çin	P-1
Konik şişe	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, Çin	18012
Sabit sıcaklık inkübatörü	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, Çin	GH4500
Dipotasyum fosfat (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, Çin	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	E397526
Elektronik terazi	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Etil alkol Shanghai	Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	E130059
Jel Midi Arıtma Kiti	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pekin, Çin	DP302
Cam çubuk	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glikoz	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	D823520
Gram'ın boyama çözüm kiti	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Çin	HB8278
Yüksek performanslı sıvı kromatografı	Agilent Technologies, Inc., California, Amerika	1260
Yatay elektroforez aparatı	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Pekin, Çin	DYCP-31DN BIOMATE
Aşılama halkası	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Şangay, Çin	3171026
Manyetik karıştırıcı	Wiggens GmbH Co., Ltd., Almanya	WH220 PLUS
Metil alkol Shanghai	Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	M116115
Mikrosantrifüj tüpü	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Şangay, Çin	1351171
Micrococcus luteus	Bena Kültür Koleksiyonu, Suzhou, Çin	BNCC102589
Mikro gözenekli filtre membranı	Nantong Suri Deneysel Ekipman Co., Ltd.	PES0.22
Ninhydrin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	N105629
Optik mikroskop	Optik Alet Fabrikası, Şangay, Çin	DYS-108
Domuz dışkısı	Nanjing Quanfu Domuz Çiftliği, Nanjing, Çin
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Amplifikatörü	Suzhou Dongsheng Xingye Bilimsel Instrument Co., Ltd., Suzhou, Çin	ETC811
Profesyonel sıralama şirketi	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, Çin
Pyridine	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	P111516
Çalkalayıcı	Taicang Qiangle Deneysel Equipment Co., Ltd., Taicang, Çin	HYL-C
Silika jel GF254 ince tabaka plakası	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, Çin	HPT-HSGF5025023
Sodyum klorür (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	S805275
Sodyum sitrat	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Şangay, Çin	C39197100001
Çözünür nişasta	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	S817547
Termostat su banyosu	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Şangay, Çin	DK-8D
Tripton Shanghai	Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Şangay, Çin	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, Çin	GR501-01
Ultra saf su aleti	Merck KGaA Co., Ltd., Almanya	Milli Doğrudan-Q8
Ultrasonik temizleyici	Jiangsu Huaguan Elektrikli Aletler Group Co., Ltd., Jiangsu, Çin	SB-100DT
Sürmeli kaliper	Sanfeng Şirketi, Japonya	N20P
Maya özü tozu	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Pekin, Çin	LP0021