Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Wharton Jöle Mezenkimal Kök Hücrelerinin ve Türetilmiş Eksozomları/Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

1.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66778

⸱

11 Kasım 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

Bu makalede

Özet

Göbek kordonu dokusu, mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) zengin, kolayca bulunabilen, invaziv olmayan bir kaynağıdır. Bu protokolde, insan Wharton jöle MSC'lerinin (WJ-MSC'ler) izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı adımlar sağlanır, ardından türetilmiş eksozomlarını veya küçük hücre dışı veziküllerini izole etmek için basit bir kısa protokol sağlanır.

Özet

Rejeneratif tıp alanında mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) özel ilgi görmüştür. Wharton jölesi olarak adlandırılan göbek kordonu (UC) dokusundan elde edilen MSC'ler, çeşitli uygulamalarda özellikle iyi bir şekilde yerleşmiştir. Diğer MSC kaynaklarıyla karşılaştırıldığında, Wharton'un jöle MSC'leri (WJ-MSC'ler) bir dizi avantaj sunar ve genellikle tıbbi atık olarak bertaraf edilen UC'den izole edilir. Bu nedenle WJ-MSC'ler, embriyonik kök hücrelerle ilgili olanlara benzer herhangi bir etik sorun ortaya çıkarmaz. WJ-MSC'leri UC dokusundan izole etmek için basit ve tekrarlanabilir bir eksplant tekniği kullanıldı. İzolasyondan sonraki beş ila on gün içinde, WJ-MSC'ler fibroblastik şekle sahip yapışık hücreler olarak ortaya çıkar. İzole edildikten sonra hücreler 14-18 gün içinde yaklaşık %80 birleşmeye ulaşır. Bunu takiben, pasaj 3'te, izole edilmiş WJ-MSC'ler, adipojenik, osteojenik ve kondrojenik mezenkimal soylar boyunca farklılaşmaları indüklenerek tamamen karakterize edildi. Ek olarak, CD34, CD14 ve HLA-DR dahil olmak üzere negatif farklılaşma kümesi (CD) yüzey belirteçlerinin yanı sıra CD105, CD90, CD73 ve CD44 gibi ayırt edici MSC yüzey belirteçleri için immünofenotipleme test edildi. Ayrıca, eksozomları/küçük hücre dışı vezikülleri (sEV'ler) bu WJ-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından izole etmek için basit bir yaklaşımda çökeltme reaktifi kullanıldı. İzole edildikten sonra, eksozomlar/sEV'ler bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemlendi ve ortalama boyutlarını hesaplamak için parçacık boyutu analizi kullanıldı. Özetle, WJ-MSC'ler, eksozomlar/sEV'ler üretmek için fabrika olarak kullanılabilecek, kolayca bulunabilen, invaziv olmayan, yenilenebilir bir kök hücre kaynağı sağlar. Bu WJ-MSC'ler ve bunlardan türetilen eksozomlar/sEV'ler, çok çeşitli terapötik ve aşağı yönlü araştırma uygulamalarında kullanılabilir.

Giriş

Sadece birkaç yıl önce, kök hücrelerin tıpta başı çektiği düşünülüyordu 1,2. Bununla birlikte, embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) yarattığı etik kaygı, bu alanda hızlı ilerlemeyi engelleyen büyük bir engeldi3. Bu, kök hücreler için alternatif yenilenebilir kaynakların, özellikle de doğum sonrası göbek kordonundan (UC) izole edilebilenlerin araştırılmasına yönelik büyük ilgiyi ateşledi4. UC, hamile bir annenin içindeki plasenta ve fetüsle doğal olarak birleşir. UC'nin doğuştan gelen rolü, büyüyen fetüsü kan damarları yoluyla sürekli ve yeterli kan akışı ile beslemek ve hareketi sırasında fetüsün olası burulma, sıkışma veya bükülmesini önleyerek bu damarların korunmasını sağlamaktır5. Anatomik olarak, insan UC'si, bir mukoid bağ dokusu içine gömülü ve amniyotik epitel6'nın bir dış tabakası içine alınmış iki arter ve bir damardan oluşur. UC matrisi veya üç göbek damarını çevreleyen mukoid bağ dokusu, "Wharton jölesi" (WJ) olarak bilinir ve esas olarak proteoglikanlar ve kollajen7'den yapılır.

Son zamanlarda, mezenkimal kök hücreler (MKH'ler), çok çeşitli rejeneratif tıp uygulamaları için etkili yeni bir terapötik yöntem olarak büyük ilgi görmüştür 7,8,9,10,11,12. MSC'ler hakkında en ilgi çekici olan şey, izolasyon kolaylığının yanı sıra kanıtlanmış immünomodülatör aktiviteler ve multipotens 13,14,15'tir. Genel olarak MKH'lerin ve özellikle WJ'den türetilenlerin diğer üstün avantajları, ESC'lerin aksine transplantasyon sırasında hiçbir teratomun ortaya çıkmaması ve birkaç hücre geçişinden sonra bile kök özelliklerini korumalarıdır16,17. Bu nedenle, MSC'lerin gerçekten de çeşitli hastalıklar için devrim niteliğinde terapötik müdahaleler sağlayabileceğine inanılmaktadır 8,18,19. 2006 yılında Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği'nin (ISCT) MSC'lerin20 uygun karakterizasyonu için belirli minimal kriterler tanımladığını belirtmek önemlidir. İlk olarak, standart kültür koşullarında yetiştirildiğinde/kültürlendiğinde, MSC'lerin plastiğe bağlı olması beklenir. İkinci olarak, MSC'ler CD90, CD105 ve CD73 gibi bazı karakteristik farklılaşma kümesi (CD) yüzey belirteçlerini ifade etmeli ve CD14, CD34 ve CD45 gibi diğerlerinin ifadesini göstermemelidir. Üçüncüsü, MSC'ler in vitro20'de ostejenik, adipojenik ve kondrojenik soylara farklılaşmalıdır. Bugüne kadar MSC'ler, kemik iliği (BM), yağ dokusu21 gibi yetişkin dokuların yanı sıra plasenta, UC kanı (UCB) ve UC matrisi22,23 gibi fetal/perinatal kaynaklar dahil olmak üzere birçok kaynaktan izole edilmiştir. Burada, MSC'lerin toplanmasındaki başarı oranı karşılaştırıldığında, UCB 24,25'ten sadece yaklaşık %6'ya kıyasla WJ dokusundan neredeyse %100'e ulaştığının bildirilmesi dikkat çekicidir. Bu nedenle, UCB gerçekten de zengin bir hematopoietik kök hücre kaynağı olmasına rağmen, WJ 26,27,28'den önemli ölçüde daha düşük olmasına rağmen, aynı zamanda iyi bir MSC kaynağı olarak kabul edilir.

WJ-MSC'ler, diğer MSC türleri ile karşılaştırıldığında istisnai bir durumdur, çünkü yetişkin muadilleriyle benzer özelliklere sahip iyi niyetli (tipik) MSC'ler olmalarına rağmen, aynı zamanda çeşitli pluripotensi/ESC belirteçlerinin ifadesine de sahiptirler17,29. Buna göre, WJ-MSC'lerin yetişkin ve embriyonik kök hücreler arasında bir yerde olduğuna inanılmaktadır17. İlginç bir şekilde, WJ-MSC'lerin hem insan MSC'lerini hem de ESC belirteçlerini ifade ettiği ve birkaç pasaj16 için köklülüğü koruyabildiği bulunmuştur. Neyse ki, nakil sırasında teratom17 oluşturmazlar. Bu, ESC'lerin yanı sıra diğer MSC'lere29,30 kıyasla benzersiz transkriptomik profilleri ile açıklanabilir. WJ-MSC'ler, yetişkin MSC'lere ve hatta genel olarak diğer kök hücre türlerine göre çeşitli avantajlar sunar. İzolasyon araçları, doğumda rutin olarak atılan ve bu nedenle tıbbi atık olarak kabul edilen UC aracılığıyla kolayca temin edilebilir. Bu nedenle, ESC'lerden farklı olarak, WJ-MSC'lerin etik kaygıları yoktur ve BM-MSC'lerin aksine, invaziv bir teknikle izole edilir31. Ayrıca, diğer MSC tipleri gibi, WJ-MSC'ler de insan lökosit antijeni-D ile ilişkili (HLA-DR) ekspresyonundan yoksundur ve özellikle insan lökosit antijeni-G'yi (HLA-G) eksprese ettikleri bulunmuştur, bu da onlara ekstra bir bağışıklık ayrıcalığı sağlar32. Bu, WJ-MSC'lerin in vivo 33,34,35 fetüs-maternal arayüzde genellikle meydana gelenleri simüle eden immünosupresif bir rol sergilediğini göstermektedir. Son olarak, UCB'den izole edilmiş analogları gibi, WJ-MSC'ler de bankacılık36 için büyük bir potansiyele sahiptir. Tüm bu avantajlar göz önüne alındığında, WJ-MSC'lerin MSC bazlı tedaviler için yeni altın standart olduğu savunulmaktadır30.

İlginç bir şekilde, çok sayıda araştırma, MSC'lerin terapötik etkilerini esas olarak parakrin sinyalleme yoluyla sergilediğini ortaya koymuştur. Çoğu durumda, bu tür etkilerin, MSC'ler37 tarafından salgılanan eksozomlara/küçük hücre dışı veziküllere (sEV'ler) yanıt olarak ortaya çıktığı bildirilmiştir. Eksozomlar/sEV'ler, hücrenin iç zar sisteminden elde edilen nano boyutlu biyoaktif veziküller olarak bilinir. Spesifik protein kargolarını, mRNA'yı ve ayrıca mikroRNA'lar ve uzun kodlamayan RNA'lar (LncRNA'lar) gibi kodlamayan RNA'ları bir şişede bir mesaj olarak aktaran mekikler olarak hareket ederler38. Sonuç olarak, alıcı hücreleri yeniden programlayabilirler ve temel hücresel fonksiyonları manipüle eden "sinyalozomlar" olarak adlandırılırlar39. MSC'lerden türetilen eksozomlar/sEV'ler, olası bir hücresiz alternatif olarak MSC tedavilerine üstünlüklerini göstermiştir. Ana MSC'lerine benzer şekilde, eksozomların/sEV'lerin çeşitli hastalıklarda terapötik etkiler ve hücresel rejenerasyon ortaya çıkardığı bulunmuştur. Bununla birlikte, ana hücrelerinin aksine, biyolojik engelleri daha kolay geçebilirler. Üstelik kritik güvenlik kaygılarından yoksundurlar; bağışıklık reddi veya uzun süreli tümör oluşumu riski taşımazlar40. Ayrıca, eksozomlar/sEV'ler, genetik bilgiyi aktarmak için doğal olarak donatılmış bir ilaç dağıtım sisteminin bir aracı olarak gen terapisi uygulamaları için kullanılabilir41. Bu nedenle, eksozomlar/sEV'ler gerçekten de çeşitli hastalıkların yeni terapötik müdahaleleri için heyecan verici yeni yolları ateşlemiştir 42,43,44.

Bu protokolde, WJ-MSC'lerin UC dokusundan izolasyonu ve karakterizasyonu için kapsamlı bir aşamalı eksplant bazlı protokol sunulmaktadır. Bunu, eksozomların/sEV'lerin bu WJ-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından izolasyonu için kısa bir protokol izleyecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler ve prosedürler onaylanmış kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiş ve hem Ain Shams Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Kahire, Mısır (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220) hem de Mısır'daki İngiliz Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Kahire, Mısır (CL-2309) Etik Kurulları tarafından onaylanmıştır. UC'ler, ebeveyn(ler)den imzalı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra alındı.

1. WJ-MSC'lerin insan göbek kordonundan izolasyonu

  1. Doğumdan hemen sonra göbek kordonunu (UC) (yaklaşık 15 cm uzunluğunda) toplamak için yaklaşık 30-40 mL fosfat tamponlu salini (PBS) bir kaba (kapalı toplama torbası) koyun. Toplanan UC'yi buz üzerinde tutun ve toplandıktan sonra maksimum 4-5 saat içinde işleyin.
    NOT: Numune 4-5 saat sonra işlenemez, çünkü bu MSC verimini büyük ölçüde azaltacaktır. PBS ve kabın steril olduğundan emin olun.
  2. WJ-MSC'ler için %10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 2 mM L-glutamin ve 0.25 μg/mL amfoterisin B ile tamamlanan Düşük Glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamından (LG-DMEM) oluşan eksiksiz kültür ortamı hazırlayın.
  3. Kuyu başına 3 mL tam ortamı 6 oyuklu plakalara yerleştirin, ardından ortam içeren bu 6 oyuklu plakaları ısıtmak ve hazırlanmak için 37 ° C'ye ve% 5 CO2'ye ayarlanmış bir CO 2 inkübatörüne yerleştirin.
  4. Biyogüvenlik kabininde, her biri 10 mL steril PBS ile doldurulmuş sekiz adet 10 cm'lik hücre kültürü kabı hazırlayın.
  5. Dikkatlice, sterilize edilmiş forseps kullanarak, kanı yıkamak için UC'yi kapalı plastik torbadan PBS içeren ilk Petri kabına aktarın (Numunedeki tüm kan yıkanana kadar bu adımı tekrarlayın).
  6. Steril bir çubuk üzerine %70 etanol püskürtün ve UC'yi 30 saniye boyunca silmek için kullanın.
  7. Kalan etanolü çıkarmak için UC'yi steril PBS ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına aktarın.
  8. UC'yi önceden steril PBS ile doldurulmuş başka bir Petri kabına aktarın ve steril makas kullanarak UC'yi daha küçük parçalara ayırın (her biri yaklaşık 3 cm). Ardından, kesme işlemi sırasında kanın salınmasını önlemek için bu 3 cm uzunluğundaki parçaları taze steril PBS içeren başka bir Petri kabına taşıyın.
    NOT: Bu noktadan itibaren, UC parçaları ve sonraki tüm işlem adımları buz üzerinde tutulmalıdır. Bu, jelatinimsi maddenin salınmasını önlemek ve WJ-MSC'lerin UC dokusundan izolasyon prosedürünün başarısını sağlamak için gerçekten önemlidir. Toplanan UC'nin maksimum 4-5 saat içinde işlenmesi, izolasyon işleminin başarısı için çok önemlidir. Daha önce, UC toplandıktan sonra daha uzun süreler içinde işleniyordu ve ne yazık ki prosedür başarılı sonuçlar göstermedi (veriler gösterilmedi).
  9. UC parçalarını steril PBS ile doldurulmuş bir Petri kabında tek tek (buz üzerinde) işlemeye başlayın. Kan damarlarını kesmek ve Wharton jölesi (WJ) dokusunu izole etmek için steril makas ve forseps kullanın. Ardından berrak WJ parçalarını buz üzerinde steril PBS ile doldurulmuş başka bir Petri kabına yerleştirin.
    NOT: WJ dokusunun UC parçasından izolasyonu sırasında, damarın kesilmesini önlemek için ilk kesi UC parçasının şeffaf tarafında, kan damarlarından uzakta yapılır. Daha sonra kan damarları klemplenir, kesilir ve çekilir.
  10. Kan damarları olmadan berrak WJ dokusu elde etmek için tüm UC parçalarında önceki adımı tekrarlayın.
    NOT: WJ doku izolasyonu sırasında PBS çözeltisi kanlı veya belirsiz hale gelirse, UC parçalarının işlenmesi ve kan damarlarının çıkarılması sırasında gerekirse PBS Petri kabını değiştirin.
  11. Toplanan WJ parçalarını steril PBS ile doldurulmuş 10 cm'lik taze bir hücre kültürü kabına aktararak PBS ile yıkayın.
  12. Toplanan WJ dokularını 10 mm uzunluğunda küçük parçalar halinde kesmek için steril, keskin bir neşter ve forseps kullanın.
  13. WJ parçalarını adım 1.3'te önceden hazırlanmış 6 oyuklu plakalara aktarın. Kuyucuk başına 5-6 WJ parçası yerleştirin, ardından WJ doku eksplantlarını içeren 6 oyuklu plakalarıCO2 inkübatöründe 37 °C'de %5CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin ve 3 gün boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
  14. WJ doku eksplantlarının yerleştirilmesinden sonraki 4. günde, eksplantları rahatsız etmemeye dikkat ederek kuyucuk başına dikkatlice 1 mL ortam ekleyin.
    NOT: WJ parçalarının takılı olduğu plakanın altına dokunmaktan veya çizmekten kaçının.
  15. WJ doku eksplantlarını yerleştirdikten sonraki 6. günde önceki adımı tekrarlayın.
  16. WJ doku eksplantlarını yerleştirdikten sonraki 8. günde (yani, eksplant yerleştirildikten yaklaşık 1 hafta sonra), eksplant yerleştirildikten sonraki 12.-14. güne kadar her gün kuyu başına ortamın yarısını değiştirmeye başlayın. Her kuyucuktan yaklaşık 2,5 mL çıkararak ve taze 2,5 mL tam sıcak ortam (37 ° C) ekleyerek kültür ortamının yarısını her bir oyuktan değiştirin.
    NOT: Ortamı kuyu yüzeyinden çekin ve WJ parçalarının takılı olduğu plakanın tabanına dokunmaktan veya çizmekten kaçının. WJ-MSC'ler genellikle eksplantların yerleştirilmesinden sonraki 5-10 gün içinde WJ doku eksplantlarının altında ve çevresinde görülür.
  17. 6 oyuklu plakaları ters mikroskop altında (10x büyütme) rutin olarak gözlemleyin ve salınan hücreler çoğalıyorsa ve birleşmeleri artıyorsa, %50-60'a ulaşıyorsa, bir sonraki adıma geçin; Değilse, Adım 1.16'yı tekrarlayın. yine. WJ parçalarının boyutu zamanla önemli ölçüde küçülür.
  18. Kuyucukların dibine bağlı WJ eksplantlarını yavaşça çıkarın ve tüm ortamı çıkarın. WJ eksplant parçalarının çıkarılması genellikle ilk yerleştirmeden sonraki 12-14. günde yapılır.
    NOT: Tüm medyanın çıkarıldığından emin olmak için medyayı çıkarırken plakaları 45° açıyla hafifçe eğin.
  19. Her bir kuyuyu 2 mL PBS ile yıkayın, plakayı hafifçe döndürün ve ardından PBS'yi atın. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
    NOT: PBS'yi kuyunun duvarına yavaşça ekleyin ve hücrelerin hiç rahatsız edilmemesini sağlamak için kuyucukların dibine dokunmaktan kaçının.
  20. Kuyu başına 2 mL ılık tam ortamı nazikçe ekleyin (adım 1.2'de açıklandığı gibi tam bileşime sahip ortam) ve 6 oyuklu plakaları nemlendirilmiş koşullar altında %5CO2 ile inkübe edin.2 37 ° C'de.
  21. Hücreler yaklaşık %80 birleşmeye ulaşana kadar ortamı her gün tamamen değiştirin (kuyu başına 2 mL tam ortam).
  22. Hücreler yaklaşık %80 birleşmeye ulaştığında, tripsin-EDTA kullanarak hücreleri T25 hücre kültürü şişelerine geçirin (bir 6 oyuklu plakadan elde edilen toplam hücreler bir T25 kültür şişesine geçirilebilir, T25 şişesi başına 8-9 mL tam ortam kullanın). Bu WJ-MSC'ler P1 hücreleri olarak gösterilir.
    NOT: Toksik etkilerden kaçınmak için hücreleri Tripsin-EDTA ile çok uzun süre bırakmayın; Genellikle hücrelerin ayrılması için 3 dakika yeterlidir. Farklı tedarikçiler Tripsin-EDTA'ya değişken etki gücü sağlayabilir. Buna göre, kuluçka süresi belirlenirken bunun dikkate alınması gerekir.
  23. Medyayı gün aşırı değiştirin. Hücreler yaklaşık %80 birleşmeye ulaştığında, Tripsin-EDTA kullanarak hücreleri T75 hücre kültürü şişelerine geçirin (bir T25 kültür şişesinden elde edilen toplam hücreler bir T75 kültür şişesine geçirilebilir; T75 şişesi başına 15-18 mL tam ortam kullanın); bu WJ-MSC'ler P2 hücreleri olarak gösterilir.
  24. Medyayı gün aşırı değiştirin. Hücreler yaklaşık %80 birleşmeye ulaştığında, Tripsin-EDTA kullanarak hücreleri ayırın, ardından WJ-MSC'leri T75 şişesi başına yaklaşık 0.75 x 106-1 x 106 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Bu WJ-MSC'ler P3 hücreleri olarak gösterilir.
    NOT: Bu protokolde açıklanan gelecekteki deneyler için P3-P5 arasındaki hücreleri kullanın.
  25. İzole edilmiş WJ-MSC'leri, %80 FBS, %10 tam ortam (adım 1.2'de açıklandığı gibi) ve %10 dimetil sülfoksitten (DMSO) oluşan kriyoprezervasyon ortamı kullanarak sıvı nitrojen içinde dondurarak saklayın.
    NOT: WJ-MSC'lerin izolasyonu için tüm adımların şematik bir sunumu Şekil 1'de verilmiştir.

2. Çeşitli CD yüzey belirteçleri için akış sitometrik analizi kullanılarak immünofenotipleme yoluyla izole edilmiş WJ-MSC'lerin karakterizasyonu

  1. 4. pasajda Tripsin-EDTA kullanarak hücreleri ayırın. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve bir hemositometre kullanarak sayılarını sayın.
    NOT: Tripsinizasyon sırasında minimum inkübasyon süresi (3 dakika), hücrelerin herhangi bir hasar vermeden başarılı bir şekilde ayrılması için kritik öneme sahiptir. Tripsin-EDTA ile uzun süreli inkübasyon, hücre yüzeyi belirteçlerine zarar verebilir ve immünofenotipleme testi sonuçlarını olumsuz etkileyebilir.
  2. Yaklaşık 100.000 hücreyi (karanlık koşullarda) 4 °C'de 20 dakika boyunca fikoeritrin (PE) veya floresein izotiyosiyanat (FITC) ile etiketlenmiş insan monoklonal antikorları ile aşağıdaki gibi inkübe edin: Anti-CD90 PE, Anti-CD73 PE, Anti-CD105 FITC, Anti-CD44 PE, Anti-CD34 PE, Anti-CD14 PE ve Anti-HLA-DR FITC ve kontrol olarak boyanmamış hücreleri kullanın
  3. Hücreleri PBS ile durulayın ve daha sonra 500 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin; Akış sitometrisi kullanarak analiz edin45.

3. İzole edilmiş WJ-MSC'lerin çeşitli mezenkimal soylara doğru farklılaşma potansiyelinin değerlendirilmesi

  1. Adipojenik farklılaşma
    1. Hücreleri tam proliferasyon ortamında yeniden süspanse edin (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Daha sonra, hücreleri 24 oyuklu bir doku kültürü plakasında 3.7 x 104 hücre/kuyu (0.5 mL orta/kuyu) yoğunlukta kültürleyin. Ardından, 37 °C'de %5CO2 nemlendirilmiş koşullar altında inkübe edin. Sonraki, Sonraki, her gün, hücreler neredeyse %100 birleşene kadar ortamı değiştirin; Bu genellikle yaklaşık 3-4 gün sürer.
    2. Proliferasyon ortamını çıkarın ve adipogenezi indüklemek için adipojenik farklılaşma ortamı ile değiştirin. LG-DMEM ortamını 100 μg/mL streptomisin, 100 U/mL penisilin, 0.25 μg/mL amfoterisin B ve mezenkimal kök hücre fonksiyonel tanımlama kitinde sağlanan adipojenik takviye ile tamamlayın. Daha sonra, ortamı her 3 günde bir nazikçe (0,5 mL/kuyu) değiştirin ve lipid vakuollerinin bozulmasını önleyin.
    3. Yaklaşık 21 gün sonra, mikroskobik inceleme kullanarak, adipojenik farklılaşmayı değerlendirmek için lipid vakuollerini Yağ Kırmızısı ile boyayın.
    4. Taze bir Yağ Kırmızısı stok çözeltisi hazırlayın; 30 mg Yağ Kırmızısı lekesini 10 mL izopropanol içinde çözün ve oda sıcaklığında en az 30 dakika dinlendirin. Daha sonra, 2 ölçü çift damıtılmış suyu (ddH2O) 3 ölçü stok çözeltisi ile karıştırarak, iyice karıştırarak ve oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirerek bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Daha sonra 0,22 veya 0,45 μm filtre kullanarak filtreleyin.
      NOT: En iyi boyama sonuçları için Yağ Kırmızısı lekesini taze olarak hazırlayın.
    5. Başarılı adipojenik farklılaşma dokümantasyonu için, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve 15 dakika boyunca nötr tamponlu% 10 formalin (0.75 mL / kuyu) ile sabitleyin. Daha sonra, hücreleri 1 mL/kuyu kullanarak PBS ile iki kez yıkayın (her yıkamadan sonra PBS'yi atmadan önce hücreleri yaklaşık 5 dakika inkübe edin).
      NOT: Proliferasyon ortamında tutulan hücreler (adım 1.2'de açıklanmıştır) kontrol, indüklenmemiş hücreler olarak kullanılır. Hücresel hasarı önlemek için nötr tamponlu formalini doğrudan hücrelere değil, duvarlara yavaşça ekleyin. PBS ile son yıkamadan sonra, verimsiz lekelenmeyi önlemek için Yağ Kırmızısı leke çalışma solüsyonunu eklemeden önce PBS'nin tamamen aspirasyonu çok önemlidir.
    6. Son yıkamadan sonra hücreleri (1 mL/kuyu) Yağ Kırmızısı çalışma solüsyonu ile boyayın ve 37 °C'de 60 dakika inkübe edin. Ardından, leke solüsyonunu geri çekin ve atın ve hücreleri PBS ile iki kez nazikçe durulayın. Daha sonra mikroskop altında lekeli lipit damlacıklarını gözlemleyin.
  2. Osteojenik farklılaşma
    1. Hücreleri tam proliferasyon ortamında yeniden süspanse edin (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Daha sonra, 24 oyuklu bir doku kültürü plakasında, 7.4 x103 hücre/kuyu tohumlayın (0.5 mL orta/kuyu ekleyin) ve neredeyse %70 birleşmeye ulaşmak için 37 °C'de %5CO2'de nemli koşullar altında 3 gün inkübe edin.
    2. Yaklaşık %70 birleşmede, proliferasyon ortamını, 100 U/mL Penisilin, 100 μg/mL Streptomisin, 2 mM L-glutamin ve 0.25 μg/mL Amfoterisin B ile birlikte %10 FBS ile tamamlanan LG-DMEM ortamında, mezenkimal kök hücre fonksiyonel tanımlama kitinde sağlanan osteojenik takviyeyi içeren farklılaşma-indüksiyon ortamıyla değiştirin.
    3. Diferansiyel medyayı her 3 günde bir değiştirin ve osteojenik indüksiyona yaklaşık 21 gün devam edin.
    4. Alizarin Red S lekesinin çalışan bir çözeltisini hazırlayın; 9 mL ddH2O getirin ve içinde 200 mg Alizarin Red S lekesini çözün ve ardından pH'ı 4.1-4.3'e ayarlamak için amonyum hidroksit ve HCl kullanın. Ardından, hacmi ddH2O ile 10 mL'ye tamamlayın. Daha sonra, çözeltiyi bir filtre kullanarak filtreleyin (0.22 veya 0.45 μm) çökeltileri gidermek için.
    5. İndüksiyon periyodunun sonunda, hücreleri PBS ile iki kez durulayın ve ardından nötr tamponlu% 10 formalin (0.75 mL / kuyu) kullanarak sabitleyin ve 15 dakika dinlendirin. Daha sonra, hücreleri PBS (1 mL/kuyu) kullanarak iki kez durulayın ve her durulamada hücrelerin 5 dakika inkübe edildiğinden emin olun.
      NOT: Proliferasyon ortamında tutulan hücreler (adım 1.2'de açıklanmıştır) kontrol, indüklenmemiş hücreler olarak kullanılır.
    6. Adım 3.2.4'te hazırlanan %2 Alizarin-Red S çalışma solüsyonunu önceki adımdaki sabit hücrelere ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık 45-60 dakika karanlıkta inkübe edin.
    7. Daha sonra, leke solüsyonunu atın ve hücreleri iki kez ddH2O ve ardından bir kez PBS ile durulayın, ardından boyalı kalsiyum açısından zengin hücre dışı matrisi gözlemleyerek mikroskop altında başarılı osteojenik farklılaşmayı değerlendirin.
  3. Kondrojenik farklılaşma
    1. Hücreleri tam proliferasyon ortamında yeniden süspanse edin (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Daha sonra, 24 oyuklu bir doku kültürü plakasında, 7.4 x 103 hücre/kuyu tohumlayın (0.5 mL orta/kuyu ekleyin) ve bunları nemli koşullar altında %5CO2'de inkübe edin 2 37 °C'de 3 gün boyunca neredeyse %90 birleşmeye ulaşın.
    2. Yaklaşık% 90 birleşmede, 0.25 μg / mL Amfoterisin B, 100 U / mL Penisilin, 2 mM L-glutamin ve 100 μg / mL Streptomisin46 ile birlikte insülin-transferrin selenyum (ITS) ve mezenkimal kök hücre fonksiyonel tanımlama kiti ile birlikte kondrojenik takviye - ile takviye edilmiş serumsuz DMEM / F12 kullanarak kondrojenik farklılaşmayı indüklemeye başlayın.
      NOT: Tam kondrojenik farklılaşma indüksiyon ortamı karanlıkta 2-8 ° C'de tutulur.
    3. Yaklaşık 21 gün boyunca kondrojenik farklılaşma indüksiyonuna devam edin; Bu arada, medyayı her 3 günde bir değiştirin.
    4. Alcian Blue leke çalışma solüsyonunu aşağıdaki gibi hazırlayın: İlk olarak, ddH2O içinde% 3 buzlu asetik asit hazırlayın (3 mL buzlu asetik asit ekleyin ve 100 mL'ye kadar ddH2O ile doldurun). Daha sonra, 20 mg'a 20 mL %3 buzlu asit çözeltisi ekleyerek, yaklaşık 30 dakika bekleterek ve ardından çökeltileri gidermek için 0,22 μm veya 0,45 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyerek bir Alcian Blue leke çalışma solüsyonu hazırlayın.
    5. İndüksiyon periyodunun sonunda, hücreleri PBS ile iki kez durulayın, ardından %10 nötr tamponlu formalin (0.75 mL/kuyu) kullanarak sabitleyin ve 15 dakika dinlendirin. Bundan sonra, hücreleri PBS (1 mL/kuyu) kullanarak iki kez yıkayın. Hücreleri her seferinde 5 dakika inkübe ettiğinizden emin olun.
      NOT: Proliferasyon ortamında tutulan hücreler (adım 1.2'de açıklandığı gibi) kontrol, indüklenmemiş hücreler olarak kullanılır.
    6. Sabit hücreleri, %0.1 Alcian mavisi hazırlanmış çalışma solüsyonunda 37 °C'de yaklaşık 60 dakika inkübe edin. Kalan lekeyi çıkarmak için hücreleri iki kez ddH2O ve bir kez PBS ile durulayın. Daha sonra mikroskobik inceleme kullanarak lekeli sülfatlanmış proteoglikanları gözlemleyin.

4. WJ-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından eksozomların/sEV'lerin izolasyonu

  1. WJ-MSC'leri tam proliferasyon ortamında (adım 1.2'de açıklandığı gibi) yeniden süspanse edin ve bu WJ-MSC'lerle 150.000 hücre/kuyu (2 mL ortam/kuyu) yoğunlukta 6 oyuklu doku kültürü plakalarını tohumlayın ve bunları nemli koşullar altında 37 °C'de %5CO2'de inkübe edin.
  2. Serumsuz (SF) eksozom toplama ortamını aşağıdaki gibi hazırlayın: 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 0,25 μg/mL amfoterisin B ile desteklenmiş düşük glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (LG-DMEM).
    NOT: Eksozom toplama ortamı, tam proliferasyon ortamı ile aynı bileşime sahiptir (adım 1.2'de açıklanmıştır), ancak FBS içermez.
  3. 6 oyuklu plakaları (adım 4.1'de hazırlanmıştır) takip edin ve proliferasyon ortamını kullanarak ortamı gün aşırı değiştirin (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Hücreleri yaklaşık% 75-80 birleşmeye ulaşana kadar mikroskop altında gözlemleyin.
  4. % 70 birleşmeye ulaşıldığında, hücreleri iki kez PBS (1 mL / kuyu) ile yıkayın, ardından serumsuz (SF) eksozom toplama ortamı (1.5 mL / kuyu) ekleyin (adım 4.2'de açıklanmıştır) ve nemli koşullar altında% 5CO2'de 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
  5. 48 saat sonra, WJ-MSC'lerin şartlandırılmış ortamını, 15 mL'lik santrifüj toplama tüplerine önceki adımda yerleştirilen 6 oyuklu doku kültürü plakalarından toplayın. Ardından, toplanan şartlandırılmış ortamı47 temizlemek için aşağıdaki sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını gerçekleştirin.
    NOT: Tripan mavisi dışlama boyasını kullanarak ve ardından hemositometreyi kullanarak hücrelerin sayılmasını kullanarak, başlangıçta toplanan şartlandırılmış ortamı elde etmek için kullanılan hücrelerin canlılık yüzdesini değerlendirin; Canlı hücreler ideal olarak %90'dan fazla olmalıdır. Daha sonra, toplanan hücre peletini gelecekteki araştırmalar için ihtiyaç duyulması ihtimaline karşı -80 °C'de saklayın.
    1. Askıya alınmış hücrelerden kurtulmak için toplanan şartlandırılmış ortamı 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı toplayın ve toplanan bu süpernatant (şartlandırılmış ortam) için bir sonraki santrifüjleme adımını gerçekleştirin.
    2. Nekrotik hücrelerden ve hücre kalıntılarından kurtulmak için adım 4.5.1'den elde edilen şartlandırılmış ortamı 3000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Santrifüjleme adımları tercihen 4 °C'de yapılır, ancak benzer sonuçlarla oda sıcaklığında da yapılabilir.
    3. Önceki adımdan elde edilen süpernatanı, 0,22 μm'lik bir filtreden geçirerek yeni bir koleksiyon 50 mL'lik polipropilen tüpe geçirerek filtreleyin ve artık hücre kalıntılarından ve büyük EV'lerden kurtulun.
      NOT: Filtrelenmiş şartlandırılmış ortam, eksozomları/sEV'leri izole etmek için sonraki adımlar için hemen kullanılabilir, buzdolabında 4 °C'de saklanabilir ve 3 günden fazla kullanılmaz veya eksozomların/sEV'lerin izole edilmesi gerekene kadar uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir. -80 °C'de saklanan temizlenmiş şartlandırılmış ortamın maksimum 1-3 ay içinde işlenmesi tercih edilir; ne kadar erken olursa o kadar iyi.
  6. 7.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 15 mL temizlenmiş şartlandırılmış ortam (adım 4.5'ten elde edilir) yerleştirin ve 1.5 mL reaktif ekleyin. Reaktifi ortama 1:5 oranında ekleyin (yani, her 5 mL ortam için 1 mL Exoquick-TC çökeltme reaktifi). Daha sonra tüpü yukarı ve aşağı ters çevirin ve çökeltici reaktifin ortamla uygun şekilde karışmasını sağlamak için birkaç kez hafifçe vurun.
    NOT: Çökeltici reaktif ağır, viskoz bir reaktiftir. Bu nedenle, amaçlanan hacmin tamamen aktarılmasını sağlamak için gereken hacim yavaş ve dikkatli bir şekilde geri çekilmelidir.
  7. Çökeltici reaktif içeren ortamın bulunduğu tüpü 4 °C'de gece boyunca yaklaşık 16 saat (en az 12 saat) dik ayakta duracak konumda saklayın.
  8. Ertesi gün, ortam/çökeltici reaktif karışımını 4 °C'de 30 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemenin ardından, eksozomlar/sEVs peleti, tüpün dibine yerleşmiş çok küçük beyaz veya bej bir pelet olarak görünür.
    NOT: Bu santrifüjleme adımı, benzer sonuçlarla oda sıcaklığında da yapılabilir. Bu santrifüjleme adımının sonunda eksozom/sEV peletinin görünmemesi durumunda, 4 °C'de ekstra 20-30 dakika boyunca 3000 x g'da ek santrifüjleme süresi eklenebilir. Bazen eksozomlar/EV'ler peleti, uzatılmış santrifüjleme süresinden sonra bile görünmez kalır, bu da az miktarda eksozom/sEV olduğu anlamına gelir. Bu durumda tüpün alt kısmını 5-10 μL bırakarak protokole devam edin.
  9. Süpernatanı aspire edin ve artık ortam/çökeltici reaktif karışımını 4 °C'de 5 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüjleyin. Ardından, çok dikkatli bir şekilde, çökelmiş eksozomları/sEV peletini bozmadan kalan sıvı izlerini aspire edin.
  10. Eksozomları/sEVs peletini, pelet boyutuna ve görünürlüğüne göre 100-300 μL steril PBS'de askıya alın. Daha sonra, bu eksozomlar/sEV'ler ya hemen kullanılabilir ya da sonraki deneyler için -80 °C'de bir ultra dondurucuda saklanabilir.
    NOT: Aynı ortam için birden fazla santrifüj tüpü ile başlanması durumunda (adım 4.9'da açıklanmıştır) ve eksozomlar/sEV peletleri (adım 4.10'da elde edilir) görünmezdir, hepsinden toplanan eksozomlar/sEV peletleri, hepsini bir araya toplayarak askıya almak için yaklaşık 100-300 μL steril PBS kullanılarak bir havuzda toplanabilir.
  11. Üretici tarafından belirtildiği gibi, ticari olarak temin edilebilen bir bisinkoninik asit (BCA) protein miktar belirleme kiti kullanarak toplanan eksozomları/sEV'leri protein içeriklerine göre ölçün.
    NOT: WJ-MSC'lerden türetilen eksozomların/sEV'lerin tüm izolasyon adımlarının şematik bir sunumu Şekil 2'de verilmiştir.

5. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak izole eksozomların/sEV'lerin görüntülenmesi

  1. Taze izole edilmiş eksozomları/sEV'leri, pelet boyutuna ve görünürlüğüne göre 100-300 μL steril PBS'de askıya alın (daha önce adım 4.11'de açıklandığı gibi).
    NOT: TEM görüntüleme için donmuş eksozomlar/sEV'ler yerine taze izole edilmiş kullanılması daha çok tercih edilir
  2. 20 μL eksozom/sEV süspansiyonunu karbon kaplı bir ızgaraya pipetleyin ve 10 dakika kurumaya bırakın.
  3. Yerleştirilen eksozomları/sEV'leri glutaraldehit çözeltisi (damıtılmış suda% 2) kullanarak yaklaşık 15 dakika sabitleyin.
  4. Daha sonra, sabit eksozomları/sEV'leri %2 uranil asetat ile boyayın ve karanlıkta yaklaşık 3 dakika bekletin, ardından varsayılan TEM ayarlarını kullanarak bunları bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) (20000 büyütme) altında inceleyin.

6. Bir partikül boyutu analizörü kullanılarak izole edilmiş eksozomların/sEV'lerin ortalama boyutunun belirlenmesi

  1. Yeni izole edilmiş eksozomları/sEV'leri steril PBS pH 7.4 ile 1:250 oranında seyreltin.
  2. 25 °C'de bir partikül boyutu analizörü kullanarak izole edilmiş eksozomların/sEV'lerin ortalama partikül boyutu dağılımını ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

WJ-MSC'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Şekil 3'te gösterildiği gibi, küçük fibroblast benzeri hücreler başlangıçta bu eksplantların tohumlanmasından sonraki 5-10 gün içinde WJ eksplant dokularının altında ve çevresinde ortaya çıktı (Şekil 3A). Serbest bırakılan bu WJ-MSC'ler çoğalmaya devam eder ve genellikle izola...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde, WJ-MSC'leri insan UC dokusundan izole etmek ve ayrıca türetilmiş eksozomlarını/sEV'lerini izole etmek için ayrıntılı adımlar sunabildik. UC, MSC'leri elde etmek için kolayca elde edilebilen, kullanılmayan, invaziv olmayan bir kaynaktır ve toplama veya işleme için özel bir ekipman gerekmez 11,15,30,32,48. WJ-MSC...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm ortak yazarlar bu çalışmayla ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Ain Shams Üniversitesi - Stratejik Plan Araştırma Destek Bursu (2024/2025), Mısır ve Nanoteknoloji Araştırma Merkezi (NTRC) - Erişim Ödülü (2019/2020), Mısır'daki İngiliz Üniversitesi (BUE), Kahire, Mısır tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, ABDA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, ABDA5533
Amonyum hidroksitFisher Scientific, Almanya1336-21-6
İnsan CD-105, FITC için antikorR& D systems Inc., MN, ABDFAB10971F
İnsan için antikor CD-14, PEBeckman Coulter, ABDIM0650U
İnsan CD-34, PE için antikorBeckman Coulter, ABDIM1420
İnsan CD-44, PE için antikorBeckman Coulter, ABDA32537
İnsan CD-73, PE için antikorR& D systems Inc., MN, ABDFAB5795P
İnsan CD-90, PE için antikorR& D systems Inc., MN, ABDFAB2067P
İnsan için antikor HLA-DR, FITCBeckman Coulter, ABDIM1638U
Bicinchoninic asit (BCA) protein nicelik kitiTermobalıkçı23227
Biyogüvenlik kabinası, Laminar akış, MSC AdvantageThermo Scientific, ABD
CO2 Kuluçka Makinesi, Direct FormaThermo Scientific, ABD
Soğutma SantrifüjüSigma, Almanya
Soğutma SantrifüjüEppendorf, Almanya
CytoFLEX Akış Sitometresi Beckman Coulter, FL, ABD
Dimetil sülfoksit (DMSO)Fisher Scientific, AlmanyaBP231-100
DMEM - Düşük Glikoz 1 g/LLonza, İsviçre12-707F
DMEM/F12 Lonza, İsviçre12-719F
DNAse/RNAse serbest suGibco Thermo Fisher, ABD10977-035
Etanol mutlak, moleküler biyoloji derecesiSigma-Aldrich, Almanya24103
ExoQuick-TCSistem Biyobilimleri (SBI), ABDEXOTC50A-1Çökeltici madde
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brezilya10270-106
Formaldehit %37Fisher ScientificBP531-500
Buzul Asetik AsidiSigma Aldrich, AlmanyaA38S-500
Glutaraldehit çözeltisi SigmaG7776
Hidroklorik asit (HCl)Fisher Scientific, AlmanyaA144-212
Ters mikroskopOlimpos, Japonya
L-GlutaminGibco Thermo Fisher, ABD25030-024
Mezenkimal Kök Hücre Fonksiyonel Tanımlama Kiti  R& D systems Inc., MN, ABDSC006
Microplate okuyucuChromate, Awareness Technologies, ABD
Yağ Kırmızı LekeSigma-Aldrich, ABDO0625
Penisillin-Streptomisin-AmfoterisinGibco Thermo Fisher, ABD15240062
Fosfatla tamponlu tuzlu süm, 1x, Ca/Mg olmadanLonza, İsviçreBE17-516F
Sallayan su banyosuDaihan Wisebath, Kore
Şırınga filtresi, 0.2 mikronCorning, ABD431224
Geçirim elektron mikroskobuJEM-1200EX II, Jeol, Almanya
Trypan blue Gibco Thermo Fisher, ABD15250061
Tripsin-Versene-EDTA, 1xLonza, İsviçreCC-5012
Uranil asetat çözeltisi (%2)Elektron Mikrosopi Bilimleri, ABD22400-2
UV-Görünür spektrofotometreShimadzu, Japonya
GirdapSciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, Birleşik Krallık Parçacık boyutu analizörü

Kaynaklar

  1. Zakrzewski, W., Dobrzyński, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 68(2019).
  2. Humes, H. D. Stem cells: the next therapeutic frontier. Trans Am Clin Climatol Assoc. 116, discussion 183-164 167-184 (2005).
  3. Sugarman, J. Ethical issues in stem cell research and treatment. Cell Res. 18 (1), S176(2008).
  4. Weiss, M., Troyer, D. Stem cells in the umbilical cord. Stem Cell Rev. 2 (2), 155-162 (2006).
  5. Kim, D., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  6. Ellis, H. Anatomy of fetal circulation. Anesth Intensive Care Med. 6 (3), 73(2005).
  7. Cook, H. J. Thomas Wharton's adenographia, first published in London in 1656. Med Hist. 42 (3), 411-412 (1998).
  8. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Handbook of Stem Cell Therapy. , Springer. Singapore. (2022).
  9. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: a meta-analysis study. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 484(2020).
  10. Nabil, M., Kassem, D. H., Ali, A. A., El-Mesallamy, H. O. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ameliorate cognitive impairment in Alzheimer's disease rat model: emerging role of SIRT1. BioFactors. 49 (6), 1121-1142 (2023).
  11. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  12. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles: a potential game changer for the COVID-19 crisis. Front Cell Dev Biol. 8, 587866(2020).
  13. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), 886(2019).
  14. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. J Cell Biochem. 123 (5), 906-920 (2022).
  15. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: achievements and challenges. Front Cell Dev Biol. 8, 16(2020).
  16. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2009).
  17. Troyer, D., Weiss, M. Concise review: Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  18. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  19. Batsali, A., Kastrinaki, M., Papadaki, H., Pontikoglou, C. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of the umbilical cord: biological properties and emerging clinical applications. Curr Stem Cell Res Ther. 8 (2), 144-155 (2013).
  20. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  21. Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells. JoVE. (186), e63348(2022).
  22. Da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P., Nardi, N. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119 (11), 2204-2213 (2006).
  23. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21 (2), 216-225 (2014).
  24. Shetty, P., Cooper, K., Viswanathan, C. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix, cord blood, and bone marrow mesenchymal stem cells. Asian J Transfus Sci. 4 (1), 14-24 (2010).
  25. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., Mesallamy, H. O. E. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regen Med. 10 (7), 841-855 (2015).
  26. Sibov, T. T., et al. Mesenchymal stem cells from umbilical cord blood: parameters for isolation, characterization and adipogenic differentiation. Cytotechnology. 64 (5), 511-521 (2012).
  27. Arutyunyan, I., Elchaninov, A., Makarov, A., Fatkhudinov, T. Umbilical cord as prospective source for mesenchymal stem cell-based therapy. Stem Cells Int. 2016, 6901286(2016).
  28. Knudtzon, S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood. Blood. 43 (3), 357(1974).
  29. Fong, C., et al. Human Wharton's jelly stem cells have unique transcriptome profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 7 (1), 1-16 (2011).
  30. El Omar, R., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell based therapies. Tissue Eng Part B Rev. 20, 523-544 (2014).
  31. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): a comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  32. La Rocca, G., et al. Isolation and characterization of Oct-4+/HLA-G+ mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol. 131 (2), 267-282 (2009).
  33. Moffett, A., Loke, Y. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal. Placenta. 25 (1), 1-8 (2003).
  34. Chao, K., Chao, K., Fu, Y., Liu, S. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One. 3 (1), e1451(2008).
  35. Tsai, P., et al. Transplantation of insulin-producing cells from umbilical cord mesenchymal stem cells for the treatment of streptozotocin-induced diabetic rats. J Biomed Sci. 19, 47(2012).
  36. Chatzistamatiou, T., et al. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood. Transfusion. 54 (12), 3108-3120 (2014).
  37. Newton, W. C., Kim, J. W., Luo, J. Z. Q., Luo, L. Stem cell-derived exosomes: a novel vector for tissue repair and diabetic therapy. J Mol Endocrinol. 59 (4), R155-R165 (2017).
  38. Wei, W., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising biological tool in nanomedicine. Front Pharmacol. 11, 590470(2021).
  39. Bjorge, I. M., Kim, S. Y., Mano, J. F., Kalionis, B., Chrzanowski, W. Extracellular vesicles, exosomes and shedding vesicles in regenerative medicine-a new paradigm for tissue repair. Biomater Sci. 6 (1), 60-78 (2018).
  40. Zhang, K., Cheng, K. Stem cell-derived exosome versus stem cell therapy. Nat Rev Bioeng. 1 (9), 608-609 (2023).
  41. Colao, I. L., Corteling, R., Bracewell, D., Wall, I. Manufacturing exosomes: a promising therapeutic platform. Trends Mol Med. 24 (3), 242-256 (2018).
  42. Zheng, W., et al. Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun. 14 (1), 4734(2023).
  43. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  44. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  45. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of Flow Cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration. , Wiley-Blackwell. (2010).
  46. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 108(2016).
  47. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  48. Xu, Y., et al. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by a novel explantation technique can differentiate into functional endothelial cells and promote revascularization. Stem Cells Dev. 19 (10), 1511-1522 (2010).
  49. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  50. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  51. Hua, J., et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix: proliferation and multilineage differentiation as compared to mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and bone marrow. Cell Biol Int. 38 (2), 198-210 (2013).
  52. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Curr Protoc Stem Cell Biol. 48 (1), e68(2019).
  53. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplant. 27 (1), 181-193 (2018).
  54. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  55. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell Tissue Res. 372 (1), 91-98 (2018).
  56. Börger, V., et al. Mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles and their potential as novel immunomodulatory therapeutic agents. Int J Mol Sci. 18 (7), 1450(2017).
  57. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  58. Kou, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration: a next generation therapeutic tool. Cell Death Dis. 13 (7), 580(2022).
  59. Huang, L., et al. Research advances of engineered exosomes as drug delivery carrier. ACS Omega. 8 (46), 43374-43387 (2023).
  60. Sun, Y., et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes for drug delivery. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 561(2021).
  61. Chopra, N., et al. Biophysical characterization and drug delivery potential of exosomes from human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. ACS Omega. 4 (8), 13143-13152 (2019).
  62. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2023).
  63. Kamei, N., et al. Comparative study of commercial protocols for high recovery of high-purity mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle isolation and their efficient labeling with fluorescent dyes. Nanomedicine. 35, 102396(2021).
  64. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87, 31-45 (2015).
  65. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12184(2022).
  66. Manning, R. R., et al. Analysis of peptides using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4). J Pharm Sci. 110 (12), 3969-3972 (2021).
  67. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 131(2018).
  68. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells Int. 2020, 8898221(2020).
  69. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  71. Witwer, K. W., et al. Updating MISEV: evolving the minimal requirements for studies of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 10 (14), e12182(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Wharton Jelisi MSC leriEkzozom zolasyonuG bek Kordonu DokusuEksplant Tekni imm nofenotiplemeY zey Belirte leriTransmisyon Elektron MikroskobuPartik l Boyutu Analizi
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.