Yöntem makalesi

Karbon İçeren Partikül Maddelere Maruz Kalan Hava Yolu Makrofajlarındaki Karbon İçeriğinin Ölçülmesi

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66781

⸱

12 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, Qingdao University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, bireysel partikül madde maruziyeti düzeyinde iç maruziyet dozunu değerlendirmek amacıyla hava yolu makrofajlarının karbon içeriğini ölçmek için ayrıntılı bir deneysel protokolü açıklamaktadır.

Özet

Pulmoner makrofajlar, fagositize edici partiküllerde doza bağlı bir patern sergiler. Yutulduktan sonra, bu makrofajlar daha sonra balgamla atılır, makrofajları ve parçacıkları ışık mikroskobu altında görünür ve ölçülebilir hale getirir. Özellikle, memeli vücudundaki elementel karbon, yalnızca dış kirleticilerden kaynaklanır. Sonuç olarak, hava yolu makrofajlarındaki (CCAM) karbon içeriği, karbon içeren partikül maddeye (PM) bireysel maruziyeti doğru bir şekilde tahmin eden geçerli bir maruziyet biyobelirteç görevi görür. Bu makale, balgam toplama, koruma, işleme, slayt hazırlama ve boyamanın yanı sıra makrofaj fotoğraf toplama ve analizini içeren bir protokolü tanımlamaktadır. Makrofaj çekirdekleri çıkarıldıktan sonra, her makrofajdaki karbon içeriğini ölçmek için karbon parçacıklarının (PCOC) kapladığı sitoplazma alanının oranı hesaplandı. Sonuçlar, karbon içeren PM'ye maruz kaldıktan sonra CCAM seviyelerinde bir yükselme olduğunu göstermektedir. Özetle, bu non-invaziv, hassas, güvenilir ve standartlaştırılmış yöntem, hedef hücrelerdeki karbon partiküllerinin doğrudan ölçülmesini sağlar ve indüklenmiş balgam yoluyla bireysel CCAM'ın büyük ölçekli miktar tayini için kullanılır.

Giriş

Ortam hava kirliliği, solunum ve kardiyovasküler hastalıklara bağlı ölümlerle ilişkili olup, insan sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır 1,2. Epidemiyolojik veriler, çapı 2,5 μm veya daha küçük (PM2.5) olan ortamdaki partikül maddeye kronik maruziyetin dünya çapında 4 ila 9 milyon insanın erken ölümlerinden sorumlu olduğunu göstermektedir. PM2.5, 2015 Küresel Hastalık, Yaralanmalar ve Risk Faktörleri Yükü Çalışması'nda (GBD) küresel mortalite için beşinci en önemli risk faktörü olarak sıralanmıştır3,4,5,6. Çalışmalar, DSÖ hava kirliliği yönergelerine uymanın PM2.5 maruziyetinden yılda 51.213 ölümü önleyebileceğini bulmuştur3. Şu anda, çoğu çalışma birey içi maruziyetin değerlendirilmesinden yoksundur ve yalnızca bireysel maruziyet seviyelerinden uzak olan daha büyük bölgesel izleme alanlarındaki kaba değerlendirmelere dayanmaktadır. İdrar PAH'ları ve benzo(a)piren gibi dahili maruziyetin mevcut biyobelirteçleri, partikül madde maruziyetleri ile sağlık etkileriarasındaki ilişkileri yansıtmamaktadır 7,8,9. Bu da sağlık etkileri ile doğru bir ilişki kurulamamasına yol açmaktadır. Bu nedenle, bir bireyde partikül maddeye maruz kalma seviyesini yansıtan belirteçlerin araştırılması, bireyler için doğru maruziyet değerlendirmesinin anahtarlarından biridir.

Bronşlara solunan partiküller, bronşlardaki siliyer salınımlar yoluyla balgam ile atılabilir. Alveollerde kirpikli bir mukoza akış taşıma sisteminin olmaması, alveollere giren partiküller için birincil temizleme yolunun fagositoz ve makrofajlar tarafından translokasyon yoluyla olduğu anlamına gelir10,11. Akciğerin anatomik yapısına bağlı olarak, çözünmeyen partikül yabancı maddelerin temizlenmesi yavaştır. Bu, partikül maddenin akciğer hücreleri ile uzun süre etkileşime girmesine ve çeşitli biyolojik etkiler başlatmasına izin vererek akciğer dokusuna ve diğer organlara zarar verir12,13. Partikül madde tarafından stimülasyon, makrofaj aktivasyonuna yol açar ve akciğerlerde sistemik bir inflamatuar yanıta neden olabilecek bir dizi inflamatuar faktörü tetikler14. Makrofaj sitofajisinin akciğerlerde sitokin fırtınalarını ortaya çıkarmadaki kritik rolü göz önüne alındığında, akciğer makrofajlarından gelen karbon partiküllerinin, havadaki karbon çekirdekli partikül maruziyetinin biyolojik olarak etkili dozunu yansıtabileceği teorize edilmiştir15. Ayrıca, memeli hücrelerinde elementel karbon agregasyonu olmadığından ve karbon içeren parçacıklar ışık mikroskobu altında siyah partikül madde olarak gözlemlenebildiğinden, alveolar ve bronşiyal makrofajların toplanması ve bunlardaki karbon içeriğinin ölçülmesi, partikül madde maruziyetinin değerlendirilmesi için bir belirteç görevi görebilir16.

Bu çalışma, Havayolu Makrofajlarının Karbon İçeriği (CCAM) olarak bilinen bireysel partikül madde maruziyet seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem tanımlamıştır. Spesifik olarak, popülasyon balgam örnekleri, katılımcılar ultrasonik bir nebülizör tarafından üretilen hipertonik salini soluduktan sonra toplandı. Bu örnekler daha sonra fiksatif bir çözelti kullanılarak korundu. Hava yolu makrofajları izole edildi, boyandı ve karbon içeren parçacıklar içeren makrofajları tanımlamak için ışık mikroskobu altında fotoğraflandı ve bunlar daha sonra niceliklendirildi. Bu yöntem, bireysel partikül madde maruziyet seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için biyolojik bir belirteç sağlar. Partikül madde maruziyeti ile sağlık etkileri arasındaki ilişkiyi araştırmak için metodolojik bir temel oluşturur ve PM maruziyeti ile akciğer hastalıkları gibi sağlık sonuçları arasındaki ilişkileri araştırmak için bir araştırma temeli görevi görür.

Protokol

Çalışma, Çin Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (NIOHP201604) İş Sağlığı ve Zehir Kontrol Enstitüsü Tıbbi Etik Komitesi'nden, çalışma ve biyolojik örnek toplama öncesinde tüm deneklerden yazılı bilgilendirilmiş onam alınarak onay aldı. Bu çalışma için, 1 yıldan fazla bir süredir karbon siyahı fabrikasında çalışan ve karbon siyahı aerosollerine maruz kalan karbon siyahı paketleyicileri seçildi. Zararlı faktörlere önemli bir mesleki maruziyeti olmayan bir su işleri fabrikasındaki su işleri işçileri, çalışmayı kurmak için yerel bölgeden kontrol popülasyonu olarak işe alındı. Çalışma popülasyonu için aşağıdaki dahil etme ve dışlama kriterleri seçilmiştir: Karbon siyahı paketleyicileri için dahil etme kriterleri, çoğu vardiya sırasında karbon siyahı ile doğrudan teması ve karbon siyahına maruz kalma alanında en az bir yıllık çalışmayı içeriyordu. Su işleri çalışanları, çalışma ortamlarında karbon siyahı veya diğer kirleticilere mesleki olarak maruz kalmamışlarsa dahil edildi. Dışlama kriterleri, kanser gibi kronik hastalıkları olan çalışanları, son üç ay içinde X-ışınına maruz kalmış olanları, akciğer tüberkülozu, akciğer cerrahisi, viral miyokardit, konjenital kalp hastalığı, yakın zamanda ateş veya iltihaplanma öyküsü olan bireyleri ve yakın zamanda antibiyotik almış işçileri kapsıyordu. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Balgam koruma

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek sabitleyici çözeltiyi hazırlayın:
    1. Bir su banyosunda% 2 polietilen glikolü (PEG1500) eritin. Bir santrifüj tüpünde 20 mL erimiş PEG1500 alın. Santrifüj tüpüne 20 mL %50 etanol ekleyin ve ana likörü oluşturmak için karışımı iyice çalkalayın.
    2. Yavaş yavaş 40 mL ana likörü 960 mL% 50 etanole dökün. Saccomanno fiksasyon solüsyonunu oluşturmak için solüsyonu iyice çalkalayın. Solüsyonu serin ve karanlık bir yerde saklayın.
  2. Hazırlanan fiksatif solüsyondan 20-30 mL ilave edilerek yaklaşık 2 mL balgam içeren bir santrifüj tüpüne ilave edilir. İçeriği iyice karıştırın.
    NOT: Toplam hacmin 40 mL'yi geçmediğinden emin olun.
  3. Santrifüj tüpünü bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Serin ve karanlık bir yerde saklayın. Hazır olduğunda daha fazla işlem için tüpü laboratuvara taşıyın.
    NOT: Her zaman bir su banyosunda PEG1500 eritin ve belirtilen doza göre kullanın.

2. Balgamda hücre süspansiyonunun hazırlanması

  1. Gerçek doza göre 0.1 g ditiyotreitol'ü 100 mL salin içinde çözerek sindirim çözeltisini hazırlayın. Hazırlanan çözeltiyi 4 ° C'de 48 saate kadar saklayın.
  2. Balgam içeren tüpü 1.998 x g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı atın. Çökeltiye eşit miktarda balgam sindirimi ekleyin. Karışımı girdap haline getirin ve iyice çalkalayın.
    1. Tüpü tamamen sıvılaşana kadar (10-15 dakika) 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
      NOT: Sıvılaştırma işlemi sırasında tüpü sürekli olarak sallayın.
  4. Sıvılaştırılmış karışımı 70 μm'lik bir filtre membranı ile filtreleyin.
  5. Filtrelenmiş çözeltiyi 500 x g'da 4 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin.
  6. Hücre çökeltisini koruyarak süpernatanı atın.
  7. Hücre çökeltisini Duchenne fosfat tamponunda yeniden süspanse edin. Saf bir hücre çökeltisi elde etmek için yeniden süspanse edilmiş çözeltiyi 500 x g'da 4 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin.

3. Hücre yaymasının hazırlanması

  1. Hücre tortusuna 200-600 μL fosfat tamponu ekleyin. İçeriği iyice karıştırın; Arabellek hacmini hücre sayımı sonuçlarına göre ayarlayın (105 hücre × >1.0 hedefleyin).
  2. 20 μL hücre süspansiyonu alın ve hematokrit yöntemini17 kullanarak bir hücre yayması oluşturun.
  3. Smear'ın doğal olarak kurumasını bekleyin (48 saat içinde). Smear'ı 10 saniye boyunca piyasada bulunan bir boyama solüsyonu ile sabitleyin.
  4. Smear'ı 8 saniye boyunca bir boyama solüsyonuna daldırın. Boyama sırasında, sürgüyü yavaşça yukarı ve aşağı kaldırın ve fazla lekeyi akan su ile durulayın.
  5. Smear lekesini B boyama solüsyonunda 8 saniye boyunca boyayın. Boyama sırasında slaytı kaldırın ve fazla lekeyi akan su altında durulayın.
    NOT: Boyama solüsyonları A ve B, piyasada bulunan boyama kitinde mevcuttur.
  6. Slaytı susuz etanole iki kez, her seferinde 2-3 saniye batırın.
  7. Kuruduktan sonra uygun miktarda nötr sakız uygulayın. Slaytı lamel ile kapatın.

4. CCAM'ın kantitatif analizi

  1. 100x yağ merceği objektifine sahip bir ışık mikroskobu kullanın. Rastgele seçilmiş, iyi boyanmış ve morfolojik olarak bozulmamış makrofajların görüntülerini yakalayın. Her örnek için rastgele 50 makrofaj resmi çekin.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek Image J yazılımında görüntü analizi gerçekleştirin:
    1. Ölçeği ölçün ve gerçek uzunluğu ve pikselden piksele dönüşümü belirleyin (282 piksel = 10 μm). Görüntü J'de ölçeği ayarlayın (Analiz > Ölçeği ayarlayın), piksel cinsinden Mesafeyi , gerçek uzunluğu, uzunluk birimini (μm) girin ve Global'i işaretleyin.
    2. Hücrelerin ana hatlarını çizmek için düzensiz bir şekil kullanın. Arka planı kaldırın (serbest seçimler, Düzenle > Dışını temizle). Hücrelerin toplam alanını ölçün (Analiz > Ölçüm).
    3. Çekirdeği kesin (Düzenle > Kes). Gri tonlamalı görüntüyü siyah beyaza dönüştürün (Görüntü > Türü > 8 bit).
    4. Doğru karbon partikül sayımı için her hücre boyamaya özgü gri tonlama değerini ayarlayın (Resim > Uygula, Analiz Et >> Ölçümü > > Eşiğini Ayarlayın).
    5. Ölçülen alana ve Image J yazılımındaki görüntü analizine dayalı olarak numune başına 50 makrofajın karbon içeriğini hesaplayın.

Sonuçlar

Fiksatif solüsyon ile korunan ve işlenen balgam, morfolojik inceleme sırasında optik mikroskop altında sağlam makrofaj morfolojisi gösterdi. Makrofajlar berrak, yuvarlak veya böbrek şeklinde, kolayca boyanabilir hücre çekirdekleri sergiledi. Boyamayı takiben, hücre çekirdeği mavimsi-mor görünürken, sitoplazma açık pembe veya açık mavi idi. Mikroskobik alan, kolay hücre tanımlamasını kolaylaştıran minimal safsızlıklar gösterdi. Hücrelerin içinde, siyah karbon parçacıkları küçük agregalarda belirgin bir şekilde görülebiliyordu ve bu da karbon parçacıklarının kantitatif analizini mümkün kılıyordu.

Balgam makrofajlarının temsili görüntüleri, farklı hücrelerde değişen sayıda karbon partikülünü gösteren Şekil 1'de sunulmuştur. Örneğin, Şekil 1A'da karbon parçacıkları gösterilmezken, Şekil 1D en yüksek konsantrasyonu gösterir. Makrofajlar (A-D) için KKAM değerleri sırasıyla %0.00, %2.24, %6.64 ve 4.61 olarak ölçüldü. CCAM parametre belirleme süreci sırasında, makrofaj boyutundaki değişikliklerden ve karbon parçacıklarının hücre çekirdeği ile örtüşmesinden kaynaklanan önyargıları azaltmak için her makrofajdaki karbon içeriğinin nicel bir değerlendirmesi yapılmıştır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, çalışma deneği başına 50 makrofaj için CCAM hesaplaması ve analizi yapıldı.

Çalışma, maruz kalan grup olarak belirli bir asetilen karbon siyahı fabrikasından karbon siyahı paketleyicilerini (CBP) seçti ve kontrol grubu (CBP olmayan) olarak zararlı faktörlere belirgin bir mesleki maruziyeti olmayan yerel su tesislerinden su pompası işçilerini işe aldı. Şekil 2'de sunulan sonuçlar, karbon siyahı ambalaj çalışanlarında kontrol grubuna kıyasla daha yüksek bir CCAM'ye işaret etmektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Hava yolu makrofajları içindeki karbon parçacıklarını gösteren optik mikroskobik görüntü. Sitoplazmadaki siyah renk karbon parçacıklarını temsil eder. Paneller (AD), her biri farklı seviyelerde CCAM sergileyen hava yolu makrofajlarının temsili görüntülerini gösterir. (A-D)'deki makrofajlar için CCAM değerleri sırasıyla %0.00, %2.24, %6.64 ve 4.61 idi. En yüksek KKAM düzeyi (D) de gözlendi. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Popülasyondaki CCAM'ın kantitatif seviyeleri. Elli sitoplazmik olarak sağlam ve iyi boyanmış makrofaj, çalışma deneği başına analiz ve miktar tayini için rastgele seçildi. Veriler Student t-testi: *P < 0.05 kullanılarak analiz edildi. CBP: karbon siyahı paketleyiciler; CBP olmayan: kontrol grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, atmosferik partikül maddeye dahili maruziyet için biyolojik bir belirteç olarak indüklenmiş balgamdan türetilmiş CCAM'ın kullanılması için ayrıntılı bir deneysel protokol sunmaktadır. CCAM, optik mikroskopi ile tespit edilebilir ve ölçülebilir, bu da sağlık etkileri ile ilişkiyi yansıtan hassas bir dahili maruziyet biyobelirteç görevi görür. Bu nedenle, metodolojik prosedürleri standartlaştırmak için uygun, güvenilir ve verimli bir indüklenmiş balgam koruma yöntemi ve bir CCAM kantifikasyon yöntemi oluşturmaya ve optimize etmeye ihtiyaç vardır.

Akciğer makrofajlarının karbon içeriğinin belirlenmesi, akciğer makrofajlarının toplanması, smearing, boyama, fotoğraflama ve görüntü analizi dahil olmak üzere çeşitli adımları içerir. Şu anda, akciğer makrofajlarını toplamak için iki yöntem vardır: indüklenmiş balgam ve akciğer lavajı, her birinin kendi avantajları ve sınırlamaları vardır 18,19. Akciğer lavajı birçok homojen akciğer makrofajı verebilir, ancak anestezi ve diğer tıbbi durumlar gerektiren travmatik bir örnekleme yöntemidir. Bu nedenle, büyük ölçekli genel popülasyon örneklemesi için uygun değildir. Buna karşılık, indüklenmiş balgamın gerçekleştirilmesi kolaydır, invaziv değildir ve genel popülasyonun büyük ölçekli örneklemesi için uygundur. Ayrıca tekrarlanan numunelerin elde edilmesine de izin verir. Akciğer lavajı makrofajları alveollerden veya distal bronşiyollerden elde ederken, indüklenmiş balgam hava yollarından kaynaklanabilecek makrofajları elde eder. Bu çalışmada Avrupa Solunum Derneği20 tarafından yayınlanan standart protokole uygun olarak indüklenmiş balgam çıkarıldı.

İndüklenmiş balgamın başarı oranı, nebulize inhale salin salin konsantrasyonu ve hastada solunum yolu hastalıklarının varlığı dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden etkilenir 21,22,23. Balgam numuneleri ayrıca tükürük içerebilir, bu da makrofaj karbon içeriğinin ölçülmesine müdahale edebilir ve potansiyel olarak numunedeki hava yolu makrofajlarının sayısını azaltır24. Bu çalışmadaki operasyonel prosedürler standardize edilmiş, yöntemler basit ve tekrarlanabilirliği yüksekti. Nebulize inhalasyon akış hızının büyüklüğü, indüksiyon süresinin yeterliliği, indüksiyon sırasında aralıkların varlığı gibi faktörlerin indüklenen balgamın başarı oranını etkilediği görülmüştür. Bu hususlar, partikül madde maruziyeti için bir biyobelirteç olarak CCAM'ın doğru ve güvenilir ölçümünü sağlamak için önemlidir.

%50 etanol ve %2 polietilen glikolden oluşan Saccomanno fiksatif solüsyonu, tipik olarak bronkoalveoler lavaj sıvısı gibi biyolojik numuneleri korumak için bir fiksatif olarak kullanılır. Bu çalışmada ilk kez epidemiyolojik saha incelemelerinden elde edilen balgamın korunması için bu fiksatif solüsyon kullanılmıştır. Sonuçlar, berrak kanser hücresi yaymaları25 elde etmek için sabahları balgam hücrelerinin korunmasına benzer şekilde, makrofajlarda daha sonraki karbon miktarını karşıladı. Operasyonel prosedürler standartlaştırıldı, yöntemler basitti ve tekrarlanabilirlik yüksekti. Bu çalışmada indüklenmiş balgam korumanın avantajları şunları içerir: (1) Fiksatifin kolay konfigürasyonu, (2) büyük ölçekli epidemiyolojik araştırmalar için uygun olan koruma için soğutmaya gerek yoktur ve (3) numuneler ışıktan uzak, serin bir yerde korunabilir. Boyamadan sonra mikroskop altında, tanımlanabilir çekirdekler, minimum safsızlıklar ve tam hücre morfolojisi ile net görünüm. Bu da morfolojik açıdan direkt balgam çıkarma ve smear uygulamasından üstündür26.

Deneysel yöntemlerle ilgili olarak, aşağıdaki ayrıntılara dikkat çekildi: Balgam, sindirim sırasında 37 ° C'lik bir su banyosunda tamamen sıvılaşana kadar periyodik olarak çalkalandı. Sıvılaştırmadan sonra, daha net boyama arka planı için safsızlıkları gidermek için santrifüjlemeden önce 70 μm'lik bir membran üzerinde filtrasyon yapıldı. Hücresel çökeltiler, slaytlar üzerine bulaşmadan önce tekrar DPBS ile yıkandı. Boyama sırasında slaytlar akan su ile yıkanarak fazla sıvı uzaklaştırıldı. Kalıntıyı önlemek için boya I ve leke II arasında sürgü tutucular değiştirildi. Fotoğrafçılık için, tam morfolojiye ve iyi boyanmaya sahip makrofajlar rastgele seçildi ve bu da CCAM kantitasyonunu etkiledi27.

Bu çalışma için kantitatif analiz yazılımı seçenekleri arasında Image SXM ve Image J28 bulunmaktadır. Görüntü SXM, doğruluğu artırmak için analizden önce manuel görüntü düzenleme gerektirir ve bu da gereken süreyi önemli ölçüde uzatır. Aynı zamanda tek bir hücre tipinin işlenmesiyle sınırlıdır. Buna karşılık, bu çalışmada kullanılan Image J yazılımı, görüntü işlemede daha iyi özgüllük ve daha geniş uyumluluk sunar. Diğer disiplinlerde, floresan etiketli hücrelerin seçimi ve müteakip analizi için yüksek içerikli tarama mikroskobu yöntemleri kullanılmış ve otomatik yüksek verimli işlemler elde edilmiştir. Metodolojik araştırmanın gelecekteki yönü, balgam ve tarama prosedürlerinde makrofajların otomatik olarak etiketlenmesini içerebilir29. Görüntü J işleme sırasında, CCAM ölçümünü etkileyen faktörler arasında ölçüm cihazının numune bilgileri hakkındaki bilgisi ve gri tonlama değeri eşiklerinin belirlenmesi yer alır. Kör bir yaklaşım benimsemek, gözlemci yanlılığını azaltabilir ve tekrarlanabilirliği değerlendirmek için bazı örneklerin tekrar tekrar ölçülmesi gerekebilir. Üst düzey uzmanlığa sahip iki kişi tarafından bağımsız görüntü yakalama ve analiz, makrofaj tanımlamasının doğruluğunu artırabilir.

Çalışma, deneklerin mesleki partikül maddelere maruz kalmasını değerlendirmek için Ulusal Mesleki Güvenlik ve Sağlık Enstitüsü'nün (NIOSH) standart yöntemlerini kullandı. Karbon siyahı paketleme alanında ve kontrol grubu su tesisi çalışanlarının çalışma alanlarında ince partikül madde (PM2.5) seviyeleri ve PM2.5 ile ilişkili elementel karbon (EC) içeriği hakkında çoklu değerlendirmeler yapılmıştır. Karbon siyahı (CB) partiküllerinin %99,6'ya kadarı 2,5 μm'den daha küçük bir aerodinamik çapa sahipti ve %96,7'si 1,0 μm'den daha küçüktü. 2012 sonbaharında, CB paketleme tesisindeki ortalama PM2.5 seviyesi metreküp başına 800 mikrogram iken, PM2.5 ile ilişkili EC seviyesi metreküp başına 657.0 mikrogram30,31 idi. 2018 sonbaharında, CB'nin geometrik ortalaması 637.4 μg/m3 ve PM2.5 ile ilişkili EC seviyesi 364.6 μg/m3 idi. Her iki gözlemde de, EC / TC oranı% 92.5'i aştı, bu da CB'nin neredeyse saf EC olduğu gerçeğiyle tutarlı olarak. Bu nedenle, bu çalışmadan, makrofajlardaki karbon parçacıklarının esas olarak karbon siyahına maruz kalmaktan türetildiği sonucuna varılabilir30,31. Sonuç olarak, bu çalışmada karbon siyahına maruz kalan popülasyonun çalışma ortamındaki PM2.5 konsantrasyonu 637.4 μg/m3 olup, kontrol popülasyonunun çalışma ortamındaki PM2.5 konsantrasyonundan (130.0 μg/m3) önemli ölçüde daha yüksek ve kontrol popülasyonununkinden yaklaşık beş kat daha yüksektir. Karbon siyahına maruz kalan popülasyondaki elementel karbon seviyeleri, kontrol popülasyonundaki 2.0 μg/m3'ten çok daha yüksek olan 364.6 μg/m3 idi.

Özetle, bu çalışmada numune toplamak, akciğer makrofajları elde etmek, hücre yaymaları yapmak ve her birey için makrofaj karbon içeriği seviyesini temsil etmek için medyan sayıyı kullanarak 50 makrofaj içindeki karbon içeriğini ölçmek için hipertonik salin kaynaklı balgam kullanılmıştır. Bu araştırma metodolojisi, büyük ölçekli popülasyon örnekleri için uyarlanabilir ve bir bireyin partikül maddeye dahili maruz kalma düzeyini doğru bir şekilde değerlendirmek için kullanılabilir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82273669, 82241086, 42207488), Shandong Eyaleti Taishan Bursiyerleri Programı (No. tsqn202211121) ve Shandong Eyaleti Yüksek Öğretimin Mükemmel Genç Akademisyenleri için İnovasyon ve Teknoloji Programı (2022KJ295) tarafından mali olarak desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3 mL steril pipetShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD84202ES03
50 mL santrifüj tüpüThermo Fisher Scientific, ABD339652
Mutlak etil alkolSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD64-17-5
Sedir yağıShanghai McLean Biochemical Technology Co., LTDC805296
Diferansiyel hızlı boyama çözümŞangay YEASEN Biyoteknoloji A.Ş., LTD40748ES76
DitiyotreitolSolebo Bio Co., LTDD8220
Duchenne fosfat tamponu (DPBS)Thermo Fisher Scientific, ABD14190144
Mikroskop kamerasıJaponya Olympus CorporationDP72
Nötr ağaç sakızıSolebo Bio Co., LTDG8590
Naylon filtre membranı 70umBD Falcon Bioscience, ABD211755
Optik mikroskopJaponya Olympus CorporationBX60
Polietilen glikolSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD25322-68-3
UltrasantrifüjThermo Fisher Scientific, ABDSL40R
Viskoz slaytJiangsu SHitAI DENEYSEL Equipment Co., LTD
188105

Kaynaklar

  1. Münzel, T., et al. Environmental stressors and cardio-metabolic disease: part I-epidemiologic evidence supporting a role for noise and air pollution and effects of mitigation strategies. Eur Heart J. 38 (8), 550-556 (2017).
  2. Guarnieri, M., et al. Lung function in rural Guatemalan women before and after a chimney stove intervention to reduce wood smoke exposure: results from the randomized exposure study of pollution indoors and respiratory effects and chronic respiratory effects of early childhood exposure to respirable particulate matter study. Chest. 148 (5), 1184-1192 (2015).
  3. Khomenko, S., et al. Premature mortality due to air pollution in European cities: a health impact assessment. Lancet Planet Health. 5 (3), e121-e134 (2021).
  4. Kulkarni, N., Pierse, N., Rushton, L., Grigg, J. Carbon in airway macrophages and lung function in children. N Engl J Med. 355 (1), 21-30 (2006).
  5. Krzyzanowski, M. WHO air quality guidelines for Europe. J Toxicol Environ Health A. 71 (1), 47-50 (2008).
  6. Cohen, A. J., et al. Estimates and 25-year trends of the global burden of disease attributable to ambient air pollution: An analysis of data from the Global Burden of Diseases Study 2015. Lancet. 389 (10082), 1907-1918 (2017).
  7. Hajat, A., et al. The association between long-term air pollution and urinary catecholamines: Evidence from the multi-ethnic study of atherosclerosis. Environ Health Perspect. 127 (5), 57007(2019).
  8. Traffic-related air pollution: A critical review of the literature on emissions, exposure, and health effects. , Available from: https://www.healtheffects.org/publication/traffic-related-air-pollution-critical-review-literature-emissions-exposure-and-health (2010).
  9. Uccelli, R., et al. Female lung cancer mortality and long-term exposure to particulate matter in Italy. Eur J Public Healt.h. 27 (1), 178-183 (2017).
  10. Zhang, L., et al. Indoor particulate matter in urban households: sources, pathways, characteristics, health effects, and exposure mitigation. Int J Environ Res Public Health. 18 (21), 11055(2021).
  11. Wang, K., Zeng, R. Cough and expectoration. Handbook of Clinical Diagnostics. , 27-29 (2020).
  12. Qi, Y., et al. Passage of exogeneous fine particles from the lung into the brain in humans and animals. PNAS. 119 (26), e2117083119(2022).
  13. Comunian, S., Dongo, D., Milani, C., Palestini, P. Air pollution and COVID-19: The role of particulate matter in the spread and increase of COVID-19's morbidity and mortality. Int J Environ Res Public Health. 17 (12), 4487(2020).
  14. Sharma, J., et al. Emerging role of mitochondria in airborne particulate matter-induced immunotoxicity. Environ Pollut. 270, 116242(2021).
  15. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  16. Kupiainen, K., Klimont, Z. Primary emissions of fine carbonaceous particles in Europe. Atmos Environ. 41 (10), 2156-2170 (2007).
  17. Tueller, C., et al. Value of smear and PCR in bronchoalveolar lavage fluid in culture positive pulmonary tuberculosis. Eur Respir J. 26 (5), 767-772 (2005).
  18. Takiguchi, H., et al. Macrophages with reduced expressions of classical M1 and M2 surface markers in human bronchoalveolar lavage fluid exhibit pro-inflammatory gene signatures. Sci Rep. 11 (1), 8282(2021).
  19. Andelid, K., et al. Lung macrophages drive mucus production and steroid-resistant inflammation in chronic bronchitis. Resp Res. 22 (1), 172(2021).
  20. Weiszhar, Z., Horvath, I. Induced sputum analysis: Step by step. Eur Respiratory Soc. 9, 300-306 (2013).
  21. Popov, T., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis. Eur Respir J. 8 (4), 559-565 (1995).
  22. Sumner, H., et al. Predictors of objective cough frequency in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 187 (9), 943-949 (2013).
  23. Brugha, R. E., et al. Carbon in airway macrophages from children with asthma. Thorax. 69 (7), 654-659 (2014).
  24. Simpson, J. L., Timmins, N. L., Fakes, K., Talbot, P. I., Gibson, P. G. Effect of saliva contamination on induced sputum cell counts, IL-8 and eosinophil cationic protein levels. Eur Respir J. 23 (5), 759-762 (2004).
  25. Risse, E. K., Van't Hof, M. A., Laurini, R. N., Vooijs, P. G. Sputum cytology by the Saccomanno method in diagnosing lung malignancy. Diagn Cytopathol. 1 (4), 286-291 (1985).
  26. Eells, T. P., Pratt, D. S., Coppolo, D. P., Alpern, H. D., May, J. J. An improved method of cell recovery following bronchial brushing. Chest. 93 (4), 727-729 (1988).
  27. Bai, Y., et al. Mitochondrial DNA content in blood and carbon load in airway macrophages. A panel study in elderly subjects. Environ Int. 119, 47-53 (2018).
  28. Jary, H., Rylance, J., Patel, L., Gordon, S. B., Mortimer, K. Comparison of methods for the analysis of airway macrophage particulate load from induced sputum, a potential biomarker of air pollution exposure. BMC Pulm Med. 15, 1-9 (2015).
  29. Gilbert, D. F., Meinhof, T., Pepperkok, R., Runz, H. DetecTiff: A novel image analysis routine for high-content screening microscopy. J Biomol Screen. 14 (8), 944-955 (2009).
  30. Dai, Y., et al. Effects of occupational exposure to carbon black on peripheral white blood cell counts and lymphocyte subsets. Environ Mol Mutagen. 57 (8), 615-622 (2016).
  31. Cheng, W., et al. Carbon content in airway macrophages and genomic instability in Chinese carbon black packers. Arch Toxicol. 94 (3), 761-771 (2020).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Partikül Madde MaruziyetiBalgam ToplamaSitoplazma Karbon KantifikasyonuIşık MikroskobuHücre BoyamaImageJ Analiziİndüklenmiş BalgamBiyobelirteç Ölçümü
Karbon İçeren Partikül Maddelere Maruz Kalan Hava Yolu Makrofajlarındaki Karbon İçeriğinin Ölçülmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.