Ultrafast Doppler Ultrason Kullanılarak Farelerin Hepatik Vaskülatürünün Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Özet

Yüksek uzamsal çözünürlüğe (100 μm) ve duyarlılığa sahip ultra hızlı Doppler ultrason (UFUS), hepatik vaskülatür hakkında kapsamlı bir kalitatif genel bakış elde etmek için uygun bir noninvaziv görüntüleme modalitesini temsil eder. UFUS ayrıca vasküler hastalık mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı geliştirmeyi amaçlayan mikrovasküler sistemin kantitatif ölçümlerini de kolaylaştırır.

Özet

Vaskülatür non-invaziv in vivo görüntüleme, kemirgenlerde hastalık mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araçtır. Doppler ultrason yöntemleri kullanılarak mikrovasküler sistemin yüksek duyarlılıkta görüntülenmesi için ultra hızlı görüntüleme kavramını kullanan görüntüleme yöntemleri tercih edilir. Ultrason tarayıcının kare hızını saniyede binlerce kareye çıkararak, kan akışının hassasiyetini 2 mm/s'ye kadar iyileştirmek ve geleneksel Doppler modlarında yaklaşık 1 cm/s'lik bir hassasiyete kıyasla mikrosirkülasyon hakkında işlevsel bilgiler elde etmek mümkün hale gelir. Ultra hızlı Doppler ultrason (UFUS) görüntüleme, nörovasküler eşleşme yoluyla beyin aktivitesini yakalayabildiği sinirbilimde benimsenmiş olsa da, solunumla bağlantılı daha büyük hareketler nedeniyle karın organlarının damar sistemini görüntülerken daha büyük zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Anatomik olarak diyaframın altına yerleştirilen karaciğer, özellikle düzlem dışı harekete ve salınımlı solunum hareketine karşı hassastır. Bu artefaktlar sadece Doppler görüntülemeyi olumsuz etkilemekle kalmaz, aynı zamanda vasküler yapıların anatomik analizini ve vasküler parametrelerin hesaplanmasını da zorlaştırır. Burada, UFUS ile farelerde hepatik vaskülatür için kalitatif ve kantitatif bir görüntüleme analizi sunuyoruz. Başlıca anatomik vasküler yapıları tanımlıyoruz ve hepatik makroskopik anatominin grafiksel çizimlerini sağlıyoruz ve bunu Doppler okumalarına dayalı olarak hepatik vaskülatür sisteminin derinlemesine anatomik bir değerlendirmesiyle karşılaştırıyoruz. Ek olarak, zaman içinde mikrovaskülatür hepatik kan hacminin sağlam ölçümleri için bir miktar belirleme protokolü geliştirdik. Daha fazla araştırmayı düşünmek için, kalitatif vasküler analiz kapsamlı bir genel bakış sağlar ve karaciğer hastalığının fare modelleriyle çalışan araştırmacılar için standart bir terminoloji önerir. Ayrıca, doku kesitlerinde ex vivo boyama kullanarak mikron ölçeğinde kan damarı anomalilerini çözmeden önce karaciğer vasküler defektlerini in vivo olarak incelemek ve organın derinliklerindeki fonksiyonel mikrovasküler değişiklikleri ölçmek için non-invaziv tamamlayıcı bir yöntem olarak ultrason uygulama fırsatı sunar.

Giriş

Klinik öncesi fare modelleri, hepatik mikrovasküler hastalığın başlangıcını ve ilerlemesini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır ^1,2. Uzunlamasına takip avantajlıdır, çünkü kan kılcal damar değişiklikleri, inflamasyon ve fibroz ortaya çıkmadan önce hastalığın erken bir aşamasında meydana gelir ve bu da zamanla sirozla sonuçlanabilir¹. Hastalığın ilerlemesini araştırmak için, kan damarı fonksiyonunu in vivo olarak görselleştirmek ve ölçmek için güçlü görüntüleme araçları gereklidir. Ultra hızlı Doppler ultrason (UFUS), düşük maliyeti, taşınabilirliği, basitliği ve gerçek zamanlı kabiliyeti nedeniyle değil, aynı zamanda non-invaziv ve zaman kazandıran bir prosedür olması nedeniyle uygun bir modaliteyi temsil eder³. Benzer bir uzamsal çözünürlüğe ulaşabilen ancak büyük kan akışıyla sınırlı olan geleneksel Doppler ultrason ile karşılaştırıldığında, UFUS, 1 cm/s'den 2 mm/s'ye kadar yavaş kan akışının tespit edilmesine izin vererek, çok daha küçük damarların katkısını araştırmaya izin verir⁴. UFUS, kare hızını ve dolayısıyla mevcut ultrason görüntülerinin sayısını artırmak için tek bir insonifikasyonda geniş bir görüş alanına sahip düzlem dalga iletimleri yoluyla gerçekleştirilen hassasiyeti iyileştirir⁵. Temporal numune sayısının yüksek olması, dokudan gelen sinyalin iptalini iyileştirir ve kan dağıtıcılardan yansıyan yankıların tespitini geliştirerek, kontrast madde gerektirmeden hassasiyeti artırır⁶. Güç Doppler tahmini yoluyla kan dağıtıcı yankılarının enerjisi tahmin edilerek, görüntü^7'de kan damarları çözülemeyecek kadar küçük olsa bile her pikseldeki kan hacmiyle orantılı bir miktar elde edilir.

UFUS, uzamsal ve zamansal çözünürlüğün uygun bir kombinasyonunu sunarak, karaciğer vasküler mimarisinin kalitatif değerlendirmesi için uygun bir araç haline getirir. Bir ultrason tarayıcısını çalıştırmak nispeten basit olsa da, farelerde farklı karaciğer loblarının hepatik damar sisteminde gezinmek için karaciğer anatomisinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması gerekir. Son çalışmalar, 3D mikro bilgisayarlı Tomografi (μ-BT) kullanarak murin karaciğer anatomisini ve hepatik vasküler ağacı tanımlamaya ^{odaklanmıştır8,9}. İnsan ve fare karaciğerleri arasındaki morfolojik farklılıkların bir kısmı iyi belgelenmiş olsa da¹⁰, kemirgenlerde yapılan araştırmalar genellikle insanlarla ilgili anatomik terminolojileri benimser ve bu da dört ayaklı hayvanlar bağlamında bazı karışıklıklara yol açar. Nomina Anatomica Veterinaria (NVA) gibi tanınmış standartlaştırılmış isimlendirme bile, kemirgen hepatik vasküler yapıları için tutarlı terminolojiler hakkında yeterli bilgiye sahip değildir¹¹. Kemirgenlerde yetersiz belgelenmiş anatomik yapıların zorluğunun ötesinde, özellikle tekrarlanabilir bir yaklaşım beklendiğinde, ultrason okumalarının yorumlanmasında daha da büyük zorluklar ortaya çıkmaktadır.

Çeşitli uzamsal ölçeklerde canlı organlar hakkında non-invaziv fonksiyonel bilgi elde etmek, in vivo görüntüleme için zorluklar doğurur³. BT, manyetik rezonans görüntüleme ve anjiyografi (MRI/MRA) gibi üst düzey karaciğer görüntüleme yöntemleri veya odaklanmış dalgalar kullanan geleneksel Doppler görüntüleme, hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için gereklidir, ancak fotoakustik görüntüleme dışında çoğu kan akış dinamiğini yakalamada başarısız olurlar 12,13,14. UFUS yüksek bir hassasiyete sahiptir ve saniyede bir santimetreden daha büyük akışla sınırlı olmayan küçük damarlardaki yavaş kan akışını tespit edebilir ^4,15. Son zamanlarda, UFUS kullanarak anatomik hususlara dayalı özelleştirilmiş bir görüntüleme yöntemi geliştirdik ve vasküler genişleme¹⁶ olan bir fare modelinde hepatik kan hacminin güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağladık.

Bu protokolde, orijinal olarak fonksiyonel beyin görüntüleme için geliştirilmiş, ticari olarak temin edilebilen bir ultrason platformu kullanarak karaciğerin non-invaziv UFUS görüntülemesi prosedürünü özetliyoruz. Süreci kolaylaştırmak ve bilgi alımını geliştirmek için, anatomik isimlendirme ve eksiksiz bir analiz yöntemi ile fare karaciğerinin kapsamlı bir resmini sunuyoruz. Ek olarak, operatöre bağlı düzlem seçimine yardımcı olmak için ortak anatomik yapıları ve yer işaretlerini gösteren bir referans olarak, elde edilen görüntüleme okumalarının ayrıntılı bir temsilini sunuyoruz. Ayrıca, hepatik vaskülatür sisteminin hem kalitatif hem de kantitatif analizlerinin ilgili bir örneğini ekliyoruz.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Avrupa mevzuatı (Direktif 2010/63/EU) ve Hollanda hükümet yönergeleri uyarınca gerçekleştirildi ve Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı.

1. UFUS görüntüleme için fare hazırlığı (Zamanlama ~ 10 dk)

1. Görüntüleme düzeneğinin hazırlanması
   1. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için ultrason iletim jelini 50 mL'lik tüplerde 100 x g'da 3-5 dakika santrifüjleyin.
   2. Isıtma yastığını açın ve 35 °C'ye kadar ısıtın. 3D baskılı su haznesini deiyonize su ile doldurun.
      NOT: Suda bulunan su kabarcıkları veya küçük parçacıklar Doppler ölçümünü bozabilir.
2. Hayvanın uyuşturulması
   1. Hayvanı tartın. 8-16 haftalık ve vücut ağırlığı 19-32 g olan erkek ve dişi çöp arkadaşları kullanıldı. % 0.9 NaCl içinde 100 mg / kg ve Xylazine 10 mg / kg uygulama dozu ile Ketamin anestezi karışımı hazırlayın. Karışımı her gün steril ve taze olarak hazırlayın, çünkü karışım stabil değildir ve gücünü kaybedebilir.
      NOT: Tercih edilen hayvan canlı ağırlığı 23-30 g arasındadır.
   2. Enjeksiyon bölgesini, yani karnın alt sağ veya sol kadranını gazlı bez ve% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin. 27G iğne ve 1 mL tek kullanımlık şırınga veya 30G insülin şırıngası ile 10 μL / g vücut ağırlığı intraperitoneal (ip) enjekte edin.
   3. Hayvanı, kafes kapağını kapatmadan bir ısıtma yastığı üzerindeki bir kafese geri yerleştirin. Zamanlayıcıyı başlatın.
      NOT: Derin anestezi yaklaşık 40 dakika sürmelidir. Daha uzun bir görüntüleme seansı isteniyorsa,% 0.9 NaCl'de Ketamin 60 mg / kg ve Medetomidin 0.4 mg / kg karışımları gibi geri dönüşümlü anestezi kullanmayı düşünün ve ardından 1 mg / kg deri altı Atipamezol enjeksiyonu ile tersine çevirin. Görüntüleme düzeni nedeniyle inhalasyon anestezisi yerine enjeksiyon anestezisi tercih edilir.
   4. Anestezinin etkinliğini kontrol edin. Yaklaşık 5 dakika sonra arka pençeleri hafifçe sıkıştırarak anestezinin işe yarayıp yaramadığını onaylayın. Hayvan hala tepki veriyorsa, tam anestezi elde etmek için 2-3 dakika daha bekleyin.
   5. Hayvan derin uykudayken kornea kurumasını ve göz travmasını önlemek için oftalmik merhem sürün. Refleksleri tekrar kontrol edin ve işleme sadece hayvan çimdiklemeye tepki göstermediğinde başlayın.
3. Görüntüleme alanının hazırlanması (Şekil 1)
   1. Hayvanın karnını, bir ısıtma yastığına yerleştirilirken bir veteriner düzeltici ile nazikçe kesin. Göğüs veya karın bölgesine kompresyon uygulamadan kırpma işlemini çok nazikçe gerçekleştirin.
   2. Tüy dökücü kremi en fazla 2 dakika uygulayın.
      DİKKAT: Cilt iltihabına neden olabileceğinden tüy dökücü kremin kuluçka süresini uzatmayın. Bu sadece görüntüleme kalitesini etkilemekle kalmaz, aynı zamanda hayvan için rahatsızlığa da neden olabilir.
   3. Tüy dökücü kremi biraz kağıt mendille çıkarın ve ılık suyla nazikçe temizleyin.
4. Doppler ölçümleri için hayvanı ve görüntüleme kurulumunu konumlandırın (Şekil 2A).
   1. Hayvanı dorsal olarak bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve pençeleri bant kullanarak nazikçe sabitleyin. Cildi az miktarda ılık suyla nemlendirin.
   2. Santrifüjlenmiş ultrason iletim jelini 20 mL'lik bir şırınga kullanarak doğrudan traş edilmiş cilde uygulayın.
      NOT: Hava kabarcıkları Doppler görüntülemeyi etkileyebilir ve artefaktlara neden olabilir.
   3. Su ile dolu 3D baskılı su tankını hayvanın üzerine yerleştirin. Su tankının yüksekliğinin hayvan için uygun, yaklaşık 1 mm üzerinde olduğundan ve hayvanı sıkmadığından emin olun.
   4. Ultrason iletim jeli ile su tankının Polimetilpenten termoplastiği (PMP) arasında hava olup olmadığını kontrol edin.

2. Prob çalışması ve düzlem seçimi (Zamanlama ~ 10 dk)

1. Yazılımı başlatın ve sistem üzerinde deneysel bir oturum oluşturun. Tarama yazılımını başlatın.
   NOT: Tarama yazılımı sisteme entegre edilmiştir.
2. Açılır pencerede Evet'e tıklayarak motorları ortalayın. Tarama yazılımı ile probu uzaktan kontrol etmek için motorlu bir sistem kullanılır. Motorları merkezleyerek, prob otomatik olarak üç yönde, yani dikey, yanal ve döndürülmüş olarak hareket edecektir. Ekipmana zarar vermemek için hiçbir nesnenin probun yörüngesini engellemediğinden emin olun.
   NOT: Motorları ortalamak çok önemlidir; Bunun yapılmaması, yazılımın işlev bozukluğuna neden olabilir.
3. Menüden Oturum'u seçerek yeni bir deneysel oturum oluşturun. Proje, Konu, Oturum, Kullanıcı Adı, Yorum ve Etiket dahil olmak üzere oturum panelinde gerekli bilgileri doldurun. Doğrula'yı tıklayın.
   NOT: Görüntü, görüntüleme verileri alınmadan veya kaydedilmeden önce oluşturulmalıdır. Oturum bilgileri deneme sırasında değiştirilebilir, ancak bunun veri kaydetme hedefini de değiştireceğini unutmayın.
4. Probu konumlandırın. 128 elemanlı lineer 15 MHz ultrasonik prob, dört eksenli bir motor modülünden, yani üç öteleme ve bir dönme hareket yönünden oluşan motorlu bir sistem aracılığıyla sisteme bağlanır.
   1. Probu hareket ettir menüsüne gidin ve probu 3D baskılı su tankındaki suya taşımak için bilgisayar kontrollü konumlandırma sistemini kullanın. Motorları hareket ettirmek için Prob konumunda belirtilen kontrol düğmelerini kullanın, öteleme hareketi (X, Y ve Z) için adımları mm cinsinden veya dönme hareketi (R) için ° cinsinden tanımlayın. Z yönündeki kazaları önlemek için Güvenlik'te Z sınırını tanımlayın.
      NOT: Probun elemanlarının su ile temas halinde olması çok önemlidir. Ancak, ekipmana zarar verebileceğinden probu tamamen suya sokmaktan kaçının. Motorlar konuma ulaşamazsa, Çalışma alanı dışında uyarısı görüntülenir.
   2. Ana Sayfayı Ayarla'ya tıklayarak koordinatları referans konum olarak kaydedin. R, X, Y ve Z'ye göre olduğu için çevirileri ve dönüşleri aynı anda değiştirmeyin. R'yi değiştirmeden önce her zaman Ana Sayfayı Ayarla'ya tıklayın.
   3. Görüntüleme ve görselleştirme parametrelerini tanımlayın. Canlı görüntü menüsüne gidin ve ilgilendiğiniz uçağı seçmek için Oynat'a tıklayın.
      DİKKAT: Ekipmanın ömrünü sağlamak ve aşırı ısınmayı önlemek için ultrason probunun elemanları akustik empedansa uygun bir ortamla çevrelendiğinde yalnızca bir Canlı görüntü veya bir çekim başlatın.
5. Ön Ayar'da görüntüleme parametrelerini seçin.
   1. Yükleme Sırası düğmesiyle 10 ms'lik bir Doppler ultra hassas ultrason dizisi, örneğin 25 V'luk bir görüntüleme voltajı ve 10 ms'lik bir Doppler kare hızına sahip 11 bileşik düzlem dalgası (-10° ila 10° arasındaki açılar) yükleyin.
      NOT: Analiz sırasında organın solunum hareketlerini görüntülemek ve filtrelemek için hızlı bir Doppler dizisi (örn. 10 ms) kullanmaya gerek yoktur.
   2. Maksimum görüntülenebilir derinlik 50 mm olmak üzere 1 mm ile 50 mm arasında görüntüleme derinliği tanımlayın. Varsayılan ayar, 9 mm ile 1 mm arasında bir derinlik ile 10 mm arasındadır ve önerilen derinlik 2 mm ile 12 mm arasındadır.
      NOT: Hayvanın ve su tankının boyutuna bağlı olarak, görüntüleme derinliği özel ihtiyaçlara göre uyarlanabilir.
6. Görselleştirme parametrelerini seçin.
   1. Damar sistemini görüntülemek için Doppler'i seçin.
      NOT: A.U.'daki piksel yoğunluğu kan hacmini temsil eder ve yalnızca aynı prob ve dizi kullanılırken karşılaştırılmalıdır.
   2. Sinyal-gürültü oranını optimize etmek için zamansal ortalama uygulamak için Ortalama'yı seçin.
      NOT: Görüntülerin geçici olarak ortalamasının alınması görüntü kalitesini artırır ancak kare hızını azaltır. Amaca bağlı olarak, uygun bir değiş tokuş yapılmalıdır.
   3. Görüntü sıkıştırma'yı seçin: Logaritmik (yüksek), Karekök (orta) veya Doğrusal (düşük). Alternatif olarak, yüksek ve düşük kontrast seçenekleri için kaydırıcıları kullanarak kontrast aralığını otomatik veya manuel olarak uyarlayın.
      NOT: Veriler, görüntü sıkıştırma seçiminden etkilenmez; yalnızca gerçek zamanlı görüntülemenin görüntülenmesini etkiler.
   4. Gri seçeneğini işaretleyerek Renk Eşlemi ölçeğini siyahtan beyaza veya Sıcak seçeneğini işaretleyerek kırmızımsı-siyahtan sarıya seçin.
7. Düzlem seçimi (Şekil 2B)
   1. Anatomik yer işaretleri üzerinde görüntüleme düzlemini seçin. Karaciğer, loblar ve damar sisteminin anatomisini tanımak için Doppler görselleştirmesi ve B modu arasında geçiş yapın.
   2. Durdur (Stop) simgesine tıklayarak Canlı görünümü durdurun.
   3. Proburada gezinmek için Probu hareket ettir menüsüne gidin ve koordinatları referans konumu olarak kaydetmek için Ana Sayfayı Ayarla'ya tıklayarak bir düzlem seçin. Vasküler ağacın iyi tanımlanmış ve mümkün olduğunca az düzlem dışı sinyalle görünür olduğundan emin olun.
   4. Menüye geri dön Canlı görüntü ve tıklayın dur simgesi.

3. Doppler taraması alımı (Zamanlama ~ 20 dk)

1. 10 ms kare hızıyla bir Doppler alımı başlatın.
   1. Belirli bir pozisyonda zaman içindeki hemodinamik değişimleri görüntülemek için fUS 2D menüsüne gidin (Şekil 3). Kontrastı arttırmak için, intravenöz olarak 50 μL'lik bir bolus uygulayın (iv) kuyruk damarına mL başına 2 x 10⁸ mikro kabarcık konsantrasyonunda enjekte edilen mikro kabarcıklar.
   2. Ön Ayar sekmesinde, toplam kayıt süresini saniye (30 sn) cinsinden tanımlayın. Görüntüler arasındaki süreyi 0 sn olarak ayarlayarak görüntüler arasında duraklama olmayan bir sürekli mod seçin.
   3. 2D alımını başlatmak için Kaydet düğmesine basın. Kayıt, Durdur düğmesine basılarak iptal edilebilir. Edinme işlemi tamamlanmadan önce kesintiye uğradığında veriler kaybolabilir.
2. Alınan kaydı görselleştirin ve uyarlayın.
   1. İsterseniz Görselleştirme'ye dokunun. Gerekirse, Zaman işlevine dahil olan kaydırıcı ile çerçeveler arasında gezinerek kaydı tekrar oynatın.
3. Verileri kaydedin.
   1. Dosyayı oturum klasörüne .scan biçiminde kaydetmek için alınan kayda bir ad girin. Verileri kaydetmek için bir açılır pencere, her kaydın sonunda otomatik olarak önerilir. Veriler otomatik olarak kaydedilir.
4. Ön Ayar sekmesine tıklayarak başka bir satın alma başlatın ve 3.1.1 adımından itibaren tekrarlayın.
5. Görüntüleme kurulumunu çıkarın ve hayvana iyi bakın.
   1. Probu 3D baskılı su deposunun dışına dikey olarak taşımak için Probu taşı taşı menüsüne gidin. Kurulumu ve ultrasonik jeli çıkarın ve hayvanı düzeltin.
   2. Deneysel tasarım son noktaya ulaştığında hayvana ötenazi yapın; Aksi takdirde, aşağıdaki adımlarla devam edin.
   3. Uzunlamasına ölçümler amaçlanıyorsa, hayvanın traşlı deri bölgesine bir miktar nemlendirici krem sürün.
   4. Hayvanı tekrar kafese yerleştirin ve hipotermiyi önlemek için bir ısı lambası altında anesteziden uyanmasına izin verin. İyileşirken hayvanı izleyin.
   5. Tekrar normal şekilde yürüdüğünde hayvanı ayrı ayrı havalandırılan kafes rafına geri yerleştirin. Veri setini analiz etmeden önce laboratuvar hayvan deneylerini bitirin.

4. Kantitatif analiz (Zamanlama ~ 1 saat)

1. Ek Dosya 1'de bulunan analiz komut dosyasını gui_analysis.m açın.
2. Taramayı seçin ve ayarlarda nicel parametreleri ayarlayın: 2 x 2 voksel boyutuna sahip 10 ilgi bölgesi (ROI). Doppler entegrasyonunu gerçekleştirmek için her kare için 40 ms seçin.
3. Organın vasküler çevresini çizin; 10 ROI, açıkça görülebilen arterler arasında otomatik olarak önceden konumlandırılır ve gerekirse manuel olarak ayarlanabilir (Şekil 4A). Konumlandırmadan memnun kaldığınızda kayan iletişim kutusunu kapatın. Sağlam kan hacmi hesaplaması için kararlı bir edinim sağlayın (Şekil 4B), güçlü hareket artefaktlarından etkilenen edinimlerden kaçının (Şekil 4C).
4. 30 s kayıt içindeki sessiz çerçeve değerlerinin ortalama ve standart sapmasını otomatik olarak tahmin ederek toplam 10 ROI'nin AU cinsinden ortalama hepatik kan hacmini ölçün (Şekil 4D).
   NOT: ROI'lerin yoğunluklarının veri tablosu doğrudan bir elektronik tablo dosyasına kopyalanabilir/yapıştırılabilir.
5. Analizi kaudal yönde -0,3 mm ve -0,6 mm olmak üzere en az iki ek düzlem için tekrarlayın. İstatistiksel analizi gerçekleştirmeden önce tüm edinme verilerini nicelleştirin.
6. Tüm görüntüdeki yoğunlukların standart sapmasını kontrol edin ve hareket artefaktlarına duyarlı ölçümleri objektif olarak dışlamak için 2 standart sapma (2σ) ile genel ortalama (μ) olarak bir kesme belirleyin (Şekil 4E).
   NOT: Tüm görüntü boyunca tahmin edilen sessiz kare değerlerinin ortalama ve standart sapması, veri tablosunun ilk satırında verilmiştir.
   DİKKAT: Hareket artefaktları sağlam nicelemeyi önler ve tüm zamansal görüntünün analizine dayalı olarak objektif olarak tanımlanmalıdır.
7. Adım 4.3'te hayvan başına 30 ROI'de 3 farklı düzlemde ölçülen tüm ortalama hepatik kan hacminin ortalamasını alın (Şekil 4F). Hayvan başına ortalama 30 ROI'den önce aykırı ROI'leri belirlemek için istatistiksel bir analiz yazılımında ROUT testini% 1 uygulayın. Kan hacminin tahminini iyileştirmek için, hayvan başına ek uçaklar kaydedin.
8. Araç tedavisini uygulamak için, enjeksiyon bölgesini, yani karnın alt sağ veya sol kadranını gazlı bez ve% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin. 27G iğne ve 1 mL tek kullanımlık şırınga veya 30G insülin şırıngası ile 20 μL salin veya DMSO ip enjekte edin veya yuvarlak uçlu yeniden kullanılabilir bir besleme iğnesi 30G kullanarak gavaj yoluyla 100 μL (Hidroksipropil) metilselüloz uygulayın. Selülozun ip veya oral uygulaması (po) ile salin veya DMSO alan 3 kohortun verilerini çizin (Şekil 4G). Durumu ve/veya alınan tedaviyi açıklamadan kör bir şekilde analiz yapın.
   NOT: Araç yönetiminin kan hacmi ölçümleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur.

Sonuçlar

Protokolü takiben, anatomik yapıların standardizasyonuna ve ilgili terminolojiye dayalı olarak hepatik vaskülatür görüntülemesi kolaylaştırılır (Şekil 1). Klinik öncesi karaciğer modellerini kullanan araştırmacılar için standart bir isimlendirme önermek için, farelerin karın boşluğundaki ortak karaciğer pozisyonunu şematik olarak gösterdik (Şekil 1A), farklı hepatik lobların yapısal düzenlemesini sağladık (Şekil 1B) ve arteriyel vasküler ağı belirledik (Şekil 1C). Anatomik uzmanlıkla donatılmış, in vivo UFUS görüntüleme, hareket artefaktlarını azaltmak için 3D baskılı bir su tankı kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 2A). Akustik empedans, probun suya sokulması ve ultrason iletim jelinin doğrudan hayvanın traş edilmiş derisine uygulanmasıyla düzeltildi. Bu kurulumu benimseyerek, prob hayvanın hareketli göğsü ve karnı ile doğrudan temas halinde olmadığı için solunum ve diğer hareket artefaktları azaltılır. Bu şekilde, yüzeysel konumları nedeniyle UFUS tarafından kolayca ulaşılabilen sağ ve sol lobların vasküler yapısını görselleştirdik (Şekil 2B). Kaudat ve kuadrat lob gibi diğer karaciğer lobları vücudun daha derinlerinde bulunur ve bu da hepatik vaskülatürü UFUS ile anatomik olarak düzgün bir şekilde tanımlamayı daha zor hale getirir.

Vasküler yapıların standartlaştırılmış ve yaygın olarak kabul edilen anatomik endikasyonlarının ve yorumlarının önemini gösterdikten sonra, farelerde kontrastlı UFUS ile görüntülenen hepatik vaskülatüre kapsamlı bir genel bakış sağlamak için çeşitli düzlemlerde çoklu Doppler taramaları gerçekleştirdik (Şekil 3). Tek tek karaciğer loblarının hepatik arteriyel ağını, yani sol lateral (LL), sol medial (LM), sağ lateral (RL) ve sağ medial (RM) lobları belirledik. Ayrıca, abdominal aort (AA), hepatik arter (HA), sol lateral hepatik arter (LLHA) ve sağ medial hepatik arter (RMHA) gibi ana arterler etiketlenir. Karaciğer loblarının, ince bağırsağın (SM) yerleşimine ve peristaltik hareketine ve ayrıca mide (S) dolgusunun durumuna bağlı olarak biraz farklı konumlandırılabileceğine dikkat etmek önemlidir. Tüm fare karaciğer damar sistemine ilişkin bu kontrastlı genel bakış, UFUS ile in vivo karaciğer görüntülemesi için kapsamlı bir vasküler atlas sağlar.

Bir karaciğer lobundan türetilen kantitatif bir okuma elde etmek için anatomik düzlemlerin doğru bir şekilde seçilmesi çok önemlidir. Sağlam kan hacmi ölçümleri, uçak başına 10 ilgi alanı (ROI) manuel olarak seçilerek elde edilebilir (Şekil 4A). Mikrosirkülasyonun güvenilir kan hacmi ölçümü için, ortalama görüntü yoğunluklarında düşük varyasyon ile stabil bir edinim gereklidir. Bu, önemli hareket artefaktlarına duyarlı bir kaydın (Şekil 4C) aksine, tüm görüntünün zaman içindeki ortalama görüntü değerine (MIV) dayalı olarak belirlenir (Şekil 4B). Hareket artefaktlarını ele almak için, tüm görüntünün tüm zamansal düşük MIV'sinin standart sapmasını çizerek hepatik kan hacmi ölçümlerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için otomatik düşük MIV seçimi kullanıldı (Şekil 4D). Hayvan başına birden fazla düzlemin Doppler taramaları, ROUT testi% 1 ile hayvan başına 30 ROI üzerinde aykırı değer tedavisinden sonra 3 farklı kohorttan fareler içinde ve arasında kabul edilebilir iç ve arası değişkenlik gösterir (Şekil 4F). Hayvan başına kan hacmi tahminini iyileştirmek için, ek düzlemlerin kaydedilmesi veya düzlem başına seçilen ROI sayısının artırılması önerilir. Ek olarak, kan hacmi ölçümleri, özellikle mikrovaskülatürü hedef alan ilaç tedavisini izlemek için kullanılabilir. Aracı iki uygulama yolu ile uygulayarak, hepatik kan hacmi ölçümleri üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterdik (Şekil 4G). Bu sonuçlar, gen silinmesinin veya tedavinin verilmesinin araç uygulamasından etkilenmediğini ve sağlam bir deneysel tasarım sağladığını göstermektedir. Genel olarak, çeşitli fare modellerinde hepatik vasküler kusurları araştırmak için gelecekteki araştırmalar için objektif ve tekrarlanabilir bir kantitatif protokol sağlanmıştır.

Şekil 1: Murin karaciğerinin anatomisi. (A) Farenin diyaframı altındaki karın boşluğunda karaciğer konumlandırmasına şematik genel bakış. (B) Dört karaciğer lobu, yani sol, kuadrat, kaudat ve sağ lob ve portal ven, hepatik arter ve safra kanalından oluşan portal triad ile murin karaciğerinin şematik tanımı. (C) Dokunsal vaskülatür arter ağının şematik gösterimi. Sağlanan Latince isimlendirme ile hepatik arterlerin (HA) ve dalların (ramus) tanımlanması. Kısaltma: HA = Hepatik arter. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Farelerde hepatik vaskülatür için ultra hızlı Doppler ultrason (UFUS) görüntüleme. (A) Non-invaziv in vivo görüntüleme için deney düzeneğine şematik genel bakış. (B) UFUS tarafından görüntülenen, sağ ve sol medial lobun yanı sıra sol lateral lobun görüntüleme yönünün ve ilişkili temsilcilerinin şematik çizimleri. Kısaltma: AA = Aort abdominalleri, LLL = Sol lateral lob, love my life = Sol medial lob, RML = Sağ medial lob. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Murin hepatik vaskülatürünün temsili kontrastlı ultra hızlı Doppler ultrasonu (UFUS). Yetişkin bir farenin tüm hepatik vaskülatürüne genel bir bakış, 3 pozisyonda, yani lateral sağ, medial ve lateral solda, kraniyalden kaudal'a doğru 4 düzlemde görüntülendi. Referans, medial ve sağda ve solda 1 cm lateral olarak görüntülenen diyaframın hemen altında, aynı düzlemler kaudal yönde olacak şekilde yerleştirilmiştir. Kısaltma: AA = Aort abdominalleri, HA = Hepatik arter, LLL = Sol lateral lob, LLHA = Sol lateral hepatik arter, love my life = Sol medial lob, RLL = Sağ lateral lob, RMHA = Sağ medial hepatik arter, RML = Sağ medial lob, SI = İnce bağırsak, S = Mide. Ölçek çubuğu 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Ultrafast Doppler ultrason (UFUS) ile karaciğer kan hacminin kantitatif ölçümü. (A) Diyaframın altında seçilen düzlem 1'deki yetişkin C57BL/6 vahşi tip kontrol farelerinin medial lobunun (ML) temsilcileri, 0 mm'ye, -0.3 mm'de düzlem 2'ye ve -0.6 mm'de düzlem 3'e karşılık gelir. Ölçek çubuğu 1 mm. Kantitatif değerlendirme için tüm görüntünün rastgele birimlerindeki (AU) ortalama görüntü değerlerine dayalı olarak (B) kararlı edinim (gri) ve (C) doku hareketi (kırmızı) ile 30 saniyelik Power Doppler'in çizimi. (D) Zaman içinde kantitatif kan hacmi ölçümü için düşük yoğunlukların (AU) otomatik olarak tanınması. (E) Düşük yoğunlukların Standart Sapması (St. Sapma), 2 SD (2σ) ile 3 kohorttan (N) toplam ortalamanın (N) genel ortalamasının (μ) kesilmesiyle gösterilen hareket artefaktlarının neden olduğu kararsız edinimleri tanımlamak için çizildi, yetişkin C57BL / 6 vahşi tip kontrol farelerinde fizyolojik durumda (AU) düşük yoğunlukların (AU) standart sapmasının (SD) değerlendirilmesi. (F) 3 düzlem boyunca ortalama 3 düzlem boyunca zaman içinde in vivo ölçülen kan hacmi değişikliklerinin nicelleştirilmesi, yani hayvan başına toplam 30 ROI, piksel yoğunluğu (AU) olarak temsil edilir. ROUT testi ile aykırı değer tespiti %1. (G) Teslimat aracının türü ile kullanım güzergahı arasında hiçbir fark yoktur. Kohort 1'e (n = 6) intraperitoneal (ip) salin enjeksiyonu, kohort 2'ye (n = 3) ip DMSO enjeksiyonu ve Kohort 3'e (n = 6) oral selüloz uygulaması (po) verildi. Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü varyans analizi, ns P > 0.05. Kısaltma: AU = Keyfi birimler, DMSO = Dimetil sülfoksit, ip = İntraperitoneal, po = Oral uygulama, ROI = İlgilenilen bölge, St. Sapma = Standart Sapma, UFUS = Ultra hızlı Doppler ultrason. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Ultra hızlı Doppler ultrason (UFUS) hepatik kan hacmi ölçümlerinin kantitatif senaryosu. Script gui_analysis.m, kan hacmi ölçümleri için ilgilenilen bölgenin (ROI) otomatik olarak konumlandırılması için grafiksel bir arayüz sağlar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokolde, fare hepatik vaskülatürünün non-invaziv UFUS görüntülemesinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Hayvanların işlenmesini, ultrason tarayıcısının çalıştırılmasını ve in vivo kan hacmi değişikliklerinin hesaplanması için veri analizini kapsayan görüntüleme prosedürünün ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Ultrason verilerinin yorumlanmasını kolaylaştırmak için, UFUS tarafından net bir şekilde görselleştirilebilen anatomik yapılara kapsamlı bir genel bakış sunuyoruz. Ayrıca, vasküler parametrelerin sağlam ölçümleri için standartlaştırılmış bir miktar tayini prosedürü tarif ediyoruz. Kontrast madde kullanılmadan uygun bir çözünürlük elde etmek mümkündür, bu da mikrosirkülasyonun hepatik kan hacminin güvenli ve basit bir kantitatif değerlendirmesini sağlar. Özellikle mikrovasküler sistemin kantitatif ölçümlerini değerlendirirken karışıklığı ve yanlış yorumlamayı önlemek için standartlaştırılmış anatomik isimlendirmenin kullanımını vurguluyoruz.

Murin damar sisteminin UFUS görüntülemesi daha önce, özellikle sinirbilim alanında bildirilmiştir⁷. Beyin görüntüleme, solunum hareketine oldukça duyarlı olan karaciğerden farklı olarak hareket artefaktlarından olumsuz etkilenmez. Diyafram altındaki anatomik konumu nedeniyle, göğüs ve karın bölgesindeki fiziksel kuvvetleri en aza indirerek düzensiz nefes almayı önlemek için karın bölgesindeki epilasyon çok nazik bir şekilde yapılmalıdır. Ayrıca, işlem sonrası adımlarda nispeten kolay bir şekilde düzeltilebilen bir faktör olan düzenli salınımlı solunumu sağlamak için uygun bir anestezi derecesine ulaşmak çok önemlidir. UFUS'un hassasiyeti burada, hareket artefaktlarını⁶ kaldırmak için bir tekil değer ayrıştırma (SVD) filtresi uygulanarak ve yüksek hareketli kareleri daha fazla sansürleyerek geliştirilmiştir. Yüksek kare hızlı Power Doppler filmleri, hareket artefaktları nedeniyle yüksek değerli zirveler oluşturan kareler üzerindeki nefes alma hareketinin etkisini görselleştirmemize ve ölçmemize daha fazla olanak sağlamak için burada 10 ms'de elde edilir. Solunum hızı daha sonra ortalama görüntü sinyalinin Hızlı Fourier dönüşümündeki zirveden tanımlanabilir ve organın yüksek hareketine karşılık gelen karşılık gelen tepe çerçeveleri atılabilir.

Zaman içinde tek bir hayvanda ve farklı vücut ağırlıklarına sahip hayvanlar arasında tekrarlanabilir ultrason Doppler görüntüleme, yine de çeşitli sınırlamalarla karşı karşıya kalabilir. İlk olarak, karaciğer pozisyonu, yüksek derecede dolu bir mide ve bağırsağın peristaltik hareketi gibi faktörlerden etkilenebilir. Bu etki özellikle sol lateral karaciğer lobunu referans olarak seçerken belirgindir. Bu nedenle, daha büyük hayvanlarda sadece sol lateral lobun seçilmesini ve daha küçük hayvanlarda sağ veya sol medial lobun tercih edilmesini öneriyoruz. İkinci olarak, sıkıntılı hayvanlarda ağır salınımsız solunum hareketleri meydana gelebilir, bu da düzeltilmesi zor olan ve sonuç olarak kan hacmi hesaplaması için kullanılamayan hareket artefaktlarına neden olabilir. Bu nedenle, vücut ağırlığına göre uyarlanmış bir dozaj ile birlikte uygun bir anestezi seçimi çok önemlidir. Son olarak, çözünürlük sınırı, hepatik mikrovaskülatür sisteminin görselleştirilmesini kısıtlar, yani kan damarları 100 mm'ye kadar değişen çaplarda görselleştirilebilir³.

Kontrast maddelerin kullanımı, yakın zamanda, mikro kabarcıkları izleyerek fare damar sisteminin ayrıntılı bir görüntüsünü elde etmek için önerilmiştir. Böyle bir yaklaşım, yüksek uzamsal çözünürlük elde edebilir ve kantitatif kan hızı ölçümleri sağlayabilir¹⁷. Bununla birlikte, mikro kabarcıkları izlemek, özellikle 2D olarak edinildiğinde, iç organları hareket ettirmek için oldukça zor olmaya devam etmektedir.

Burada, ultra hızlı Doppler ile elde edilen stabil hepatik kan hacmi ölçümlerinin, ip enjeksiyonları veya oral gavaj ile uygulanan farklı araçlar alan üç kohorttan kontrol farelerinde elde edilebileceğini gösterdik. Son zamanlarda, bu tür kan hacmi ölçümleri bir karaciğer hastalığı fare modelinde¹⁶ başarıyla kullanılmıştır. Detaylandırmak gerekirse, vasküler genişleme elektron mikroskobik düzeyde tespit edildi ve UFUS kullanılarak yapılan kantitatif ölçümlerle doğrulandı. Bu çalışma, klinik tanı ve izleme için umut verici olan, korunmuş bir hepatik anjiyomimari ile bile, fonksiyonel ve kantitatif düzeylerde vasküler kusurları araştırmak için in vivo değerlendirmenin duyarlılığını vurgulamıştır.

Özetle, bu protokol farelerde hepatik vaskülatür invaziv olmayan kalitatif ve kantitatif çalışmalar için bir rehber görevi görür. Non-invaziv ve basit prosedürü nedeniyle uzunlamasına takip için de kullanılabilir. Ek olarak, kan damarlarının fonksiyonel değerlendirmelerini sağlama potansiyeline sahiptir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
(Hidroksipropil)metil selüloz HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	%0,5 HPMC
Santrifüj ZentriMix 380 R	Hettich	3200
Santrifüj Tüpleri 50 mL konik Steril Polipropilen	CELLSTAR tüpler	227 261
Pamuk uçlar	Meditip Clean	G80215
Evde			deiyonize su
Tüy dökücü krem	yakındaki eczane
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma	D2650-5X5ML	steril
Etanol mutlak	FRESENIUS KABI	010-0622-1
Besleme iğnesi, yeniden kullanılabilir	FST Güzel Bilim Araçları	18064-20
İnce uçlu forseps Dumont #5 forseps	FST Güzel Bilim Araçları	11252-00
Gazlı bez pedleri 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
GraphPad Prizma	GraphPad Software, Inc	Sürüm 9
GUI analiz komut dosyası	Inserm	gui_analysis.m	10 ms Doppler taraması gerektirir
Isıtma yastığı 17 x 17 cm, 6 W	ThermoLux Acculux	461265
İnsülin şırıngası 30G 0,30 x 8 mm, 0,3 mL ve 0,5 mL	BD Microfine + Demi	25636
Ketamin Anesketin	Dechra	REG NL 111764	100 mg / mL
Kimwipes KIMTECH düşük tüylü silecek	ULINE	S-8115
Laboratuvar bandı 19 mm x 50 m x 0,125 mm	Stokvis	M451
MATLAB yazılımı	MathWorks	Sürüm R2022b
Eczane yakınındaki			nemlendirici krem
İğne sarı 30G 0,3 x 13 mm	BD Microlance	304000
Oftalmik merhem Oculentum Simpleks	Eklendi İlaç	220201
Evde			kağıt mendiller
Kalıcı laboratuvar işaretleyicisi	VWR	52877-310
Fizyolojik tuz çözeltisi (NaCl% 0.9)	FRESENIUS KABI	B102986	steril
Sharps tek kullanımlık kap Tıbbi Dispo 2,5 L	APmedical	UN3291
Steril güvenli kilit 1,5 mL tüpler	Eppendorf	0030 120.086
Şırınga 1 mL	BD Plastipak	303172
Şırınga 20 mL Luer-Lok	BD Plastipak	300629
Zamanlayıcı	West Bend	40053
Düzeltici	Exacta Aesculap	GT416
Ultrafast ultrason platformu	Iconeus &   INSERM 'Biyomedikal Ultrason' ART	Iconeus	10ms dizili
Ultrason iletim jeli Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N
Su deposu 3D baskılı 10 x 10 x 1,5 cm polimetilpenten (PMP) 0,125 mm	GoodFellow Cambridge limited	ME311100/2	CAD dosyası istek üzerine
Xylazine Sedamun	Dechra	REG NL 10084	20 mg/mL