Yöntem makalesi

κ-Carrageenan Sub-Microjel Ortamı Kullanılarak Doku Benzeri Yapıların Gömülü Biyobaskısı

DOI:

10.3791/66806

⸱

3 Mayıs 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, dikkate değer geri dönüşümlü sıkışma-sıkışma giderme geçiş özellikleri sergileyen yeni bir κ-İrlanda yosunu alt mikrojel süspansiyon banyosunu tanıtmaktadır. Bu özellikler, gömülü 3D biyobaskıda biyomimetik doku ve organların inşasına katkıda bulunur. Kalp/özofagus benzeri dokuların yüksek çözünürlüklü ve hücre büyümesi ile başarılı bir şekilde basılması, yüksek kaliteli biyobaskı ve doku mühendisliği uygulamalarını göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granül hidrojel destek banyosu kullanan gömülü üç boyutlu (3D) biyobaskı, biyomimetik iskeleler oluşturmak için kritik bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, hassas biyomürekkep birikimini hücre canlılığı ve işlevi ile dengeleyen uygun bir jel süspansiyon ortamının mühendisliği, özellikle istenen viskoelastik özelliklerin elde edilmesinde birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Burada, yeni bir κ-karagenan jel destek banyosu, homojen alt mikro ölçekli parçacıklar üreten, kullanımı kolay bir mekanik öğütme işlemiyle üretilir. Bu alt mikrojeller, biyomürekkeplerin düzgün bir şekilde birikmesini kolaylaştıran küçük akma gerilimi ve hızlı kesme inceltme özellikleri ile tipik Bingham akış davranışı sergiler. Ayrıca, κ-karagenan mikrojel ağının geri dönüşümlü jel-sol geçişi ve kendi kendini iyileştirme yetenekleri, basılı yapıların yapısal bütünlüğünü sağlayarak, tanımlanmış mimari özelliklere sahip karmaşık, çok katmanlı doku yapılarının oluşturulmasını sağlar. Baskı sonrası, κ-karagenan alt mikrojelleri, basit bir fosfat tamponlu tuzlu su yıkama ile kolayca çıkarılabilir. Hücre yüklü biyomürekkeplerle daha fazla biyobaskı, biyomimetik yapılar içindeki hücrelerin %92 gibi yüksek bir canlılığa sahip olduğunu ve psödopodiyi hızla uzattığını ve ayrıca sağlam proliferasyonu sürdürdüğünü göstermektedir, bu da doku ve organ üretimi için bu biyo-baskı stratejisinin potansiyelini göstermektedir. Özetle, bu yeni κ-İrlanda yosunu alt mikrojel ortamı, mühendislik doku ve organlarının in vitro gelişimi için derin etkiler taşıyan, olağanüstü kalitede gömülü biyo-baskı için umut verici bir yol olarak ortaya çıkmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektro-eğrilmiş lifler, gözenekli süngerler ve polimer hidrojeller dahil olmak üzere doku mühendisliği iskeleleri, hücre büyümesini, doku yenilenmesini ve organ fonksiyonunun restorasyonunu destekleyen yapısal bir çerçeve sağlayarak hasarlı doku ve organların onarımında ve yeniden yapılandırılmasında çok önemli bir rol oynar 1,2,3. Bununla birlikte, geleneksel iskeleler, doğal doku yapılarını doğru bir şekilde kopyalamada zorluklarla karşılaşır ve bu da tasarlanmış ve doğal dokular arasında bir uyumsuzluğa yol açar. Bu sınırlama, kusurlu dokuların verimli bir şekilde iyileşmesini engelleyerek, daha doğru biyomimikri elde etmek için iskele tasarımı ilerlemelerine acil ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. Üç boyutlu (3D) biyobaskı, biyomalzeme mürekkepleri ve hücreleri kullanarak karmaşık biyolojik doku yapılarını katman katman hassas bir şekilde oluşturan yenilikçi bir üretim tekniğidir4. Çeşitli biyomalzemeler arasında, polimer hidrojeller, hücrelerin yerinde kapsüllenmesini kolaylaştıran ve büyümelerini en önemli şekilde destekleyen ayırt edici ağları ile ideal biyomürekkepler olarak ortaya çıkmaktadır 5,6. Bununla birlikte, birçok yumuşak ve yüksek oranda hidratlı hidrojel, biyomürekkep olarak kullanıldığında, baskı işlemi sırasında basılı iskele yapılarının bulanıklaşmasına veya hızlı bir şekilde çökmesine neden olma eğilimindedir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, gömülü 3D biyo-baskı teknolojisi, destek malzemesi olarak bir mikrojel banyosu kullanır ve hassas yumuşak biyomürekkep biriktirmeye izin verir. Hidrojel biyomürekkeplerin jelleşmesi üzerine, mikrojel banyosu çıkarılarak karmaşık yapılara sahip rafine biyonik iskeleler elde edilir. Jelatin 7,8, agaroz9 ve gellan zamkı10,11 gibi malzemeler, gömülü 3D biyobaskı için mikrojel banyoları oluşturmak için kullanılmış ve doku mühendisliğinde yumuşak hidrojellerin uygulanmasını önemli ölçüde ilerletmiştir. Bununla birlikte, bu parçacıklı jellerin mikron düzeyinde ve tekdüze olmayan parçacık boyutu, 3D baskınınçözünürlüğünü ve aslına uygunluğunu zararlı bir şekilde etkiler 12,13,14. Küçük ve homojen bir şekilde dağılmış parçacıklara sahip jel benzeri bir süspansiyon şamandırasının üretilmesine acil ihtiyaç vardır ve bu da yüksek kaliteli biyo-baskı elde etmede avantajlar sunar.

Bu protokolde, gömülü 3D baskı için tek tip bir mikron altı seviyesine sahip yeni bir kurban granül κ-İrlanda yosunu süspansiyon banyosu sunulmaktadır. Hızlı sıkışma-sıkışma giderme geçişinin bu yenilikçi alt mikrojel banyosu davranışı, yüksek yapısal doğruluğa sahip biyomimetik hidrojel iskelelerin hassas imalatını kolaylaştırır15. Bu yeni süspansiyon ortamını kullanarak, jelatin metakrilat ve ipek fibro metakrilattan oluşan kompozit bir biyomürekkep kullanılarak çok katmanlı doku yapılarına sahip bir dizi biyomimetik doku ve organ yapısı başarıyla basılmıştır. Bu çalışmada, özofagusun sadece çok katmanlı bir doku yapısına sahip olması değil, aynı zamanda kas tabakasının iç, dairesel ve dış, uzunlamasına karmaşık bir katmanlama yapısı sergilemesi nedeniyle, 3D biyo-baskı biyomimetik nesnesi olarak özofagusu seçtik. Bu katmanların uygun şekilde hizalanmasını ve organizasyonunu sağlamak, fonksiyonel doku rejenerasyonu için esastır. Bu nedenle, yemek borusunun çok katmanlı mimarisini çoğaltmayı çok arzuluyoruz. Daha da önemlisi, doku mühendisliği için biyomimetik bir iskele tasarlamak ve inşa etmek için süspansiyon banyosu olarak κ-karragenan alt mikrojelleri ve biyomürekkep olarak GelMA/SFMA'yı kullandık. Basılı yemek borusu, tekrarlanan fosfat tamponlu tuzlu su yıkama ile kolayca serbest bırakılabilir. Ayrıca, κ-karragenan alt mikrojel banyosu sitotoksik maddeler içermez ve yüksek sitouyumluluk sağlar15. Anizotropik iskeleler içine yüklenen düz kas hücreleri, kayda değer bir yayılma aktivitesi sergiler. Bu tek tip alt mikrojel süspansiyon ortamı, gömülü 3D biyo-baskı yoluyla karmaşık doku ve organların üretimi için yeni bir yol sunar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. κ-İrlanda yosunu alt mikrojel süspansiyon banyosunun hazırlanması

  1. 1.000 mL'lik bir cam şişe içinde 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) çözeltisine 1.75 g κ-İrlanda yosunu tozu ekleyerek 500 mL κ-İrlanda yosunu süspansiyon banyosu (ağırlıkça% 0.35 / hacim) hazırlayın.
  2. Sulu karışımı karıştırmak için cam şişeye 70 mm'lik bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin. Cam şişe kapağını sıkın ve ardından yarım tur gevşetin.
  3. Cam şişeyi 70 °C'lik bir su banyosuna koyun ve ısıtın. Manyetik karıştırıcıyı 300 rpm hızında açın, şişeyi yerleştirin ve polimer tamamen eriyene kadar karıştırın.
  4. Başka bir cam şişe alın ve sterilizasyon için 121 °C'de 30 dakika boyunca çalışan bir otoklava koyun.
  5. Yüksek basınçlı sterilizatör 80 °C'ye soğuduktan sonra, şişeyi sterilizatörden çıkarın ve daha fazla kullanım için ultra temiz çalışma tezgahına aktarın.
  6. Tamamen çözünmüş κ-karagenan çözeltisini 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilmiş cam şişeye süzün.
    NOT: κ-İrlanda yosununun soğumasını ve filtreyi tıkamasını önlemek için çözelti sıcakken filtrelemeyi hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
  7. 12 saat boyunca katyon çapraz bağlı bir jelleşmeyi indüklemek için κ-karragenan çözeltisini 4 ° C'de saklayın.
  8. Κ-İrlanda yosunu hidrojellerini, 25 °C'de 1200 rpm karıştırma hızına sahip 60 mm'lik bir manyetik karıştırıcı kullanarak, yaklaşık 60 dakika sürecek şekilde başarılı bir şekilde sıvı hale gelene kadar mekanik olarak öğütün.
    NOT: Düşük sıcaklıklarda jelleşmeyi veya yüksek sıcaklıklarda çözünmeyi önlemek için κ-karragenan hidrojellerini 25-37 °C arasında saklayın.

2. Jelatin metakrilat / ipek fibroin metakrilat kompozit biyomürekkeplerin hazırlanması

  1. PBS çözeltisinde (pH 7.4) %10 (ağırlıkça/hacim) jelatin metakrilat (GelMA) ve %6 (ağırlıkça/hacim) ipek fibroin metakrilatı (SFMA) birleştirerek kompozit biyomürekkepler hazırlayın. 2,0 g GelMA ve 1,2 g SFMA tozlarını ayrı ayrı tartın.
  2. Tozları yavaşça iki adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne ekleyin. 50 mL santrifüj tüplerine ayrı ayrı 10 mL PBS çözeltisi ekleyin.
  3. Her birine 10 mm'lik bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve 45 °C'de bir su banyosunda sürekli karıştırın ve ısıtın. GelMA ve SFMA tozlarının tamamen çözülmesine izin verin, yaklaşık 30 dakika sürer.
  4. GelMA ve SFMA çözeltilerini 45 °C'de sürekli karıştırarak eşit hacimde karıştırın. 100 μm gözenek boyutu filtresi kullanarak kompozit biyomürekkepleri filtreleyin.
  5. Kompozit GelMA/SFMA biyomürekkeplerini bir biyogüvenlik kabininde UV ışınlaması yoluyla 12 saat boyunca sterilize edin.
    NOT: SFMA'nın kendi kendine montaj yoluyla erken jelleşmesini önlemek için biyomürekkepleri hemen hazırlayın ve kullanın.

3. κ-İrlanda yosunu alt mikrojel süspansiyon banyosunun reolojik karakterizasyonu

  1. Reoloji ile ilgili ekipmanı başlatın ve hazırlayın.
    1. Hava kompresörünü 30 dakika boyunca açın ve basıncın 30 psi'ye ulaştığından emin olun. Çekme çubuğunu saat yönünün tersine çevirerek yatak kelepçesini çıkarın. Aşağıdaki siyah kapağı sabitleyin ve cihazın üst kısmındaki düğme eksenini saat yönünde çevirin.
    2. Reometreyi açın ve başlamasına izin verin. Sirkülasyon suyu anahtarını açın ve sıcaklığın 15 °C'ye ulaşmasını bekleyin.
    3. Çevrimiçi bağlantıyı kurmak için reometre kontrol yazılımını açın.
  2. Reometreyi kalibre edin ve paralel plaka geometrisini kurun.
    1. Esas olarak kalibrasyon cihazı atalet yolunun ayarlanmasını içeren kontrol yazılımında cihaz kalibrasyonu gerçekleştirin. Çekme çubuğunun ucuna 40 mm çapında bir paralel plaka geometrisi takın. Tutarlı geometri yerleşimi için motor milini başlangıç konumuna getirmek için Kilit düğmesini 3 saniye basılı tutun.
    2. Kontrol yazılımında Kalibrasyon Yöneticisi'ni seçin ve ardından paralel plaka geometrisini kalibre etmek için Atalet, Sürtünme Kalibrasyonu ve Rotasyonel Eşleme'ye tıklayın.
  3. Hassas ölçümü sağlamak için standart bir boşluk sıfırlama prosedürü uygulayarak reometre boşluk yüksekliğini sıfırlayın.
  4. 0,01 ila 1000 1/sn kesme hızı arasında değişen bir akış rampası, 10 rad/sn'de %0,1 ila %100 gerinim arasında değişen bir genlik taraması, 10 rad/sn'de %1 ve %100'lük alternatif gerinimlerle 60 saniye süren çok adımlı salınım süresi taraması ve 0,1 1/sn ve 10 1/sn alternatif kesme hızıyla 120 sn süren çok adımlı Tepe Tutma taraması dahil olmak üzere deneysel adımları ayarlayın.
  5. Reometrenin Peltier plakasına 2 mL %0.35 κ-İrlanda yosunu süspansiyonu damlatın.
  6. Geometri boşluğunu 510 μm'ye yerleştirin ve kelepçe cihazının kenarındaki fazla taşmayı giderin. Numunenin kelepçe kenarının biraz ötesine uzanmasını sağlamak için numune aralığını 500 μm'ye ayarlayın.
  7. Deneysel tasarım seçeneklerinden Akış Rampasını seçerek bir akış deneyi yapın.
    1. Deney tasarımında Akış Rampası testini seçin. Kesme hızlarını 25 °C sıcaklıkta 0,001 ila 10 1/s arasında ayarlayın.
    2. Eklenen örnek üzerinde adım 3.5'i ve Akış Rampası deneyini gerçekleştirin.
  8. Malzemenin geri kazanım performansını değerlendirmek için döngüsel bir Tepe Tutma testi gerçekleştirin.
    1. Deney tasarımında Peak Hold taramasını seçin ve 25 °C'de 120 s'lik bir süre ile 5 ardışık deney ayarlayın.
    2. Kesme hızını birinci, üçüncü ve beşinci adımlar için 0,01 1/sn'ye ve ikinci ve dördüncü adımlar için 10 1/sn'ye ayarlayın.
    3. 2 mL'lik yeni bir örnek ekleyin. Adım 3.5'i ve döngüsel kurtarma testini gerçekleştirin.
  9. κ-İrlanda yosunu süspansiyon banyosunun potansiyel jel-sol geçişini değerlendirmek için viskoelastisite analizi yapın.
    1. Deneysel tasarımda Genlik Tarama testini seçin. Salınım gerinimini 25 °C sıcaklıkta %0,1 ila %100 arasında ayarlayın. Eklenen örnek üzerinde Genlik Tarama deneyini gerçekleştirmek için Başlat'a tıklayın.
  10. Malzemenin elastik geri kazanım performansını değerlendirmek için alternatif gerinim analizi yapın.
    1. Deney tasarımında Salınım Süresi Taraması'nı seçin ve 25 ° C'de 60 s'lik bir süre ile 5 ardışık deney ayarlayın.
    2. Gerinimi birinci, üçüncü ve beşinci adımlar için %1'e ve ikinci ve dördüncü adımlar için %100'e ayarlayın.
    3. 2 mL'lik yeni bir örnek ekleyin. Adım 3.5'i ve sürekli döngüsel kurtarma testini gerçekleştirin.
      NOT: Her deney testinden sonra geometri plakasını ve Peltier plakasını temizleyin ve 2 mL'lik yeni bir numune ekleyin.

4. Özel olarak tasarlanmış bir mikro ekstrüzyon biyoyazıcı kullanarak biyomimetik hidrojel iskelelerinin yazdırılması

  1. Bir 3B grafik yazılımı kullanarak STL biçimli küpler tasarlayın ve 3B veritabanından (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.) doku benzeri modeller indirin.
    1. STL formatındaki modelleri PANGO yazılımına aktarın ve yazdırma parametrelerini girin. Modelin belirli X, Y ve Z koordinatlarını 3B uzayda ayarlayın, modelin beklenen ölçekleme boyutunu milimetre (mm) cinsinden girin, X, Y ve Z eksenlerindeki nesnenin boyutunu ve ölçekleme oranını ayarlayın ve modelin uzayda dönme açısını gerektiği gibi ayarlayın.
    2. Her katmanın Z ekseni kalınlığını belirlemek için tahmini filament çapını (çoğu biyomürekkep için tipik olarak yaklaşık 200-500 μm) katman kalınlığı alanına girin. Baskı hızını beklenen çizgi kalınlığına (yaklaşık 10-90 mm/sn) göre ayarlayın ve dolgu yoğunluğunu %30-%80 olarak ayarlayın.
    3. Son parametreleri G kodu olarak bir SD karta aktarın.
  2. Biyoyazıcıyı ve mikro ekstrüzyon pompasını çalıştırın.
    1. Mikro ekstrüzyon pompası kontrolörünü açın, ilgili hacim şırıngasını (5 mL) seçin ve ekstrüzyon hızını 0.08 mL/dk ve ekstrüzyon süresini, hidrojel hacminin ekstrüzyon hızına bölünmesiyle elde edilen istenen baskı süresi ile koordineli olarak ayarlayın.
    2. İç çapı 210 μm olan bir iğne ile şırıngayı, biyoyazıcının şırınga yuvasına yerleştirin.
    3. Şırınganın pistonunun vida ile yakın temas halinde olduğundan emin olmak için şırınga kontrol cihazını ayarlayın.
    4. 35 mm'lik bir hücre kültürü kabına 3 mL süspansiyon banyosu yerleştirin. Çanağı kod ayarlarına göre platforma yerleştirin ve baskı kafasının çanağın altından 1 mm yukarıda olduğunu onaylayın.
      NOT: Yazdırma sırasında yazdırma platformundaki çanak konumlarının doğruluğundan emin olmak için bir ön test yapın.
    5. Kodu içeren SD kartı 3D biyoyazıcıya takın, kod dosyasını etkinleştirin, biyoyazıcıyı başlatın ve denetleyicideki Başlat düğmesine tıklayın.
  3. Yapıların işlenmesi
    1. Fotoçapraz bağlamayı başlatmak için yazdırılan yapıyı 405 dakika boyunca 1 nm mavi ışığa maruz bırakın.
    2. 1 mL'lik bir pipet kullanarak κ-karagenan jeli çıkarın, ardından yıkama ve ardından çıkarma için 3 mL PBS (pH 7.4) ekleyin. İyice yıkamak için bu işlemi tekrarlayın.
      NOT: Basılı yapılara zarar vermemek için yıkama işlemini nazikçe gerçekleştirin.

5. Özofagus kas tabakası analoglarının gömülü 3D biyobaskısı

  1. Kültür tavşanı özofagus düz kas hücreleri (eSMC'ler).
    1. % 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 15 mL DMEM ortamı kullanarak 2 x 106 hücre ile T75 şişelerinde kültürü başlatın.
    2. ESMC'leri 37 °C'de, %5CO 2 ve %95 havadan oluşan nemli bir atmosferde, %80 birleşme noktasına ulaşana kadar tutun.
  2. Özofagus kas tabakası biyomükkebinin hazırlanması
    1. Birleşme noktasına ulaştıktan sonra ortamı aspire edin ve eSMC'leri 5 mL 1x PBS ile yıkayın.
    2. Şişeye 2 mL% 0.2 Tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri sindirmek için 2 dakika inkübe edin. Hücreleri duvardan ayırmak için şişeye dokunun.
    3. 2 mL DMEM ekleyerek sindirimi sonlandırın ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 10 μL hücre süspansiyonlu bir hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu ölçün.
    4. 3 dakika boyunca 675 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini kompozit GelMA / SFMA biyomürekkeplerinde (adım 2.1'de hazırlandığı gibi) yeniden süspanse edin. Biyomürekkepte 10 x 106 hücre/mL'lik bir yoğunluk elde etmek için nihai hücre konsantrasyonunu ayarlayın, böylece sonraki 3D biyo-baskı uygulamaları için koşulları optimize edin.
  3. 3D biyoyazıcı ve ilgili materyallerin hazırlanması
    1. Baskı işlemi için aseptik bir ortam sağlamak için şırınga iğneleri, forseps, manyetik karıştırıcı ve 1000 mL silikat cam şişe dahil olmak üzere temel baskı aletlerini standart sterilizasyon koşullarında (30 dakika boyunca 121 °C) otoklavlayın.
    2. Biyoyazıcıyı bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve steriliteyi korumak için 30 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışıkla sterilize edin.
    3. Sırasıyla adım 1 ve adım 2'de açıklandığı gibi 50 mL steril κ-karragenan ve 5 mL steril GelMA / SFMA kompozit biyomürekkepleri hazırlayın.
    4. Modeli tasarlayın, istenen parametreleri ayarlayın ve biyoyazıcıyı adım 4.1'de belirtildiği gibi hazırlayın.
  4. Biyo-baskı işleminin başlatılması
    1. 3D özofagus kas tabakasını biyolojik olarak yazdırmak için adım 4.2 ve 4.3'te açıklanan prosedürleri gerçekleştirin, ardından PBS yıkama ve değiştirme işlemini gerçekleştirin.
    2. Yazdırılan yapıda hücre kontaminasyonu riskini en aza indirmek için baskı işlemi boyunca steril tekniklerle hücre baskısı gerçekleştirin.
  5. Baskı sonrası hücre kültürü ortamının değiştirilmesi
    1. PBS'yi dikkatlice aspire edin ve% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 3 mL DMEM ile değiştirin. Optimum hücre büyüme koşullarını sağlamak için yazdırılan yapıların tamamen suya batırıldığından emin olun.
    2. Basılı yapıları içeren hücre kültürü kabını,% 5 CO2 ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde inkübe edin. Hücre kültürü ortamını her seferinde 3 mL kullanarak günlük olarak taze ortamla değiştirin ve ışık mikroskobu kullanarak yapılar içindeki hücrelerin durumunu izleyin.

6. Canlı / Ölü tahlil boyama yoluyla basılı yapılar içinde eSMC'lerin canlılığının değerlendirilmesi

  1. 5 saatlik inkübasyondan sonra hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücre yüklü yapıları PBS ile yıkayın.
  2. Basılı hücre yüklü yapılara 2 mL standart kalsein-/propidyum iyodür çözeltisi (1:1000) ekleyin ve inkübe edin.
  3. 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra yapıları 3x PBS ile yıkayın ve ardından taze hücre kültürü ortamı ekleyin.
  4. Canlı ve ölü hücreleri gözlemleyin ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak floresan görüntüler yakalayın.

7. Basılı yapılar içindeki eSMC'lerin FITC-Phalloidin/DAPI boyama yoluyla gözlemlenmesi

  1. Basılı yapıları, F-aktin için floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli phalloidin (Yeşil) ve 5 günlük inkübasyon sonrası nükleer için 4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol (DAPI, mavi) kullanarak boyayın.
  2. Fiksasyon çözeltisi hazırlama
    1. 5 mL'lik bir polietilen (PE) tüpte 4 mL 1x PBS'yi 0.16 mL paraformaldehit (PFA) ile birleştirin ve %4'lük bir nihai konsantrasyon elde edin.
    2. Biyobaskılı yapıları içeren kültür kabını temiz bir yüzeye yerleştirin. Ortamı çıkarın ve yapıları PFA çözeltisi ile nazikçe kaplayarak tam olarak daldırılmalarını sağlayın. Çözeltiyi atmadan önce fiksasyonun oda sıcaklığında 20 dakika ilerlemesine izin verin.
      NOT: Biyo-baskılı yapıların yapısal bütünlüğünü korumak için ekleme ve çıkarma işlemleri sırasında sıvıları dikkatli kullanın.
    3. Kültür kabına 2,5 mL 1x PBS verin ve artık boyama reaktiflerini çıkarmak için yapıları tamamen daldırın.
  3. Hücre zarı geçirgenliği
    1. 5 mL'lik bir PE tüpte 4 mL 1x PBS'ye 20 μL Triton X-100 ekleyerek %0.5'lik bir Triton X-100 çözeltisi formüle edin.
    2. Triton X-100 solüsyonunu, hücre zarlarına nüfuz etmesi için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yapılara uygulayın, ardından solüsyonu çıkarın.
    3. Kültür kabına 2,5 mL 1x PBS verin ve artık boyama reaktiflerini çıkarmak için yapıları tamamen daldırın.
  4. Spesifik olmayan bağlamayı engelleme
    1. 4 mL 1x PBS'ye 0.12 mL BSA ekleyerek 5 mL'lik bir PE tüpte% 3'lük bir sığır serum albümini (BSA) bloke etme çözeltisi oluşturun.
    2. Spesifik olmayan alanları engellemek için BSA çözümünü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yapılara tanıtın, ardından çözeltiyi atın.
  5. FITC-Phalloidin ile aktin boyama
    1. 4 mL 1x PBS ve 8 μL boyama reaktifi ile 5 mL'lik bir PE tüpte% 0.2 FITC-phalloidin çözeltisi hazırlayın.
    2. Yapıları karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bu çözeltiye daldırın, ardından çözeltiyi atın.
    3. Kültür kabına 2,5 mL 1x PBS ekleyin, artık boyama reaktiflerini çıkarmak için yapıları tamamen daldırın.
  6. DAPI ile nükleer boyama
    1. Yapılara 4 mL DAPI boyama solüsyonu uygulayın ve tam kapsama alanı sağlayın.
    2. DAPI çözeltisini çıkarmadan önce karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  7. Son yıkama ve PBS daldırma: Kültür kabına 2,5 mL 1x PBS ekleyin, artık boyama reaktiflerini çıkarmak için yapıları tamamen daldırın.
    NOT: Boyama solüsyonlarını önceden hazırlayın ve nazikçe tutun. Hücreler hiçbir noktada kültür kabı içinde kurumaya uğramamalıdır.
  8. Konfokal mikroskop kullanarak gözlemleyin: Hücre büyümesini değerlendirmek için konfokal mikroskopi kullanarak lekeli yapıları inceleyin ve görüntüleyin, sonuçların kapsamlı bir şekilde belgelenmesini sağlayın.

8. CCK-8 testi kullanılarak basılı yapılar içinde eSMC'lerin çoğalmasının değerlendirilmesi

  1. Kültür ortamını 7. ve 14. günlerde yapılardan çıkarın. Artık ortamı ve ayrılmış hücreleri çıkarmak için yapıları PBS ile yıkayın.
  2. Üreticinin talimatlarını izleyerek her yapıya CCK-8 çözümü ekleyin. CCK-8 çözümünün hacminin her bir yapıyı tamamen kaplamak için yeterli olduğundan emin olun.
  3. Yapıları CCK-8 çözeltisi ile 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, süpernatanı dikkatlice 96 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.
  4. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 450 nm'de ölçün.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granül κ-İrlanda yosunu jel banyosu, dökme hidrojellerin mekanik olarak partikül bir jel bulamacına ayrılmasıyla oluşturulmuştur. En son çalışma, κ-karragenan parçacıklarının, daha önce literatürde bildirilen mikrojellerin boyutlarından önemli ölçüde daha küçük olan, 1000 rpm mekanik harmanlamada15 tekdüze morfolojilerle yaklaşık 642 ± 65 nm'lik bir ortalama çap sergilediğini göstermiştir 16,17,18. Daha uzun kırılma süreleri ve daha büyük hızlar, bu çalışmada ortalama çapı 565 ± 86 nm olan alt mikropartiküller veren 1200 rpm'de 60 dakikalık bir karıştırma süresi ile daha küçük mikropartikül boyutlarına neden olur (Ek Şekil 1). Bu kadar küçük parçacık boyutunun, baskı işlemlerinin çözünürlüğünü artırması beklenmektedir. Bu parçacıklar, hidrojen bağı ve katyon etkileşimlerinin oluşumu yoluyla granüler bir jel halinde birleşir (Şekil 1A). Strese maruz kaldığında, κ-karragenan alt mikrojel ortamı, tümü başarılı gömülü 3D biyo-baskı için gerekli olan verim, kayma-inceltme ve tersine çevrilebilir bir sıkışma-sıkışma geçişi gibi karakteristik davranışlar sergiler. Şekil 1B, bir akış rampası testi üzerine granül κ-karragenan jellerin temsili akma davranışını ve kayma incelmesini göstermektedir. Kesme hızı 0,001'den 10 s-1'e yükseldiğinde, %0,35 (ağırlık/hacim) granül κ-İrlanda yosunu jelleri için kesme gerilmeleri, 0,3 s-1'in altındaki kesme hızlarında nispeten değişmeden kalır ve bu da 3,5 Pa'lık düşük bir akma gerilimine işaret eder. Daha sonra, kesme gerilmelerinin kesme hızlarıyla doğrusal olarak arttığı gözlemlenir, bu da bir Bingham sıvısınınkine benzer akış davranışını düşündürür. Ayrıca, κ-karragenan alt mikrojellerinin gerinim süpürme reolojik ölçümleri, jelden sola belirgin bir geçiş olduğunu ortaya koymaktadır. Bu jeller 'u aşan suşlarda verim verir ve 5'lik bir suşta jel-sol geçişine uğrar (Şekil 1C). Alt mikropartikül jellerin küçük verim suşu, hidrojen bağları ve katyonik etkileşimler yoluyla kurulan fiziksel ağa atfedilir. Bu tür jel-sol geçiş davranışı geri dönüşümlüdür. Şekil 1D'de gösterildiği gibi, 0'lük bir gerinimde, κ-karragenan alt mikrojellerinin depolama modülü, kayıp modülünden daha düşük olan 38 Pa'dan 6 Pa'ya düşer ve bu da bir sol durumunu gösterir. Tersine, gerinimde %1'e ani bir azalma üzerine, depolama modülü hızla yaklaşık 38 Pa'ya geri döner. 5 saniye içinde kayıp modülünü aşar, bu da κ-karragenan alt mikrojellerinin parçacıklar arasındaki fiziksel çapraz bağları hızlı bir şekilde yeniden kurabildiğini düşündürür.

Küçük ve homojen morfolojileri ile karakterize edilen granül κ-karagenan jeller, gömülü 3D biyo-baskı uygulamalarında kullanımları için avantajlı olan kesme inceltme özellikleri, hızlı kendi kendini kurtarma ve verim gerilimi davranışı sergiler. Gömülü baskı için bir destek banyosu olarak κ-karagenan alt mikrojel süspansiyonunun etkinliğini değerlendirmek için, κ-karagenan ortamı19,20 içindeki baskı denemeleri için (ağırlıkça) jelatin metakrilat ve %6 (ağırlıkça/hacim) ipek fibroin metakrilat kompozitlerinden (GelMA/SFMA) oluşan yaygın olarak kullanılan bir biyomürekkep kullanılır. GelMA, gelişmiş görselleştirme için rodamin ile etiketlendi21. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, granül κ-İrlanda yosunu jel banyosu oldukça şeffaftır ve baskı işleminin gerçek zamanlı olarak izlenmesini kolaylaştırır. Nozul hızları 10-90 mm/s aralığında değiştiğinde, nozul tarafından üretilen kesme hızları 0,66 ila 6 s-1 arasında değişir. Κ-İrlanda alt mikrojel banyosu, 6 s-1 ve 0.01 s-1 alternatif hızlarında sürekli döngüsel kesme üzerine 20 s içinde kendi kendini iyileştirme davranışı sergiler (Ek Şekil 2). 15 x 15 x 2 mm3 ölçülerinde, 150 μm katman kalınlığına sahip bir ızgara yapısı, κ-karragenan alt mikrojel banyosu içinde sürdürüldü. Özellikle, ızgara, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) görüntüleri ile doğrulandığı gibi, yaklaşık 200 μm genişliğinde ve yaklaşık 350 μm'lik filamentler arası boşluk ölçen bireysel filamentler ile dikkate değer bir bütünlük ve çözünürlük göstermiştir (Şekil 2B,C). Ayrıca, 3D ızgara yapısı, birbirine bağlı gözeneklere sahip gözenekli bir ağa sahipti. Bunlar, basılabilirliği etkileyen ve nihayetinde hücre sağkalımı, çoğalma ve farklılaşma potansiyeli gibi hücresel davranışları etkileyen hayati özelliklerdir.

Karmaşık

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyobaskıda kullanılmak üzere κ-karagenan alt mikrojel süspansiyon banyolarının hazırlanması, elde edilen ortamın biyomürekkepleri desteklemek için istenen özellikleri sergilemesini sağlamak için birkaç kritik adımı içeren, dikkatlice düzenlenmiş bir süreçtir. İlk olarak, κ-İrlanda yosunu tozunun yüksek sıcaklıklarda deiyonize su içinde çözülmesi ve homojen bir karışım oluşturulmasıyla bir κ-karagenan çözeltisi hazırlanır. Çözeltinin konsantrasyonu anahtardır ve sonraki jelleşme için optimize edilmelidir. % 0.3-0.6 (ağırlıkça / hacim) κ-carrageenan, gömülü 3D biyobaskıda mükemmel performans gösterdi15. Soğuduktan sonra, bu çözelti toplu bir jele dönüşür.

Dökme jel daha sonra alt mikrojel parçacıkları üretmek için mekanik bir öğütme stratejisine tabi tutulur. Bu, jeli eşit boyutta parçacıklara ayıran yüksek kesmeli mekanik kuvvetleri içerir. Kesme yoğunluğu, süresi ve sıcaklığı dahil olmak üzere öğütme işlemi parametreleri, istenen parçacık boyutu dağılımını elde etmek için hassas bir şekilde kontrol edilir. Öğütme işleminden sonra, alt mikrojel parçacıkları, karmaşık biyo-baskı görevlerini destekleyen tek tip bir süspansiyonun korunması için gerekli olan toplanma veya çözünmeyi önlemek için 25-37 °C'de saklanır. Jelin hemen hazırlanması ve kullanılması tavsiye edilir.

κ-karragenan alt mikrojel süspansiyon banyolarının üretiminin kullanımı kolaydır, bu da endüstriyel uygulamalarla ve büyük ölçekli doku mühendisliği ve rejeneratif tıp çabalarına yönelik artan taleple uyum sağlar. Ayrıca, κ-karagenan alt mikrojel süspansiyon banyoları, çözücü olarak hücre uyumlu PBS veya kültür ortamı kullanır, bu da mükemmel biyouyumluluk sağlar ve onu biyobaskılı yapılar içindeki hücreleri desteklemek için ideal bir ortam haline getirir. Granül jelin raf ömrü, aseptik hazırlama koşulları altında yaklaşık 1 aydır.

Bingham plastik akış davranışı (Şekil 1B) ile karakterize edilen κ-karragenan alt mikrojel banyosu, basılı yapıların hassasiyetini artırmada çok önemli olan hızlı kendi kendini iyileştirme yetenekleriyle (Şekil 1C,D) birlikte mükemmel kesme inceltme özellikleri gösterir. Bu alt mikrojel banyosunun uygulanmasının, çok katmanlı mimarilere sahip dokuların oluşturulmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır (Şekil 2), yüksek sadakat ve çözünürlüğe sahip yapıların üretimini sağlar. Hücre yüklü biyomürekkepler içine gömülü hücrelerde hızlı psödopodia uzama kapasitesinin dikkat çekicidir (Şekil 3), bu da banyonun hücresel süreçlerle uyumluluğunun altını çizmektedir. Sonuç olarak, bu κ-karragenan alt mikrojel banyosu, in vitro doku ve organ üretimi alanı için dönüştürücü bir umut vaat ediyor. Daha karmaşık, uygulanabilir ve işlevsel olarak bütünleştirici doku yapılarının geliştirilmesini sağlayarak doku mühendisliği ve rejeneratif tıp üzerinde derin bir etki yaratmayı amaçlamaktadır.

Biyobaskı ve doku mühendisliği uygulamaları için κ-karragenan alt mikrojel banyosunun önemli potansiyeline rağmen, hala çeşitli zorluklar ve sınırlamalar mevcuttur. Birincil endişe, bileşiminin, büyük organların uzun süreli baskısı sırasında hücre canlılığını korumak için çok önemli olan hücre kültürü ortamına çok benzemesi gerektiğidir. κ-İrlanda yosunu alt mikrojelleri ağırlıklı olarak çözücü olarak PBS kullanılarak üretilir, bu da materyali çözmek için çeşitli hücre kültürü ortamlarının dahil edilmesini gerektirir. PBS'ye ek olarak, κ-İrlanda yosunu ayrıca bir kalsiyum klorür çözeltisi kullanılarak jelatinleştirilir. Bununla birlikte, kalsiyum klorür çözeltisi hücrelerde toksisiteye neden olabilir veya ozmotik bir basınç dengesizliği yaratabilir. Bu nedenle, bir hücre kültürü ortamının kullanılması, κ-karagenan çözücüleri ve çapraz bağlama maddeleri için ideal olacaktır. Ayrıca, mikrojellerin yüksek verimli steril üretiminin elde edilmesi önemli bir zorluk teşkil etmektedir. κ-İrlanda yosunu çözeltilerinin sterilizasyonu, yüksek sıcaklıklarda 0.22 μm'lik bir filtreden filtrasyon gerektirir. Bununla birlikte, steril κ-karragenanın verimi, PBS çözeltisinin kalitesi ve filtrasyon işlemi sırasında κ-karagenanın soğutulması dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından sıklıkla engellenir. Her filtrasyon partisi tipik olarak sadece 20-50 mL steril κ-İrlanda yosunu ile sonuçlanır ve bu da κ-İrlanda yosunu mikrojellerinin yüksek verimli üretimi için önemli bir engel oluşturur. Sonuç olarak, gelecekteki araştırmalar biyofabrikasyon sürecini optimize etmeye, uzun vadeli hücre canlılığını ve işlevini değerlendirmeye ve basılı dokuların canlı sistemlere entegrasyonunu keşfetmeye odaklanacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların bu yazıda açıklanan ürünlerle ilgili hiçbir mali çıkarı yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Ningbo Doğa Bilimleri Vakfı (2022J121, 2023J159), Ningbo Şehri Doğa Bilimleri Vakfı'nın Anahtar projesi (2021J256), Polimerlerin Moleküler Mühendisliği Devlet Anahtar Laboratuvarı Açık Vakfı (Fudan Üniversitesi) (K2024-35) ve Çin'in Zhejiang Eyaleti Aterosklerotik Hastalıklar için Hassas Tıp Anahtar Laboratuvarı (2022E10026) tarafından desteklenmiştir. Ningbo Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Çekirdek Tesisleri'nin teknik desteği için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3D biyoyazıcıÖzel tasarlanmış
4 ',6-Diamidino-2-FenilindolSolarbio Yaşam BilimleriC0065Kullanıma hazır
405 nm UV ışığıEFLXY-WJ01
Hücre SayacıCorningCyto smart 6749
Konfokal lazer tarama mikroskobuLeicaSTELLARIS 5
DMEM yüksek glikozVivaCellC3113-0500Sodyum Pirüvat ve L-Glutamin ile Yüksek Glikoz
Dinamik rotasyonel reometreTA EnstrümanKeşfi HR-20
Özofagus düz kas hücreleriNingbo Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi, Hücre Biyolojisi ve Rejeneratif Tıp Bölümü tarafından sağlanırTavşan özofagusundan alınan birincil hücreler
F9070L
Floresein izotiyosiyanat etiketli phalloidinSolarbio Yaşam BilimleriCA1610300T
Jelatin metakrilatEFLEFL-GM-60%60 ikame
k-İrlanda yosunuAladdinC121013-100gReaktif sınıfı
Lityum Fenil (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfinatAladdinL157759-1g365 ~ 405 nm
Canlı-Ölü kitibeyotimeC2015M
Mikroplaka okuyucuPotenovPT-3502B
ParaformaldehitSolarbio Yaşam BilimleriP1110 %4
Penisilin / streptomisinSolarbio Yaşam BilimleriMA0110100 ve akut;
Fosfat tamponlu tuzlu suVivaCellC3580-0500pH 7.2-7.4
İpek fibroin metakrilatEFLEFL-SilMA-001%39 ikame
Triton X-100Solarbio Life ScienceT8200
Tripsin-EDTAVivaCellC100C1%0.25, fenol kırmızısı olmadan
Fetal sığır serumu UE

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
  2. Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692(2021).
  3. Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957(2020).
  4. Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616(2023).
  5. Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
  6. Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  7. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  8. Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004(2023).
  9. Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011(2023).
  10. Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013(2023).
  11. Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104(2022).
  12. Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  13. Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
  14. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573(2020).
  15. Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009(2024).
  16. Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  17. Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947(2024).
  18. Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458(2023).
  19. Roche, C. D., et al. durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 63657(2021).
  20. Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), eabq6900 (2022).
  21. Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kappa Carrageenan Microgels3D BioprintingTissue EngineeringGranular Hydrogel BathBioink DepositionMechanical GrindingCell Laden BioinksPhoto Cross Linking

İlgili makaleler