Method Article

İnsan Kalbinin Çok Ölçekli Üç Boyutlu Anatomik Çalışması için Boru Hattı

DOI:

10.3791/66817

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  , 
1University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, UCLA Health System, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Neurocardiology Program of Excellence, UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mikroskobik ve makroskopik ölçekleri kapsayan insan kalplerinden elde edilen örnekleri analiz etmek için kapsamlı bir boru hattı sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantasyon için reddedilen başarısız insan kalplerinin ayrıntılı çalışması, mikroskobik ve makroskopik ölçeklerde yapısal analizler yapmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu teknikler arasında doku temizleme (modifiye immünoetiketleme özellikli solventle temizlenmiş organların üç boyutlu (3D) görüntülemesi) ve immünohistokimyasal boyama yer alır. Mezoskopik muayene prosedürleri stereoskopik diseksiyon ve mikro bilgisayarlı tomografik (BT) taramayı içerir. Makroskopik muayene prosedürleri arasında brüt diseksiyon, fotoğrafçılık (anaglifler ve fotogrametri dahil), BT ve fiziksel veya sanal olarak diseke edilmiş veya tüm kalbin 3D baskısı yer alır. Makroskopik incelemeden önce, kalbin 3D mimarisini ve fizyolojik olarak ilgili morfolojisini korumak için basınç-perfüzyon fiksasyonu yapılabilir. Bu tekniklerin insan kalbini incelemek için kombinasyon halinde uygulanması, kalbin 3D mimarisi bağlamında koroner vaskülatür ve miyokard innervasyonu gibi farklı anatomik özellikler arasındaki ilişkiyi anlamada benzersiz ve çok önemlidir. Bu protokol, metodolojileri ayrıntılı olarak açıklar ve insan kardiyak anatomisi araştırmalarındaki ilerlemeyi göstermek için temsili sonuçlar içerir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşlev formu takip ettiğinden, kalbin mimarisini anlamak, fizyolojisinin takdir edilmesi için esastır. Çok sayıda araştırma, mikrodan makro ölçeklerekadar kardiyak anatomiyi ortaya çıkarmış olsa da, 1,2,3, özellikle insan kardiyak anatomisi ile ilgili olanlar olmak üzere birçok soru çözülmeden kalmıştır. Bu kısmen, fonksiyonel anatomiye odaklanan temel çalışmaların genellikle insan kalbinden farklı olan hayvan kalplerini4,5,6 kullanmasından kaynaklanmaktadır 1,7,8. Ayrıca, her bir çalışma, insan kalbi örneklerini kullananlar bile, çok spesifik yapılara odaklanma eğilimindedir ve bu da bulguların tüm kalp bağlamında uygulanmasını zorlaştırır. Bu, odaklanmış yapılar perinexus9 ve ganglionlu pleksuslar10 gibi mikro veya mezo ölçeklerde ise daha da geçerlidir.

Bu bağlamda, transplantasyon için reddedilen insan kalbinin sistemik yapısal çalışması, mikroskobik ve makroskopik ölçeklerde odaklanan kapsamlı bir kardiyak yapı atlası elde etmek için benzersiz ve nadir bir fırsat sunmaktadır11. Mikroskobik inceleme protokolleri arasında doku temizleme (solventle temizlenmiş organların modifiye immünoetiketleme özellikli üç boyutlu (3D) görüntülemesi, iDISCO+)12,13 ve immünohistokimyasal boyama yer alır. Mezoskopik muayene protokolleri arasında stereoskopik diseksiyon, makro fotoğrafçılık ve mikro bilgisayarlı tomografik (BT) tarama yer alır. Makroskopik muayene protokolleri arasında brüt diseksiyon14, fotoğrafçılık (anaglifler ve fotogrametri dahil)15,16,17, BT, sanal diseksiyon18 ve fiziksel veya sanal olarak diseke edilmiş veya tüm kalbin 3D baskısı 17 bulunur. Makroskopik incelemeye hazırlık olarak, kalbin 3D mimarisini ve fizyolojik olarak ilgili morfolojisini korumak için basınç-perfüzyon fiksasyonu yapılır 14,19,20,21. Bu tekniklerin kombine uygulaması, insan kalbinin 3D mimarisi bağlamında farklı anatomik özellikleri ilişkilendirmek için benzersiz ve çok önemlidir.

Patolojik olmayan bir insan kalbi örneği elde etme fırsatı son derece sınırlı olduğundan, burada açıklanan çok ölçekli bir yaklaşım, örneğin kullanımını en üst düzeye çıkarır. Aşağıda açıklanan çeşitli prosedürleri uygulayarak, temsili sonuçlar okuyucuya, bulguların bilimsel araştırmalardakeşif 11 (kardiyak innervasyonun kapsamlı analizleri, ganglionlu pleksusların dağılımı), klinik prosedürlerin iyileştirilmesi (cerrahi ve girişimsel yaklaşımlar için simülasyon) ve anatomik eğitim (kardiyak anatominin gerçek 3D gösterimi) dahil olmak üzere birden fazla amaç için nasıl kullanılabileceğini gösterecektir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, başarısız olmayan donör insan kalplerinden toplanan tanımlanmamış doku örneklerini kullandı ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Transplantasyon için reddedilen başarısız kalplerden örnekler alındı. Kalpler basınçla perfüze edildi, %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlendi ve aşağıdaki yöntemlere göre doku işlemeden önce görüntülendi. Şekil 1 , etüt sırasının akış şemasını özetlemektedir. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Mikro ölçekli inceleme

  1. Solventle temizlenmiş organların modifiye edilmiş immüno-etiketleme özellikli 3D görüntülemesi (iDISCO+) protokolü kullanılarak doku temizleme.
    1. Konfokal mikroskopi için 3 mm × 16 mm × 25 mm'lik hazneye sığacak şekilde %4 PFA ile sabitlenmiş dokuyu bir neşter ile inceleyin. Daha kalın dokuları görüntülemek için, slayt üzerine ek bölmeler ve/veya ara parçalar istiflenebilir.
    2. Dereceli metanol (MeOH) serisi (%20, %40, %60, %80 ve %100 MeOH) kullanılarak her biri oda sıcaklığında (RT) oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyuncaçalkalama ile dehidrat numuneleri.
    3. RT'de 1 saat boyunca %100 MeOH ile yıkayın ve gece boyunca çalkalayarak RT'de %66 diklorometan / %33 MeOH'ye daldırın.
    4. Ertesi gün, RT'de 1 saat boyunca MeOH'de (%100) iki kez yıkayın, 4 °C'de soğutun ve gece boyunca 4 °C'de MeOH'de (hacim/hacim) %5 H2O2 ile muamele edin.
    5. Dereceli MeOH serisi (%80, %60, %40 ve %20 MeOH) ile rehidrat edin ve çalkalama ile RT'de her biri 1 saat boyunca 0.01 mol / L PBS'de yıkayın.
    6. Dokuları RT'de 1 saat boyunca% 0.2 Triton X-100 ile 0.01 mol / L PBS'de iki kez yıkayın.
    7. Çalkalama ile 37 ° C'de 2 gün boyunca 0.01 mol / L PBS,% 20 dimetil sülfoksit (DMSO),% 0.2 Triton X-100 ve 0.3 mol / L glisin içinde geçirgenleştirerek immüno-etiketlemeye hazırlanın.
    8. % 10 DMSO,% 0.2 Triton X-100 ve% 5 normal eşek serumu ile 0.01 mol / L PBS'yi ajitasyon ile 37 ° C'de 2 gün daha bloke edin.
    9. 37 ° C'de 3-4 gün boyunca 10 mg / mL heparin (PTwH),% 0.2 Tween-20,% 5 DMSO ve% 3 normal eşek serumu ile 0.01 mol / L PBS içinde seyreltilmiş floroforlara konjuge MeOH ile uyumlu bir primer antikor ile etiketleyin.
    10. Antikor çözeltisini doldurun ve çalkalama ile 37 ° C'de 3-4 gün daha inkübe edin.
    11. Primer antikor çözeltisinde 1 haftalık inkübasyondan sonra, RT'de gece boyunca PTwH'de 4 ila 5 kez yıkayın.
    12. PTwH'de seyreltilmiş floroforlara konjuge edilmiş ikincil antikor,% 3 normal eşek serumu ile 37 ° C'de 3 gün boyunca ajitasyon ile inkübe edin.
    13. İkincil antikor çözeltisini doldurun, 37 ° C'de çalkalama ile 3 gün daha inkübe edin.
    14. İkincil antikor çözeltisinde 6 günlük inkübasyondan sonra, RT'de gece boyunca PTwH'de 4-5 kez yıkayın.
    15. Dereceli bir MeOH serisi ile dehidrat (%20, %40, %60, %80, %100 ve %100 MeOH). Numune gece boyunca RT'de saklanabilir.
    16. % 66 diklorometan /% 33 MeOH içinde RT'de 3 saat çalkalama ile inkübe edin.
    17. RT'de çalkalama ile 15 dakika boyunca% 100 diklorometan içinde iki kez yıkayın.
    18. Örnekleri benzil eter içinde inkübe edin ve saklayın. Havanın numuneyi oksitlemesini en aza indirmek için tüpü doldurun.
  2. Doku ile temizlenmiş numunenin görüntülenmesi
    1. Yapıştırıcı içeren bir hazneyi bir slayta yapıştırın ve haznenin çevresine oje sürün. Daha kalın dokular için, slayt üzerine ek odalar ve / veya ara parçalar istiflenebilir.
    2. Temizlenmiş dokuyu hazneye yerleştirin, benzil eter ile doldurun ve bir lamel uygulayın.
    3. Bir conta oluşturmak için lamel etrafına oje sürün.
    4. Lensin çalışma mesafesine kadar bir derinlikte görüntü elde etmek için 5x veya 10x lensli dik lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak döşeme taraması ve Z yığını görüntüleri elde edin.
    5. Kullanılan floroforların emisyon spektrumlarına uygun lazer çizgileri kullanılarak 1024 x 1024 çözünürlükte görüntü. Kas otofloresansı, 488 nm lazer çizgisi kullanılarak görülebilir.
    6. Z ekseni adım boyutunun, belirtilen objektifin11 sayısal açıklığına dayalı olarak Nyquist örneklemesi ile orantılı olduğundan emin olun.
    7. Görüntüleri birleştirin ve 3D görselleştirme için yazılım kullanın.
    8. Tek tek ve birleştirilmiş kanallar için Z yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP) görüntülerini kullanarak şekiller oluşturun (Şekil 2).
  3. İmmünohistokimya
    NOT: Doku parafine22 gömüldükten sonra, immünohistokimyasal çalışma için slaytlar oluşturmak için aşağıdaki prosedür kullanılır.
    1. Kırılma indisi eşleştirme çözeltisinin (RIMS) hazırlanması.
      1. Toplam 1 L (pH 7.4) hacme kadar deiyonize H2O'ya 10.9 gNa2HPO4(susuz) ve 3.1 g NaH 2PO4 (monohidrat) ekleyerek 0.1 mol / L fosfat tamponu hazırlayın. Solüsyonu filtreyle sterilize edin ve RT'de saklayın.
      2. Fosfat tamponunu 0,02 mol/L'ye seyreltin.
      3. Histodenz'i 30 mL 0.02 mol / L fosfat tamponu içinde, buharlaşmayı ve kirlenmeyi en aza indirmek için kapatılabilecek son saklama şişesinde manyetik bir karıştırma çubuğu ile 10 dakika karıştırarak çözün.
      4. Toplam% 0.01 (a / h) konsantrasyona sodyum azid ekleyin ve pH'ı NaOH ile 7.5'e ayarlayın.
      5. Histodenz'in son konsantrasyonunu değiştirerek RI'yi ayarlayın.
      6. RIMS'i aylarca RT'de saklayın. Mikrobiyal kontaminasyon tespit edilirse atın.
        NOT: Sodyum azid içeren herhangi bir çözeltiyi otoklavlamayın.
    2. İmmünohistokimyasal çalışma için slaytların hazırlanması
      1. Mikrotom ile 5 μm kalınlığında kesitler oluşturun. Yüklü slaytlara doku bölümü uygulayın.
      2. Slaytları %>75 ksilen içinde 10 dakika inkübe ederek parafini çıkarın. Slaytları 10 dakika daha ksilen içeren ikinci bir kaba taşıyın.
      3. Slaytları 10 dakika boyunca %100 EtOH'ye, ardından 5 dakika boyunca %95 EtOH'ye ve 5 dakika boyunca %70 EtOH'ye batırarak ksileni çıkarın.
      4. Slaytları deiyonize H2O ile 5 dakika durulayın.
      5. Slaytları 90-95 ° C'de 25 dakika boyunca antijen alma tamponuna daldırın.
      6. Kabın çalkalama ile 1 saat RT'ye soğumasını bekleyin.
      7. Slaytları 0.01°C'de 30 dakika boyunca ıslatma tamponuna (0.4 mol/L PBS + %100 Triton X-4) daldırın.
      8. Dokuyu bir PAP kalemi ile çevreleyin. Her slayta PBS ekleyin ve kurumasını önlemek için nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin.
      9. Slaytları RT'de PBS ile 5 dakika çalkalayarak yıkayın.
      10. Çalkalama ile 1 saat boyunca bloke edici tamponlu blok (0.01 mol / L PBS +% 10 Eşek Serumu +% 0.1 TX-100).
      11. Gece boyunca 4 ° C'de bloke edici tampon içinde seyreltilmiş bir birincil antikor ile inkübe edin.
      12. Ertesi gün, slaytların 15 dakika RT'ye ısınmasına izin verin.
      13. Slaytları 0,01 mol/L PBS + %0,2 TritonX-100 ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
      14. Çalkalama ile RT'de 1 saat boyunca bloke edici tampon içinde seyreltilmiş ikincil bir antikor ile inkübe edin.
      15. Slaytları 0,01 mol/L PBS + %0,2 TritonX-100 ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
      16. Slaytları 0,01 mol/L PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.
      17. Bir damlalık ile 1 damla JANT yerleştirin ve bir lamel uygulayın.
      18. Contayı oluşturmak için lamel etrafına oje sürün.
      19. Negatif bir kontrol olarak, spesifik boyamanın olmadığını göstermek için birincil antikor olmadan bir numune çalıştırın.
    3. İmmün lekeli slaytların görüntülenmesi
      1. Slaytları 10x, 20x ve 40x objektif lensli lazer taramalı konfokal mikroskopla görüntüleyin.
      2. Kullanılan ikincil antikorların emisyon spektrumlarına uygun lazer çizgileri kullanılarak 1024 x 1024 çözünürlükte görüntü.
      3. Tek tek ve birleştirilmiş kanallar için Z yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP) görüntülerini kullanarak şekiller oluşturun (Şekil 3).

2. Mezo ölçekli inceleme

  1. Stereoskopik diseksiyon
    1. Atriyoventriküler düğüm, atriyoventriküler düğüm arter ve kardiyak sinir pleksus (milimetre altı ila milimetre ölçeğinde) gibi küçük veya ince yapılara odaklanan hassas diseksiyonları kelepçeli bir büyüteç masa lambası, cerrahi teleskoplar veya stereomikroskop ile gerçekleştirin.
  2. Mikro-CT taraması
    NOT: BT görüntüleme, basınç perfüzyonu ve fiksasyondan sonra ve diseksiyonun herhangi bir aşamasında mikropozitron emisyon tomografisi (PET)/BT tarayıcı kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 4).
    1. Örnek görüntülemeden önce CT X-ışını kaynağını 25 dakika ısıtın.
    2. Kalp örneğini tarayıcı yatağına yerleştirin.
    3. Kalbi CT görüş alanında (FOV) ortalamak için tarayıcı yatağını 544 mm yatay konuma ve 14 mm dikey konuma getirin.
    4. 200 μm uzamsal çözünürlükte 1 dakikalık tarama süresi boyunca 720 projeksiyonla 80 kVp, 150 μA'da CT görüntüsü elde edin.
    5. CT verilerini 12 cm x 12 cm x 10 cm görüş alanı ve 600 x 600 x 500 vokselden oluşan bir matris ile yeniden oluşturun ve bir DICOM dosyası olarak kaydedin.

3. Makro ölçekli inceleme

  1. Basınç perfüzyonu ve fiksasyonu
    NOT: Yazarlar daha önce tarif edilen basınç perfüzyonu ve fiksasyon tekniklerini değiştirir ve bunları transplantasyon için reddedilen başarısız olmayan insan kalplerine uygular 14,19,20,21.
    1. Perfüzyon fiksasyonu için yüksek akışlı pompalar kullanın. Fiksatif için %100 etanol14, %4 PFA veya %10 formalin kullanın.
      NOT: Kalp, çıkan aort, pulmoner gövde ve her iki vena kava ile kurtarılır ve pulmoner venler mümkün olduğunca distal olarak rezeke edilir ve Wisconsin Üniversitesi solüsyonu23'te verilir.
    2. Sağ ve sol kalp perfüzyonu için iki adet 20-24 Fr cerrahi kanül kullanın. Sağ kalp perfüzyonu için, superior vena kava'yı kanül edin ve pulmoner gövdeye veya pulmoner artere, üç musluklara bağlı Luer-Lock uçları olan yarı kesilmiş 12-30 mL boyutunda plastik şırıngalarla bir havalandırma deliği yerleştirin.
    3. Uygun boyutta kilitli, yarı kesilmiş plastik şırınga veya 1.5-5.0 mL santrifüj tüpü koyduktan sonra inferior vena kava ve diğer pulmoner arteri sicim ile kapatın.
      1. Sol kalbin antegrad perfüzyonu için, pulmoner venlerden birini kanül edin ve aortun distal kesi ucuna, üç musluklara bağlı Luer-Lock uçlu yarı kesilmiş 12-30 mL boyutlu plastik şırıngalarla bir havalandırma deliği yerleştirin.
      2. Sol kalbin retrograd perfüzyonu için, aort ark dallarından birini kanül edin ve aort arkının başka bir dalına bir havalandırma deliği yerleştirin. Kanüllerin uçlarını her iki ventriküle yerleştirin.
    4. Uygun boyutta kilitli, yarı kesilmiş plastik şırınga veya 1.5-5.0 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirdikten sonra diğer damar deliklerini sicim ile kapatın. Sızıntıyı ve kaymayı önlemek için şırıngaların / tüplerin / kanüllerin yerleştirme kısmını kapatmak için ince bir gazlı bez kullanın. Dikiş, bantlama veya topaklanma kullanarak büyük sızıntıları düzeltin. Küçük sızıntılara izin verilir.
    5. Kalbi plastik bir kapta asın.
    6. Her bir kanüle 22-24 Fr yumuşak plastik boru bağlayın ve tüpün diğer ucunu fiksatif ile dolu kaba yerleştirin.
    7. Sağ ventrikülde yaklaşık 20 mmHg ve sol ventrikülde 80 mmHg elde etmek için sağ kalp için yaklaşık 100-300 mL / dk ve sol kalp için 200-400 mL / dk'ya ayarlanmış yüksek akışlı bir pompa kullanarak fiksatifi sağ ve sol kalp devrelerinde dolaştırın.
    8. Perfüzyonu 24 saat boyunca 4 ° C'de tutun.
    9. Kalbi 0.01 mol / L PBS ile 30 dakika boyunca dört kez çalkalayarak yıkayın.
    10. Kalbi 4 °C'de 0,01 mol/L PBS/%0,02 sodyum azid içinde saklayın.
      NOT: Basınç perfüzyon fiksasyonu, mumyalanmış bir kadavradan kurtarılan bir kalp için değil, yalnızca taze bir kalp için etkilidir.
  2. Brüt diseksiyon
    1. Diseksiyonun her aşamasında fotoğraf kayıtları ile progresif diseksiyon yapın.
    2. Klinik alaka düzeyini korumak için, kalbin fizyolojik morfolojisini korumak için herhangi bir yapıyı bozmaktan/deforme etmekten kaçınmaya özellikle dikkat edin.
    3. Sağ ön eğik oryantasyon gibi klinik olarak ilgili oryantasyonu kullanarak hedef yapıları görüntüleyin.
  3. Fotoğrafçılık
    1. Basınçla perfüze edilmiş ve sabitlenmiş kalbi, birden fazla çatalla monte edilmiş bir platforma ve 360derece dönebilen bir tripoda yerleştirin.
    2. Dijital tek lensli refleks kamera (Şekil 5)24 kullanarak kalbin fotoğrafını çekerken, C-Standlara yerleştirilmiş birden fazla ışık yayan diyot ışık paneli ve geniş siyah yorgan arka plan bezi kullanın.
    3. Konunun bozulmasını en aza indirmek için 200-4 ft çalışma mesafesi için uzun odak uzaklığına (6 mm) sahip lensi kullanarak fotoğraf çekin14.
  4. Anaglyphs
    1. Anaglif görüntüleri görüntülemek için, yatay düzlemde dönüş açısında 10°'lik bir farkla CT veri kümelerinden bir çift fotoğrafı veya hacimle oluşturulmuş görüntüleri yeniden oluşturun.
    2. Stereogram olarak adlandırılan bu iki boyutlu (2D) görüntülerden oluşan bir seti, ücretsiz16 kullanarak anagliflere dönüştürün.
    3. Bir anaglif görüntülemek için kırmızı/camgöbeği gözlükler kullanın.
  5. Fotogrametri
    NOT: Fotogrametri, farklı açılarda çekilmiş birden fazla iki boyutlu fotoğraftan üç boyutlu yüzey işlemeli bir rekonstrüksiyon oluşturmaya yönelik uygulamalı bilimdir17.
    1. Bir akıllı telefon ile yüzlerce çok yönlü fotoğraf elde etmek için numuneyi C-Standlara asın veya döndürme tablasına yerleştirin.
    2. Piyasada bulunan yazılımı kullanarak 3B modeli FBX formatında oluşturun.
  6. Bilgisayarlı tomografi (CT) taraması
    NOT: BT taraması, basınç perfüzyonu ve fiksasyondan sonra ve diseksiyonun herhangi bir aşamasında yapılabilir.
    1. Kalp örneğini, kabın üst kısmına yerleştirilmiş bir çubuktan asın. Tarama sırasında kalbin sallanmasını önlemek için, kabın dibine sabitlenmiş plastik tırnaklarla kalbin tabanını destekleyin. Böylece, hava negatif bir kontrast görevi görecektir.
    2. Aşağıdaki parametrelere sahip, piyasada bulunan çok dedektörlü sıralı bir CT tarayıcı kullanarak CT taramasını gerçekleştirin: 120 kV tüp voltajı, 800-900 mA tüp akımı ve 280 ms'lik bir portal dönüşü. Doz uzunluğu ürünü genellikle 500-1200 mGy.cm'dir.
    3. Aşağıdaki parametreleri kullanarak eksenel görüntü verilerini yeniden oluşturun: bir kesit kalınlığı, 0,6 mm; artımlı bir aralık, 0,3 mm; mümkün olduğunca küçük bir görüş alanı (genellikle 100-200 mm); ve bir matris, 512 × 512.
  7. Sanal diseksiyon
    1. Sanal diseksiyon görüntüleri oluşturmak için piyasada bulunan yazılımı kullanarak BT tarama görüntülerini analiz edin.
      NOT: Sanal diseksiyon, odağın kalp odalarının ve damarlarınduvarlarına kaydırıldığı hacim oluşturma işleminin bir modifikasyonudur 18. Bu süreçte, manuel eşikleme, geliştirilmiş odayı orijinal veri kümelerinden neredeyse kaldırır.
    2. Brüt diseksiyona benzer görüntüler üretmek için geliştirilmemiş duvarları, septaları ve valfleri sanal diseksiyon ile görselleştirin. Kalp örneklerinin brüt diseksiyonundan farklı olarak, sanal diseksiyon sırasında kesilen düzlemler pratik olarak sınırsızdır. İlgilenilen yapıları gerektiği gibi görselleştirmek için hemen hemen her görünüm yeniden oluşturulabilir.
  8. 3D baskı
    1. Kalp örneğinin uyumlu dosyasını 3D yazıcı yazılımında açın.
    2. 3D yazıcıdaki baskı Ayarları için 0,10 mm Hızlı DETAY profilini kullanın ve baskı hızını 20 mm/sn'ye düşürün. Destek malzemesi oluştur'u etkinleştirin.
    3. 3D yazıcıda "Filament Ayarları" için TPU filament profilini kullanın.
    4. Yazıcıdaki "Yazıcı Ayarları" için Orijinal Prusa MK4 Giriş Şekillendirici 0.4 nozulunun profilini kullanın.
    5. Dilimleme tamamlandıktan sonra, BGCODE dosyasını 3D yazdırma için bir USB flash sürücüye kaydedin.
    6. İnsan kalbi örneğini 3D yazdırmak için 1,75 mm TPU filamenti kullanın. 3D baskıdan önce, bir filament kurutucu kullanarak TPU filamentini 6 saat kurutun.
    7. 3D baskı sırasında filament gerginliğini azaltmak için, filament makarasının dönüşünü kolaylaştırmak için filament makarasını yerleşik bir yatağa sahip bir makara tutucusuna yerleştirin. Dokulu toz boyalı çelik sac ile piyasada bulunan bir 3D yazıcı kullanarak 3D baskı gerçekleştirin.
    8. 3D baskı tamamlandığında destek malzemelerini dikkatlice çıkarın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro ölçekli incelemeler
Doku temizleme uygulamak, konfokal mikroskopi kullanılarak daha büyük hacimlerde dokuların 3D olarak görüntülenmesine olanak tanır. Kalpte, kardiyak nöronları içeren ganglionlar ve miyokard innervasyonunun nöral paterni görüntülenebilir (Şekil 2). Şekil 3 , sinirler ve düz kas hücreleri için immün boyanmış insan sol ventrikül miyokardının konfokal bir görüntüsünü göstermektedir. Kan damarlarının miyokardiyumu geçtiği not edilir ve hem kan damarlarıyla ilişkili hem de kan damarlarından bağımsız olarak çok sayıda sinir lifi tanımlanır.

Orta ve makro ölçekli incelemeler
24 saatlik basınç perfüzyonu ve fiksasyonu için mutlak etanol kullanıldığında, numunenin doğal rengi ağartılır, doku25 kurutulur ve elastikiyet önemli ölçüde azalır. Öte yandan, PFA ve formalin ile fiksasyon üzerine, doğal renk ve elastikiyet önemli ölçüde korunur. Bu nedenlerden dolayı, PFA veya formalin esas olarak tercih edilen fiksatif olarak kullanılır.

Şekil 6 , brüt diseksiyon, sanal diseksiyon, STL poligon modeli ve üç boyutlu baskının temsili görüntülerini göstermektedir. Şekil 7 , hem brüt hem de sanal diseksiyon görüntülerinden oluşturulan anagliflerin temsili görüntülerini göstermektedir. Anaglif camlar ile derinlik algısı elde edilebilir. Yakalanan tek fotogrametrik model, ticari olarak temin edilebilen yazılım kullanılarak hemen hemen her yönden gözlemlenebilir ve rutin transkateter kardiyak prosedürlerle ilgili karmaşık anatomik özellikleri gösterir. Basınç, perfüzyon ve fiksasyon ile hazırlanan kalbe bu teknikler uygulanarak, kalbe ait üç boyutlu bilgiler dijital veya fiziksel olarak neredeyse sonsuza kadar saklanabilmekte ve sınırsız olarak paylaşılabilmektedir. Şekil 8 , nakil için reddedilen diseke kalplerden çoğaltılan P ölçekli 3D baskıları göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Protokolün akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İnsan sağ atriyumunun doku temizlenmiş bölümü. (A) Doku temizleme için diseke edilen sağ atriyal ganglionated pleksus (RAGP) ile bir insan hakları atriyumunun sağ posterior eğik görünümü. (B) Doku temizlemeden önce ve sonra RAGP örneği. (C) Pan-nöronal belirteç protein gen ürünü 9.5 (PGP9.5) ile immün olarak boyanmış gangliyonları (ok uçları) gösteren insan RGP'sinin iDISCO+ ile temizlenmiş bir kısmının maksimum yoğunluk projeksiyonu. Ölçek çubukları 1 cm (A), 5 mm (B) ve 500 μm'dir (C). Bu şekil Hanna ve ark.11'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İnsan sol ventrikülünün immün boyalı slaytları. Pan-nöronal belirteç protein gen ürünü 9.5 (PGP9.5) ve düz kas hücresi belirteci α-düz kas aktini (αSMA) ile immün olarak boyanmış insan sol ventrikül miyokard diliminden konfokal görüntü. Kas otofloresansı, 488 nm lazer çizgisi (yeşil) kullanılarak görülebilir. Ölçek çubuğu 50 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kalp örneklerinin mikro bilgisayarlı tomografik görüntülemesi. (A) Kalp örneği görüntüleme için mikro bilgisayarlı tomografi kurulumu. (B) Mikro bilgisayarlı tomografi görüntüleme için kullanıcı arayüzü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: UCLA Kardiyak Aritmi Merkezi'ndeki fotoğraf stüdyosu ortamı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Aort ve mitral kapak kompleksinin brüt diseksiyonu (sol üst), sanal diseksiyon (sağ üst), STL poligon modeli (sol alt) ve üç boyutlu baskı (sağ alt) görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Aort ve mitral kapak kompleksinin brüt diseksiyonu (solda) ve sanal diseksiyonunun (sağda) anaglifleri. Derinlik algısı elde etmek için anaglif camlar (kırmızı / camgöbeği) gereklidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Kalp örneklerinin üç boyutlu baskısı. (A) TPU filament ile kalp örneği 3D baskı için üç boyutlu (3D) yazıcı kurulumu. (B) Bu çalışmada açıklanan yöntemler kullanılarak üretilen temsili kalp 3D baskıları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, tüm insan kalplerinden elde edilen örnekleri analiz etmek için kapsamlı bir boru hattını göstermektedir. Temsili sonuçlar, tek bir kalp için rutin olarak gerçekleştirilen mikro-makro ölçekli anatomik muayeneleri göstermektedir. Bir insan kalbi örneği son derece değerli olduğundan, bilimsel araştırmalarda keşif, klinik prosedürlerin iyileştirilmesi ve tüm kalp bağlamında anatomik korelasyonun sürdürülmesi ile anatomik eğitim dahil olmak üzere çeşitli amaçlar için birden fazla protokol uygulayarak numunenin herhangi bir parçasını israf etmemek için çok ölçekli bir yaklaşım ideal ve etkilidir.

Mikro ölçekli inceleme ile ilgili olarak, insan kardiyak örneklerinin sitomimarisini anlamak için immünoboyama ve mikroskopi uygulanabilir. Burada, hücresel ölçekte kardiyak nöroanatomiyi incelemek için doku temizleme ve immünohistokimyanın uygulanması gösterilmiştir. Bu tekniklerin kullanımı, kardiyak iletim sistemi ve kalp odaları gibi ilgilenilen yapılarla ilişkili olarak kardiyak sinir sistemi ve miyokard innervasyon paternlerinin karakterizasyonunda yardımcıdır. Mükemmel uzamsal çözünürlük elde edilmesine rağmen, özellikle doku ile temizlenmiş örnekler için konfokal mikroskopi kullanımı zaman alıcıdır. Işık tabakası mikroskobu, uzamsal çözünürlük pahasına görüntü elde etme süresini azaltmak için kullanılabilir.

Mezo-makro ölçekli inceleme ile ilgili olarak, yazarların kurumundaki mikro-BT tarayıcılarının uzamsal çözünürlüğü 10-200 μm arasında değişmektedir. Numune boyutu 10 μm'lik bir tarama için 20 mm ve 100-200 μm'lik bir tarama için 120 mm ile sınırlıdır. Yazarların kurumundaki mikro-BT tarayıcıları tüm kalbi barındıramaz. Bu nedenle, yazarların kurumunda, tüm kalp taraması, 600 μm uzamsal çözünürlüğe sahip bir klinik BT tarayıcısının kullanılmasını gerektirir, ancak ilerlemeler tüm kalbi görüntüleyebilen mikro-BT tarayıcılarının geliştirilmesine izin vermiştir2. Foton sayma CT gibi teknolojik gelişmeler kesinlikle daha fazla olasılığı genişletecektir. STL dosyasının uzamsal çözünürlüğünün iyileştirilmesi, 3D baskının kalitesini daha da iyileştirmenin ilk adımı olmalıdır. 3D baskının daha yüksek maliyeti, tekniğin rutin klinik uygulamaya uygulanmasını sınırlar. Herhangi bir akıllı telefon uygulamasından oluşturulan fotogrametri görüntülerinin geliştirilmesi kolaydır ve kabul edilebilir kalitededir, ancak çözünürlüğü iyileştirmek için daha karmaşık ancak pahalı ve zaman alıcı sistemler gerektirecektir26. 3D olarak görselleştirmek için, özel başlık dişlisi27,28 ve holografik monitörler29 ile genişletilmiş gerçeklik ek araçlardır, ancak aynı zamanda daha yüksek maliyetle sınırlıdır.

Özetle, mikroskobik ve makroskopik ölçeklerde kapsamlı yapısal analizler yoluyla, her yapının mikro ölçekli anatomisi ve fonksiyonel katkısı tüm kalp bağlamında anlaşılabilir. Yüksek çözünürlüklü görüntülemenin gelişmesiyle birlikte, mikro ve makro ölçekli anatomi arasındaki mesafe önemli ölçüde genişlemektedir. Kardiyomiyositlerin elektron mikroskobik analizinde uzmanlar, mitral broşürlerin sayısına aşina olmayabilir ve bunun tersi de geçerlidir. Kardiyak morfolojinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırmak için, bilim adamları, tüm ormanın kuşbakışı görünümünü korurken, her ağacın daha fazla ayrıntısını keşfetmeye devam etmelidir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eğitim ve araştırmanın ilerlemesi için bedenlerini bağışlayan bireylere teşekkür ederiz. Araştırma için bağışçı kalpleri elde etmenin temelini oluşturan OneLegacy Vakfı'na minnettarız. UCLA Translasyonel Araştırma Görüntüleme Merkezi'nden (Radyoloji Bölümü) Anthony A. Smithson ve Arvin Roque-Verdeflor'a da BT veri toplamadaki destekleri için minnettarız. Bu proje UCLA Amara Yad Projesi tarafından desteklenmiştir. Araştırma için bir insan kalbi boru hattı kurdukları ve sürdürdükleri için Dr. Kalyanam Shivkumar ve Olujimi A. Ajijola'ya müteşekkiriz. Araştırma Operasyonları Müdürümüz Amiksha S. Gandhi'ye projelerimizi desteklemeye olan bağlılığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibeleri OT2OD023848 ve P01 HL164311 ve Leducq hibesi 23CVD04'ü Kalyanam Shivkumar'a, Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü 23CDA1039446'yı PH'ye ve UCLA Amara-Yad Projesi'ne (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project) vererek mümkün olmuştur. Bu çalışmada kullanılan GNEXT microPET/CT tarayıcısı, NIH Hayvan Araştırmaları için Ortak Enstrümantasyon Hibesi (1 S10 OD026917-01A1) tarafından finanse edilmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x Fosfat tamponlu tuzlusu Sigma-AldrichP3813
3D GörüntüleyiciMicrosoft
647 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgGJackson İmmüne Araştırma Laboratuvarları711-605-152
647 AffiniPure Eşek Anti-Koyun IgGJackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED objektifNikon
Anti-Aktin, &alfa;-Düz Kas - Cy3 antikoruSigma-AldrichC6198
Antijen Alma Tamponu (100x EDTA Tamponu, pH 8.0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (protein gen ürünü 9.5)Abcamab108986
Anti-TH (tirozin hidroksilaz)Abcamab1542
Anti-VAChT (veziküler asetilkolin taşıyıcısı)Sinaptik Sistemler139 103
Benzil eterSigma-Aldrich108014
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA4503-10G
Cheetah 3D yazıcı filamenti (95A), 1,75 mmNinjaTek
Lamel, 22 mm x 30 mm, No. 1.5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgGJackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları711-165-152
DiklorometanSigma-Aldrich270997-100ML
Dimetil sülfoksitSigma-AldrichD8418-500ML
Etanol,% 100Decon laboratuvarları2701
GlisinSigma-AldrichG7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences,
Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzuSigma-AldrichH3149-50KU,
Histodenz, Sigma-AldrichD2158-100G,
Hidrojen peroksit çözeltisiSigma-AldrichH1009-500ML
Görüntüleme yazılımı, ZeissZEN (black edition)
Görüntüleme yazılımıOxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3mm
KIRI MotorKIRI İnovasyon
Lazer taramalı konfokal mikroskopZeissLSM 880
LEAD-2 - Dikey & Çok Kanallı Peristaltik PompaDAHA UZUN
Lightview XL Brightech
Metanol (Sertifikalı ACS)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
Normal eşek serumuJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Orijinal Prusa MK4 3D yazıcıPrusa Araştırma
PAP kalemiAbcamab2601
Paraformaldehit, %32Elektron Mikroskobu Bilimleri15714-S
PolycamPolycam
Birincil antikor
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic İkincil
antikor
SlowFade Altın Antiface MountantInvitrogenS36936
Sodyum azid, %5 (a/h)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Tanımı ASSiemens Healthcare
Standart Alan Cerrahi Özellikli Teleskoplar, Vision
Stereomikroskop Sistemi SZ61OLYMPUS
StereoPhoto MakerMasuji Suto
Mikroskop Slaytları, Önceden TemizlenmişFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
KsilenSigma-Aldrich534056-4L
Ziostation2Ziosoft,
, , , için Tasarımlar Superfrost Plus tarafından geliştirilen ücretsiz yazılım

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tawara, S. Das reizleitungssystem des säugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie über das atrioventrikularbündel und die purkinjeschen fäden. Jena: Gustav fischer. , https://wellcomecollection.org/works/gnxjxg9e (1906).
  2. Stephenson, R. S., et al. High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling. Sci Rep. 7 (1), 7188(2017).
  3. Kawashima, T., Sato, F. First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination. Sci Rep. 11 (1), 8636(2021).
  4. Bojsen-Moller, F., Tranum-Jensen, J. Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart. J Anat. 108, Pt 3 375-386 (1971).
  5. Zhao, Y., et al. Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs. Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).
  6. Chung, W. H., et al. Ischemia-induced ventricular proarrhythmia and cardiovascular autonomic dysreflexia after cardioneuroablation. Heart Rhythm. 20 (11), 1534-1545 (2023).
  7. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: Comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  8. Saburkina, I., Pauziene, N., Solomon, O. I., Rysevaite-Kyguoliene, K., Pauza, D. H. Comparative gross anatomy of epicardiac ganglionated nerve plexi on the human and sheep cardiac ventricles. Anat Rec (Hoboken). 306 (9), 2302-2312 (2023).
  9. Hoagland, D. T., Santos, W., Poelzing, S., Gourdie, R. G. The role of the gap junction perinexus in cardiac conduction: Potential as a novel anti-arrhythmic drug target. Prog Biophys Mol Biol. 144, 41-50 (2019).
  10. Aksu, T., Gopinathannair, R., Gupta, D., Pauza, D. H. Intrinsic cardiac autonomic nervous system: What do clinical electrophysiologists need to know about the "heart brain". J Cardiovasc Electrophysiol. 32 (6), 1737-1747 (2021).
  11. Hanna, P., et al. Innervation and neuronal control of the mammalian sinoatrial node a comprehensive atlas. Circ Res. 128 (9), 1279-1296 (2021).
  12. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10, 1944(2019).
  13. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Mcalpine, W. Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment. Springer-verlag. , ISBN 13: 9783540069850 (1975).
  15. Mori, S., Shivkumar, K. Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine. Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).
  16. Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures. Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).
  17. Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy. JACC Case Rep. 21, 101937(2023).
  18. Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy. J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30(2020).
  19. Thomas, A. C., Davies, M. J. The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation. Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).
  20. Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. Controlled pressure fixation apparatus for hearts. Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).
  21. Iaizzo, P. A. The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy. Europace. 18, suppl 4 163-172 (2016).
  22. Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue. J Vis Exp. (201), e65850(2023).
  23. Tripathy, S., Das, S. K. Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges. Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).
  24. Mori, S., Shivkumar, K. Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1). Cardiotext. , (2022).
  25. Crosado, B., et al. Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand. Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).
  26. Titmus, M., et al. A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry. J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).
  27. Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine. JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).
  28. Maresky, H. S., et al. Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education. Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).
  29. Mori, S., Shivkumar, K. Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display. Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Heart AnatomyThree Dimensional ImagingTissue ClearingConfocal MicroscopyMicro CT ScanningPressure Perfusion FixationImmunohistochemical StainingGross DissectionCardiac Innervation3D Heart Model

Related Articles