Yöntem makalesi

Farelerde Cerrahi Lomber Sempatektomi

5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66821

⸱

5 Temmuz 2024

 , 
1Medical Scientist Training Program, Emory University School of Medicine, 2Neuroscience Graduate Program, Laney Graduate School, Emory University, 3Department of Cell Biology, Emory University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, postganglionik lomber sempatik nöronların bir fareden cerrahi olarak çıkarılması için bir protokol sunmaktadır. Bu prosedür, distal doku hedeflerinde sempatik innervasyonun rolünü araştırmayı amaçlayan çok sayıda çalışmayı kolaylaştıracaktır.

Özet

Periferik sinir yaralanmaları sık görülür ve hastaların sadece %10'unda yaralanma sonrası tam fonksiyonel iyileşme sağlanır. Sempatik sinir sistemi, bedensel homeostazın korunmasında birçok kritik rol oynar, ancak nadiren periferik sinir hasarı bağlamında incelenmiştir. Periferdeki distal hedeflerde postganglionik sempatik nöronal fonksiyonların kapsamı şu anda belirsizdir. Periferik hedeflerin sempatik innervasyonunun rolünü daha iyi araştırmak için, cerrahi bir "nakavt" modeli alternatif bir yaklaşım sağlar. Bu kimyasal olarak elde edilebilse de, postganglionik sempatik nöronların kimyasal yıkımı spesifik olmayabilir ve doza bağımlı olabilir. Bir zamanlar küçük hayvanlarda "neredeyse uygulanamaz" olduğu düşünülen farelerde cerrahi lomber sempatektominin kullanılması, arka bacakları innerve eden postganglionik sempatik nöronların spesifik olarak hedeflenmesine izin verir. Bu el yazması, L2-L5 lomber sempatik gangliyonların, arka pençe ter tepkisini ve siyatik sinirdeki sempatik akson sayısını güvenilir bir şekilde azaltan bir sağkalım ameliyatı olarak bir fareden cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır.

Giriş

Periferik sinir yaralanmaları (PNI'ler) distal doku hedeflerinde nadiren fonksiyonel olarak tam olarak iyileşen motor, duyusal ve sempatik defisitlere yol açabilir1. PNI araştırması genellikle motor ve duyusal yenilenme üzerine odaklanmıştır; Bununla birlikte, sıçan siyatik sinirinin yaklaşık dörtte biri miyelinsiz sempatik aksonlardan oluşur2. Bununla birlikte, periferik dokularda sempatik innervasyonun rolü tam olarak anlaşılamamıştır3. Sempatik sinir sistemi, bedensel homeostazın korunmasında, bağışıklık regülasyonuna, termoregülasyona, vasküler tonusa, mitokondriyal biyogeneze ve daha fazlasına katılmada önemli bir rol oynar 4,5,6,7,8,9,10,11 . Nöromüsküler kavşakta sempatik innervasyon kaybolduğunda, motonöron innervasyonunun korunmasına rağmen kalıcı kas güçsüzlüğü ve sinaptik instabilite gözlenir12. Nöromüsküler kavşaktaki sinaptik iletimin bu sempatik regülasyonunun yaşlanma ile azaldığı gösterilmiştir 13,14, bu da kas kütlesi, kuvveti ve gücünde yaşa bağlı azalma olarak tanımlanan sarkopeniye katkıda bulunur15. Periferik dokuların sempatik innervasyonunun rolünün daha iyi anlaşılması, PNI'ler ve diğer sempatik disfonksiyon formları olan hastalar için fonksiyonel sonuçları optimize edecek tedavilerin geliştirilmesi için gereklidir.

Sempatektomi, distal hedef dokularda sempatik innervasyonun rolünün araştırılmasına izin verecek güçlü bir deneysel araçtır. Spesifik olarak, L2-L5 seviyesindeki sempatik gangliyonların çıkarılması, alt ekstremitelere sempatik innervasyonun çoğunu ortadan kaldırır, bu da özellikle siyatik sinirle ilgilenen araştırmacılar için yararlıdır.

Bu protokol, hayatta kalma ameliyatı olarak bir fareden L2-L5 seviyesi postganglionik sempatik nöronların çıkarılmasını detaylandırır. Bu prosedür, kemirgen mikrocerrahi becerileri ve fare anatomisine aşinalık gerektirir ve etkili bir şekilde uygulandığında, herhangi bir görünür fenotipik farklılığa neden olmaz. Kemirgen araştırmalarında cerrahi lomber sempatektomi kullanılmıştır, sıçanlarda farelere göre daha fazla 16,17,18,19,20,21; Ancak, protokolü açıklayan ayrıntılı bir protokol şu anda mevcut değildir. Lomber sempatektomiyi kullanan önceki çalışmalar, öncelikle çeşitli sinir yaralanması modellerinde genellikle sempatektomi ile zayıflatılan ağrı yanıtında sempatik innervasyonun rolüne odaklanmıştır. Farelerdebu tekniği 22 kullanmıştır, muhtemelen anatomik işaretlerin daha küçük boyutu nedeniyle, cerrahi sempatektomi kullanımının küçük hayvanlarda "neredeyse uygulanabilir olmadığına" inanılmaktadır23,24. Mikrosempatiektomiler şeklindeki lokalize sempatikektomiler, kemirgen modellerinde, çoğunlukla ağrı davranışları bağlamında da kullanılmıştır 25,26,27. Mikrosempatektomi, total lomber sempatektominin aksine, gri ramusun belirli bir spinal sinire giden bir segmentinin bağlantısının kesildiği ve çıkarıldığı bir dorsal yaklaşım kullanır ve bu da daha geniş yayılımlı yan etkilerden kaçınacak çok hedefli bir sempatektomiye izin verir.

Fare modelleri, genetik manipülasyon gerektiren birçok çalışma için kritik öneme sahip olduğundan, bu prosedür periferik sinir yaralanmalarının genişliğinin ötesinde de çok yönlü uygulamalara sahip olacaktır. Transabdominal bir yaklaşım kullanılarak, lomber sempatik gangliyonlar, belirgin bir yan etki olmaksızın fareden güvenilir bir şekilde görüntülenebilir ve rezeke edilebilir. Postganglionik sempatik nöronların kimyasal yıkımı için 6-hidroksidopamin (6-OHDA) kullanımı gibi protokoller mevcut olmasına rağmen23,24, bu cerrahi prosedür postganglionik lomber sempatik ganglionların anatomik olarak spesifik hedeflenmesine izin verir. Cerrahi sempatektomi kullanımı, farmakolojik yöntemlerle ilgili spesifik olmayan ve doza bağlı endişeleri de ortadan kaldırır28,29.

6-OHDA uygulaması yoluyla kimyasal sempatiektomilerin kullanımı, 1967'de küçük hayvanlarda cerrahi sempatiektomiler tercih edilmediğinden, adrenerjik sinir uçlarının seçici yıkımını sağlamanın basit bir yolu olarak tanımlanmıştır23,24. 6-OHDA, Parkinson hastalığı olan hastalarda endojen olarak oluşan katekolaminerjik bir nörotoksindir ve toksisitesi, mitokondride serbest radikaller oluşturma ve elektron taşıma zincirini inhibe etme yeteneğinden kaynaklanır30,31. Norepinefrin alımı-1 taşıma mekanizmaları sayesinde, 6-OHDA, postganglionik sempatik nöronlar28 gibi noradrenerjik nöronlar içinde birikebilir. Sonunda, nöron 6-OHDA tarafından yok edilir; Bununla birlikte, periferik sinir sistemindeki terminaller, amin seviyeleri hala azaldığında bile fonksiyonel aktivitenin restorasyonu ile yenilenir. 6-OHDA'ya yanıt olarak farklı organlar için farklı dozaj eşikleri de mevcuttur ve daha yüksek dozlarda 6-OHDA'nın daha spesifik olmayan etkiler sergilediği, nörotoksik sonuçlarını katekolamin içermeyen nöronlara ve hatta nöronal olmayan hücrelere genişlettiği gösterilmiştir. Noradrenerjik nöronların yanı sıra, dopaminerjik nöronlar da 6-OHDA'danetkilenir 29, bu da kimyasal sempatektomiyi postganglionik sempatik nöronlara cerrahi sempatektomiden daha az spesifik hale getirir.

Bu nedenle, cerrahi bir lomber sempatektomi, sempatik sinir sisteminin çeşitli yaralanma ve hastalık durumlarına nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için farede çeşitli deneysel teknikler ve genetik manipülasyonlarla birleştirilebilen, sempatik innervasyonun alt ekstremitelere hedefli ablasyonunu sağlar.

Protokol

Tüm deneyler, Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı (IACUC protokol numarası PROTO201700371 altında). Bu çalışmada 14 haftalık ve 16-21 g ağırlığında dört yetişkin dişi vahşi tip C57BL / 6J faresi kullanıldı. Burada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

  1. Cerrahi aletleri otoklavlayın: 1 çift keskin makas, 2 ince uçlu cımbız, 1 iğne ucu.
  2. Bir ısıtma yastığını 37 °C'ye ısıtın ve ameliyat masasının altına yerleştirin.
  3. Anestezi indüksiyon odası da dahil olmak üzere cerrahi alana dezenfektan püskürtün ve kağıt havluyla iyice silin.
  4. Fareyi tutmadan önce uygun önlük giydiğinizden ve el yıkadığınızdan emin olun.
  5. Fareyi 5 mg / kg vücut ağırlığında meloksikam ile besleyin ve indüksiyon sırasında aspirasyonu önlemek için farenin ilacı tamamen yutması için bolca zaman tanıyın.
  6. Fareyi anestezi altında 1 L / dak oksijende% 3 izofluran ile indükleyin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
  7. Fare uyuşturulduktan sonra (ayak parmağını sıkıştırmaya tepki vermeden), fareyi burnu takılı bir burun konisi içinde olacak şekilde sırtüstü cerrahi masanın üzerine yerleştirin.
  8. Fare burun konisine düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, anestezinin sürdürülmesi için izofluranı %2'ye ayarlayın.
  9. Keratokonjonktivit sicca'yı (kuru göz) önlemek için farenin gözlerine göz jeli yerleştirin.
  10. Farenin cerrahi bantla cerrahi masanın üstüne düzgün şekilde sabitlendiğinden emin olun.
  11. Nefes alma kolaylığı ve yeterli solunum hızı için sürekli izleyin.
  12. Kürkü farenin karnından cinsel organların hizasından kaburgaların altına kadar tıraş edin.
  13. Kürk çıkarıldıktan sonra, önce cerrahi alanı %70 etanol ile merkezden çevreye dairesel hareketlerle silin. Ardından, cerrahi bölgeyi aynı dairesel hareketlerle betadin ile silin. Hem etanol hem de betadin adımlarını toplam 3 kez tekrarlayın.
  14. Fareyi, cerrahi alanı görselleştirmek için ortasından uygun boyutta bir delik açılmış steril bir cerrahi örtü ile örtün. Eşkenar dörtgen şekil, perdeyi ikiye katlayarak ve ~10 mm yüksekliğinde ve ~15 mm tabana sahip bir ikizkenar üçgen keserek yapılabilir.

2. Kesiler

  1. Bir çift keskin makas ve ince uçlu cımbız kullanarak, kasık simfiz seviyesinin ~ 1 mm üstünden kaburgaların ~ 2 mm altına kadar orta hat kesisi oluşturun.
  2. Bilateral rektus abdominis kasları arasındaki orta hat fasyasını (linea alba) tanımlayın. Cımbız kullanarak, karın kaslarını alttaki organlardan uzaklaştırın ve karın boşluğuna girmek için linea alba boyunca kesin.
    NOT: Linea alba, orta hat32 boyunca uzunlamasına uzanan daha ince bir fasya çizgisini ortaya çıkarmak için bilateral rektus abdominus kaslarını yanal olarak hafifçe çekerek tanımlanabilir. Kesi işleminin linea alba içinden yapılması kasın daha kolay kapanmasını sağlar.
  3. Sonraki adımları düzgün bir şekilde görselleştirmek için karın kaslarını ve cildi yanal olarak 5-0 dikişle geri çekin.

3. L2-L5 lomber sempatik ganglionların tanımlanması

  1. Lomber sempatik ganglionlar abdominal aortun posterior ve inferior vena kava ile uzanır. Aortu görselleştirmek için, bağırsakları karın boşluğundan kısmen çıkarın.
    NOT: L2-L5 seviyesindeki sempatik ganglionlar, aort bifurkasyon seviyesinden iliak damarlara geçiş yaparak sol renal arterseviyesine kadar uzanır 21,33.
    1. Örtünün üzerine steril tuzlu suya doyurulmuş steril bir pamuklu kare yerleştirin, üstte ve insizyonun soluna uzanın. Dikkatlice, 2 steril pamuk uçlu aplikatör ile kolonu ve ince bağırsağı kısmen tuzlu suya batırılmış pamuk karenin üzerine itin.
      NOT: Çekum ve apendiksin karın boşluğunun dışında olduğundan ve inen kolonun görüntülenebildiğinden emin olun.
    2. Açıkta kalan bağırsakları başka bir tuzlu doymuş pamuklu kare ile örtün.
    3. Bağırsakların ritmik hareketi ile tanımlanabilen ameliyat boyunca peristalsis'i periyodik olarak izleyin.
  2. Bağırsağın rektum ve anüse doğru hareket eden ve görünür dışkı maddesi içerebilen kısmı olan inen kolonu tanımlayın ve abdominal aort ve inferior vena kava'yı ortaya çıkarmak için bu yapıyı kapalı cımbızla sola doğru saptırın. Bu iki damar bağ dokusu ile bağlıdır ve tek bir birim olarak hareket etmelidir.
    1. Bir cımbızla, karın damarlarını çevredeki bağ dokusundan kaldırın. Bu kaldırılırken, bağ dokusundan dikkatlice 5-0 naylon bir dikiş yerleştirin.
      DİKKAT: Karın damarlarını iğne ile delmeyin: Bu, farenin hızlı bir şekilde dekompansasyonuna ve muhtemelen ölüme yol açacaktır.
    2. Sütür bağ dokusundan yerleştirildikten sonra, karın damarlarını sola doğru kaydırın. Bu, bilateral psoas kaslarının doğrudan görüntülenmesine izin veren üçgen bir pencere verecektir.
      NOT: Ganglionların abdominal damarlarla olan yakın bağlantıları nedeniyle, sempatik gangliyonlar, tipik olarak orta hatta yer almasına rağmen, damarlarla birlikte hafifçe sola (farenin sağına) saptırılacaktır. Abdominal damarlar saptırıldıktan sonra, soldaki iki tarafı saptırılmış karın damarlarından oluşan ve sağ tarafı farenin orta hattı tarafından tanımlanan (bilateral psoas kasları arasında) bir üçgen görselleştirilmelidir. Sempatik ganglionlar bu üçgenin ortasında yer alır (Şekil 1A). Dikey olarak yan yana hareket ederler ve yarı saydam görünürler. Farenin orta hattına dalan ve sağ psoas kası üzerinde düz duran küçük bir damarla örtüşebilirler. Gangliyonları ortaya çıkarmak için üstteki herhangi bir fasyayı kör bir şekilde incelemek için cımbız kullanın (Şekil 1B).
  3. Sol renal arteri ve sol testis veya yumurtalık arterini tanımlayın.
    NOT: Yanları üstte sol renal arter, lateralde hayvanın orta hattı ve abdominal aort/inferior vena kava, altta ise sol testis veya over atardamarından oluşan dörtgen oluşturacak büyük damarlardır. L2 seviyesindeki gangliyonlar büyüktür ve bu dörtgen içinde yer alır (Şekil 1A). Bu dörtgene cımbızla girmek ve bilateral L2 gangliyonlarını tanımlamak için dikkatlice künt diseksiyon yapın (Şekil 1B).
  4. Ganglionların alt ve üst kısımları tanımlandıktan sonra, görünür bilateral ganglionların alt yönünü bir cımbızla tutun ve yukarı doğru çekin. L4 ve L5 gibi daha alt yerleşimli ganglionların görselleştirilmesi, ikinci cımbız çifti ile görüşü engelleyen herhangi bir organı hafifçe iterek arttırılabilir.
    NOT: Adım 3.2.2'de bahsedilen orta hat perforan damarın görüntülenmesi daha eksiksiz bir lomber sempatektomi sağlayacaktır. Diğer elinizde ikinci bir cımbız tutarak, ilk cımbız çifti ile gangliyonları aynı anda yukarı çekerken karın içindeki gangliyonları tutan fasya ve nöronal bağlantıları çekin. Sadece bir cımbız gangliyonlara tutunmalı, diğeri ise fasya ve nöronal bağlantıları temizlemelidir. Sol testis veya yumurtalık arteri seviyesine geldikten sonra, alt zincir gangliyonları hala sağlamsa, L2 gangliyonları alt zincir tarafından çekildiğinde hareket edeceğinden, L2 tanımlaması için yardımcı olabilir. L3-5 gangliyonları, L2 gangliyonlarını cımbızla dörtgenden çıkarmadan önce testis veya yumurtalık arterinde kırılabilir. Kuadrik içinde bulunan tek ganglionlar L2 gangliyonlarıdır.
  5. Bu prosedür minimum kan kaybına sahip olmalıdır. Kanama meydana gelirse, kapatmadan önce yeterli hemostaz olduğundan emin olun.

4. Cilt kapanması

  1. Yeterli hemostaz elde edildikten sonra, karın damarlarını yerinde tutan dikişi çıkarın.
  2. 2 steril pamuk uçlu aplikatör kullanarak, yönlendirilmiş bağırsakları dikkatlice karın boşluğuna yerleştirin.
  3. 5-0 emilebilir bir sütürle, karın kaslarına yaklaşmak için çalışan bir dikiş yapın.
  4. 5-0 naylon sütür ile cildi kapatmak için basit kesikli dikişler kullanın.
  5. Kesi bölgesine Neosporin gibi cömert bir antibiyotik merhem tabakası sürün.
  6. Fareyi bir ısıtma yastığı üzerindeki temiz bir kafese yerleştirin.
  7. Fareyi uyanık ve gezici olana kadar her 15 dakikada bir gözlemleyin. Bu genellikle 30 dakikadan az sürer.

5. Pilokarpin ter deneyi

NOT: Lomber sempatektomi sonrası sempatik fonksiyonel aktivitenin tükenmesini değerlendirmek için lomber sempatektomiden 7 gün sonra pilokarpin ter testi kullanıldı.

  1. Hint yağında %10 patates nişastası karışımının yanı sıra %0.9 NaCl içinde %1'lik bir pilokarpin hidroklorür çözeltisi hazırlayın.
  2. Bir boya fırçası kullanarak ayağın plantar yüzeyini betadin ile kaplayın. Bu tabakanın tamamen kurumasını bekleyin.
  3. Betadin tabakası kuruduktan sonra, hint yağında %10'luk bir nişasta tabakası uygulamak için ayrı bir boya fırçası kullanın.
  4. 0.25 μL / g vücut ağırlığında% 1 pilokarpin subkutan olarak bir şırınga kullanarak boynun üzerindeki gevşek cilde uygulayın. Pilokarpin uygulamasından hemen sonra bir zamanlayıcı başlatın.
  5. Enjeksiyondan 8 dakika sonra, ayağın plantar yüzeyinin fotoğraflarını çekin.
  6. Fiji'yi kullanarak, altı (6) ayak tabanının tümünde bulunan koyu lekelerin sayısını sayın (Şekil 2A).

6. İmmünohistokimya

NOT: Lomber sempatektomi sonrası periferik sinirlerdeki sempatik aksonların dejenerasyonunu değerlendirmek için bilateral siyatik sinirler postoperatif 21. günde çıkarıldı.

  1. Fareleri uyuşturun (protokolün 1. adımını izleyerek), iki taraflı siyatik sinirleri toplayın ve ardından hayvanı derhal ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
  2. Siyatik sinirleri 20 dakika boyunca 0,01 M fosfat tamponlu salin (PBS) içinde doğrudan% 4 paraformaldehite yerleştirin, ardından 4 ° C'de gece boyunca kriyoproteksiyon için 0,1 M PBS'de% 20 sükroza aktarın.
  3. Siyatik sinirleri 20 μm'de bir kriyostat kullanarak uzunlamasına bölümlere ayırın ve bölümleri yüklü slaytlara yerleştirin.
  4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 Tween 20 (TBST) ile tris tamponlu salin içinde% 10 normal keçi serumu (NGS) ile sinir bölümlerini bloke edin.
  5. Bloke edici tamponu çıkarın ve sırasıyla 1:750 ve 1:1000'de bloke edici tamponda (TBST'de %10 NGS) seyreltilmiş birincil antikorlar tavşan anti-tirozin hidroksilaz ve tavuk anti-nörofilament ağırlıklı ile değiştirin. Birincil antikorların gece boyunca oda sıcaklığında bir nem odasında inkübe etmesine izin verin.
  6. Her ikisi de bloke edici tamponda 1:200'de seyreltilmiş ikincil antikorlar keçi anti-tavşan 647 ve keçi anti-tavuk 488'i uygulamadan önce, her yıkamada 10 dakika olmak üzere TBST ile slaytı yıkayın. İkincil antikorların oda sıcaklığında 2 saat boyunca bir nem odasında inkübe etmesine izin verin.
  7. Sürgünü TBST ile her yıkamada 10 dakika olmak üzere 4 kez yıkayın ve montajdan önce sürgünün ışık korumalı bir alanda kurumasını bekleyin.
  8. 10x objektif üzerinde bir floresan mikroskobunda en az 40 μm aralıklı sinir kesitlerini görüntüleyin.
  9. Fiji'de, sinir bölümlerini düzeltin ve bölümün genişliğini kapsayan rastgele yerleştirilmiş üç dikey çizgi çizin. Her dikey çizgiyi geçen aksonların sayısını sayın ve bunu dikey çizgideki bölümün genişliğine bölün. Bölüm başına üç dikey çizginin her biri için tekrarlayın. Bölüm başına elde edilen üç değerin ortalamasını alın ve ayrıca sinir başına üç bölümün değerlerinin ortalamasını alın.

Sonuçlar

Bu protokol, postganglionik lomber sempatik nöronların bir fareden cerrahi olarak çıkarılmasını tanımlar. İki fareye lomber sempatiektomi yapıldı ve iki fare kontrol olarak görev yaptı. Başarılı bir cerrahi lomber sempatektomi elde etmek için, Şekil 1'de görüldüğü gibi en azından L2 ve L3 bilateral lomber sempatik gangliyonların yeterli görüntülenmesi sağlanmalıdır. L4 ve L5 gangliyonlarının çıkarılması, alt gövdenin tamamen sempatik denervasyonunu sağlayacaktır; Bununla birlikte, alt ganglionların görüntülenmesi ürogenital organlar tarafından engellenebilir. Önceki retrograd izleme çalışmaları, L2-L5 gangliyonlarındaki nöronların çoğunluğunun L2 ve L3 gangliyonlarında yer aldığını göstermiştir. Temsili sonuçları elde etmek için sadece dişi, yaşa uygun fareler kullanılmış olsa da, bu cerrahi prosedür hem erkek hem de dişi farelerde birçok kez yeniden üretilmiştir ve testis veya yumurtalık arterinin yerleri ve sempatik gangliyonlar açısından önemli bir anatomik fark gözlenmemiştir.

Ganglionların çıkarılmasından sonra, pilokarpine yanıt olarak terleme yanıtı hızla azalır ve postoperatif 7. günde önemli farklılıklar görülür (Şekil 2). Sıçanlarda çeşitli siyatik sinir yaralanmalarından sonra 7 gün içinde sempatik aracılı terleme aktivitesindeki üstel azalma nedeniyle postoperatif 7. gün seçildi34. Akson dejenerasyonunun tamamlanması 14 gün kadar sürebileceğinden ve L4 ve L5 gangliyonlarının intraoperatif olarak görüntülenmesinde potansiyel zorluk nedeniyle (mesane ve genital organlar görüşü engelliyor olabilir), terleme yanıtı tamamen kesilemeyebilir35,36.

Tirozin hidroksilaz pozitif (TH+) akson yoğunluğu, nörofilament-ağır zincir (NF-H) yoğunluğunda herhangi bir değişiklik olmaksızın postoperatif 21. günde önemli ölçüde azaldı (Şekil 3). Düşük eşikli mekanoreseptörleri innerve eden TH + duyusal aksonlarının varlığı ve tam lomber sempatik zinciri görselleştirmede potansiyel zorluklar nedeniyle TH + aksonlarının tamamen tükenmesi olası değildir37.

Abdominal anatomide statik denge; Sol böbrek ve damarların diyagramı ve etiketli cerrahi görüntüsü.
Şekil 1: Lomber sempatik ganglionların intraoperatif görünümü. (A) Beklenen yer işaretlerini içeren şematik. (B) Etiketli yer işaretlerine sahip temsili intraoperatif görüntü. Lomber sempatik ganglionlar inen abdominal aort ve inferior vena kava (saptırılmış) arkasında bulunur. Gangliyonlar, abdominal damarların sapması ile farenin sağına çekilir ve sağ psoas'ta bulunur, aşağı ve üst çaprazda yer alır. Bilateral L2 gangliyonları, sol renal arter ile sol testis veya over arteri arasında görüntülenebilir ve L3 gangliyonları, sol testis veya over arterine göre daha aşağıda görülür. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kemirgen pençelerinde ter bezi işlevi; diyagram, mikroskop görüntüleri ve terleme noktalarını karşılaştıran grafik.
Şekil 2: Cerrahi lomber sempatektomi, arka pençedeki terleme noktalarının sayısını azaltır. (A) Farenin arka pençesinin plantar yüzeyindeki ayak tabanı konumlarının şeması. (B) Sağlam bir hayvanda pilokarpin enjeksiyonundan 8 dakika sonra terleme tepkisinin temsili bir görüntüsü. (B') Belirli sayıda terleme noktasını gösteren beyaz oklarla yakınlaştırılmış görüntü. (C) Postoperatif 7. günde sempatik bir hayvanda pilokarpin enjeksiyonundan 8 dakika sonra terleme tepkisinin temsili bir görüntüsü. (C') Belirli sayıda terleme noktasını gösteren beyaz oklarla yakınlaştırılmış görüntü. (D) Sağlam ve sempatik farelerde arka pençenin altı ayak tabanının tümündeki toplam terleme noktası sayısı. Veriler, medyanı temsil eden çizgi ile gösterilir. Mann-Whitney testi. *p < 0.05. Ölçek çubukları: 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Akson yoğunluk analizi, çubuk grafik karşılaştırması, kontrol ve SynprX grupları, floresan mikroskobu.
Şekil 3: Cerrahi lomber sempatektomi (Sympx) siyatik sinirdeki sempatik akson sayısını azaltır. (A) Postoperatif 21. günde siyatik sinirin μm'si başına (sinirin genişliği) tirozin hidroksilaz (TH) pozitif aksonları. Sağlam (B) ve sempatik (B') bir farede TH boyamasının temsili sinir bölümleri. (C) Siyatik sinirin μm'si başına nörofilament ağır zincir (NF-H) pozitif aksonlar. Sağlam (D) ve sempatize (D') bir farede NF-H boyamasının temsili sinir bölümü. Eflatun kesikli çizgiler, sinirdeki akson yoğunluklarını hesaplamak için kullanılan sinir bölümünün genişliğini kapsayan rastgele yerleştirilmiş olası dikey çizgileri temsil eder. Eflatun oklar, rastgele yerleştirilmiş dikey çizgileri kesen belirli sayıda aksonu gösterir. Veriler ortalama ± SEM. Eşleştirilmemiş t-testi olarak gösterilmiştir. **p < 0.01. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Lomber sempatik gangliyonlar, birçok kritik karın organının ve büyük damarların arkasında yer alan çok küçük yapılardır. Bu nedenle, bu prosedür önemli bir hassasiyet ve doğruluk gerektirir. Zorluğun çoğu, intraoperatif olarak sempatik gangliyonların tanımlanmasında yatmaktadır. Öğrencinin, bu prosedürü canlı bir farede denemeden önce bir fare kadavrasındaki gangliyonu tanımlayabilmesi önerilir. Bağırsakların saptırılmasından sonra sempatik gangliyonları tanımlarken sorun gidermenin sıklıkla yapılması gerekecektir. Yeterli görselleştirmeyi sağlamak için, azalan iki nokta üst üste görünür olmalıdır. Karın boşluğunun dışındaki bağırsak sapması çekumu içermelidir. Ek olarak, mesane dolu ve genişlemiş olabilir, bu da inen kolonun ve ardından inen abdominal aortun ve inferior vena kava'nın görüşünü engelleyebilir. İdeal olarak, mesane, ilk cilt kesisini yapmadan önce fare anestezi altındayken manuel olarak ifade edilir. Bununla birlikte, mesanenin eksprese edilmemesi ve intraoperatif görüntünün engellenmesi durumunda, 2 steril pamuk uçlu aplikatör ile nazik ifade mümkündür. Mesanenin arka yüzüne bağlı olan üreterlere zarar vermemeye özen gösterin. İnen kolonun posteriorunda abdominal aort ve inferior vena kava tespit edildikten sonra, damarların yeterli sapması ve stabilizasyonu sempatik ganglionların görüntülenmesi için kritik öneme sahiptir. Fasya nispeten serttir ve eğer sütür damar duvarlarından değil de sadece fasya tabakası ve nöronal bağlantılardan yerleştirilirse, damarlar orta hattan en az 1 mm çekilmelidir. Sempatik ganglionların üzerindeki fasya cımbızla nazikçe diseke edilebilir. İşlem sırasında herhangi bir küçük damar kırılırsa, kapatmadan önce yeterli hemostazı sağlamak için en az 10 saniye boyunca steril pamuk uçlu bir aplikatör ile basınç uygulayın. Ameliyat sırasında büyük karın damarları delinirse, fareye hızlı bir şekilde ötenazi yapılmalıdır.

Bu yöntem, sempatik gangliyonların doğrudan görüntülenmesine ve çıkarılmasına izin vermesine rağmen, bu postganglionik sempatik nöronların kimyasal sempatiektomilere kıyasla daha spesifik hedeflenmesine izin verir23, bazı sınırlamalar vardır. Bu ameliyat, L2-L5 lomber sempatik ganglionların çıkarılmasıyla sonuçlanır; ancak hayati ürogenital organların neden olduğu görme engeli nedeniyle, L4-L5 seviyesindeki ganglionlar gibi en alt ganglionların bu işlem sırasında görüntülenmesi ve çıkarılması daha zordur. Alt ekstremiteleri innerve eden nöronların çoğu büyük L2 gangliyonlarında bulunur. L5 gangliyonları son derece küçüktür ve önceki floresan retrograd izleme deneylerinde görüldüğü gibi daha az nöron içerir38; Bununla birlikte, bu nöronların çıkarılmaması, ayaklar gibi en distal yapılardan elde edilen sonuçların analizini bozabilir. Ayaklardaki distal hedefleri incelerken daha iyi sonuçlar elde etmek için, çıkarılan ganglionların sayısını saymak için çıkarılan dokuyu kontrol etmeniz tavsiye edilir. Bu, postganglionik sempatik nöronların kolayca görüntülenebildiği bir floresan muhabir fare veya ameliyattan önce distal hedefe enjekte edilen bir floresan retrograd izleyici aracılığıyla yapılabilir. Bu amaç için bazı floresan raportör fareler arasında tirozin hidroksilaz-pozitif nöronların39 son derece seyrek etiketlenmesine sahip olan ThCre:mTmG (Malzeme Tablosuna bakınız), postganglionik sempatik nöronların40,41 orta derecede etiketlenmesine sahip Phox2bCre:tdTomato (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ThCre:tdTomato (Malzeme Tablosuna bakınız) bulunur), postganglionik sempatik nöronların kapsamlı bir şekilde etiketlenmesine sahiptir42. Bu, kullanılabilir satırların kapsamlı bir listesi değildir.

Ek olarak, bu cerrahi prosedür için gereken büyük kesi nedeniyle, daha fazla deney yapılmadan önce farelerin daha uzun bir iyileşme süresine ihtiyacı olabilir. Fareler uygun dışkılama, idrara çıkma ve beslenme için en az 3 gün izlenmelidir. Ayrıca, yanlış hemostaz, ele alınmamış karın içi kanamaya yol açabilir ve bu da beklenmedik zaman noktalarında fare ölümüne neden olabilir. Bu nedenle, cerrahi kapatmadan önce hemostaz elde edildiğinden emin olmak, gelecekteki deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. Sempatik nöronlar, daha önce de belirtildiği gibi kimyasal olarak da hedeflenebilir24.

Cerrahi sempatiektomilerin kullanımı, nöromüsküler kavşakta sempatik innervasyonun rolü gibi distal hedeflerde postganglionik sempatik innervasyonun rolünü araştırmayı amaçlayan çok sayıda çalışmaya izin verecektir12. Ek olarak, distal dokuların sempatik reinnervasyonunu ölçmek için floresan retrograd izleme teknikleri kullanılabilir, çünkü bu protokol paraformaldehitle sabitlenmiş farelerden gangliyonları en blok halinde çıkarmak için uyarlanabilir38. Periferik sinir yaralanmaları bağlamında, bu cerrahi "nakavt" modeli, daha önce innerve edilmiş dokularda beklenen sempatik fonksiyonel iyileşmenin daha iyi karakterize edilmesini sağlayacaktır.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, NIH Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü tarafından K01NS124912 numaralı ödül altında ve kısmen NIH tarafından finanse edilen Emory Cinsiyet Farklılıklarında Araştırma Mükemmeliyet İhtisas Merkezi U54AG062334 ve Emory Üniversitesi Tıp Bilimcisi Eğitim Programı'ndan gelişimsel bir hibe ile desteklenmiştir. Siyatik sinirleri kesitlere ayırdığı için lisans sonrası David Kim'e ve videonun çekilmesine izin veren stereo mikroskobumuz için bir telefon yuvasını 3D yazdırdığı için araştırma uzmanı HaoMin SiMa'ya teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5-0 emilebilir sütürCP Medical421A
5-0 naylon sütürMed-Vet InternationalMV-661
%70 etanolSigma-AldrichE7023-4L
Anestezi İndüksiyon OdasıKent Scientific VetFloVetFlo-0530XS
Anestezi BuharlaştırıcıKent Scientific VetFlo13-005-202
BetadineHealthyPetsBET16OZ
C57BL / 6J farelerJackson Laboratuvarı# 000664
Tavuk anti-nörofilament ağırAbcamab72996
KriyostatLeicaCM1850
Veri Analiz YazılımıPrizma
İnce uçlu cımbızDünya Hassas Aletler500233
Floresan mikroskopNikonTi-E Keçi
anti-tavuk 488InvitrogenA32931
Keçi anti-tavşan 647InvitrogenA21245
Isıtma yastığıBraintree Scientific39DP
Görüntü Analiz YazılımıFiji
Görüntüleme YazılımıNikonNIS-Elements
IsofluranMed-Vet InternationalRXISO-250
MeloksikamMed-Vet InternationalRXMELOXIDYL32
İğne sürücüsüRoboz Cerrahi MağazaRS-7894
Normal Keçi SerumuAbcamab7481
Oftalmik merhemRefreshRefresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant farelerJackson Laboratuvarı #016223, #007914
Pilokarpin hidroklorürSigma-AldrichP6503
Tavşan anti-tirozin hidroksilazAbcamab112
Küçük düz makas Güzel Bilim Araçları14084-09
Steril pamuklu çubuklar 2x2Dynarex3252
Steril pamuk uçlu aplikatörlerDynarex4301
Steril örtüMed-Vet InternationalDR4042
Steril salin solüsyonuMed-Vet International1070988-BX
ThCre:mTmG mutant farelerMutant Fare Kaynak ve Araştırma Merkezlerisuşu #017262-UCDJackson Laboratuvarı, suş #007576
ThCre:tdTomato mutant farelerAvrupa Fare Mutant Arşivisuşu #00254Jackson Laboratuvarı, suş #007914

Kaynaklar

  1. Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: An international survey of current treatments and future perspectives. J Reconstr Microsurg. 25 (06), 339-344 (2009).
  2. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  3. Tian, T., Moore, A. M., Ghareeb, P. A., Boulis, N. M., Ward, P. J. A perspective on electrical stimulation and sympathetic regeneration in peripheral nerve injuries. Neurotrauma Rep. 5 (1), 172-180 (2024).
  4. Gagnon, D., Crandall, C. G. Sweating as a heat loss thermoeffector. Hand Clin Neurol. 156, 211-232 (2018).
  5. Grassi, G. Role of the sympathetic nervous system in human hypertension. J Hypertens. 16 (12), 1979-1987 (1998).
  6. Dibona, G. F. Sympathetic nervous system and the kidney in hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 11 (2), 197-200 (2002).
  7. Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P., Vizi, E. S. The sympathetic nerve-An integrative interface between two supersystems: The brain and the immune system. Pharmacol Rev. 52 (4), 595-638 (2000).
  8. Besedovsky, H. O., Del Rey, A., Sorkin, E., Da Prada, M., Keller, H. Immunoregulation mediated by the sympathetic nervous system. Cell Immunol. 48 (2), 346-355 (1979).
  9. Straka, T., et al. Postnatal development and distribution of sympathetic innervation in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 19 (7), 1935(2018).
  10. Geng, T., et al. Pgc-1α plays a functional role in exercise-induced mitochondrial biogenesis and angiogenesis but not fiber-type transformation in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (3), C572-C579 (2010).
  11. Lin, J., Handschin, C., Spiegelman, B. M. Metabolic control through the pgc-1 family of transcription coactivators. Cell Metab. 1 (6), 361-370 (2005).
  12. Khan, M. M., et al. Sympathetic innervation controls homeostasis of neuromuscular junctions in health and disease. Proc Natl Acad Sci. 113 (3), 746-750 (2016).
  13. Delbono, O., Rodrigues, A. C. Z., Bonilla, H. J., Messi, M. L. The emerging role of the sympathetic nervous system in skeletal muscle motor innervation and sarcopenia. Ageing Res Rev. 67, 101305(2021).
  14. Rodrigues, A. C. Z., et al. Heart and neural crest derivative 2-induced preservation of sympathetic neurons attenuates sarcopenia with aging. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 12 (1), 91-108 (2021).
  15. Rosenberg, I. H. Summary comments. Am J Clin Nutr. 50 (5), 1231-1233 (1989).
  16. Murata, Y., Olmarker, K., Takahashi, I., Takahashi, K., Rydevik, B. Effects of lumbar sympathectomy on pain behavioral changes caused by nucleus pulposus-induced spinal nerve damage in rats. Eur Spine J. 15, 634-640 (2006).
  17. Xie, J., Park, S. K., Chung, K., Chung, J. M. The effect of lumbar sympathectomy in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. J Pain. 2 (5), 270-278 (2001).
  18. Lee, D. H., Katner, J., Iyengar, S., Lodge, D. The effect of lumbar sympathectomy on increased tactile sensitivity in spinal nerve ligated rats. Neurosci Lett. 298 (2), 99-102 (2001).
  19. Ringkamp, M., et al. Lumbar sympathectomy failed to reverse mechanical allodynia-and hyperalgesia-like behavior in rats with l5 spinal nerve injury. Pain. 79 (2-3), 143-153 (1999).
  20. Zhao, C., et al. Lumbar sympathectomy attenuates cold allodynia but not mechanical allodynia and hyperalgesia in rats with spared nerve injury. J Pain. 8 (12), 931-937 (2007).
  21. Zheng, Z. -F., et al. Recovery of sympathetic nerve function after lumbar sympathectomy is slower in the hind limbs than in the torso. Neural Regen Res. 12 (7), 1177(2017).
  22. Holmberg, K., Shi, T. -J. S., Albers, K. M., Davis, B. M., Hökfelt, T. Effect of peripheral nerve lesion and lumbar sympathectomy on peptide regulation in dorsal root ganglia in the ngf-overexpressing mouse. Exp Neurol. 167 (2), 290-303 (2001).
  23. Thoenen, H., Tranzer, J. Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 261, 271-288 (1968).
  24. Thoenen, H., Tranzer, J. P., Häusler, G. Chemical sympathectomy with 6-hydroxydopamine. New Aspects of Storage and Release Mechanisms of Catecholamines. , 130-143 (1970).
  25. Xie, W., et al. Localized sympathectomy reduces mechanical hypersensitivity by restoring normal immune homeostasis in rat models of inflammatory pain. J Neuroscience. 36 (33), 8712-8725 (2016).
  26. Zhu, X., Xie, W., Zhang, J., Strong, J. A., Zhang, J. -M. Sympathectomy decreases pain behaviors and nerve regeneration by downregulating monocyte chemokine ccl2 in dorsal root ganglia in the rat tibial nerve crush model. Pain. 163 (1), e106-e120 (2022).
  27. Tonello, R., et al. Local sympathectomy promotes anti-inflammatory responses and relief of paclitaxel-induced mechanical and cold allodynia in mice. Anesthesiology. 132 (6), 1540-1553 (2020).
  28. Kostrzewa, R. M., Jacobowitz, D. M. Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine. Pharmacol Rev. 26 (3), 199-288 (1974).
  29. Michel, P., Hefti, F. Toxicity of 6-hydroxydopamine and dopamine for dopaminergic neurons in culture. J Neuroscience Res. 26 (4), 428-435 (1990).
  30. Andrew, R., et al. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochemical Res. 18, 1175-1177 (1993).
  31. Glinka, Y., Gassen, M., Youdim, M. Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity. J Neural Transm Suppl. 5, 55-66 (1997).
  32. Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Montine, K. S. Comparative anatomy and histology: A mouse, rat, and human atlas. , Academic Press. 119(2017).
  33. Hweidi, S. A., Lee, S., Wolf, P. Effect of sympathectomy on microvascular anastomosis in the rat. Microsurgery. 6 (2), 9-96 (1985).
  34. Navarro, X., Kennedy, W. R. Sweat gland reinnervation by sudomotor regeneration after different types of lesions and graft repairs. Exp Neurol. 104 (3), 229-234 (1989).
  35. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8 (1), 1-13 (2011).
  36. Babetto, E., et al. Targeting nmnat1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo. J Neuroscience. 30 (40), 13291-13304 (2010).
  37. Brumovsky, P. R. Dorsal root ganglion neurons and tyrosine hydroxylase-an intriguing association with implications for sensation and pain. Pain. 157 (2), 314(2016).
  38. Tian, T., Harris, A., Owyoung, J., Sima, H., Ward, P. J. Conditioning electrical stimulation fails to enhance sympathetic axon regeneration. bioRxiv. , (2023).
  39. Tian, T., Ward, P. J. The ThCre: Mtmg mouse has sparse expression in the sympathetic nervous system. bioRxiv. , 2023(2023).
  40. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. J Comparative Neurol. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  41. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. -F. The homeobox gene phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  42. François, M., et al. Sympathetic innervation of the interscapular brown adipose tissue in mouse. Ann N Y Acad Sci. 1454 (1), 3-13 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sempatik Sinir SistemiPeriferik Sinir YaralanmasPostganglionik Sempatik N ronlarFare CerrahisiSempatik Akson RejenerasyonuGanglion DiseksiyonuTirozin Hidroksilaz BoyamasSiyatik SinirN ronal H cre K lt r

İlgili makaleler