Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Eksikliklerin yavru sağlığı sonuçları üzerindeki etkisini incelemek için maternal diyet folik asit veya kolin seviyelerinin değiştirilmesi

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66827

⸱

28 Haziran 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, 2Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, 3Department of Anesthesiology, Pharmacology, & Therapeutics, Faculty of Medicine, University of British Columbia, 4Center of Metabolomics, Institute of Metabolic Disease, Baylor Scott & White Research Institute, 5Department of Physiology, Southern Illinois University, 6Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, 7Department of Neuroscience, Carleton University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, anne diyetinin yavru sağlığı sonuçları üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla hamilelikten önce dişi farelerde diyetle folik asit veya kolin alımını azaltma yöntemini açıklar.

Özet

Hamilelik ve emzirme döneminde annenin beslenmesi, yavruların nörogelişiminde önemli bir rol oynar. Folik asit ve kolinin yanı sıra diğer B vitaminlerini merkeze alan tek karbonlu (1C) metabolizma, gelişmekte olan fetüsün nöral tüpünün kapanması sırasında anahtar bir rol oynar. Bununla birlikte, hamilelik sırasındaki bu maternal beslenme yetersizliklerinin doğumdan sonra yavru sağlığı sonuçları üzerindeki etkisi nispeten tanımlanmamıştır. Ayrıca, folik asit veya kolindeki maternal diyet eksiklikleri, yavrulardaki diğer sağlık sonuçlarını etkileyebilir - bu da bunu değerli bir model haline getirir. Bu protokol, diyet değişiklikleri yoluyla dişi farelerde 1C metabolizmasında bir eksikliğe neden olma prosedürünü ana hatlarıyla belirtmeyi amaçlamaktadır. Dişiler sütten kesimde, 2 aylık olana kadar, çiftleşmeden 4-6 hafta önce diyetlere yerleştirilir ve hamilelik ve emzirme boyunca diyette kalırlar. Bu dişilerden elde edilen yavrular sağlık sonuçları açısından değerlendirilebilir. Dişiler yavru üretmek için birden çok kez kullanılabilir ve 1C metabolit ölçümlerini ölçmek için dişilerden dokular toplanabilir. Bu protokol, yavru sağlığı sonuçlarını incelemek için folik asit veya kolindeki maternal diyet eksikliklerinin nasıl indükleneceğine dair bir genel bakış sağlar.

Giriş

Hamilelik ve emzirme döneminde annenin beslenmesi, yavru gelişiminde hayati bir rol oynar. Tek karbonlu (1C) metabolizma, beslenme sinyallerini biyosentez, redoks homeostazı ve epigenetik ile bütünleştiren önemli bir metabolik ağdır. Folik asit ve kolin, nöral tüpün kapanmasında önemli bir rol oynayan 1C'nin merkezi bileşenleridir. Kadınların doğurganlık yıllarında folik asit ve kolin takviyesi yapmaları yaygın olarak tavsiye edilir1. Folik asidin fetal gelişimdeki kritik rolü açıkça belirlenmiş olsa da, ilgili altta yatan mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Çocuk doğuran kadınların hamile kalmadan önce folik asit almaları önerilir, çünkü nöral tüpün kapanması ilk trimester2 içinde gerçekleşir. Folik asit veya kolin gibi 1C'nin diğer bileşenlerinde eksik olan hamile anneler, nükleotid sentezi ve erken gebelik döneminin gerektirdiği diğer süreçlere olan yüksek talep nedeniyle nöral tüp defektli yavruların doğum insidansı daha yüksektir3.

1C metabolizması alımında yetersiz olan anne diyetlerinin yavru sağlığı sonuçları üzerindeki uzun vadeli etkisi tam olarak anlaşılamamıştır. Laboratuvarlarımızdan ve diğerlerinden yapılan araştırmalar, folik asit veya kolin eksikliği olan anne diyetlerinin, klinik öncesi modeller 4,5,6 kullanılarak iskemik inme sonrası yavru sağlığı sonuçlarını gerçekten etkilediğini göstermiştir. Maternal diyetin etkisi, daha küçük beyin hacimlerinin ve değişmiş metilasyon seviyelerinin tanımlandığı klinik çalışmalarda da gösterilmiştir7. Sağlık ve Hastalığın Gelişimsel Kökenleri (DOHaD) teorisi, prospektif kronik hastalıkların utero 8,9'da programlandığını ve anne diyetinin önemli bir rol oynadığını göstermektedir.

Bu protokol, anne beslenmesinin yavruların sağlık sonuçları üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla, hamilelikten önce dişi farelerde 1C diyet tüketimini değiştirme yöntemini ana hatlarıyla belirtmek için tasarlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol onaylandı ve tüm hayvan denekler Midwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak kullanıldı (Protokol 2983). Bu çalışmada 2 aylık (vücut ağırlığı, ~ 20 g) dişi C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Genel olarak, üreme çağındaki dişi fareler kullanılabilir10. Çöp etkilerinden kaçınılmasını sağlamak için, her diyet için birden fazla dişi kullanılması gerekir11. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney hazırlığı

  1. Ticari kemirgen gıda üreticilerinden folik asit veya kolin eksikliği olan diyet alın. Eksik diyetlerde ihtiyaç duyulan folik asit veya kolin miktarı da dahil olmak üzere mikro ve makro besinlerin ayrıntılı listesi için Tablo 1'e bakın.
    NOT: Karşılık gelen bir kontrol diyetinin de sipariş edilmesi gerekir; detaylar Tablo 1'de listelenmiştir. Bu diyetler AIN93G'ye dayanıyordu ve kemirgenler için önerilen besinleriiçeriyordu 10.
  2. Üretici ile işbirliği içinde, diyetlerin renklendirilmesini belirleyin, çünkü bu, deneysel çalışmalar sırasında doğru diyetlerin dağıtımına yardımcı olabilir. Bu çalışmada folik asit eksikliği olan diyetler için yeşil, kolin için sarı ve kontrol diyeti için beyaz kullanılmıştır. Hepsi kolayca ayırt edilebilir.
    NOT: Su tüketimi ile ilgili herhangi bir kısıtlama yoktur. Su herhangi bir folik asit, kolin veya diğer 1C metabolitleri içermez.

2. Folik asit veya kolin diyet eksikliğinin indüklenmesi

  1. Dişileri diyetlere koymadan önce, tüm hayvanları tartın. Bu, temel ağırlık olarak adlandırılır.
  2. Bireysel laboratuvar kafesi kurulumuna bağlı olarak (havalandırmalı veya havalandırmasız, Malzeme Tablosuna bakınız), her kafes için özel diyet peletlerini haftada birkaç kez değiştirin veya doldurun. Kafes maması çemberlerini özel diyetlerle aşırı doldurmayın, çünkü bu, hayvanlardan gelen tükürüklerle etkileşime girdiklerinde peletlerin bozulmasına ve zamanla bozulmasına neden olabilir.
    NOT: Diyet stoğunun üretici yönergelerine göre saklandığından ve son kullanma tarihinden önce kullanıldığından emin olun.
  3. Dişi fareleri çiftleşmeden önce 4-6 hafta boyunca diyetlerde tutun.
  4. Erkek fareleri çiftleşmek için dişi kafeslere sokun. Dişiler en az 4-6 hafta boyunca özel diyetler uyguladıktan sonra erkeklerin dişi kafeslere sokulduğundan emin olun. Bir erkeği bir ila birkaç gün boyunca bir dişi kafese sokun.
    NOT: Bu çalışmada, farelerde çiftleşme doğumdan sonra gerçekleşebileceğinden, üretilen yavru sayısını artırmak için erkekler deneyin tüm süresi boyunca (~ 4 ay) dişilerle birlikte tutulmuştur12. 6 aylıktan sonra dişiler herhangi bir çalışma için kullanılmadı.
  5. Dişi fareleri, üremenin gerçekleştiğini gösteren bir çiftleşme tıkaç için günlük olarak kontrol edin.
  6. Sağlıklarını ve hamilelik durumlarını takip etmek için her hafta dişi farelerin ağırlık ölçümlerini toplayın.
    NOT: Kadınların hamilelik (~ 21 gün) ve emzirme (~ 21 gün) için diyette tutulması güvenlidir.
  7. Yavrular anneden sütten kesildiğinde (doğumdan ~ 21 gün sonra), onları folik asit ve kolin eksikliği olan bir diyete ve ayrıca bir kontrol diyetine yerleştirin. Ayrıntılar için sonuçlar bölümüne bakın.
    NOT: Anne diyetinin yavru sağlığı sonuçları üzerindeki etkisini incelerken, yavruların sütten kesildikten sonra bir kontrol diyetine yerleştirilmesi önerilir. Kontrol diyeti hayatta kalmak için yeterli miktarda vitamin ve besin içermelidir.
  8. Çalışmanın sonunda (folik asit veya kolin eksikliği olan diyetlerde tutulan kadınların genel sağlığını izlemek için haftalık ağırlıkların belirlenmesi), anneleri aşırı dozda CO2 kullanarak ötenazi yapın (dozaj, dakikada %10-30 hacim yer değiştirmesi, kurumsal olarak onaylanmış protokolleri takiben) ve diyet eksikliklerini doğrulamak için dokuları toplayın (adım 3).

3. 1C ve ilgili metabolitlerin ölçümleri için doku toplanması

NOT: Hayvanlara ötenazi yaparken, hayvanların ayak parmağını çimdiklemeye tepki vermediğinden emin olmak önemlidir. Hayvanlar yanıt vermediğinde, dokuların diseksiyonu başlayabilir. Diseke edilecek dokunun önceden belirlenmesigerekir 13,14 ve materyallerin hazırlanması gerekir. Bu malzemeler, depolama için tüpleri, uygun diseksiyon aletlerini ve kuru buz veya sıvı nitrojeni içerir.

  1. Daha önce yayınlanmış protokollere göre kan ve karaciğer dokularını toplayın15,16.
    1. Aşağıdaki adımları izleyerek kardiyak ponksiyon kullanarak ~ 500-1000 μL kan toplayın. Ayrıntılar için Parasuraman ve ark.17'ye bakın:
      1. Deriden ve karın duvarından V şeklinde bir kesi yapın. Karın organlarını bir kenara çekin ve kan örneğini almak için diyaframdan kalbe bir iğne sokun.
      2. Kan örneklerini EDTA kaplı tüplere yerleştirin. Tüp, tüm numuneler toplanana kadar oda sıcaklığında bırakılabilir.
    2. Kan plazmasını izole etmek için kan örneklerini 1000-2000 x g'da 4 ° C'de 7 dakika boyunca bir santrifüjde döndürün. Plazmayı 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne toplayın ve analize kadar -80 ° C'de saklayın.
    3. Karaciğeri çıkarmak için karnı açın ve daha önce yayınlanmış protokol15'i izleyerek tüm karaciğeri inceleyin.
      1. Karaciğeri vücut boşluğundan çıkardıktan sonra, dokuyu küçük bir makasla daha küçük parçalara ayırın ve kuru buz veya sıvı nitrojen kullanarak dondurun.
        NOT: Donmuş doku parçaları 1.5 mL'lik bir kriyojenik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilebilir ve analize kadar -80 ° C'de tutulabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmanın odak noktası, maternal diyet eksikliklerinin folik asit veya kolin üzerindeki yavru sağlığı sonuçları üzerindeki etkisini araştırmaktı. Folik asit veya kolin eksikliği olan diyetlerde tutulan kadınların genel sağlığını izlemek için haftalık ağırlıklar belirlendi. Önceki çalışmamızda, anne diyet grupları arasında vücut ağırlığında herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir4. Şekil 1 , çiftleşmeden önceki dört hafta boyunca kontrol, kolin veya folik asit eksik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolün araştırma laboratuvarlarında uygulanması sırasında, araştırmacıların deneylere başlamadan önce göz önünde bulundurmaları gereken birkaç önemli not vardır. İlk olarak, diyet üretiminde, deneysel çalışmanın başlamasından önce diyetin üretilmesi için yeterli teslim süresinin verilmesi gerekir. Teslim süreleri şirketten şirkete değişebilir ve diyet sevkiyatının da hesaba katılması gerekir. Üreme çağındaki (~ 2-2.5 aylık) dişi fareler çiftleşmeden 4-6 hafta önce diyete alınabilir 4,6...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL tüplerEppendorf
C57BL / 6 Dişi FarelerCharles River27Fareler evde de yetiştirilebilir.
Kolin Eksikliği DiyetiEnvigoTD.06119
Kontrol DiyetiEnvigoTD.190790
EDTA tüpleri
Folik Asit Eksikliği DiyetiEnvigoTD.01546
GraphPad prizma
https://www.graphpad.com/features Kemirgenler için MuhafazaLab Products, LLCOne Kafes Havalandırmalı Raflar & Kafesler
Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS)SCIEX, Framingham, MA5500 QTrap
Ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC)Shimadzu, Columbia, MD,ABD Nexera

Kaynaklar

  1. Van Gool, J. D., Hirche, H., Lax, H., De Schaepdrijver, L. Folic acid and primary prevention of neural tube defects: A review. Reprod Toxicol. 80, 73-84 (2018).
  2. Ali, S. A., Economides, D. L. Folic acid supplementation. Curr Opin Obstet Gynecol. 12 (6), 507-512 (2000).
  3. Osterhues, A., Ali, N. S., Michels, K. B. The role of folic acid fortification in neural tube defects: a review. Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (11), 575966(2013).
  4. Hurley, L. Maternal dietary deficiencies in folic acid and choline result in larger damage volume, reduced neuro-degeneration and -inflammation and changes in choline metabolites after ischemic stroke in middle-aged offspring. Nutrients. 15 (7), 1556(2023).
  5. Clementson, M. Maternal dietary deficiencies in folic acid or choline worsen stroke outcomes in adult male and female mouse offspring. Neural Regen Res. 18 (11), 2443-2448 (2023).
  6. Pull, K., et al. Impact of maternal dietary folic acid or choline dietary deficiencies on vascular function in young and middle-aged female mouse offspring after ischemic stroke. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (6), H1354-H1359 (2023).
  7. Virdi, S., Jadavji, N. M. The impact of maternal folates on brain development and function after birth. Metabolites. 12 (9), 8766(2022).
  8. Barker, D. J. P. Fetal nutrition and cardiovascular disease in later life. Br Med Bull. 53 (1), 96-108 (1997).
  9. Barker, D. J. P. Maternal nutrition, fetal nutrition, and disease in later life. Nutrition. 13 (9), 807-813 (1997).
  10. Jackson, S. J. Does age matter? The impact of rodent age on study outcomes. Lab Anim. 51 (2), 160-169 (2017).
  11. Jiménez, J. A., Zylka, M. J. Controlling litter effects to enhance rigor and reproducibility with rodent models of neurodevelopmental disorders. J Neurodev Disords. 13 (1), 2(2021).
  12. Breeding and Reproduction of Mice - All Other Pets. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/all-other-pets/mice/breeding-and-reproduction-of-mice 159-185 (2024).
  13. Jena, S., Chawla, S. The anatomy of the laboratory mouse. Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices. , 159-185 (2021).
  14. The anatomy of the laboratory mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/imageindex.shtml (2024).
  15. Mortimer, T., Welz, P. S., Benitah, S. A., Sassone-Corsi, P., Koronowski, K. B. Collecting mouse livers for transcriptome analysis of daily rhythms. STAR Protoc. 2 (2), 100539(2021).
  16. Aboghazleh, R. Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  17. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Parmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  18. Jadavji, N. M., Deng, L., Malysheva, O. V., Caudill, M. A., Rozen, R. MTHFR deficiency or reduced intake of folate or choline in pregnant mice results in impaired short-term memory and increased apoptosis in the hippocampus of wild-type offspring. Neuroscience. 300, 1-9 (2015).
  19. Pickell, L., et al. High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice. Birth defects research. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 91 (1), 8-19 (2011).
  20. Mikael, L. G., Deng, L., Paul, L., Selhub, J., Rozen, R. Moderately high intake of folic acid has a negative impact on mouse embryonic development. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (1), 47-52 (2013).
  21. Mikael, L. G., Pancer, J., Wu, Q., Rozen, R. Disturbed one-carbon metabolism causing adverse reproductive outcomes in mice is associated with altered expression of apolipoprotein ai and inflammatory mediators. J Nutr. 142 (3), 411-418 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Anne BeslenmesiFolik Asit EksikliğiKolin EksikliğiTek Karbon MetabolizmasıNöral Tüp KapanmasıAnne DiyetiDavranışsal NörobilimEpigenetik AraçlarMetabolit Ölçümleri
Eksikliklerin yavru sağlığı sonuçları üzerindeki etkisini incelemek için maternal diyet folik asit veya kolin seviyelerinin değiştirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.