Yöntem makalesi

PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu

4.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66831

⸱

3 Mayıs 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümüne dayanmaktadır. Hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-AAD çift boyamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz, tüm hücreyi kullanıyoruz ve hücre zarı morfolojisini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanıyoruz.

Özet

Hücre ölümü, tüm canlı organizmalarda temel bir süreçtir. Protokol, hücre ölümünü gözlemlemek için insan monosit (THP-1) makrofaj modelinde lipopolisakkarit (LPS) ve adenosin trifosfat (ATP) ile indüklenen forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile farklılaşmış lipid birikimi oluşturur. ATP ile kombine LPS, genellikle piroptozu incelemek için kullanılan klasik bir inflamatuar indüksiyon yöntemidir, ancak apoptoz ve nekrotoz da LPS / ATP ile stimülasyona yanıt verir. Normal şartlar altında, fosfatidilserin sadece plazma zarının iç broşüründe lokalizedir. Bununla birlikte, piroptoz, apoptoz ve nekrotozun erken aşamalarında, hücre zarı bozulmadan kalır ve fosfatidilserine maruz kalır ve sonraki aşamalarda hücre zarı bütünlüğünü kaybeder. Burada, tüm hücrelerden hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-Aminoaktinomisin D (AAD) çift boyamasını analiz etmek için akış sitometrisi kullanıldı. Sonuçlar, LPS / ATP ile stimülasyondan sonra önemli hücrelerin öldüğünü göstermektedir. Taramalı elektron mikroskobu kullanarak, tek tek hücrelerde olası hücre ölümü biçimlerini gözlemliyoruz. Sonuçlar, hücrelerin LPS / ATP ile stimülasyondan sonra piroptoz, apoptoz veya nekrotoz geçirebileceğini göstermektedir. Bu protokol, LPS/ATP ile stimülasyondan sonra makrofajların ölümünü gözlemlemeye odaklanır. Sonuçlar, LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünün piroptoz ile sınırlı olmadığını ve apoptoz ve nekrotik apoptozun da meydana gelebileceğini gösterdi, bu da araştırmacıların LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünü daha iyi anlamalarına ve daha iyi bir deneysel yöntem seçmelerine yardımcı oldu.

Giriş

Hücre ölümü, tüm canlı organizmalarda temel bir fizyolojik süreçtir. Son yıllarda, önemli çalışmalar, hücre ölümünün organizma içindeki bağışıklık ve dengede rol oynadığını göstermiştir. Hücre ölümünü incelemek, hastalıkların başlangıcını ve gelişimini daha iyi anlamamıza yardımcı olur. Programlanmış hücre ölümünün çeşitli biçimleri tanımlanmış ve bu süreçlerdeki bazı kilit hedefler tanımlanmıştır. Pipoptoz, apoptoz ve nekrotoz, iç denge ve hastalık1'de yer alan genetik olarak tanımlanmış üç programlanmış hücre ölümü yoludur.

Piraktoz, zar gözeneklerinin oluşumu ve hücre içeriğinin salınması ile karakterizedir. Aktive edilmiş kaspazlar veya granzimler, daha sonra oligomerleşen, zara bağlanan ve gözenekleri 2,3,4 oluşturan N-terminal alanlarını ayırmak için gasderminleri parçalar. Gasdermin gözeneği, hücresel zarlar boyunca atipik bir salgı kanalı sağlar, bu da içerik salınımı ve iyon akışı 2,3,4 dahil olmak üzere aşağı akış hücre tepkilerine neden olur. Sonuçta, hücreler sonunda ninjurin-15 tarafından kolaylaştırılan plazma zarı yırtılması ve piroptotik lizis yaşarlar. Apoptozda, aktive edilmiş Bax ve Bak, mitokondriyal dış zar üzerinde oligomerler oluşturur ve BCL-2 ailesinin proapoptotik ve antiapoptotik proteinleri, başlatıcı kaspazlar (kaspaz-8, -9 ve -10) ve efektör kaspazlar (kaspaz-3, -6 ve -7) arasındaki denge ile düzenlenen sitokrom C'yi serbest bırakır1,6,7. Apoptozun morfolojik değişiklikleri arasında membran kanaması, hücre büzülmesi, nükleer parçalanma, kromatin yoğunlaşması ve apoptotik cisim oluşumubulunur 6,8. Reseptör etkileşimli serin / treonin-protein kinaz 1 (RIPK3) ve karışık soy kinaz alanı benzeri (MLKL), nekrototik mekanizma1'in iki aşağı akış çekirdek bileşenidir. RIPK3 MLKL'yi işe alır ve fosforile eder, p-MLKL oligomerize eder, hücre zarı ile birleşir, zar deliklerini başlatır, iyon akışına neden olur, hücre içi ozmolariteyi arttırır ve sonunda hücre yırtılması 6,9. Gasdermins ve MLKL plazma zarına bağlanır ve sırasıyla piroptoz ve nekrotoza aracılık ederken, BAX/BAK mitokondri6'nın dış zarına bağlanarak apoptoza aracılık eder.

Her yolun kendine özgü mekanizmaları ve sonuçları olmasına rağmen, hücre zarında benzer değişikliklere yol açarlar. Normal şartlar altında, fosfatidilserin (PS) sadece plazma zarının iç broşüründe lokalizedir. Bununla birlikte, piroptoz, apoptoz ve nekrotozun erken evrelerinde, PS plazma zarının dışında açığa çıkacaktır. Kaspaz-3 / kaspaz-7, asimetrik bir hücre zarına yol açan ve apoptoz10 sırasında PS'yi dışsallaştıran TMEM16 ve XKR ailelerini aktive eder. Gasdermin D aracılı ve MLKL aracılı Ca2 + akışı, hücre zarı üzerindeki fosfolipid çift tabakasının simetrisinin kaybına ve PS'nin maruz kalmasına yol açar. Maruziyet, hücre zarı bütünlüğünün kaybından önce gerçekleşir11,12. Bu üç tip programlanmış hücre ölümünün zarındaki benzer değişikliklere dayanarak, hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V / 7-Aminoaktinomisin D (7-AAD) çift boyamasını analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz. Kalsiyuma bağımlı bir fosfolipid bağlayıcı protein olan Annexin V, plazma zarının13 yüzeyinde açıkta kalan PS'yi tespit etmek için hassas bir prob görevi görebilen PS için yüksek bir afiniteye sahiptir. 7-AAD, tüm hücre zarından geçemeyen bir nükleik asit lekesidir. Yaygın olarak kullanılan bir nükleik asit boyası olan propidyum iyodür (PI) ile benzerdir. Benzer floresan özelliklerine sahiptirler, ancak 7-AAD daha dar bir emisyon spektrumuna ve diğer algılama kanallarıyla daha az parazite sahiptir. Bu benzerlikler nedeniyle piroptoz, apoptoz ve nekrotoz arasında ayrım yapmak yeterli değildir. Tüm hücrelerden hücre ölümünü tespit etmek için akış sitometrisi kullandık. Tek tek hücrelerde olası hücre ölümü biçimlerini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak hücre zarını yakalamak için ikinci bir yöntem kullanılır.

Hücre ölümünü gözlemlemek için insan monosit (THP-1) makrofaj modelinde lipopolisakkarit (LPS) ve adenozin trifosfat (ATP) ile indüklenen forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile farklılaşmış lipid birikimi oluşturduk. Bu protokol, mekanizmaları araştırmaktan ziyade hücre ölümünü gözlemlemeye odaklanır.

Protokol

1. Hücre hattı ve hücre kültürü

  1. İnsan monositik hücre hattı THP-1'i% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 1 mM β-merkaptoetanol ile RPMI-1640 tam kültür ortamında büyütün. Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş havada kültürleyin. Her 2-3 günde bir alt kültür hücreleri.
    NOT: THP-1 bir süspansiyon hücresidir, alt kültür için ortamın yarısını değiştirmeyi seçin. Işık mikroskobu altında birçok hücre parçasını gözlemlerken, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Önceden ısıtılmış taze tam hücre kültürü ortamında hücreleri yeniden süspanse edin.
  2. Tüm deneyler için logaritmik büyüme aşamasında hücreleri (4-10. bölümlerde) kullanın. Hücreler iyi durumda ve logaritmik büyüme evresinde olduklarında, 100 x'te ışık mikroskobu altında yuvarlak, parlak, yoğun ve kümeler ve hücre parçaları içermezler.

2. THP-1 hücrelerinin farklılaşması

  1. 1 mM konsantrasyonda bir PMA stok çözeltisi hazırlayın (1 mg PMA'yı 1.62 mL dimetil sülfoksit içinde çözün). PMA stok çözeltisini şununla seyreltin:tam hücre kültürü ortamı 100 nM'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna kadar.
  2. Kültür kabındaki hücreleri 10 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, hücreleri PMA içeren 3 mL tam kültür ortamı ile yeniden süspanse edin.
  3. Hücre sayacını ve sayma yazılımını açın. Hücre sayaç kartına 20 μL hücre süspansiyonu pipetleyin ve hücre sayaç kartına yerleştirin. Önizleme B1'e tıklayın, enstrümanın sağ alt kısmındaki düğmeyi çevirin ve hücrelerin yazılımda net konturlara sahip parlak merkeze sahip olmasını sağlamak için odak mesafesini ayarlayın. Saymaya başlamak için Sayım'a tıklayın.
  4. Sayım sonuçlarına dayanarak, bir hücre yoğunluğunu 1 x 106 hücre / mL'ye ayarlamak için PMA içeren tam kültür ortamı kullanın. 6 oyuklu bir plakadaki tohum hücreleri, daha fazla tedaviye başlamadan önce plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2 'de 24 saat inkübe edin.

3. THP-1 hücrelerinin tedavisi

  1. 1 mg / mL konsantrasyonda bir LPS stok çözeltisi hazırlayın (1 mg LPS'yi 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün). LPS stok çözeltisini serumsuz ortamla 1 μg/mL'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna seyreltin. 500 mM konsantrasyonda bir Na2ATP stok çözeltisi hazırlayın (0.3026 g ATP'yi 1 mL PBS içinde çözün).
  2. PMA içeren ortamı kuyulardan aspire edin ve PBS 1x ile yıkayın. Kontrol grubuna serumsuz besiyerini ve model grubuna LPS içeren serumsuz besiyerini ekleyin. Daha fazla işleme devam etmeden önce plakayı 37 ° C +% 5 CO2 'de 6 saat inkübe edin.
  3. 6 saat sonra, ATP stok çözeltisini model grubuna 500 nM'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna ekleyin. Devam etmeden önce plakayı 37 ° C +% 5 CO2'de 45 dakika inkübe edin.

4. Akış sitometrisi analizi (Yöntem 1)

  1. Deney örneklerinin hazırlanması
    1. Hücreleri adım 2'ye göre 6 oyuklu plakalarda tohumlayın ve inkübe edin. Tedavi edilmeyen dört kontrol grubu oluşturun: bir leke yok kontrolü, iki tek boyama kontrolü (her leke için bir tane) ve bir çift boyama kontrolü. Bir tedavi grubu oluşturun ve 3. adıma göre tedavi edin.
    2. Tedaviden sonra, tüm süpernatanı kuyulardan aspire edin ve PBS 2x ile yıkayın. Her oyuğa 500 μL% 0.05 Tripsin (EDTA olmayan) ekleyin ve inkübatörde 30 saniye inkübe edin.
    3. Hücre ayrılmasını durdurmak ve hücreleri 5 mL'lik tüpe toplamak için her oyuğa 1 mL RPMI-1640 tam kültür ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    4. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL PBS ekleyin. Hücreli tüpleri 37 °C'de 3 dakika boyunca bir su banyosuna yerleştirin. Tüm numuneleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    5. 200 μL 5x bağlama tamponunu 800 μL damıtılmış su ile 1x bağlama tamponuna seyreltin. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 100 μL 1x bağlayıcı tampon ekleyin ve hücreleri 5 mL'lik tüpe aktarın.
    6. 10 dakika boyunca bir kontrol grubu hücresi tüpüne 5 μL Annexin V-PE çözeltisi ve 5 dakika boyunca başka bir kontrol grubu hücresi tüpüne 5 μL 7-AAD çözeltisi ekleyin (ayrı ayrı tek boyama kontrolleri olarak). Boyayı karıştırmak ve numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında inkübe etmek için her bir tüpü nazikçe girdaplayın. Her tüpe 400 μL PBS ekleyin ve inkübasyonu sonlandırmak için hafifçe girdaplayın.
    7. Kalan tüplere 5 μL Annexin V-PE çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Boyayı karıştırmak ve numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında inkübe etmek için her bir tüpü nazikçe girdaplayın. 5 dakika sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5 μL 7-AAD çözeltisi ekleyin. Her tüpe 400 μL PBS ekleyin ve inkübasyonu sonlandırmak için hafifçe girdaplayın.
    8. 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplerin bir parçası olan 35 μm'lik bir naylon ağ kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve test için bekleyin. Test etmeden önce yavaşça karıştırın ve ardından cihaza yerleştirin.
  2. Akış sitometrisi
    1. Test için floresanla etkinleştirilen hücre sıralama akış sitometresi kullanın. Akış sitometresi veri analiz yazılımını açın ve dedektörün ve lazerin performansını onaylayın. Sitometreye tıklayın ve Fluidics başlatmayı seçin, sistemin hazır olmasını bekleyin. Sitometre > Temizleme Modları > Gaz Giderme Akış hücresine tıklayarak akış odası kabarcıklarını hariç tutun.
    2. Deney'e tıklayın, sırayla Yeni klasör, Deney, Numune, Tüp ve Adı Düzenle'yi seçin. Tüpün önündeki beşgen şekilli bir ok, yandığında yeşile döner.
    3. Sitometre FACSCelesta (bir kısayol tuşu simgesi) simgesine tıklayın, Parametre'yi seçin ve ardından FSC, SSC ve PE sinyalini seçin. PE histogramını oluşturmak için Global Çalışma Sayfası (bir kısayol tuşu simgesi) simgesine tıklayın. Bu çalışmada kullanılan akış sitometresi için, 586 nm'de Annexin V için PE kullanın ve X ekseni üzerinde çizin; 700 nm'de 7-AAD için PerCP-Cy5.5 ve Y ekseni üzerinde çizim.
    4. Lekesiz kontrol örneğini yerleştirin.ampönce cihaza yerleştirin. Edinme Panosu simgesine (bir kısayol tuşu simgesi) tıklayın, istenen popülasyondan en az 10.000 olay alın. FSC-A ve SSC-A nokta grafiğinde bir geçit (P1) kullanarak kalıntıları hariç tutun. Akış hızını Orta hıza ayarlayın ve Verileri Kaydedin. Hücre popülasyonunu FSC/SSC histogramının köşegenine yerleştirmek için voltajı ayarlayın ve Yeniden Başlat'a tıklayın. Akış hızını Orta hıza ayarlayın ve Verileri Kaydedin.
    5. Sonraki tüpe tıklayın, telafiyi ayarlamak için Annexin V ve 7-AAD'nin tek boyama kontrollerini çalıştırın. Kalan tüpleri çalıştırın ve veri toplayın.

5. SEM görüntüleme (Yöntem 2)

  1. Deney örneklerinin hazırlanması
    1. Hücreleri 6 oyuklu plakalarda 2. adıma göre tohumlayın ve inkübe edin ve 3. adıma göre muamele edin.
    2. Tedaviden sonra, tüm süpernatanı kuyulardan aspire edin ve 2x'i PBS ile yıkayın. Her oyuğa 500 μL% 0.05 Tripsin (EDTA olmayan) ekleyin ve inkübatörde 30 saniye inkübe edin.
    3. Hücre ayrılmasını durdurmak ve hücreleri 5 mL'lik tüpe toplamak için her oyuğa 1 mL RPMI-1640 tam kültür ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    4. Hücreleri 500 μL elektron mikroskobu fiksatifi (%2,5 glutarik dialdehit, 100 mM fosfor tuzları) ile oda sıcaklığında 2 saat sabitleyin, ardından gece boyunca 4 °C'de bekletin.
    5. Krom şap çözeltisi hazırlayın: 100 mL ultra saf suya, 70 °C su banyosu ısıtmasına 1.0 g jelatin ekleyin ve eşit şekilde karıştırın. 0,05 g krom şap ekleyin, eşit şekilde karıştırın ve filtre kağıdı ile süzün. Temiz kapak camını 37 °C'de 2 saat krom şap çözeltisine batırın ve daha sonra kullanmak üzere 37 °C fırında kurutun.
      NOT: Amaç, deney sırasında hücre ayrılmasını önlemektir.
    6. Hücreleri sabit çözeltiden toplayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. 100 μL PBS ekleyin ve hücreleri nazikçe üfleyin. Hücre süspansiyonunu kapak camına bırakın, 5 dakika bekletin. Tüm süpernatanı aspire edin ve her seferinde 5 dakika boyunca 3x'i PBS ile yıkayın.
      NOT: Hücre ayrılmasını önlemek için işlem nazikçe yapılmalıdır. Kuvvetlice sallamayın, yavaş hareket etmeyin ve duvar boyunca yavaşça sıvı ekleyin.
    7. 1 saat boyunca 500 μL% 1 osmik asit fiksasyonu ekleyin. Tüm süpernatanı aspire edin ve her seferinde 5 dakika boyunca 3x'i PBS ile yıkayın.
    8. Numuneleri, EtOH çözeltisi başına 15 dakika boyunca bir dizi etanol (EtOH) konsantrasyonunda (%30, %50, %70, %80, %90, %95, %100, %100) art arda dehidre edin.
      NOT: Kapak camları 4 ° C'de birkaç gün boyunca% 100 EtOH içinde tutulabilir, ancak aşırı dehidrasyonu önlemek için mümkün olan en kısa sürede kurumalıdır.
    9. Kritik nokta kurutucuyu açın, CO2 tankını açın, hazneyi 10 °C'ye soğutun. Hazne basıncı 0 psi olduğunda numuneyi hızlı bir şekilde filtre kağıdı ile sarın ve hazneye koyun.
    10. Giriş vanasını açın, CO2 gözlem penceresinden gözlemleyin, iki kırmızı çizgi arasındaki sıvı CO2 seviyesini yükseltin (Üst limiti aşmayın), giriş vanasını kapatın. Numuneyi 10 dakika bekletin. CO2'yi 1 dakika eşitlemek için giriş ve egzoz valflerini aynı anda açın (sıvı CO2 , EtOH'nin yerini alır). Sıvı CO2 seviyesini belirtilen konuma yükseltmek için egzoz valfini kapatın, giriş valfini kapatın.
    11. Sıcaklığı 35 °C'ye ve basıncı 1250 psi'ye ayarlayın. Sıcaklık ve basınç dengelendiğinde, 100 psi/dk'da basıncı boşaltın. Hazne basıncı sıfır olduğunda numuneyi çıkarın ve cihazı kapatın.
    12. İletken bant kullanarak numuneleri SEM alüminyum numune tutuculara monte edin. Numuneleri bir altın tabakası (2-5 nm) ile kaplamak için bir püskürtme kaplayıcı kullanın.
  2. Görüntüleme
    1. Görüntüleme için yüksek çözünürlüklü soğuk alan emisyon SEM kullanın. SEM'in hızlanma voltajını 3 kV'a ayarlayın. Çalışma mesafesini 10 mm'ye ayarlayın. Panoramayı gözlemlemek için büyütmeyi 1.000x'e ayarlayın. Plazma zarını bulmak ve numuneyi görüntülemek için büyütmeyi 5.000x ve 20.000x olarak ayarlayın.
      NOT: PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarını SEM yoluyla görselleştirme işlemi, diğer hücre ve doku türlerine benzer ve kullanılan aletlere bağlıdır. Referans14 , eşlik eden videolarla birlikte ayrıntılı bir SEM protokolü sağlar.

Sonuçlar

Hücre örnekleri protokolde tarif edildiği gibi tedavi edildi ve akım sitometrisi tespiti yapıldı. Normal hücreler Annexin V ve 7-AAD (Annexin V- / 7-AAD-) ile boyanamaz. Pipoptoz, apoptoz ve nekrotozun erken evrelerinde, PS maruz kaldı ve Annexin V'e bağlandı, ancak hücre zarı hala sağlamdı ve hücre dışı boşluktan 7-AAD hariç tutuldu (Annexin V + / 7-AAD-). Daha sonraki aşamalarda, hücre zarı bütünlüğünü kaybeder, hücreler aynı anda Annexin V ve 7-AAD ile boyanır ve çift pozitif sonuçlar gösterir (Annexin V + / 7-AAD +). Nekrotik hücreler sadece 7-AAD (Annexin V-/7-AAD +) ile boyandı. Şekil 1 , LPS/ATP stimülasyonundan sonra, Q2 bölgesindeki hücrelerin önemli ölçüde arttığını ve hücre ölümünü gösterdiğini göstermektedir.

Plazma zarı yüzeyini yakalamak için SEM kullanıyoruz ve zarın özelliklerini tek bir hücreden doğrudan gözlemliyoruz. Şekil 2A, kontrol hücrelerini, Şekil 2B-D, LPS/ATP stimülasyonundan sonraki hücreleri göstermektedir. Membran kanaması ve membran rüptürü (Şekil 2B) dahil olmak üzere piroptoz özelliklerine sahip hücreleri, membran kanaması ve hücre büzülmesi dahil olmak üzere apoptotik özelliklere sahip hücreleri (Şekil 2C) ve hücre şişmesi ve membran yırtılması dahil olmak üzere nekrotoz özelliklerine sahip hücreleri (Şekil 2D) gözlemledik.

figure-results-1
Şekil 1: Akış sitometrisi kullanılarak Annexin V/7-AAD çift lekelenmesinin tespiti. (A) Ek V negatif ve 7-AAD negatif boyama (Q4), Ek V pozitif ve 7-AAD negatif çift boyama (Q3), Ek V pozitif ve 7-AAD pozitif boyama (Q2) ve Ek V negatif ve 7-AAD pozitif boyama (Q1). (B) (A) için nicel veriler. Veriler ortalama ± SD (n=3), eşleşmemiş t testi, **p < 0.01 olarak sunuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının taramalı elektron mikroskobu görüntüleri. (A) Kontrol grubu, 5.000x/20.000x büyütme. (B, C, D) LPS/ATP grubu, 5.000x/20.000x büyütmede zar kanaması, zar yırtılması (↑), hücre şişmesi (↑) ve hücre büzülmesi (↑) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu yazıda, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümünü saptamak için iki yöntem kullanılmıştır. Annexin V/7-AAD çift boyama kullanıldı ve sonuçlar genel boyamadan akış sitometrisi ile analiz edildi. Diğer akış sitometrik analizlerinde olduğu gibi, yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçları dışlamak için bir grup boyanmamış hücre ve iki grup tek boyanmış hücre kuruldu. Sonuçlar, LPS / ATP stimülasyonundan sonra, birkaç hücrenin zar bütünlüğünü kaybettiğini ve bu da hücre ölümünün meydana gelmiş olabileceğini göstermektedir. Bu tespit yöntemi, tüm hücrelerden hücre ölümünü değerlendirmemizi sağlar. Annexin V/7-AAD çift boyamanın piroptoz, apoptoz ve nekrotoz arasında ayrım yapmak için yeterli olmadığını belirtmekte fayda var. Bu üç formun erken aşamalarında, PS plazma zarının dışına maruz kalacaktır ve Annexin V boyaması pozitiftir. Bu üç formun geç evresinde membranın bütünlüğü kaybolur ve boyama sonuçları çift pozitif boyama gösterir. Bu nedenle, meydana gelebilecek olası hücre ölümü biçimlerini daha fazla gözlemlemek için SEM kullandık.

Apoptozda mitokondriyal dış zarda BAX/BAK gözenek oluşumu, ardından hücre küçülmesi ve hücre zarında kanama meydana gelir. Nekrotoz, hücre zarındaki gözenekleri açmak için MLKL'yi kullanırken, piroptoz sinyali, hücre zarında gözenekler oluşturmak için gasdermin'i aktive eder. Hem piroptoz hem de nekrotoza, son aşamada hücre zarı yırtılmasının eşlik ettiğini belirtmek gerekir. Bununla birlikte, gasedermin gözenekleri MLKL gözeneklerinden çok daha büyüktür, bu nedenle gasdermin gözenekleri iyon seçiciliğine sahip değildir. Nekrototik hücreler morfolojide önemli şişlik gösterir15. Sonuçta zar yırtılması ile sonuçlanırlar. Hücre zarı geçirgenlik aktivasyonunun yukarı akışındaki sinyal yolundan bağımsız olarak, hücre zarındaki değişiklikler bu üç hücre ölümü biçimine eşlik eder. Hücre ölümünü incelemek için sezgisel bir yol sağlayan hücre zarını daha fazla gözlemlemek için SEM kullandık. Önceki araştırmacılar tarafından incelenen özelliklerle tutarlı olarak, membran kanaması ve rüptür membranı dahil olmak üzere piroptozun özelliklerini ve hücre şişmesi ve rüptür membranı dahil olmak üzere nekrotozun özelliklerini gözlemledik15. Önceki araştırmacılar tarafından incelenen apoptozun özellikleriyle tutarlı olarak membran kanaması ve hücre büzülmesi gözlemledik16.

Önceki çalışmalarda, LPS ve ATP kombinasyonu genellikle piroptozu indüklemek için kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, apoptoz ve nekrotozun özelliklerini gözlemledik. Her üç form da LPS / ATP'nin neden olduğu hücre ölümünde ortaya çıkabilse de, önceki çalışmalar piroptozun baskın ölüm şekli olmaya devam ettiğini göstermiştir. LPS, en karakterize edilen patojenle ilişkili moleküler modellerden biridir. Ölmekte olan hücrelerden salınan ATP, hücre içinde yüksek bir konsantrasyona sahiptir. Hücre dışı ATP, tehlikeyle ilişkili moleküler modellerden biridir17. LPS/ATP, piroptozu indüklemek için klasik iki aşamalı bir stimülasyon yöntemidir. Araştırmalar, LPS ile uyarılan hücrelere ATP ilavesinin kaspaz-118'i hızla aktive edebildiğini, kaspaz-1 geninin susturulmasının ise LPS / ATP'nin neden olduğu hücre ölümünü önemli ölçüde tersine çevirebileceğinigöstermiştir 19. Önceki çalışmalarda, apoptotik ve nekrototik hedef proteinlerin LPS/ATP ile indüklenen aktivasyonunu da bulduk20,21. LPS/ATP klasik bir piroptoz indükleyicisi olmasına rağmen, apoptoz ve nekrotoza da neden olabilir.

Aslında, bu üç form genellikle bağımsız olarak mevcut değildir ve sinyal aşamaları arasında karışma vardır. Örneğin, gasdermin proteinleri, mitokondriyal apoptotik yol22'yi arttırmak için sitokrom c salınımını teşvik etmek için mitokondriyi hedefler. Kaspaz-3'ün aktivasyonu gasdermin E'yi parçalayabilir ve daha sonra piroptozutetikleyebilir 23. Bir çalışma, MLKL / PIPK3 sinyallemesinin NLRP3 inflamatuarlarının24 aktivasyonunda rol oynadığını göstermektedir. Bu karmaşık çapraz konuşma, PANoptozis kompleksi tarafından düzenlenen ve piroptoz, apoptoz ve/veya nekrotozun temel özelliklerine sahip ve tek başına bu programlanmış hücre ölüm yollarının hiçbiri tarafından açıklanamayan inflamatuar programlanmış bir hücre ölüm yolu olarak tanımlanan PANoptosis kavramına yol açmıştır25. PANoptosis kavramı önerildiğinde, bilim adamları programlanmış hücre ölümünün oluşumunu daha kapsamlı bir şekilde tanımladılar, bu aynı zamanda programlanmış hücre ölümünün karmaşıklığını da vurgulamaktadır. Bu arada, bu aynı zamanda bu araştırma yönteminin sınırlılıklarını da göstermektedir. LPS / ATP'nin neden olduğu hücre ölümünde piroptoz baskın olarak kabul edilse de, bu ölüm formlarının oranı veya hepsinin var olup olmadığı, hatta diğer programlanmış ölüm formlarını da içerip içermediği belirlenemez. Bu, gelecekte araştırılması gereken bir alan olabilir.

Bu protokol, LPS ve ATP'nin neden olduğu makrofaj ölümüne dayanmaktadır. Diğer modeller ve hücreler için de geçerli olan, bütünden bireye kadar bir test yöntemi tanımladık. Sonuçlar, hücrelerin piroptozla sınırlı olmayan piroptoz, apoptoz veya nekrotoz geçirmiş olabileceğini ve araştırmacıların LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünü daha iyi anlamalarına ve daha iyi bir deneysel yöntem seçmelerine yardımcı olabileceğini göstermektedir. Önceki çalışmalarda, Annexin V/7-AAD veya Annexin V/PI çift boyama, apoptoz26,27 oluşumunu belirtmek için yaygın olarak kullanılmıştır, bazı araştırmacılar bunu apoptoz28'i incelemek için de kullanmışlardır. Aslında, bu çift boyama yoluyla üç tür hücre ölümü arasında ayrım yapamayız. Bu protokol, araştırmacılara, özellikle yeni başlayanlara, Annexin V/7-AAD veya Annexin V/PI çift boyamanın hücre ölümü tipini kalitatif hale getiremeyeceğini hatırlatır. Sadece hücre hasarını ve ölümünü bir bütün olarak gösterebilir veya hücrenin bir tür ölüm geçirmiş olabileceğini gösterebilir. Daha hedefli araştırmalarda, kesin olarak program ölümünün el altında olduğunu göstermek için diğer ölümleri engelleyen bir kontrol grubu tanıtmak gerekir. Benzer şekilde, daha fazla mekanik araştırma, farklı programlanmış ölümlerin kritik hedeflerini araştıracaktır.

Ek olarak, deneyin hazırlanması sırasında, şu anda asılı hücrelerin çok az tanımı olan, yapışık hücrelerin SEM'i için birçok ayrıntılı deneysel prosedür olduğunu bulduk. Burada, askıda hücreler için numune hazırlama yönteminin daha ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Adım 5.5, askıya alınmış hücrelerin hücre slaytları üzerine hareketsiz hale getirilmesine yardımcı olmak için gerekli bir adımdır. Hücre ayrılmasını önlemek için sonraki işlemler nazikçe yapılmalıdır. Krom şap çözeltisine ek olarak, poli-L-lizin de hücreleri hareketsiz hale getirebilir.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi, Yenilikçi Çin Tıbbı ve Eczacılık Enstitüsü'nden Jiayi Sun ve Lu Yang'a, akış sitometrisi konusunda yardım için, Güneybatı Çin Tıbbı Kaynakları Devlet Anahtar Laboratuvarı'nda Cuiping Chen'e, taramalı elektron mikroskobu konusunda yardım için büyük takdirimizi sunuyoruz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [82104491], Sichuan Doğa Bilimleri Vakfı [2023NSFSC0674] ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı [2021M693789] tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 pankreas enzim çözeltisi (EDTA hariç)BOSTER Biyolojik Teknoloji co.ltdPYG0068
5 mL Polistiren Yuvarlak Tabanlı TüpCORNING352235
5 mL santrifüj tüpüLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
6 oyuklu plaka Sorfa Yaşam Bilimleri Araştırma A.Ş., Ltd220100
Annexin V-PE / 7-AAD apoptoz analiz kitiAbsin (Şangay) Biyolojik Teknoloji co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5 kez; Bağlayıcı tampon, Apoptoz Pozitif Kontrol Çözeltisi
celculture CO2 inkübatörüEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.Yok hücre
kültürü kabı, 100 mmSorfa Yaşam Bilimleri Araştırma Co, Ltd230301
Cellometer K2 Floresan Hücre SayacıNexcelom Bioscience LLCCellometer K2
Cellometer SD100 Sayma OdalarıNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
santrifüj makinesiHunan Xiangyi Laboratuvar Enstrüman Geliştirme Co, LtdL530
krom şap Guangdong Wengjiang Kimyasal Reaktif Co., Ltd.
kapaklı camlar, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
kritik nokta kurutucuQuorum TechnologiesK850
dimetil sülfoksitBOSTER Biyolojik Teknoloji co.ltdPYG0040
elektron mikroskobu fiksatifServicebio Technology co., ltd ve nbsp;G1102%2,5 glutarik dialdehit, 100 mM fosfor tuzları
elektronik teraziSHIMADZUATX124
etanol mutlakChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021033102
akış sitometresiBecton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
akış sitometrisi analiz yazılımıBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Yazılım
jelatinGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
Yüksek çözünürlüklü soğuk alan emisyon taramalı elektron mikroskobuTITACHIRegulus 8100
insan monositik hücre hattı THP-1Procell Yaşam Bilimi ve Teknoloji Co., Ltd.CL0233
ters mikroskop Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vorteks KarıştırıcıVELP Scientifica SrlZX4
lipopolisakkarit ve nbsp;Pekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd. L8880LPS, Escherichia coli 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. A8270
forbol-12-miristat-13-asetat Pekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd. P6741
fosfat tamponlu tuzlu suServicebio Technology co., ltd ve nbsp;G4202
PipetEppendorf AGN/A
pipet uçları, 10 μ LServicebio Teknoloji ltd.ŞTİ T-10PL
pipet uçları, 1 mL Servicebio Teknoloji ltd.ŞTİ T-1250L
pipet uçları, 200 & LServicebio Teknoloji ltd.ŞTİ T-200L
RPMI-1640 tam kültür ortamıProcell Yaşam Bilimleri ve Teknoloji Co., Ltd.CM0233RPMI-1640 +% 10 FBS + 0.05mM β-merkaptoetanol +% 1 P/S
RPMI-1640 kültür ortamı Şangay  BazalMedya  Teknolojiler A.Ş., LTD.
kılıf sıvısıBECKMAN COULTER8546733
püskürtme kaplayıcıCressington Scientific Instruments Ltd108
termostatik su banyosuGUOHUA Elektrikli Aletler CO., Ltd HH-1
PA04354K211104 Serisi

Kaynaklar

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
  3. Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803(2023).
  4. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  5. Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
  6. Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).
  7. Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
  8. Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772(2020).
  9. Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
  10. Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
  11. Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
  12. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
  13. Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
  14. JoVE, JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  15. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
  16. Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
  17. Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
  18. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  19. Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48(2018).
  20. Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830(2022).
  21. Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233(2018).
  22. Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689(2019).
  23. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  24. Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515(2015).
  25. Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
  28. Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244(2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

LPS ATP StimülasyonuPMA DiferansiyasyonuHücre ÖlümüPiroptozApoptozNekroptozAkış SitometrisiTaramalı Elektron MikroskobuAnnexin V Boyama
PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.