Yöntem makalesi

Gen ve dokuya özgü güçlendiricileri seçmek için web tabanlı bir iş akışı

DOI:

10.3791/66840

⸱

18 Temmuz 2025

 ,  ,  , 
1Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 3Stem Cell Medicine Department, Murdoch Children's Research Institute, The Royal Children's Hospital, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine, reNEW Melbourne, Murdoch Children's Research Institute, 5Systems Biology Institute (SBI) Australia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyologların yalnızca tarayıcı tabanlı araçları kullanarak dokuya özgü gen arttırıcıları tanımlamaları için kodlama gerektirmeyen bir iş akışı sunuyoruz. Protokolümüz, halka açık H3K4me1/H3K27ac histon işaretlerinden ve Hi-C verilerinden yararlanarak, programlama uzmanlığı olmayan araştırmacıların ilgilendikleri genlerle ilişkili potansiyel düzenleyici unsurlara erişmesine, bunları analiz etmesine ve tanımlamasına olanak tanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arttırıcılar, gen ekspresyonunu düzenleyen DNA bölgeleridir. Arttırıcılar içindeki mutasyonlar, hastalığa yol açan anormal gen düzenlemesine neden olabilir. Bu nedenle, belirli dokularda gen aktivitesini düzenleyen arttırıcıların belirlenmesi, hastalığın genetik temelini anlamak için çok önemlidir. Bununla birlikte, proteinleri kodlamadıkları için güçlendiricilerin tanımlanması zordur. Çok sayıda geliştirici deposu ve tanımlama aracı mevcut olsa da, bu araçların karmaşıklığı biyologlar için bir zorluk teşkil edebilir. Biyologların bu kaynakları kullanmasını kolaylaştırmak için, H3K4me1 ve H3K27ac histon işaretleri gibi mevcut web tabanlı genomik verilerden ve kromatin konformasyon analizi (Hi-C) verilerinden yararlanan biyolog dostu bir protokol (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow) sunuyoruz. Bu protokol tamamen web tabanlıdır ve son kullanıcılardan programlama becerisi gerektirmez. Bu yaklaşımın faydasını, kalp gelişimi için kritik bir gen olan TBX5'i düzenleyen aday güçlendiricileri karakterize ederek gösterdik. Bu protokol, sol ventrikülde bu gen ile ilişkili güçlendiricilerin tanımlanmasını kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arttırıcılar, gen transkripsiyonunu, gelişimini ve hücresel farklılaşmayı düzenleyen kodlamayan DNA bölgeleridir 1,2. Arttırıcıların mutasyonu, gelişimsel bozukluklar, kanserler ve diğer genetik durumlar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara yol açabilir 3,4,5,6. Bu nedenle, güçlendiricileri anlamak, gen ekspresyonu, mutasyon ve hastalıkları anlamak için çok önemlidir.

Güçlendiricilerin hedef genleriyle nasıl etkileşime girdiğini anlamak için, genom içindeki konumlarını belirlemek önemlidir. Bununla birlikte, güçlendiriciler hem transkripsiyonel başlangıç bölgesine (TSS) yakın hem de çok daha uzağa, onlarca ila yüzlerce kilobaz 2,7,8,9'a kadar yerleştirilebileceğinden, geliştirici konumlarını belirlemek her zaman kolay değildir.

Öngörülemeyen genomik konumlarına rağmen, arttırıcılar farklı biyokimyasal ve yapısal imzalar gösterir ve bu da sistemik olarak izlenmelerine izin verir. Genel olarak, arttırıcılar, intergenik ve intronik bölgelerde zenginleştirme eğilimindedir ve küçük bir sayı ekzon 2,8 içinde bulunur. Genellikle, düzenleyici rollerini tanımlayan ve farklı gelişim aşamaları ve dokular boyunca uzaysal-zamansal aktivitelerini belirleyen spesifik histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörü bağlanması ile işaretlenirler10,11.

ChIP-seq, transkripsiyon faktörü bağlama bölgelerini (TFBS'ler) ve 1,12,13,14,15 promotörbölgelerinde zenginleştirilmiş güçlendiricilerin ayırt edici özelliği, H3K4me1, aktif güçlendirici işaretleri, H3K27ac ve H3K4me3 işaretleri gibi histon modifikasyon işaretlerini tanımlamak için kullanılır. Kromatin konformasyon yakalama (3C) teknikleri ve 4C, 5C, Hi-C ve ChIA-PET gibi türevleri, uzak genomik bölgeler arasındaki fiziksel etkileşimleri haritalamak için kullanılır. 3C, belirli dokulardaki spesifik etkileşimleri hedeflerken, Hi-C, hücre tipleri arasında genom çapında bir mimari sunar 16,17.

Mevcut yöntemlere ek olarak, EnhancerAtlas veya EnhancerFinder18,19 gibi havuzlanmış geliştirici veritabanları da dahil olmak üzere geliştiricileri karakterize etmek için özel yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu araçlar genellikle araştırmacıların birçok dokuda birden fazla geliştiriciyi araştırmak için birden fazla veri kümesini entegre etmelerini gerektirir ve bu, biyoinformatik ve veri madenciliği deneyimi olmayan biyologlar için bunaltıcı olabilir.

Burada, tamamen mevcut web araçlarına dayalı olarak geliştiricileri seçmek için kullanıcı dostu bir protokol açıklıyoruz. Bu, araştırmacıların ilgilenilen bir geni (GoI) sorgulamasına ve karşılık gelen arttırıcıları almasına olanak tanır. Buradaki protokol, belirli bir dizi kritere göre güçlendiricileri seçer: histon modifikasyonları, kromatin etkileşimleri ve doku özgüllüğü 1,12,13,14,15,16,17,20,21. İntronlarda bulunan güçlendiricilerin,22 numaralı genler arasındaki genomik bölgelerde yer alan intergenik arttırıcılara kıyasla dokuya özgü aktivite gösterme olasılığı daha yüksektir. Potansiyel aktif arttırıcıların kapsamlı bir şekilde kapsanmasını sağlamak için, gen cisimlerinin dışında bulunan düzenleyici unsurları yakalama olasılığını artırmak için iki komşu GoI arasındaki arama aralığını tanımladık. Geliştirici adaylarını listelemek için geliştiriciye özgü bir epigenetik ayırt edici özellik olan H3K4me1 ve aktif bir geliştirici işareti olan H3K27ac kullandık. Bu adaylar daha sonra Hi-C verilerine dayalı olarak rafine edildi ve ilgili promotör ile fiziksel etkileşimlere sahip güçlendiriciler korundu. Bu protokol, yalnızca halka açık web tabanlı araçları kullanarak geliştirici tanımlama sürecinde biyologlara rehberlik etmek için tasarlanmıştır. Epigenetik ve kromatin etkileşim verilerini entegre ederek, burada açıklanan yaklaşım, daha fazla deneysel doğrulama için potansiyel arttırıcılar hakkında hipotezler oluşturmak için pratik bir çerçeve sunar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Adım adım izlenecek yol https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow'da mevcuttur. Protokolde kullanılan veriler Tablo 1 ve Tablo 2'de özetlenmiştir.Sorun giderme Ek Dosya 1'de mevcuttur.

1. GoI'nin Yerini Belirleme (Şekil 1)

  1. EnsEMBL genom tarayıcısını (https://www.EnsEMBL.org) açın.
  2. Türe ve versiyona uygun genom montajını seçin.
  3. Arama alanına GoI yazın ve Git'e tıklayın.
  4. Uygun EnsEMBL gen kimliğine giden bağlantıyı seçin.
  5. GoI'yi çevreleyen bölgede gezinmek için özet bölümünün altında bulunan Ayrıntılarda bölge sekmesi görüntüleyicisinin bağlantısını tıklayın.

2. Geliştirici algılama bölgesinin tanımlanması (Şekil 2)

  1. Algılama bölgesini tanımlamak için GoI'nin iki komşu genini tanımlayın. GENCODE yolundan Temel Gen Açıklamaları'nda birleştirilmiş EnsEMBL/Havana ile ilgili görsel öğeler olarak açıklamalı bu genleri aramak için Gen Efsanesi yolunu kullanın. GENCODE izindeki uygun gen adı üzerindeki < ve > işaretleri ile GoI'nin yönlülüğünü belirleyin.
  2. Bu genler arasındaki intergenik bölgeyi seçmek için tıklayın ve sürükleyin ve seçilen alanı görselleştirmek için açılır kutuda Bölgeye atla'yı tıklayın. Bu adımı tekrarlayarak ilgilendiğiniz bölgeyi istediğiniz zaman yeniden tanımlayın.
  3. (İSTEĞE BAĞLI) Parça görüntüleyicinin üst kısmındaki Parça ekle/kaldır'ı seçerek ekranı özelleştirin. Parça görüntüleyicinin üzerindeki yakınlaştırma/gezinme kontrollerini kullanarak yakınlaştırma seviyesini değiştirin.

3. Histon işareti analizi (Şekil 3)

  1. Ayrıntılı bölge sekme görüntüleyicisinin kenar çubuğunda Bu sayfayı yapılandır'ı seçin.
  2. Bölge Görüntüsünü Yapılandır sekmesi ekranının kenar çubuğunda, Düzenleme açılır menüsü altında, Hücreye/Dokuya Göre Etkinlik'i seçin.
  3. İlgilendiğiniz dokuları aramak ve seçmek için Hücre/Doku arama çubuğunu kullanın. Alternatif olarak, ilgilendiğiniz dokuları bulmak için arama çubuğunun altındaki alfabetik gezinme çubuğunu kullanın.
  4. Hücre/Doku'nun yanındaki Deneyler sekmesini seçin.
  5. Güçlendiricilerin işaretçisi olarak H3K4me1 ve H3K27ac'yi ve destekleyicilerin işaretçisi olarak H3K4me3'ü seçin.
  6. Parça görüntülemeyi yapılandır'ı seçin.
  7. Geliştirici algılama bölgesindeki H3K4me1 ile işaretlenmiş bölgeleri ve GoI'nin yukarısındaki H3K4me3 ile işaretlenmiş bölgeleri görselleştirmek için İzleri görüntüle'yi seçin.
  8. Geliştirici adayları için, yeni eklenen H3K4me1 parçalarındaki renkli görsel/kutu öğelerine tıklayarak tanımlanan algılama bölgeleri içinde H3K4me1 ile işaretlenmiş genomik bölgelerin koordinatlarını alın. Bu, elementin baz çiftindeki (bp) genomik konumu hakkında bilgi içeren "Hists & Pols" açılır penceresini ortaya çıkarır.
    1. Hem H3K4me1 hem de H3K27ac'nin renkli görsel/kutu öğelerinin çakıştığı H3K4me1 bölgelerini seçerek aktif geliştirici adaylarını alın. Yakınlaştırma düzeyinin ayrıntı düzeyi, bu parçada gösterilen geliştirici adaylarının sayısını etkileyebilir.
    2. Alternatif olarak, H3K4me1/H3K27ac izi altındaki grafik tepe noktalarını kapsüllemek için parçayı tıklayıp sürükleyerek her bir genomik özellik için ilgilenilen bölgeleri manuel olarak tanımlayın. Genomik konum koordinatlarını bir metin dosyasına kopyalayın ve .bed biçiminde kaydedin.
  9. Benzer şekilde, destekleyici bölgeler için, GoI'nin yukarı akışındaki bölgeye odaklanarak H3K4me3 izini kullanarak adım 3.8'i tekrarlayın.

4. Kromatin konformasyon yakalama (Hi-C) analizi (Şekil 4)

  1. 4DN veri portalına (https://data.4dnucleome.org/) erişin. 4DN ana sayfasının ana yığılmış çubuk grafiğinde (Şekil 5), Deney Setlerinin Y ekseni olarak, Deney Türü'nün X ekseni olarak seçildiğinden ve grafiğin Organizma'ya göre gruplandırıldığından emin olun.
  2. Ana çubuk grafiğin X Ekseni boyunca yerinde Hi-C çubuğunu bulun. Çubuğun İnsan Deney Setleri için gruplandırılmış kısmına tıklayın ve ardından açılır penceredeki Gözat düğmesine tıklayın. Sol taraftaki paneli kullanarak ilgili veri kümelerini filtreleyin.
  3. İlgilenilen doku için ilgili Biosample'ın Başlık sütunundaki bağlantıya tıklayın.
  4. Hi-C veri kümesini daha ayrıntılı bir şekilde incelemek için İşlenmiş Dosyalar sekmesinde Verileri Keşfet'e tıklayın.
  5. Tanımlanan promotörün koordinatlarını ilgilenilen dokuya girin (adım 3.9'dan itibaren) ve ısı haritasına sağ tıklayarak bölgeyi yatay olarak işaretleyin (Şekil 4). Eklenen çizgiler, organizatör bölgesinin ısı haritası boyunca görsel olarak izlenmesini sağlar. Çizgiye sağ tıklayıp yatay/dikey cetvel ve Seriyi Kapat'ı seçerek yanlışlıkla çizgileri kaldırın.
  6. Minimum değerlerine göre etkileşim eşiğini hesaplamak için deneysel olarak doğrulanmış tüm kontrol geliştiricilerin23 koordinatlarını girin. Bu kontrol arttırıcıların, minimum önemli etkileşimi tanımlamak için kıyaslama görevi görerek, destekleyici bölge ile etkileşime girdiği daha önce onaylanmıştır.
  7. Matrisin sağ tarafındaki renk anahtarına göre sıfır olmayan en düşük etkileşim puanına dayalı olarak kontrol geliştiricilerini kullanarak destekleyici-geliştirici eşiğini tanımlayın.
  8. H3K4me1 ile ilişkili tüm bölgelerin genomik koordinatlarını girin (adım 3.8'den itibaren) ve Hi-C ısı haritasında dikey olarak işaretleyin. Bu, H3K4me1 işaretli arttırıcılar (dikey) ve promotör bölgesi (yatay) arasındaki kesişimin önemli etkileşimler için incelenebildiği bir çapraz kontrol modeline izin verir.
    1. Ardından, H3K4me3 ile işaretlenmiş bölgelerin etkileşim puanlarını etkileşim eşiği ile karşılaştırarak zayıf etkileşimde bulunan bölgeleri filtreleyin (adım 4.6).
    2. 4DN portal ısı haritasında tanımlanan eşikten daha yüksek etkileşim frekansları sergileyen genomik koordinatları seçin. Bu bölgeler, ısı haritasında daha konsantre (daha koyu) sinyaller olarak görünür ve BED formatında kaydedilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan protokolün kullanımını göstermek için, insan kalbindeki TBX5 genini araştırdık ve H3K4me1, H3K27ac ve Hi-C verilerini içeren kapsamlı iş akışını kullanarak TBX5 ile ilişkili güçlendiricileri araştırdık. TBX5 , dört odacıkların oluşumu ve septum ayrılması da dahil olmak üzere uzuv ve kalp gelişimine katkıda bulunan bir gendir24. Bu gendeki mutasyon, septum defektleri de dahil olmak üzere uzuv anormalliklerine ve konjenital kalp hastalığına (KKH) neden olan Holt-Oram sendromunun (HOS) ana nedenidir24. TBX5 ile ilişkili kardiyak arttırıcıların mutasyonu, CHD24'ü kritik olarak etkileyebilir. Önceki bir çalışma, insan kardiyak spesifik dokusunda bilinen üç TBX5 arttırıcı keşfetti - yani "Enhancer 2", "Enhancer 9" ve "Enhancer 16" (Ek Dosya 2), transgenik farelerde karşılaştırmalı fenotiplere sahip olduğu gösterildi23.

İnsanda TBX5'in aşağı ve yukarı akışında iki yan gen olan RBM19 ve TBX3 arasındaki H3K4me27- ve H3K27ac ile zenginleştirilmiş bölgeleri, TBX5 lokusundaki varsayılan arttırıcıları elde etmek için araştırdık (Şekil 1 ve Şekil 2). Kalbe özgü arttırıcıları tanımlamak için kalp kası hücreleri seçildi. Varsayılan TBX5 kardiyak arttırıcı bölgeler koordinat olarak alındı (chr12: başlangıç-bitiş) ve hem H3K4me1- hem de H3K27ac ile ilişkili 22 bölge tanımlandı (Şekil 3 ve Ek Dosya 3). Varsayılan TBX5 kardiyak arttırıcılar, 4DNucleome veritabanında tutulan Hi-C verilerini çapraz referans almak için EnsEMBL genomik veritabanından alındı (Şekil 4). Bu, potansiyel arttırıcılar ve TBX5 kardiyak promotör arasındaki olası etkileşimleri ölçmek için yapıldı. Burada açıklanan protokolü takiben, 22 genomik bölgeden 21'inin kalp kası hücrelerinde TBX5 promotörü (chr12: 114400143-114410103) ile etkileşime girdiği doğrulanmıştır (Ek Dosya 4). Promotör ile fiziksel etkileşimi olmayan bir bölge vardı (Şekil 4, adım 4.8). Son olarak, bu protokolü biyolojik olarak doğrulanmış bu güçlendiriciler ve mevcut altın standart kalp güçlendiriciler veritabanı olan VISTA Kardiyak Arttırıcılar Tarayıcısı ile karşılaştırdık ve şu anda veritabanı25 tarafından yakalanmayan ek güçlendiricileri ortaya çıkardık.

Burada sunulan protokol tarafından alınan 21 TBX5 geliştiricinin mevcut veritabanlarıyla çapraz karşılaştırmasını gerçekleştirdik. VISTA Cardiac Enhancer Browser'dan (Ek Dosya 5)25 adet TBX5 geliştirici aldık. VISTA tarafından tanımlanan 4 kardiyak güçlendiriciden 3 güçlendirici, hs2329, mm1282 ve m370, bu web tabanlı güçlendirici algılama protokolü tarafından tanımlanan bölgelerle örtüştü (Şekil 5). Tahmin edilen güçlendiricilerin her biri, genomik bölgeleri Smemo ve ark.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) ve Enhancer 16'dan (chr12:114415466-114420433, GRCh38) daha önce deneysel olarak doğrulanmış güçlendiricilerle paylaşırken, Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38) ile örtüşme göstermediler. VISTA tarafından tanımlanan güçlendiricilerden biri olan hs498, bölge H34Kme1 işaretleriyle kısmi örtüşme göstermesine rağmen, bu protokol veya Smemo ve ark.'nın deneysel olarak doğrulanmış güçlendiricileri23 (Şekil 5) tarafından tahmin edilen herhangi bir güçlendirici ile örtüşmedi (Şekil 5). Benzer şekilde, Enhancer 9, bu boru hattı tarafından tahmin edilen geliştiricilerle örtüşmedi, ancak H3K4me1 işaretleriyle ilişkilendirildi (Şekil 5).

figure-results-1
Şekil 1: EnsEMBL Genome Browser'da GoI'yi bulmak için adım adım kılavuz. Kullanıcı önce EnsEMBL ana sayfasını açar (1.1), türü (İnsan) seçer ve geni arama çubuğuna girer (1.2-1.3). Sonuç listesinden, uygun gen kimliği seçilir (1.4), bu da gen özeti sayfasını açar. Kullanıcı daha sonra, komşu öğeler ve düzenleyici özellikler de dahil olmak üzere GoI'yi çevreleyen genomik bölgeyi görselleştirmek için Ayrıntılı Bölge köprüsüne (1.5) tıklar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: EnsEMBL Genome Browser kullanılarak GoI etrafındaki geliştirici algılama bölgesinin tanımlanması. Geliştirici algılama bölgesini tanımlamak için, genlerin birleştirilmiş EnsEMBL/Havana açıklamaları ile etiketlenmiş koyu sarı bloklar olarak gösterildiği GENCODE yolundan Temel Gen Açıklamalarını kullanarak GoI'yi çevreleyen iki komşu geni tanımlayın. Her genin transkripsiyon yönü, gen adının (2.1) yanındaki ok uçları (< veya >) ile gösterilir. Komşu genler arasındaki intergenik bölgeyi seçmek için, ilgilenilen bölgeye tıklayın ve sürükleyin, ardından yakınlaştırmak için açılır kutuda Bölgeye atla'yı seçin (2.2). Düzenleyici veya geliştirici ile ilgili ek açıklamalar eklemek için Parça ekle/kaldır (2.3) seçeneğini tıklayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: EnsEMBL Genome Browser kullanılarak güçlendirici algılama bölgesindeki histon modifikasyon izlerinin konfigürasyonu. Sol araç çubuğunda, parça yapılandırma paneline erişmek için Bu sayfayı yapılandır'a (3.1) tıklayın ve Düzenleme bölümü (3.2) altındaki "Hücreye/Dokuya Göre Etkinlik"e gidin. Açılan sekmede, "Deneyler" bölümünü (3.3) seçin ve ilgilendiğiniz dokuyu (kalp kası hücresi) (3.4) bulmak ve seçmek için Hücre/Doku arama çubuğunu kullanın. Histon işareti panelinde (3.5), H3K4me1 ve H3K27ac'yi aktif geliştirici işaretleri olarak ve H3K4me3'ü düzenleyici işareti olarak etkinleştirin ve ardından "Parça ekranını yapılandır"a (3.6) tıklayın. Parça seçimlerini onayladıktan sonra, genom görüntüleyiciye dönmek için "Parçaları görüntüle"ye (3.7) tıklayın. Histon işareti zirveleri artık algılama bölgesinde (3.8) ilgili doku etiketi altında renkli bloklar olarak gösterilmektedir (sarı: H3K4me1, mavi: H3K27ac ve turuncu: H3K4me3). "Hists & Pols" pop-up'ı, bölgenin genomik koordinatlarını baz çiftleri (chr:start-end) halinde içerir, bu koordinatlar kopyalanabilir ve aşağı akış analizi için kaydedilebilir. Parçadaki renkli öğelere tıkladıktan sonra bir "Hists & Pols" açılır penceresi belirir. Açılır pencere, bölgenin genomik koordinatlarını baz çiftleri halinde içerir (örneğin, promotör bölgesi için chr12:11443450-114451611), bunlar kopyalanabilir ve aşağı akış analizi için kaydedilebilir (3.8). Benzer şekilde, aday güçlendiricileri çıkarmak için, izler boyunca tepe noktalarının ve kutuların dikey olarak hizalanmasıyla gösterildiği gibi, H3K4me1 ve H3K27ac tepe noktalarının çakıştığı bölgelere öncelik verin (3.9). Çakışan bölgeler, kutularına tıklanarak doğrudan veya bir bölge tanımlamak için hizalanmış tepeler arasında manuel olarak tıklatıp sürükleyerek seçilebilir (örneğin, aktif bir aday bölge için chr12:114400143-114410103). Açılır pencerede gösterilen koordinatlar, aşağı akış doğrulaması veya görselleştirme için BED biçiminde kaydedilmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: 4D Nucleome Veri Portalından Hi-C ısı haritaları kullanılarak promotör-arttırıcı kromatin etkileşimlerinin görselleştirilmesi. 4D Nucleome Veri Portalı ana sayfası, mevcut deney türlerini organizmaya göre özetleyen yığılmış bir çubuk grafik görüntüler. İnsan numuneleri için "yerinde Hi-C" veri seti, çubuğun (4.1) ilgili bölümüne tıklanarak seçilir. İlgili veri kümelerinin filtrelenmiş bir listesi görüntülenir; kardiyak miyoblastlara farklılaşmış H9 hücrelerinden türetilen bir Hi-C veri seti seçilmiştir (4.2). Seçilen veri kümesi (4.3), Verileri Keşfet düğmesi (4.4) aracılığıyla HiGlass tarayıcısında açılır. İlgilenilen genomik bölge koordinat kutusuna (4.5) girilir ve temas matrisi renk ölçekli bir ısı haritası olarak işlenir. Daha koyu renkler (koyu kırmızıdan siyaha) daha güçlü kromatin temas frekansını gösterirken, daha açık renkler (beyazdan turuncuya) daha zayıf etkileşimleri temsil eder. Promotör koordinatına yatay bir kural yerleştirilir ve deneysel olarak doğrulanmış üç kontrol arttırıcının pozisyonlarına dikey kurallar çizilir (4.6). Bu kesişimler, destekleyici-geliştirici kontaklar (4.7) arasındaki en güçlü görünür sinyal (en koyu renk) tarafından belirlenen katı bir etkileşim eşiği tanımlamak için kullanılır. Aday H3K27ac ve H3K4me1 işaretli arttırıcıların konumlarına ek dikey kurallar çizilir (adım 3.8'den itibaren). Destekleyici-geliştirici kesişimleri eşiğe eşit veya eşikten daha koyu olan adaylar korunurken, sinyalleri daha zayıf olanlar (daha açık renkli kareler) hariç tutulur (4.8). Tutulan koordinatlar manuel olarak çıkarılır ve aşağı akış analizleri için BED formatında kaydedilir. (a. Geliştirici 2, b. Geliştirici 9 ve c. Geliştirici 16) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: VISTA onaylı kardiyak güçlendiriciler ve kontrol arttırıcılar ile karşılaştırıldığında, tahmin edilen TBX5 arttırıcıların genomik tarayıcı görünümü. Genom tarayıcı anlık görüntüleri, web tabanlı protokol (altta) tarafından alınan tahmin edilen geliştiricileri VISTA onaylı geliştiricilerle (üstte) ve deneysel olarak doğrulanmış kontrol geliştiricilerle (ortada) karşılaştıran geliştirici arama aralığını (ADIM 2) görüntüler. Ana panel, kalp kası hücresine özgü H3K4me1 (sarı), H3K27ac (mavi) ve H3K4me3 zirveleri (turuncu) dahil olmak üzere açıklamalı düzenleyici unsurlarla birlikte tam genomik lokusu gösterir. Yakınlaştırılmış üç şekil, protokol, VISTA ve kontrol geliştiriciler tarafından alınanlar arasındaki hizalamayı yakalar. Kontrol arttırıcılarla örtüşme kırmızı kutularla özetlenmiştir. Her alt bölge için koordinatlar alt tarayıcı panellerinde görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çalışmada kullanılan veriler. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Çalışmada kullanılan web tabanlı araçlar. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: EnsEMBL Genome Browser için sorun giderme talimatları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: GRCh38 formatında bir BED dosyası, deneysel olarak doğrulanmış TBX5 kardiyak kontrol arttırıcılar23. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: GRCh38 formatında bir BED dosyası, TBX5 kardiyak arttırıcılar STEP3 tarafından EnsEMBL'den alındı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: GRCh38 formatında bir BED dosyası, TBX5 kardiyak arttırıcılar STEP4 tarafından EnsEMBL'den alındı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: GRCh38 formatında bir BED dosyası, VISTA kardiyak arttırıcı tarayıcıdan alınan TBX5 kardiyak arttırıcılar25. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan web tabanlı protokol, geliştirici tahmini yerine geliştirici alımı için bir iş akışı olarak işlev görür. Halka açık dokuya özgü veri kümelerinden, histon modifikasyonlarından (H3K4me1 ve H3K27ac) ve Hi-C etkileşim verilerinden yararlanarak, GoI ile ilişkili potansiyel arttırıcıları daraltır. Makine öğrenimine veya dizi tabanlı modellere dayanan hesaplamalı tahmin araçlarının aksine, yaklaşımımız yalnızca deneysel verilere dayalı olarak geliştiricileri almaya odaklanır. EnsEMBL genom tarayıcısı için sorun giderme talimatları Ek Dosya 1'de verilmiştir.

Bu iş akışı, geliştirici-promotör etkileşimlerini daha yüksek doğrulukla haritalayan ChIA-PET ve PLAC-seq gibi gelişmiş yöntemlere benzer şekilde, histon işaretleri ve kromatin etkileşim verileri gibi temel unsurları entegre eder10,11. Bununla birlikte, bu yöntem, protokol daha az kaynak yoğun olduğundan ve önemli ölçüde zaman kazandırdığından, yüksek çözünürlüklü deneysel tekniklerin uygulanabilir olmadığı durumlarda faydalıdır.

Yukarıda sunulan yaklaşımın birincil sınırlaması, alınan etkileşimlerin kesinliğini etkileyebilecek mevcut veri kümelerinin kullanılabilirliğine ve kalitesine bağımlılığıdır. TBX5 ile ilişkili genetik mutasyonlar bağlamında kardiyak gelişim sırasında arttırıcı aktivitenin araştırılması, dokuya özgü çözünürlük gerektirir. Bu tür bir analiz için, gelişimsel düzenleme ile ilgisi göz önüne alındığında, embriyonik kalp dokusu en uygun olacaktır. Bununla birlikte, hiçbir embriyonik veri seti, histon modifikasyon verilerini içermiyordu, analiz sırasında halka açık idi. Bunu hesaba katmak için ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 veya EnhancerFinder gibi alternatif kaynakları entegre etmek, geliştirici tanımlama ve doğrulama için ek veri kümeleri sağlayarak işlem hattının faydasını genişletebilir18,19.

TBX5 REPFIX'te, H3K4me1 tabanlı analiz, daha fazla araştırma için bir başlangıç noktası olarak 22 varsayılan geliştiriciyi ortaya çıkardı. Sonraki Hi-C analizi, önceki histon modifikasyon işaretlerine dayanan 22 arttırıcı adayından 21'inin kalp kası hücrelerinde TBX5 promotörü ile etkileşime girdiğini gösterdi (Şekil 5). Bu, ilgilenilen bölgeleri tahmin etmede histon modifikasyon işaretlerine dayalı yaklaşımın güvenilirliğini destekler.

Bu protokolde türler arasında dizi korumasına öncelik vermemeyi seçtik, ancak bu, arttırıcıları tanımlamak için yaygın bir kriterdir. Daha önce doku veya türe özgü güçlendiriciler için daha az etkili olduğu kanıtlandığından, bunların çoğu evrim sırasında güçlü bir şekilde korunmamıştır26. Bu göz önüne alındığında, fonksiyonel arttırıcı aktivitenin daha doğrudan göstergesi olan kromatin bazlı belirteçlere odaklanmayı seçtik. Bununla birlikte, dizi korunumu, evrimsel öneme sahip arttırıcıları incelemek gibi belirli bağlamlarda hala değer taşıyabilir. Bu durumda, korunan düzenleyici unsurlarla ilgilenen kullanıcılar için isteğe bağlı bir adım olarak eklenebilir.

Protokolün, daha önce mevcut bir platform olan VISTA Cardiac Enhancers Browser tarafından tanımlanamayan EnsEMBL web sitesinden TBX5 geni için 21 kalbe özgü güçlendiricinin alınmasında etkili olduğu kanıtlandı. Burada açıklanan protokol, geliştiricilerden biri olan hs498'i geri getiremese de, algılamada sınırlama olasılığını düşündürse de, yaklaşım, VISTA Kardiyak Arttırıcılar Tarayıcısı tarafından algılanmayan bazı güçlendiricileri ortaya çıkardı. Bununla birlikte, alınan geliştiricilerin daha fazla doğrulanması gereklidir, çünkü protokol, küratörlüğünde VISTA veritabanlarına kıyasla daha fazla sayıda varsayılan bölge verir. Bu daha yüksek sayı, yanlış pozitif riskini artırır ve daha fazla sayıda tahmin edilen geliştirici, mutlaka gelişmiş özgüllük veya işlevsel alaka düzeyini göstermez. Gen ekspresyon analizi, CRISPR pertürbasyonu veya raportör tahlilleri gibi ek deneysel veri kümelerinin veya fonksiyonel tahlillerin dahil edilmesi, bu adayların Smemove ark.'da gerçekleştirilen biyolojik geçerliliğini doğrulamak için çok önemli olacaktır. S çalışması23.

Deneysel olarak doğrulanmış üç güçlendirici ile çapraz karşılaştırma, tahmin edilen bölgelerle kısmi örtüşme gösterdi (Şekil 5). Tahmin edilen geliştirici "e1", doğrulanmış Enhancer 2'den daha geniş bir şekilde konumlandırılırken, "e18", Enhancer 16 ile kısmi örtüşme gösterdi (Şekil 5). Bu sonuçlar, bu yaklaşımın bilinen düzenleyici etkinliğe sahip bölgeleri başarılı bir şekilde tanımladığını, ancak tahmin edilen geliştiricilerin daha geniş kapsamının, geliştirici sınırlarındaki esnekliği yansıtabileceğini göstermektedir. Arttırıcılar genellikle modüler elemanlar olarak işlev görür ve aktiviteleri kromatin bağlamına, hücre tipine ve gelişimsel zamanlamayabağlı olabilir 2,27. Bu nedenle, tahmin edilen bölgeler, bu daha geniş tahminlerin hangi bölümlerinin dokuya özgü veya gelişimsel bir bağlamda işlevsel olarak aktif olduğunu belirlemek için deneysel doğrulamaya ihtiyaç duyulmasına rağmen, düzenleyici işleve katkıda bulunan bitişik dizilere sahip çekirdek aktif bölgeleri içerebilir. VISTA Kardiyak Arttırıcı Tarayıcı, tanımlanan aralık içinde dört bölge tanımlarken, yalnızca bir arttırıcı, mm370, özellikle H3K4me1 ile işaretlenen bölgede, deneysel olarak doğrulanmış bir arttırıcı olan Enhancer 16 ile kısmen örtüştü (Şekil 5)23. Enhancer 16 ile örtüşmeyen mm370'in kalan kısmı, enhancer28,29'un işlevsel olmayan veya etkin olmayan bir alt bölgesini gösterebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir rekabet çıkarı bildirmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yararlı tartışmalar için Ramialison laboratuvarı (Transkriptomik ve Biyoinformatik, reNEW Biyoinformatik Merkezi) üyelerine teşekkür ederiz. MR ve HTN, bir NHMRC Fikir Hibesi (APP1180905) tarafından desteklenmektedir. Richard Saffery'ye desteği için teşekkür ederiz. MR, Kalp Vakfı Gelecek Lideri Bursu (107328) tarafından finanse edilmektedir. Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü'ne ek altyapı finansmanı, Avustralya Hükümeti Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Bağımsız Araştırma Enstitüsü Altyapı Destek Programı tarafından sağlandı. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Victoria Eyalet Hükümeti ve Avustralya Hükümeti'nden alınan hibelerle desteklenmektedir. Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi, Novo Nordisk Vakfı hibeleri (NNF21CC0073729) tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bilgisayar iş istasyonuYOKYOKWeb tarayıcısı özellikli bilgisayar, Windows/Mac/Linux işletim sistemi
4DN veri portalı4DN veri portalıhttps://data.4dnucleome.org/
GökadaGökadahttps://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
GithubGithubhttps://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
VISTA VISTA Kardiyak Güçlendirici Tarayıcıhttps://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barral, A., Déjardin, J. The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation. Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).
  3. Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease. Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).
  4. Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. Enhancer redundancy in development and disease. Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).
  5. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  6. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  7. Panigrahi, A., O'Malley, B. W. Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown. Genome Biol. 22 (1), 108(2021).
  8. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  9. Krivega, I., Dean, A. Enhancer and promoter interactions-long distance calls. Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations. Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).
  11. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  12. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  13. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  14. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  15. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  16. Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  17. de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).
  18. Gao, T., Qian, J. EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).
  19. Erwin, G. D., et al. Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction. PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).
  20. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  21. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  22. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  23. Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease. Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).
  24. Boogerd, C. J., Evans, S. M. TBX5 and NuRD divide the heart. Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).
  25. Dickel, D. E., et al. Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers. Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).
  26. Pennacchio, L. A., Visel, A. Limits of sequence and functional conservation. Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).
  27. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  28. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  29. Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers. Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Enhancer IdentificationGene RegulationH3K4me1 MarkerH3K27ac MarkerChromatin ConformationHi C DataEnsembl Genome BrowserHeart Development

İlgili makaleler