Yöntem makalesi

Triticum aestivum ve Zea mayslarında C3 ve C4 için Yapısal Özelliklerin Değerlendirilmesi Serbest El ve Yarı İnce Kesitler Kullanılarak Fotosentetik Farklılaşma

2.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66843

⸱

12 Temmuz 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

C3 veC4 yaprak kesitleri arasındaki anatomik farklılıkların değerlendirilmesi, fotosentez verimliliğinin anlaşılmasına yardımcı olur. Bu makale, Triticum aestivum ve Zea mays mahsul türleri için hazırlıktaki uyarılarla birlikte serbest el ve yarı ince yaprak kesitlerinin hazırlanması ve incelenmesini açıklamaktadır.

Özet

C4 fotosentezinin C3 mekanizmasına kıyasla artan verimliliği, CO2'yi demet kılıf hücrelerinde konsantre etme yeteneğinden kaynaklanmaktadır. C4 fotosentezinin etkinliği ve içsel su kullanım verimliliği, mezofil ve demet yaprak hücrelerinin payı, demet kılıflarının boyutu ve yoğunluğu ve demet kılıf hücrelerinin boyutu, yoğunluğu ve hücre duvarı kalınlığı ile doğrudan bağlantılıdır. Bu özelliklerin hızlı mikroskobik analizi, geleneksel ışık mikroskobu kullanılarak serbest el ve yarı ince kesitler üzerinde gerçekleştirilebilir ve belirli hücre tiplerinin tanımlanması ve incelenmesi yoluylaC4 mahsullerinde fotosentetik verimlilik hakkında değerli bilgiler sağlar. Ek olarak, anatomik ölçümleri ve hücre tipi teşhislerini etkileyen serbest el ve yarı ince kesit hazırlama hatalarının yanı sıra bu hataların nasıl önleneceği de gösterilmektedir. Bu mikroskobik yaklaşım, çevresel varyasyona fotosentetik adaptasyon hakkında bilgi toplamak için etkili bir yol sunar ve gelecekteki iklimler için mahsullerin hızlı bir şekilde taranmasına yardımcı olur.

Giriş

Fotosentez, ışık enerjisinin kimyasal enerjiye dönüştürüldüğü ve karasal trofik ağların temel taşı olarak hizmet eden temel bir süreçtir. Bitkilerin çoğu, birincil fotosentetik ürünün üç karbonlu bileşik gliserat 3-fosfat olduğuC3 fotosentez yolunu takip eder. C3 fotosentezi, 2 milyar yıldan fazla bir süre önce, CO2'de bol veO21'de düşük olan atmosferde gelişti. Bu koşullar altında gelişen anahtar fotosentetik enzim ribuloz 1,5 bifosfat karboksilaz/oksijenaz (Rubisco), O2 ile rekabetçi bir şekilde reaksiyona girerek fotorespirasyon2'yi başlattığı için mevcut düşük CO2 yüksek O2 koşulları için yetersizdir. Fotorespirasyon, enerjiyi üretmek yerine tüketen ve yan ürün olarak CO2 salan savurgan bir yoldur. Sonuç olarak, oksijenasyonu önlemek için kloroplastlarda Rubisco çevresinde yüksek CO2 konsantrasyonunun korunması çok önemlidir 3,4. C3 bitkilerinin CO2'yi konsantre edememesi nedeniyle, ortam havasından kloroplastlara önemli bir CO2 düşüşü olur, bu da fotosentezi engeller ve bitki büyümesini ve biyokütle üretimini etkiler 2,5,6.

C3 bitkilerinde fotosentez, CO2'nin stoma yoluyla girişi, mezofil yoluyla difüzyonu ve fotosentetik enzimlerin biyokimyasal aktivitesi ile sınırlıdır. CO2'nin girişi ilk olarak hava sıcaklığı ve nem gibi çevresel koşullar tarafından kontrol edilen stoma iletkenliği ile sınırlıdır. Daha sonra CO2 yaprağın iç gaz ve sıvı fazından Rubisco7'ye yayılır. C3 bitkilerinde, fotosentezin tüm aşamaları mezofil hücrelerinin kloroplastlarında meydana gelir ve bitkilerin atmosferden kloroplastlara sürekli bir CO2 akışı sağlaması gerekir. Kloroplastlardaki CO2 mevcudiyetinin stoma açıklığına, mezofil mimarisine ve bireysel hücre ve kloroplast özelliklerine bağımlılığı, bitkileri düşük su mevcudiyeti ve yüksek sıcaklıklar 7,8,9,10 gibi sonunda fotosentezi etkileyen çevresel kısıtlamalara karşı hassas hale getirir ve özellikle iklim değişikliği koşullarına karşı savunmasızlıklarını vurgular11.

C3 yolunun verimsizliklerinin ortaya çıkardığı zorlukların yanı sıra optimal CO2 seviyelerinin korunmasındaki sınırlamalar ve çevresel faktörlere duyarlılık göz önüne alındığında, bazı bitkilerde başka bir yol olanC4 fotosentez yolu gelişmiştir. Karakteristik olarak,C4 bitkilerinin mekansal olarak ayrılmış iki biyokimyasal yolu vardır; ilk CO2 fiksasyonu, mezofil hücrelerinde, CO2 için Rubisco'dan daha yüksek bir afiniteye sahip olan ve aynı zamanda oksijenasyon aktivitesinden yoksun olan fosfoenolpiruvat karboksilaz ile meydana gelir. OluşanC4 ürünü ayrıca dekarboksilatlandığı demet kılıf hücrelerine taşınır ve CO2 tekrar salınır ve Rubisco (C3 fotosentezi) ile sabitlenir12,13,14. PEP karboksilazın CO2'ye ve demet kılıf hücrelerinin kalın hücre duvarlarına daha fazla afinitesi, demet kılıf hücrelerinde CO2 konsantrasyonuna izin verir ve bu nedenle,C4 bitkileri, CO2 fiksasyonunu ve Calvin döngüsünü uzamsal olarak ayırarak fotorespirasyonu en aza indirir. C4 yolunun benimsenmesi, doğanın çevresel kısıtlamalara uyarlanabilir tepkisini sergileyerek, değişen iklim koşullarında mahsul verimliliğini ve direncini artırmak için potansiyel stratejiler hakkında içgörüler sunar15.

C4 bitkilerindeki yaprak yapısının özel anatomisi, kloroplast içeren genişlemiş vasküler demet kılıf hücreleri ile çevrili damarlar ve demet kılıf hücreleri etrafında bir dış halka deseninde mezofil hücrelerinin radyal bir düzenlemesi ile karakterize edilir. Özofil hücreleri, iki hücre tipi arasında metabolitlerin hızlı ve sürekli bir şekilde taşınmasını sağlayan demet kılıf hücrelerine yakındır. Bu hücrenin düzeniC4 bitkileri için tipiktir ve Kranz anatomisi16 olarak adlandırılır. C3 türlerinde, mezofil hücresi uzmanlaşması ve eğilimi değişebilir, ancak demet kılıf hücreleri belirgin şekilde daha küçüktür ve birkaç kloroplast içerir veya hiç kloroplast içermez. Spesifik Kranz anatomisi, C 3-karboksilatlayıcı enzim Rubisco'nun bulunduğu demet kılıf hücrelerindeki kloroplastlarda CO2'nin konsantre edilmesine izin verir ve fotorespirasyonu etkili bir şekilde engeller 4,17,18. Görünüşte karmaşık düzenlemesine rağmen, bu değişiklikler kapalı tohumluların evriminde bağımsız olarak birçok kez meydana gelmiştir, bu da bunun nispeten uygulanabilir bir evrimsel yol olduğunu gösterir 19,20,21 ve çeşitli taksonlarınC3-C 4 veya C2 olarak adlandırılan C3 ve C4 karbon metabolizması arasında bir ara aşamada olduğu gösterilmiştir. CO2 22,23,24,25'i konsantre etme ve yeniden özümseme yeteneklerine sahip olmak.

BirçokC4 bitkisi, yüksek ekonomik öneme sahip ürünlerdir ve iklim direncini artırmak ve verimi güvence altına almak için pirinç gibiC3 bitkilerinin genetik mühendisliği, son on yılda ilgi konusu olmuştur26,27. Bununla birlikte, mühendislik çabaları,C4 özel anatomisinin ve fotosentezi nasıl kontrol ettiğinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını gerektirir 2,28.

C4 Kranz anatomisini oluşturmak, C4 fotosentezini C3 ekinlerine25 mühendislik gibi iddialı bir hedefe ulaşmak için bir ön koşuldur. Bununla birlikte, Kranz anatomisinin düzenlenmesi ve temel anatomik özelliklerinin hızlı bir şekilde taranması için kullanılan yöntemlere ilişkin mevcut anlayış sınırlıdır ve bu da melez türlerin tanımlanmasını zorlaştırmaktadır. Önceki çalışmalar,C3 veC4 bitkilerinde fotosentetik verimliliği düzenleyen temel özelliklerin damarlar arası mesafeyi, demet kılıf kompleksinin çapını ve demet kılıf hücrelerinin boyutunuiçerdiğini göstermiştir 14,29. Bu özellikler, serbest el kesitleri kullanılarak kolayca taranabilir ve yarı ince kesitler kullanılarak kantitatif olarak analiz edilebilir. Burada, serbest el çapraz ve ışık mikroskobu yoluylaC3 veC4 anatomik farklılaşma teşhisine izin veren özellikleri, yani demet kılıf alanı, damarlar arası mesafe ve damar frekansını değerlendirme yöntemini açıklıyoruz.

Protokol

1. Bitki büyüme koşulları

  1. SırasıylaC3 ve C4bitkilerini temsili olarak buğday (Triticum aestivum L. Var. Kış Buğdayı, "Fredis") ve mısırı (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") seçin. Her iki bitki türünü de tohumlardan çevre kontrollü bir büyüme odasında büyütün.
  2. 55 saatlik ışık periyodu ile 25 °C/18 °C (gündüz/gece) hava sıcaklığı ile bağıl nemi %12'te tutun. Doğal yetiştirme koşullarını temsil etmek için bitki yüzeyindeki fotosentetik foton akı yoğunluğunu (Q) 1200 μmol/m2/s'de tutun. Tüm bitkileri 400 μmol/mol ortam CO2 konsantrasyonunda yetiştirin.
  3. Bitkileri her2 günde bir damıtılmış su ile sulayın ve fide çıktıktan 10 gün sonra Hoagland solüsyonu ile gübreleyin. Bitkileri 60 gün boyunca verilen koşullarda büyütün ve mikroskobik analizler için tamamen genişlemiş yapraklar kullanın.

2. Serbest el bölümlerinin hazırlanması ve görüntülenmesi

  1. Her bitkiden 3 olgun yaşlanmayan yaprak seçin ve bunları damıtılmış suda tutun. Yeni bir tek taraflı tıraş bıçağı kullanarak, bölümlerin yaprak yüzeyine dik olarak yapılmış enine kesitler olduğundan emin olmak için yaprak yüzeyi ile dik bir açı oluşturmak için bir tesviye kesimi yapın.
  2. Numuneyi stabilize etmek ve kaymayı önlemek için yaprak numunesini bir parça diş mumu üzerindeki cam bir plakaya yerleştirin. Hücreleri temiz bir şekilde kesmek için bıçağı yaprak numunesi üzerinde düz bir şekilde aşağı hareket ettirerek kesin. Kesitleri damıtılmış suda tutun.
  3. Numuneleri bir su damlası üzerine yerleştirerek ve mikroskobik görüntüleme ve görüntüleme için bir cam lamel ile kaplayarak bir cam slayt üzerine monte edin. Hava kabarcıklarını hapsetmekten kaçının.
  4. Slaytı bileşik ışık mikroskobu altında 10x ve 20x büyütmede görüntüleyin. Görüntüleri, ilgili ölçekle birlikte yazılım kılavuzuna göre kaydedin.

3. Yarı ince kesitlerin hazırlanması

  1. Adım 2.2'deki gibi bir cam plaka üzerinde hem Z. mays hem de T. aestivum'dan elde edilen yapraklardan orta kaburga ile birlikte interkostal alanlardan yaklaşık 3 mm x 5 mm boyutlarında kesitler kesin. Kesilen bölümün uzunluğunun yaprağın tanesi boyunca uzandığından emin olun.
  2. Bitki materyalini 1 mL fiksasyon tamponu olan bir şırıngaya yerleştirin (0.1 M fosfat tamponunda% 4 glutarik aldehit, pH = 6.9, Tablo 1).
  3. Şırıngayı dikey olarak tutun, havayı çıkarın ve ucunda bir parmağınızı tutarak, bir vakum oluşturmak için şırıngayı pompalayın. Numuneler şırınganın dibine gelene kadar tekrarlayın, bu da başarılı bir sızma olduğunu gösterir.
  4. Şırınganın içeriğini etiketli bir cam şişeye aktarın ve bir sonraki adımdan önce 4 ° C'de 48 saat saklayın (Tablo 2).
  5. Her flakon için, sabitleyiciyi bir pipetle nazikçe çıkarın ve numune kaplanana kadar fosfat tamponunu ekleyin. 30 dakika bekletin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
  6. Fosfat tamponunu bir pipetle çıkarın ve numune kaplanana kadar osmiyum tetroksit (DİKKAT) ekleyin. Numuneler ve diğer organik maddeler siyaha dönecektir. Çift eldiven kullanın. 1 saat bekletin.
  7. Önceki çözeltiyi bir pipetle çıkarın ve numuneleri damıtılmış suyla örtün. 30 dakika bekletin: Bu adımı 3 kez tekrarlayın ve çift eldiven kullanın.
  8. Önceki çözeltiyi bir pipetle çıkarın ve numuneleri 50/50 damıtılmış su-etanol çözeltisi ile örtün. 30 dakika bekletin. Bu adımı aşağıdaki seride damıtılmış su-etanol çözeltileri ile tekrarlayın: 30/70, 20/80, 10/90 ve 2x %100 etanolde. Bu çözeltilerden herhangi birindeki numuneler gece boyunca 4 °C'de bırakılabilir.
  9. Önceki çözeltiyi bir pipetle çıkarın ve numuneleri 1/3 reçine-etanol çözeltisi ile örtün. Numuneleri bir mikser plakasına koyun ve 2 saat bekletin. Bu adımı aşağıdaki serideki reçine-etanol çözeltileri ile tekrarlayın: %100 reçinede 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 ve 2x. Bu çözeltilerden herhangi birindeki numuneler gece boyunca 4 °C'de bırakılabilir.
  10. Düz bir gömme kalıbının boşluklarını (16 boşluk, boşluk boyutları: 14 U x 4,8 G x 3 D (mm)) %100 reçine ile örtün ve numuneleri boşluğun bir ucuna yerleştirin. Her numune için kurşun kalemle yazılmış kağıt etiketler hazırlayın ve bunları boşluğun diğer ucuna yerleştirin.
  11. Tüm boşlukları tamamen %100 reçine ile doldurun ve hareket etmişlerse numuneleri ve etiketleri düzeltin. Kalıbı gömme film ile örtün ve akrilik reçine ürün yönergelerine göre bir fırında polimerize edin.
  12. Polimerize bloğu, numune ile ultramikrotomun numune tutucusuna yerleştirin. Doku görünür hale gelene ve fazla reçine elimine edilene kadar sert bir cam bıçak kullanarak bloğu kesin.
  13. Bir cam veya elmas bıçak kullanarak yarı ince kesitleri enine (1 μm) kesin. Su yüzeyinden metal bir aşılama halkası kullanarak bölümleri toplayın ve bunları bir cam slayt üzerine yerleştirin. Bölümleri cama sabitlemek için sürgüyü sıcak bir plaka (60 °C) üzerinde kurutun.
  14. Damıtılmış su ile durulamadan ve sıcak plaka üzerinde tekrar kurutmadan önce sabit bölümleri 5 saniye boyunca toluidin mavisi (% 1 sulu çözelti) ile boyayın.
    NOT: Kimyasal sabitleme işleminin çeker ocak altında yapıldığından emin olun. Yırtılma veya bozulma olmayan bölümlere izin veren keskin kesimler sağlamak için cam bıçaklar periyodik olarak değiştirilmelidir.

4. Numunelerin görüntülenmesi

  1. Taze yaprak kesitlerinin görüntülenmesi
    1. Bileşik ışık mikroskobunu, beraberindeki yazılımla birlikte verilen kılavuza göre kurun.
    2. Cam slaytı sahneye yerleştirin. Göz merceğini ayarlayın ve genel bir bakış elde etmek için bölümü 10x'te, ardından 20x ve 40x objektiflerde görüntüleyin.
    3. Her hedefte, Canlı kanalda gezinin, ilgi alanına odaklanın ve damarın etrafındaki demet kılıf hücrelerini bulun.
    4. Odaklandıktan sonra, Dondur düğmesine tıklayın ve Araçlar sekmesindeki Ölçek Çubuğu düğmesine basarak ölçeği ekleyin. Görüntüyü içine kaydedin. Görüntü analizi için TIF formatı.
  2. Reçine ile sızan bölümlerin görüntülenmesi
    1. Otomatik ışık mikroskobunu, bilgisayardaki eşlik eden yazılımla bağlantılı olarak ayarlayın.
    2. Şeffaf kanalı yükleyin ve slaytı mikroskop tablasına yerleştirin. 40x objektif büyütme kullanarak bölüme odaklanın ve tüm hücre yapılarının görünür olduğundan emin olmak için parlaklığı ayarlayın.
    3. Tüm bölümün görüntülendiğinden emin olmak için gezgin işlevini kullanarak bölümün konum alanını ayarlayın ve Birleştir düğmesine tıklayın.
    4. Mikroskobun tüm bölümü görüntülemesine izin vermek için Bitti'ye ve ardından Başlat'a tıklayın. Görüntü analiz yazılımını açın ve mikroskop tarafından çekilen karoları açın.
    5. Hizala özelliğini kullanarak döşemelerin üst üste gelmediğinden emin olun. Görüntüyü oluşturduktan sonra, Ayarla sekmesini kullanarak konumlandırmayı, parlaklığı ve dönüşü ayarlayın.
    6. 'a kaydetmeden önce ölçeği görüntünün üzerine yazdırın. TIF formatı.
  3. ImageJ yazılımını kullanarak anatomik ölçümler
    1. ImageJ yazılımını açın ve görüntüyü pencereye sürükleyerek yükleyin.
    2. Çizgi aracını kullanarak ölçeği aşağıdaki gibi kalibre edin: Ölçek çubuğunun üzerine bir çizgi çizin, Ölçeği Analiz Et > Ayarla'yı seçin, ölçek çubuğunun uzunluğuna olan bilinen mesafeyi değiştirin ve uzunluk birimini doğru birimle değiştirin.
    3. Çizgi Aracını seçerek, ilgi alanı boyunca bir çizgi çizerek ve M tuşuna basarak olası özelliği ölçün.
    4. Alan ölçümleri için Poligon Seçim Aracı'nı seçin ve ilgilenilen dokunun etrafını çizin. M tuşuna basarak sonlandırın. Ölçümler, daha fazla veri analizi için bir elektronik tabloya kopyalanabilen bir açılır pencere olarak görünür.

Sonuçlar

Şekil 1A , hem taze kesitleme hem de ışık mikroskobu için yaprağın kesitlendirilmesi için doğru yönü göstermektedir. Tek taraflı bir tıraş bıçağı ve bir diş cilası tabakası kullanarak taze kesitleri kesme yöntemi Şekil 1B'de görülebilir. Ortaya çıkan bölümler Şekil 1C'de gösterilmiştir.

Şekil 2 , C3 bitkisi T. aestivum ve C4 bitkisi Z. mays'ın temsili yapraklarının serbest el bölümlerini göstermektedir. Demet kılıf hücreleri damar çevresinde görülebilir, mısır daha yuvarlak ve daha yeşil hücrelere sahiptir, bu da daha yüksek bir kloroplast varlığına işaret eder. Bu görüntülerden yaprak kalınlığı ve toplam demet kılıf alanı elde etmek mümkündür; Bununla birlikte, mezofilin daha fazla karakterizasyonu bu yöntemle mümkün değildir.

Şekil 3 , T. aestivum ve Z. mays'ın yarı ince kesitlerini göstermektedir. Bu yöntemle yaprağın tüm dokuları görünür ve ölçülebilir hale gelir. Kranz'ın anatomisi, damarların etrafında düzenlenmiş mezofil hücreleri ile Z. mays'ta belirgindir. Demet kılıfları büyütülür ve özellikle mezofil hücrelerine doğru konsantre edilen kloroplastlarla doldurulur. Bu, demet kılıf hücreleri ve mezofil hücreleri arasında hızlı bir metabolit değişimine izin verir. Bu görüntülerden şu yaprak yapısal özellikleri ölçüldü: küçük ve büyük damarlar arasındaki damarlar arası mesafe, demet kılıf çapı, toplam demet kılıf alanı, damar alanı, demet kılıf hücrelerinin fraksiyonu alanı, demet kılıf hücreleri alanı, 500 μm içindeki damar frekansı ve yaprak kalınlığı. Şekil 4'teki kutu çizimleri, T. aestivum ve Z. mays arasındaki bu tür özelliklerdeki farkı göstermektedir. Biri hariç tümü, büyük damarlar arasındaki damarlar arası mesafe, p değeri 0.05'<

Yaprak kesit kromatografisi kurulumu; yeşil pigment ekstraksiyonu. Pigment ayırma adımlarının şeması.

Bitki yaprak yapısının kesit mikroskobu, 50μm ve 100μm ölçekleri, vasküler doku detayı.

Dokular ve yapılar için etiketlerle vasküler demet kesitini gösteren bitki anatomisi diyagramı.

T-testi kullanılarak T. aestivum ve Z. mays'ı karşılaştıran kutu grafikleri; metrikler arasında SY-HD, LV-ID ve VBA bulunur.

Bitki dokusu kesitlerinin mikroskobik görüntüleri, hücresel yapı ve anatomiyi vurgulamaktadır.

Tartışma

Bu yazıda, yaprak anatomisini ölçmenin hem nicel hem de nitel yöntemlerini ve bunların nasıl optimize edilebileceğini tartışıyoruz. Ayrıca, metodoloji,C3 veC4 kesitlerini ayırt etmede hangi anatomik özelliklerin en yararlı olduğunu belirlemek için temsili mahsul türlerine uygulanır. C2 fotosentezi olarak adlandırılan melez türler daha umut verici bir araştırma yolu haline geldiğinden, bu özellikleri anlamak çok önemlidir. Şu an itibariyle, sadece bir mahsul türü olan Diplotaxis tenuifolia (roka),C2 fotosentezini kullanmak için tanımlanmıştır, ancak mevcut kayıtların25'i gösterdiğinden daha fazla olması muhtemeldir. C2 soyları içinde yüksek düzeyde intraspesifik fotosentetik çeşitlilik ve plastisite mevcuttur. Bu,C2 fotosentezinin oluşumunu doğrulamanın, CO2 kompanzasyon noktası, ultrastrüktürel analizler ve immünohistokimya30 gibi çok sayıda kanıt dizisi gerektirdiği anlamına gelir.

Serbest el ve yarı ince kesitler, belirli bitki dokularının tanımlanmasında ve ölçülmesinde uzun yıllardır kullanılmaktadır, ancak bu makale,C3 veC4 mahsul bitkileri arasındaki fotosentetik farklılaşmayı etkileyen anatomik yaprak yapılarının özel kullanım durumunu tartışmayı amaçlamaktadır. Hem serbest el hem de yarı ince kesitleme için dikkate alınması gereken uyarılar vardır. Serbest el bölümleri, elde edilmesi hızlı olsa da, tutarsız kalınlıklara sahip yaprak bölümleriyle sonuçlanması muhtemeldir ve bu da kantitatif analizleri engeller. Bu, taze bitki materyalinin kesitlenmesi için özel ekipman (örn. vibratom veya kriyostat) kullanılarak önlenebilir. Elle kesitlemeden daha kalın bölümler, üst üste birden fazla hücre katmanına neden olabilir, bu da hücreleri ve dolayısıyla anatomiyi bulanıklaştırır. Kesitlemenin amacı tamamen kalitatif ise, serbest el kesitleri bitki dokularının kimyasal olarak işlenmesi (yani histokimya) avantajını sunar31. Bu, bitki hücrelerinde belirli bileşiklerin varlığının kalitatif olarak gösterilmesine izin verir. Tersine, yarı ince bölümler neredeyse her zaman tutarlı bir şekilde kalın bölümlerle sonuçlanır. Bununla birlikte, süreçler daha uzun, hassastır ve bu nedenle hataya açıktır. Ortaya çıkabilecek sorunlar ve bunlardan kaçınmanın yolları daha fazla tartışılmaktadır.

Sabitleme
Hem serbest hem de yarı ince bölümler için taze materyal kullanılmalıdır, yani yeterince sulandırılmış bitkilerden elde edilen yapraklar. Solmuş yapraklardan elde edilen bölümler, hücrelerin turgor basıncı azaldığı için yapısal bütünlüğe sahip değildir. Reçine gömülü malzemeden yarı ince kesitler elde ederken, kanadın içindeki havayı değiştirmek için yaprak bölümlerinin bir vakum altında sabitlenmesini sağlamak çok önemlidir. Bu, sızma işlemi sırasında yapısal bütünlük ve ozmoza izin verir. Bu adım doğru bir şekilde yapılmazsa, hücrelerin çökmesi muhtemeldir, bu da gerçek yaprak yapısını doğru bir şekilde göstermeyen kesitlere ve ardından yanlış anatomik ölçümlere yol açar32.

Tersine, yüksek vakum basıncı yumuşak dokulara (kotiledonlar gibi) sahip yapraklara zarar vererek hücrelerin küçülmesine veya numunelerin tahrip olmasına neden olabilir. Bu, uygun bir vakum pompası ayarı kullanılarak veya tamamen atlanarak ve numuneleri sadece fiksatif solüsyona batırarak önlenebilir. İkincisi tercih edilirse, fiksatifin dokuya sızmasını kolaylaştırmak için numuneler her taraftan kesilebilir.

Ön Sızma
Hücre duvarı kalınlığı ve sklereid dokusu, numunenin optimal fiksasyonuna ve infiltrasyonuna izin veren solüsyonların nüfuz etmesinde en etkili anatomik özelliklerdir. Bitki dokusundaki sklereidlerin amacı, sızma sürecini etkileyebilecek mekanik destek ve korumadır33. Bu dokular oldukça kalınlaşmış odunsu hücre duvarlarına sahip olduğundan, çözeltilerin nüfuz etmesi engellenebilir. İnfiltrasyon sorunları olan numuneler, reçinede kırık hücreler ve yırtıklar içeren yarı ince kesitlerle sonuçlanır (Şekil 5C,D). Boyuna kesitleme, çarpık hücrelere neden olur, anatomik analizlerde ve hücre boyutu ve hücre yoğunluğu gibi yaprak özelliklerinin ölçülmesinde yanlılıklara neden olur (Şekil 5F-H).

Reçine Sızması
Kaliteli kesitleme, numunenin gömülü olduğu ortamdan doğrudan etkilenen anatomik dokuların gözlemlenmesi için hayati önem taşır. Bitki histolojisinde kullanılan en yaygın gömme ortamı parafin mumu, epoksi ve akrilik reçinelerdir34,35. Balmumu gömme, numunelerin kimyasal fiksatif ile hazırlanmasını ve oda sıcaklığında sertleştirilen sıvı balmumu ile sızmayı gerektirir. Bu kesikler tipik olarak 5-10 μm kalınlığında kesitlerle sonuçlanır, burada gösterildiği gibi elle de elde edilebilir (Şekil 2) ve sadece sabitlenmemiş taze doku gerektirir. Bu durumda, demet kılıfı etrafındaki hücrelerin düzenlenmesi, daha sağlam ve sert bir gömme ortamının kullanılmasını gerektiren C3 ve C4 bitkilerini ayırt etmek için hayati önem taşır. Bu çalışmada epoksi reçine (Spurr'un reçinesi36) ve akrilik reçine (LR White) hem sertlik, uzun ömür, numune sızması hem de kesit dayanıklılığı açısından test edilmiştir. Epoksi reçine, biyolojik materyalin gömülmesinde onlarca yıldır kullanılmaktadır37. Akrilik reçineler nispeten yenidir ve epoksi reçinelerin aksine, UV maruziyetinin bir sonucu olarak renk değiştirmezler ve büzülmeye daha az eğilimli olduklarından, zaman içindeki esneklikleri nedeniyle başlangıçta bitki örneklerini gömmek için düşünülmüştür38. LR Beyaz akrilik reçine (sert dereceli), toksik olmayan ve UV'ye dayanıklı formülü nedeniyle seçilmiştir. Akrilik reçineler, epoksi reçinelerden önemli ölçüde daha az viskoz olma eğilimindedir, bu da daha hızlı numune sızmasına izin verir ve malzemenin sertliği, bir mikrotom39 ile daha temiz kesime izin verir. Şekil 5C,D, akrilik reçine ile karşılaştırıldığında, epoksi reçinenin yumuşaklığı nedeniyle yırtılmaların kaçınılmaz olduğu büyük miktarda yapısal dokuya sahip yaprak örneklerinde epoksi reçinenin sonuçlarını göstermektedir (Şekil 3).

Ultramikrotomi
Fazla reçinenin kesilmesi, reçinede numuneye nüfuz eden çatlaklar oluşturabilir. Bunu önlemek için, gömme için seçilen reçinenin yoğunluğunu ve kırılganlığını dikkate almak çok önemlidir. Bölümün daha derine inmesi, elle veya kaba bıçak kesiminden kaynaklanan herhangi bir artefakttan kaçınmalıdır. Numune, numune tutucuya dik olarak hizalanmalı ve göz merceğinden büyütme artırılarak ve ayrıca sabit ve lekeli bir bölüm görüntülenerek doğrulanmalıdır. Mükemmel bir dik açıyla kesilmeyen bitki hücreleri, bir ucu diğer40'tan daha büyük olan konik hücreler olarak görünür.

Boyama sonrası
Ultramikrotom üzerinde kesilen yarı ince kesitleri boyamak için toluidin mavisi (sulu çözelti içinde% 1) kullanıldı. Leke kesit üzerinde çok uzun süre kurumaya bırakılırsa, aşırı lekelenmeye neden olur ve görüntülendiğinde bölümün aşırı doygunluğuna neden olur (Şekil 5A). Leke iyi filtrelenmediğinde, kesit üzerinde çözünmemiş partiküllerin kurumasına neden olarak anatomik yapıların görüntülenmesini engeller (Şekil 5B). Bu sorun, toluidin mavisi çözeltisi yapılırken ince bir filtre kullanılarak ve bölümün lekeye maruz kalmasını sınırlayarak önlenebilir. Numuneler, kesitin cam mikroskop lamına yapışmasını sağlamak için boyamadan önce 60 °C'de sıcak bir plaka üzerinde kurutulur, ancak tekrar durulanmadan ve kurutulmadan önce 10 saniyeden fazla toluidin mavisine maruz bırakılmamalıdır41.

Anatomik ölçümlerle ilgili hususlar
Bu yazıda gösterilen ölçümler, hücreler arası hava boşluğunun bir kısmı, ortalama mezofil kalınlığı (vasküler doku olmadan) ve birim yaprak alanı başına hücreler arası hava boşluklarına maruz kalan mezofil yüzey alanı dahil olmak üzere yarı ince kesitler kullanılarak kantitatif olarak değerlendirilebilen birçok anatomik özelliğin sadece bir örneğidir42. Bununla birlikte, demet kılıf hücre boyutu,C3 veC4 metabolizması arasında ayrım yapmak için önemli bir gösterge iken, demet kılıf hücre duvarı kalınlığı, demet kılıf hücrelerinin sızıntı derecesini, yani mezofil hücrelerine geri yayılan CO2 miktarını belirlediği için tek başına ışık mikroskobuna dayalı olarak görülemeyen bir diğer önemli özelliktir42, 43. Yüksek sızıntı, PEP karboksilaz tarafından CO2 fiksasyonu için kullanılan enerjinin büyük bir kısmı kaybedildiğinden fotosentetik verimliliği azaltır 44,45,46. Bu tür ultrastrüktürel analizler için Transmisyon Elektron Mikroskobu ve görüntü analizleri gereklidir. Bu çalışma için sadece ışık mikroskobu düşünülmüş olsa da, protokol, TEM mikroskobu için bir köşe taşı olan kontrast ve sabitleyici bir ajan olan osmiyum tetroksit ile tedaviyi içermektedir. Bu nedenle, polimerize numuneler, hazırlama sırasında dikkate alınmasa bile, ihtiyaç duyulduğunda TEM analizi için kullanılabilir.

Anatomik tanı Kranz benzeri yapıları kolayca tespit edebilse de, C4'ün varlığı, tipik C4 fizyolojisini, yani düşük CO2 kompanzasyon noktasını, fotosentezin sınırlı O2 inhibisyonu ve farklı karbon izotop bileşimini gösterebilen gaz değişimi ölçümleri ile daha fazla teşhis edilebilir 2,4,47.

Tek hücreli C4 bitkilerinin keşfi ile gösterildiği gibi,C4 fotosentezinin gelişmesi için Kranz anatomisinin gerekli olmadığı da belirtilmelidir 48,49,50. Bu nedenle, daha az çalışılmış taksonlardaC4 fizyolojisini tespit etmek için tek başına anatomik analiz yeterli olmayabilir. Anatomik karakterizasyonun fizyolojik analizle birleştirilmesi, hem mahsullerde hem de yabani bitkilerde yaprak özelliklerini ve bunların yapı-işlev ilişkilerini araştırmak için güçlü araçlar sunar.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, Avrupa Birliği H2020 Programını (proje GAIN4CROPS, GA no. 862087) kabul etmektedir. AgroCropFuture Agroecology ve gelecekteki iklimlerde yeni mahsuller Mükemmeliyet Merkezi, Estonya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı tarafından finanse edilmektedir. T. aestivum ve Z. mays'ın tohumlarını sağladığı için Profesör Evelin Loit-Harro'ya, yaprak kesitlerinin hazırlanmasındaki yardımları için Paula Palmet ve Vaiko Vainola'ya ve analiz konusundaki yardımları için João Paulo de Silva Souza'ya teşekkür ederiz. Tüm görüntüler Estonya Yaşam Bilimleri Üniversitesi mikroskopi ünitesinden çeşitli projeler kapsamında elde edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Disodyum hidrojen fosfat dihidrat (Na2HPO42H2O) safPENTA, CZ10028-24-7
Gömme Film, 7,8 mil Kalın, 8 x 12,5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
Etanol, abs. %100 ARChem-Lab NV, BECL00.0505.1000Tehlike: Yüksek derecede yanıcı sıvı ve buhar.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Görüntüleme SistemiThermo Fisher Scientific, ABD
Metal Çerçeveli Düz Gömme PTFE Kalıp, 16 boşlukPELCO, US10501
Cam şişe 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Gluteraldehit %50 çözeltiVWR Life Science, US23H2856331Tehlike: Solunması halinde ölümcüldür. Yutulması halinde toksiktir. Ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur. Solunum yolu tahrişine neden olabilir. Koruyucu eldiven, koruyucu giysi, göz ve yüz koruması kullanın.
Histo elmas bıçakDiatom, ABD
LEICA EM UC7Leica Viyana, AT
LR Beyaz reçine sert dereceliElektron Mikroskobu Bilimleri, ABD14383Tehlike: Cilt tahrişine neden olur. Ciddi göz tahrişine neden olur Solunum yolu tahrişine neden olabilir. Uyuşukluğa veya baş dönmesine neden olabilir Koruyucu eldiven, koruyucu giysi, göz ve yüz koruması kullanın.
Mikroskop slaytlarıNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 ve Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmiyum Tetroksit (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Tehlike: Yutulması, cilt ile temas etmesi veya solunması halinde ölümcüldür. Ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur Çift koruyucu eldiven, koruyucu giysi, göz ve yüz koruması kullanın.
Pipet ve pipet uçlarıThermo Scientific, FIKJ16047
Sodyum dihidrojen fosfat dihidrat (NaH2PO4 . 2H2O) safPENTA, CZ13472-35-0
Şırınga 10 mlEcoject, DE20010
Toluidin mavisi, genel amaçlı sınıfFisher Scientific, GB2045836

Kaynaklar

  1. Erb, T. J., Zarzycki, J. A short history of RubisCO: the rise and fall (?) of Nature's predominant CO2 fixing enzyme. Curr Opinion Biotechnol. 49, 100-107 (2018).
  2. Smith, E. N., et al. Improving photosynthetic efficiency toward food security: Strategies, advances, and perspectives. Mol Plant. 16 (10), 1547-1563 (2023).
  3. Nisbet, E. G., et al. The age of Rubisco: the evolution of oxygenic photosynthesis. Geobiology. 5 (4), 311-335 (2007).
  4. Boretti, A., Florentine, S. Atmospheric CO2 concentration and other limiting factors in the growth of C3 and C4 plants. Plants. 8 (4), 92(2019).
  5. Elferjani, R., et al. A meta-analysis of mesophyll conductance to CO2 in relation to major abiotic stresses in poplar species. J Exp Botany. 72 (12), 4384-4400 (2021).
  6. Knauer, J., et al. Contrasting anatomical and biochemical controls on mesophyll conductance across plant functional types. New Phytol. 236 (2), 357-368 (2022).
  7. Tosens, T., Niinemets, Ü, Westoby, M., Wright, I. J. Anatomical basis of variation in mesophyll resistance in eastern Australian sclerophylls: news of a long and winding path. J Exp Botany. 63 (14), 5105-5119 (2012).
  8. Ehleringer, J. R., Monson, R. K. Evolutionary and ecological aspects of photosynthetic pathway variation. Ann Rev Ecol Syst. 24 (1), 411-439 (1993).
  9. Niinemets, Ü, Díaz-Espejo, A., Flexas, J., Galmés, J., Warren, C. R. Role of mesophyll diffusion conductance in constraining potential photosynthetic productivity in the field. J Exp Botany. 60 (8), 2249-2270 (2009).
  10. Flexas, J., et al. Mesophyll diffusion conductance to CO2: An unappreciated central player in photosynthesis. Plant Sci. 193 - 194, 70-84 (2012).
  11. Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Ann Rev Plant Biol. 67 (1), 107-129 (2016).
  12. Kanai, R., Edwards, G. E. The biochemistry of C 4 photosynthesis. C4 Plant Biol. , 49-87 (1999).
  13. Sage, R. F., Sage, T. L., Kocacinar, F. Photorespiration and the evolution of C4 photosynthesis. Ann Rev Plant Biol. 63 (1), 19-47 (2012).
  14. Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Botany. 65 (13), 3357-3369 (2014).
  15. Furbank, R., Kelly, S., Von Caemmerer, S. Photosynthesis and food security: the evolving story of C4 rice. Photosyn Res. 158 (2), 121-130 (2023).
  16. Dengler, N. G., Nelson, T. Leaf structure and development in C4 plants. C4 Plant Biol. , 133-172 (1999).
  17. Leegood, R. C. Roles of the bundle sheath cells in leaves of C3 plants. J Exp Botany. 59 (7), 1663-1673 (2007).
  18. Mallmann, J., et al. The role of photorespiration during the evolution of C4 photosynthesis in the genus Flaveria. eLife. 3, e02478(2014).
  19. Edwards, E. J., et al. The origins of C4 grasslands: Integrating evolutionary and ecosystem science. Science. 328 (5978), 587-591 (2010).
  20. Sage, R. F. The evolution of C 4 photosynthesis. New Phytol. 161 (2), 341-370 (2004).
  21. Ludwig, M., Busch, F. A., Khoshravesh, R., Covshoff, S. Editorial: Understanding C4 evolution and function. Fron Plant Sci. 12, 774818(2021).
  22. Stata, M., Sage, T. L., Sage, R. F. Mind the gap: the evolutionary engagement of the C4 metabolic cycle in support of net carbon assimilation. Curr Opinion Plant Biol. 49, 27-34 (2019).
  23. Sage, R. F., Khoshravesh, R., Sage, T. L. From proto-Kranz to C4 Kranz: building the bridge to C4 photosynthesis. J Exp Botany. 65 (13), 3341-3356 (2014).
  24. Lyu, M. J. A., et al. The coordination of major events in C4 photosynthesis evolution in the genus Flaveria. Sci Rep. 11 (1), 15618(2021).
  25. Lundgren, M. R. C2 photosynthesis: a promising route towards crop improvement. New Phytol. 228 (6), 1734-1740 (2020).
  26. Ermakova, M., Danila, F. R., Furbank, R. T., Von Caemmerer, S. On the road to C4 rice: advances and perspectives. Plant J. 101 (4), 940-950 (2020).
  27. Yadav, S., Mishra, A. Ectopic expression of C4 photosynthetic pathway genes improves carbon assimilation and alleviate stress tolerance for future climate change. Physiol Mol Biol Plants. 26 (2), 195-209 (2020).
  28. Schuler, M. L., Mantegazza, O., Weber, A. P. M. Engineering C4 photosynthesis into C3 chassis in the synthetic biology age. Plant J. 87 (1), 51-65 (2016).
  29. Simpson, C. J. C., Singh, P., Sogbohossou, D. E. O., Eric Schranz, M., Hibberd, J. M. A rapid method to quantify vein density in C4 plants using starch staining. Plant, Cell Environ. 46 (9), 2928-2938 (2023).
  30. Upadhyay, P., Agrawal, N., Yadav, P. K., Patel, R. The evolutionary path from C3 to C4 photosynthesis: A review. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 9 (1), 748-762 (2020).
  31. Hewitson, T. D., Wigg, B., Becker, G. J. Tissue preparation for histochemistry: Fixation, embedding, and antigen retrieval for light microscopy. Histol Prot. 611, 3-18 (2010).
  32. Kalve, S., Saini, K., Vissenberg, K., Beeckman, T., Beemster, G. Transverse sectioning of Arabidopsis thaliana leaves using resin embedding. Bio Prot. 5 (18), 1592(2015).
  33. Whitehill, J. G. A., et al. Histology and cell wall biochemistry of stone cells in the physical defence of conifers against insects. Plant, Cell Environ. 39 (8), 1646-1661 (2016).
  34. Yeung, E. C. The use of histology in the study of plant tissue culture systems-Some practical comments. In Vitro Cell Dev Biol- Plant. 35 (2), 137-143 (1999).
  35. Lee, K. J. D., Knox, J. P. Resin embedding, sectioning, and immunocytochemical analyses of plant cell walls in hard tissues. Plant Cell Morpho. 1080, 41-52 (2014).
  36. Spurr, A. R. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. J Ultrastr Res. 26 (1-2), 31-43 (1969).
  37. Coste, R., et al. Unveiling the impact of embedding resins on the physicochemical traits of wood cell walls with subcellular functional probing. Compos Sci Technol. 201, 108485(2021).
  38. De Smet, I., et al. An easy and versatile embedding method for transverse sections. J Microsc. 213 (1), 76-80 (2004).
  39. Khoshravesh, R., Lundsgaard-Nielsen, V., Sultmanis, S., Sage, T. L. Light microscopy, transmission electron microscopy, and immunohistochemistry protocols for studying photorespiration. Photorespiration. 1653, 243-270 (2017).
  40. Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A comparative study of sample preparation for staining and immunodetection of plant cell walls by light microscopy. Front Plant Sci. 8, 1505(2017).
  41. Rodríguez, J. R., Turégano-López, M., DeFelipe, J., Merchán-Pérez, A. Neuroanatomy from mesoscopic to nanoscopic scales: An improved method for the observation of semithin sections by high-resolution scanning electron microscopy. Front in Neuroanat. 12, 14(2018).
  42. Veromann-Jürgenson, L. L., Brodribb, T. J., Niinemets, Ü, Tosens, T. Variability in the chloroplast area lining the intercellular airspace and cell walls drives mesophyll conductance in gymnosperms. J Exp Botany. 71 (16), 4958-4971 (2020).
  43. Sonawane, B. V., Koteyeva, N. K., Johnson, D. M., Cousins, A. B. Differences in leaf anatomy determines temperature response of leaf hydraulic and mesophyll CO2 conductance in phylogenetically related C4 and C3 grass species. New Phytol. 230 (5), 1802-1814 (2021).
  44. Hatch, M. D., Agostino, A., Jenkins, C. Measurement of the leakage of CO2 from bundle-sheath cells of leaves during C4 photosynthesis. Plant Physiol. 108 (1), 173-181 (1995).
  45. Kromdijk, J., Ubierna, N., Cousins, A. B., Griffiths, H. Bundle-sheath leakiness in C4 photosynthesis: a careful balancing act between CO2 concentration and assimilation. J Exp Botany. 65 (13), 3443-3457 (2014).
  46. Wang, Y., et al. Increased bundle-sheath leakiness of CO2 during photosynthetic induction shows a lack of coordination between the C4 and C3 cycles. New Phytol. 236 (5), 1661-1675 (2022).
  47. Johnson, J. E., Field, C. B., Berry, J. A. The limiting factors and regulatory processes that control the environmental responses of C3, C3-C4 intermediate, and C4 photosynthesis. Oecologia. 197 (4), 841-866 (2021).
  48. Sage, R. F. C4 photosynthesis in terrestrial plants does not require Kranz anatomy. Trend Plant Sci. 7 (7), 283-285 (2002).
  49. Voznesenskaya, E. V., et al. Proof of C4 photosynthesis without Kranz anatomy in Bienertia cycloptera (Chenopodiaceae). Plant J. 31 (5), 649-662 (2002).
  50. Koteyeva, N. K., Voznesenskaya, E. V., Berry, J. O., Cousins, A. B., Edwards, G. E. The unique structural and biochemical development of single cell C4 photosynthesis along longitudinal leaf gradients in Bienertia sinuspersici and Suaeda aralocaspica (Chenopodiaceae). J Exp Botany. 67 (9), 2587-2601 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

C3 FotosenteziC4 FotosenteziDemet K l f H creleriSerbest El KesitleriI k MikroskobuKranz AnatomisiImageJ Analizi
Triticum aestivum ve Zea mayslarında C3 ve C4 için Yapısal Özelliklerin Değerlendirilmesi Serbest El ve Yarı İnce Kesitler Kullanılarak Fotosentetik Farklılaşma
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.