Yöntem makalesi

Bitki Tarafından Üretilen Rekombinant Proteinin Saflığını Artırmak için Apoplast-Ekstraksiyon Bazlı Yöntem

DOI:

10.3791/66852

⸱

5 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Academy of Medical Sciences, Shandong First Medical University, 2State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 3College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, 4Beijing Life Science Academy

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki sistemlerinden rekombinant proteinlerin saflaştırılması genellikle bitki proteinleri tarafından sorgulanır. Bu çalışma, Nicotiana benthamiana'nın apoplastından salgılanan bir rekombinant proteini etkili bir şekilde ekstrakte etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkiler, terapötik proteinler üretmek için araştırılan yeni gelişen bir ökaryotik ekspresyon sistemidir. Bitkilerden rekombinant proteinlerin saflaştırılması, üretim sürecindeki en kritik adımlardan biridir. Tipik olarak, proteinler toplam çözünür proteinlerden (TSP) saflaştırıldı ve çeşitli hücre içi proteinlerin ve sitokromların varlığı, sonraki protein saflaştırma adımları için zorluklar doğurur. Ayrıca, antijenler ve antikorlar gibi terapötik proteinlerin çoğu, uygun glikozilasyon elde etmek için salgılanır ve tam olarak değiştirilmemiş proteinlerin varlığı, tutarsız antijen veya antikor yapılarına yol açar. Bu çalışma, bitki apoplastik alanından yüksek oranda saflaştırılmış rekombinant proteinler elde etmek için daha etkili bir yöntem sunmaktadır. Rekombinant Yeşil floresan proteini (GFP), Nicotiana benthamiana'nın apoplastına salgılanmak üzere tasarlanmıştır ve daha sonra bir infiltrasyon-santrifüjleme yöntemi kullanılarak ekstrakte edilir. Ekstrakte edilen apoplasttan elde edilen GFP-His daha sonra nikel afinite kromatografisi ile saflaştırılır. TSP'nin geleneksel yöntemlerinin aksine, apoplasttan saflaştırma, yüksek oranda saflaştırılmış rekombinant proteinler üretir. Bu, bitki üretim sistemleri için önemli bir teknolojik gelişmeyi temsil eder.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Günümüzde, antikorlar, aşılar, biyoaktif proteinler, enzimler ve küçük polipeptitler 1,2,3,4,5,6 dahil olmak üzere bitki tarafından üretilen çeşitli rekombinant terapötik proteinler incelenmektedir. Bitkiler, güvenlikleri, düşük maliyetleri ve üretimi hızlı bir şekilde ölçeklendirme yetenekleri nedeniyle terapötik proteinler üretmek için giderek daha fazla kullanılan bir platform haline gelmektedir 7,8. Bitki sistemlerinde protein ekspresyonu ve modifikasyonu, protein saflaştırması ile birlikte, bitki biyoreaktörlerininverimliliğini belirleyen kritik faktörlerdir 9,10. Bitki verimliliğini artırmak ve yüksek saflıkta hedef proteinler elde etmek, bitki bazlı üretim sistemlerinin karşılaştığı temel zorluklardır11,12.

Rekombinant proteinlerin hücre altı lokalizasyonu ve modifikasyonu, gen ekspresyonu sırasında proteini nihai organel hedefine hedefleyen N-terminalinde kodlanan spesifik sinyal peptidine bağlıdır. Rekombinant proteinler, benzersiz özelliklerine bağlı olarak apoplast, endoplazmik retikulum (ER), kloroplast, vakuol veya sitoplazmaya lokalize olacak şekilde tasarlanmıştır13. Antijenler ve antikorlar için salgılanan proteinler tercih edilir. Sekresyondan önce, proteinler doğru katlanma ve translasyon sonrası modifikasyonlar için ER ve Golgi boyunca ilerler 14,15,16.

Bitkilerde üretimden sonra, rekombinant proteinler bitki özlerinden saflaştırılmalıdır. Tipik olarak proteinler, bol miktarda hücre içi proteinler, yanlış katlanmış ve modifiye edilmemiş ürünler ve sitokromlar17 içeren toplam çözünür bitki özlerinden saflaştırılır. Safsızlıkları gidermek için bitki özleri, ribuloz-1,5-bifosfat karboksilaz/oksijenaz (RuBisCO) spesifik afinite kromatografisi, fitat çökeltme, polietilen glikol çökeltme ve sıcaklık ve pH 18,19'un ayarlanması dahil olmak üzere kapsamlı fraksiyonlamaya tabi tutulur. Bu tür safsızlık giderme adımları zahmetlidir ve protein kalitesini tehlikeye atabilir.

Plazma zarının ötesindeki bitki hücresi bölmesi, hücre duvarını, hücreler arası boşlukları ve ksilem20'yi kapsayan aplast olarak tanımlanır. Sulu faz genellikle apoplast yıkama sıvısı (AWF) olarak adlandırılır. AWF, taşıma, hücre duvarı metabolizması ve stres tepkileri gibi çok sayıda biyolojik ilerlemeyi düzenlemek için hücreler tarafından salgılanan molekülleri içerir21,22. TSP'nin aksine, AWF'nin moleküler bileşenleri daha az karmaşıktır. AWF'den rekombinant proteinlerin çıkarılması, hücre içi proteinler, yanlış katlanmış ürünler ve sitoplazmik kalıntılar tarafından kontaminasyonu önleyebilir. Kısaca, ekstraksiyon lipidi yapraklara negatif basınç altında stomalardan girer ve AWF nazik santrifüjleme23 ile toplanır. AWF'nin izolasyonu, apoplast24,25,26,27 içindeki biyolojik ilerlemeyi incelemek için yaygın olarak kullanılırken, bitki bazlı üretim sistemlerinde kullanılmamıştır.

Bitki verimliliğinin artırılması ve yüksek saflıkta hedef proteinlerin elde edilmesi, bitki üretim sistemleri için temel zorluklardır28. Tipik olarak, proteinler, büyük miktarlarda hücre içi proteinler, yanlış katlanmış ve modifiye edilmemiş ürünler ve sonraki saflaştırma için büyük maliyetler gerektirensitokromlar 29 içeren toplam çözünür bitki özlerindensaflaştırılır 30. Apoplast içine salgılanan eksojen rekombinant proteinlerin ekstraksiyonu için AWF protein ekstraksiyon yöntemlerinin kullanılması, rekombinant proteinlerin homojenliğini etkili bir şekilde artırabilir ve protein saflaştırma maliyetini azaltabilir. Burada, apoplast boşluğuna eksojen protein salgılanmasını sağlamak için bir sinyal peptidi PR1a kullanıyoruz ve N. benthamiana'nın AWF'sinden rekombinant protein saflaştırması için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. N. benthamiana bitkilerinin hazırlanması

  1. Fide bloklarını bir tepsiye koyun, 1 L su ekleyin ve tamamen dolana kadar yaklaşık 2 saat bekletin.
  2. Fide bloklarının üzerine eşit şekilde yabani tip N. benthamiana tohumlarını serpin, bir kapakla örtün ve 1 hafta boyunca çimleyin. N. benthamiana'yı 18 saat fotoperiyodu, 24 °C, %45 bağıl nemi olan bir serada yetiştirin ve her 2 haftada bir gübreleyin.
  3. Tohumlar filizlendikten sonra, köklerine zarar vermemeye dikkat ederek bir fideyi nazikçe çıkarmak için cımbız kullanın. Yeni bir tepsinin ortasına küçük bir çukur kazın, fideyi içine yerleştirin ve kökleri hafifçe toprakla örtün. Bir kapakla örtün ve büyümeye devam edin.
  4. Fidelerin kapağı kapalı olarak üç yaprağı olana kadar büyütün. 4. gerçek yaprak çıktığında kapağı çıkarın.
  5. Agroinfiltrasyondan önce bitkilerin iki hafta daha büyümeye devam etmesine izin verin.

2. Rekombinant GFP-His'in inşası

  1. Gen dizilerine dayalı olarak GFP ve PR1a'nın (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) N . benthamiana kodon optimizasyonunu ve sentezini gerçekleştirin.
  2. Xba I ve Sac I enzimlerini kullanarak pCAMBIA1300 vektörünün çift sindirimini gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Yukarı akış primerleri kullanarak PR1a'nın amplifikasyonunu gerçekleştirin (TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
    TGTTCTCTTTTC) ve aşağı akış primerleri (TCCTCG
    CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
    GTGGG), yukarı akış primerleri (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG kullanılarak GFP'nin amplifikasyonu
    CAAGGGCGAGGA) ve aşağı akış primerleri (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG
    GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
  4. Homolog rekombinasyon kullanarak, PR1a ve GFP'yi pCAMBIA1300 bitki ekspresyon vektörüne klonlayın. E. coli'ye aktardıktan sonra, tek klonları seçin ve sıralama için şirkete gönderin. Dizileme sonuçlarının ve sağ plazmitin karşılaştırılması, p35s-PR1a-GFP-His olarak adlandırılan rekombinant plazmid pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His'tir.

3. N. benthamiana'da GFP-His üretimi

  1. 50 μL Agrobacterium reseptör hücresi GV3101'e 1 μL GFP plazmidi ekleyin, hafifçe karıştırın ve elektrot kabına ekleyin, elektroşok makinesinde elektrik çarpmasından sonra çıkarın.
  2. Dönüştürülmüş Agrobacterium tumefaciens'i 50 μg/mL kanamisin (Kan) ve 50 μg/mL rifampisin (Rif) içeren bir LB katı orta plaka üzerine yayın. 28 ° C'de 48 saat ters çevrilmiş olarak inkübe edin. pCAMBIA1300 vektörü kana dirençlidir ve Agrobacterium rif'e dirençlidir; sadece doğru Agrobacterium, kan ve rif içeren plakalarda büyüyebilir. Monoklonal klonlar, A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG) olarak adlandırılan pozitif dönüştürücülerdi.
  3. Uygun miktarda AtGPG almak için sterilize edilmiş bir kürdan kullanın ve Kan ve Rif ile 4 mL sıvı LB'ye aşılayın. 28 °C'de, 24 saat boyunca 220-300 rpm'de kültür.
  4. Bakterileri 1:50 taze LB (50 μg/mL Kan, 10 mM 2-(N-Morpholino) etansülfonik asit (MES), 20 μM asetosiringon (AS)) içine subkültür yapın ve 28 ° C'de, 220-300 rpm'de 10-12 saat inkübe edin.
  5. Bakterileri 10 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüjleme ile hasat edin ve peleti 1 mL MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 100 μM AS) ile yeniden süspanse edin.
  6. MMA kullanarak AtGPG'nin optik yoğunluğunu (OD) OD600=0.8 olarak ölçün ve ayarlayın. Bakterileri oda sıcaklığında 2-4 saat daha inkübe edin. Bakteri çözeltisini iğnesiz bir şırınga ile çekin, yaprakların arkasına hafifçe bastırın ve çözeltiyi yapraklara nüfuz etmesi için baskı yapın. Bitki başına sadece ortadaki 3-4 yaprağı enjekte edin.
  7. Protein ekstraksiyonu için yaprakları hasat etmeden önce 3-4 gün boyunca serada N. benthamiana yetiştirmeye devam edin.

4. GFP'nin hücre altı lokalizasyonunun gözlemlenmesi

  1. 48 saatlik agroinfiltrasyondan sonra, düz bir yaprak seçin ve delme için bıçağı sıkıştırmak için 6 mm'lik bir delgeç kullanın.
  2. %30 sükroz solüsyonunu bir cam lam üzerine damlatın, yaprak örneğini arkası yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve üzerini bir kapak camı ile örtün.
  3. Uyarma dalga boyunu 488 nm'ye ayarlayın ve 400x büyütmeden sonra 490-550 nm'de yeşil floresansı tespit edin. Slayt hazırlandıktan sonra ilk fotoğrafı çekin ve 10 dakika sonra başka bir fotoğraf çekin.

5. Bitkiden GFP'nin çıkarılması

  1. AWF çıkarma
    1. Agroinfiltrasyondan 3 gün sonra rekombinant GFP'yi ifade eden bozulmamış taze N. benthamiana yapraklarını toplayın. Hücre içi protein akışını önlemek için yaprağa nazikçe davranın ve yaprak bütünlüğünü koruyun. Protein bozulmasını önlemek için toplanan yaprakları hemen bir sonraki adım için kullanın.
    2. Kalıntıları temizlemek için yaprak bıçağı önceden soğutulmuş sterilize edilmiş ddH2O ile durulayın.
    3. Taze yaprakları tartın ve 20 g yaprağı (abaksiyal tarafı aşağı) 100 mL önceden soğutulmuş 100 mM fosfat tamponuna batırın (PB 100 mM Na2HPO4 ve 100 mM NaH2PO4 ayrı ayrı yapılandırıldı ve 2.2: 1 pH 7.0 oranında karıştırıldı) 200 mL geniş ağızlı bir beherde. Yaprakları 100 gözenekli naylon ince örgü iplik ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve plastik bir plaka ile örtün.
      NOT: Ön soğutma, protein bozulmasını önler. Tampon hacimleri deneysel ölçeğe göre ayarlanabilir. Tüm yaprakların suya daldırıldığından emin olun.
    4. Beheri bir vakum pompasına yerleştirin. 1 dakika boyunca 0,8 MPa vakum uygulayın, ardından hızlı bir şekilde atmosfer basıncına geri dönün.
    5. Yaprakları tampondan çıkarın ve emici kağıtla nazikçe kurulayın. Yaprakları sarın, örgü iplikle sarın ve her 50 mL'lik santrifüj tüpüne 5 g yaprak yerleştirin. AWF'yi toplamak için, haddelenmiş yaprakları, tüp kapakları tarafından tutturulmuş ağ ipliği ile tüplere uç tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
    6. 4 °C'de, 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Yaprakları çıkarın ve AWF'yi bir pipet kullanarak tüpün altında toplayın. Her tüpten yaklaşık 5 mL AWF elde edilebilir.
      NOT: Hücre içi proteinlerden kaynaklanan paraziti en aza indirmek ve maksimum miktarda AWF proteinini çıkarmak için, ekstraksiyon 2x-3x tekrarlanabilir, ancak 3x'ten fazla olamaz.
  2. Toplam çözünür protein ekstraksiyonu
    1. 20 g yaprağı sıvı nitrojen içinde ince toz haline getirin. 1: 2 oranında ekstraksiyon tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl,% 10 gliserol,% 1 Triton X-100,% 0.034 β-merkaptoetanol (Malzeme Tablosuna bakınız)) ekleyin.
    2. Homojenatı dikey bir karıştırıcıda 4 °C'de 30 dakika çalkalayın. 13.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve santrifüjlemeyi 15 dakika boyunca tekrarlayın. Temizlenmiş süpernatanı başka bir tüpe aktarın.
    4. Toplam çözünür protein ekstraktı elde etmek için süpernatanı 0.22 μm'lik bir filtreden süzün ( Malzeme Tablosuna bakınız).

  

6. GFP-His'in nikel (Ni) afinite kromatografisi ile saflaştırılması

NOT: Tüm adımları 4 °C'de gerçekleştirin.

  1. Adım 5.1.6'daki protein özü hacmine göre 1:1000 oranında bir tüpe Ni sefaroz excel reçinesi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Reçine hacmi, protein özühacminin 1 /1000'ine eşittir.
  2. Ni reçinesi 3x'i 10x reçine hacmi ddH,2O ve PB (pH 7.0) ile sırayla yıkayın ve süpernatanı çıkarın.
  3. Tam bağlanmayı sağlamak için protein ekstraktını Ni reçinesi ile 2 saat inkübe edin. Süpernatanttaki bağlanmamış proteinleri çıkarmak için 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. 3x'i 20x reçine hacmi PB ile yıkayın. 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
  4. 10x reçine hacmine 250 mM imidazol (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, %10 gliserol, 250 mM imidazol) ekleyerek GFP-His'i elute edin ve süpernatanı toplayın.

7. Proteinlerin Coomassie mavisi boyanması

  1. 40 μL protein örneğine 10 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, 10 dakika kaynatın, ardından 60 dakika boyunca 110 V'ta %15 SDS-PAGE üzerinde çalıştırın.
  2. Protein jellerini Coomassie blue çözeltisi (% 0.1 R-250,% 25 izopropanol,% 10 Buzlu asetik asit) ile 2 saat boyunca boyayın.
  3. Solüsyonu dökün ve 2 saat renk giderici solüsyonla yıkayın. Jeli gözlemleyin; Jel üzerindeki proteinler mavi renkte olacaktır.

8. Proteinlerin batı lekelenmesi

  1. 40 μL protein örneğine 10 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, 10 dakika kaynatın, ardından 60 dakika boyunca 110 V'ta %15 SDS-PAGE üzerinde çalıştırın.
  2. Proteinleri 280 mA'da 0.45 μm nitroselüloz membrana aktarın. Membranı 1 saat% 5 yağsız sütle bloke edin.
  3. Anti-His-tag antikorlarını 1:5000'de seyreltin ve zarı antikorlarla 1 saat inkübe edin. Membranı 4x'i 5 dakika boyunca yıkamak için tris-tamponlu salin ve tween 20 (TBST) kullanın.
  4. Anti-fare antikorlarını 1:10000'de seyreltin ve zarı antikorlarla 1 saat inkübe edin. Membranı 4x'i 5 dakika yıkamak için TBST kullanın.
  5. Geliştiriciyi ( Malzeme Tablosuna bakın) 1:1 oranında karıştırın. Membrana 400 μL ekleyin ve 1 dakika reaksiyona girmesine izin verin. Bir görselleştirici ile 1 dakika maruz kaldıktan sonra fotoğraf çekin.

9. Protein konsantrasyonu tahlili

  1. 1 mL Bradford 1x boya reaktifine 5 μL protein ekleyin ve 5 dakika reaksiyona sokun.
  2. Sıfırlamadan sonra OD595 değerini belirleyin ve standart eğriden protein konsantrasyonunu hesaplayın.

10. Protein miktar tayini 31

  1. Protein örneklerinin standartlarla birlikte Western blotlamasını gerçekleştirin.
  2. ImageJ 1.5.0 gri tonlama analizini kullanarak GFP'nin standartlara oranına göre nicelleştirilmesini gerçekleştirin.

  

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GFP-His, N. benthamiana'nın apoplastik alanına salgılanması hedefleniyor
GFP, sekresyon için bir N-terminal PR1a sinyal peptidi ve saflaştırma için bir C-terminal His-tag ile pCAMBIA1300 plazmidine klonlandı ve p35s-PR1a-GFP-His üretildi (Şekil 1A). Rekombinant protein N . benthamiana'da geçici olarak eksprese edildi ve agroinfiltrasyondan 3 gün sonra anti-His antikoru kullanılarak western blot ile 30 kDa bandı tespit edildi (Şekil 1B). Plazmoliz, hücre duvarını hücre zarından ayırmak için hipertonik bir çözelti kullanılarak yaprakların tedavisidir32. GFP'nin apoplastta bulunup bulunmadığını belirlemek için, yaprakların plazmolizini yapmak için% 30 sükroz kullandık. Floresan mikroskobu, apoplast içinde GFP-His'in varlığını göstermiştir (Şekil 1C). Vakum infiltrasyon-santrifüjleme ile ekstrakte edilen AWF proteinleri ayrıca GFP-His içeriyordu (Şekil 1D). Bu sonuçlar, GFP-His'in N. benthamiana yapraklarının AWF'sine salgılandığını ve buradan aşağı akış saflaştırması için ekstrakte edilebileceğini göstermektedir.

AWF'den protein saflaştırması
AWF ekstraksiyonunun etkinliği, nihai GFP verimini güçlü bir şekilde etkiler. Yayınlanmış AWF ekstraksiyon protokolleri24,25,26,27'ye dayanarak, salgılanan GFP-His'in geri kazanımını optimize etmek için çeşitli çözümleri test ettik. Burada sekiz ekstraksiyon çözeltisi incelendi: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4.5), 50 mM NaCl (pH 7.1), 40 mM KCl (pH 7.0), 20 mM CaCl2 (pH 5.7), 100 mM PB (pH 7.0), 10 mM MES (pH 5.6) ve ddH2O (pH 7.0). PB, diğer çözeltileri 4 kattan fazla aşarak en yüksek miktarda AWF ve GFP-His'i çıkardı (Şekil 2A,B). Değişen pH'da PB'nin karşılaştırılması, nötr ila hafif alkali koşullarda (pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 ve 8.0; Şekil 2C,D). Ek olarak, ekstraksiyon etkinliği için 50 mM, 100 mM ve 150 mM konsantrasyonlara sahip PB karşılaştırıldı. Sonuçlar, 100 mM PB'nin hem AWF hem de GFP-His'in geri kazanılması için maksimum etkinlik gösterdiğini gösterdi (Şekil 2E, F).

Bu optimizasyon deneylerine dayanarak, N. benthamiana'dan büyük ölçekli AWF ekstraksiyonu için 100 mM PB, pH 7.0 seçildi. Bu tampon kullanılarak, apoplasttan bir gram taze yaprak materyali başına 495 μg toplam AWF proteini geri kazanıldı (Şekil 2G). Ekstrakte edilen AWF, TSP'deki toplam GFP-Hi'nin yaklaşık 'ine karşılık gelen 10 μg GFP-His (Şekil 2H) içeriyordu (Şekil 2I). Ni-afinite kromatografisini takiben, GFP-His saflığı, AWF ekstraksiyonundan% 84.3'e ulaştı, toplam çözünür protein ekstraksiyonu yoluyla elde edilen% 44.9 saflıktan önemli ölçüde daha yüksek (Şekil 2J).

figure-results-1
Resim 1: GFP-His, N. benthamiana'nın apoplastına salgılanması hedeflenmiştir. (A) pCAMBIA1300 bitki ekspresyon vektöründe PR1a-GFP-His yapısının şeması. (B) Batı lekesi, GFP-N. benthamiana'daki üretimini tespit ediyor.Burada 10 μL protein örneği yüklendi ve tespit edildi. Negatif kontrol olarak eş zamanlı olarak MMA enjekte edilen N. benthamiana yaprakları kullanıldı. Aynı hacimde numuneler, GFP-His'in (yeşil) hücre altı lokalizasyonunu gösteren yükleme kontrolü (C) Konfokal mikroskopi olarak bitki büyük alt birimleri kullanılarak incelendi ve boyandı. N. benthamiana yaprakları 0 sükroz ile plazmolize edildi. Beyaz kesikli çizgiler plazma zarını gösterir. Kırmızı oklar GFP-O'nun apoplasttaki birikimini gösterir. (D) Ekstrakte edilen apoplastik sıvıda GFP-His'in varlığını gösteren Western lekesi. Burada 10 μL protein örneği yüklendi ve tespit edildi. Negatif kontrol olarak eş zamanlı olarak MMA enjekte edilen N. benthamiana yaprakları kullanıldı. Kısaltmalar: 35s = 2x Karnabahar mozaik virüsü 35s promotörü; PR1a = tütün patogenezi ile ilişkili protein 1a sinyal peptidi; Onun = 6x O'nun etiketi; Nos = nopalin sentaz sonlandırıcı. BS = plazmolizden önce; PS = plazmoliz sonrası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: AWF'den protein ekstraksiyon yönteminin optimizasyonu. (A-B) Farklı tamponlar kullanılarak AWF'den proteinlerin ekstraksiyonu. AWF'den protein ekstraksiyonu için sekiz çözelti test edildi: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4.5), 50 mM NaCl (pH 7.0), 40 mM KCl (pH 7.0), 20 mM CaCl2 (pH 5.7), 100 mM PB (pH 7.0), 10 mM MES (pH 5.6) ve ddH2O (pH 7.0). Ekstraksiyon etkinliği SDS-PAGE (A) ile analiz edildi ve GFP-His, anti-His antikoru (B) kullanılarak western blotlama ile tespit edildi. (C-D) Farklı pH değerlerinde PB kullanarak ekstraksiyon. AWF'den ekstraksiyon için pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 ve 8.0 olan PB kullanıldı. Ekstraksiyon etkinliği SDS-PAGE (C) ile tespit edildi ve GFP-His, anti-His antikoru (D) ile western blotlama ile tespit edildi. (E-F) Farklı konsantrasyonlarda PB kullanarak ekstraksiyon. AWF'den ekstraksiyon için 50 mM, 100 mM ve 150 mM'de PB kullanıldı. Ekstraksiyon etkinliği SDS-PAGE (E) ile analiz edildi ve GFP-His, anti-His antikoru (F) ile western blotlama ile tespit edildi. (G-H) Ekstrakte edilen proteinlerin kantitatif analizi. Proteinler 100 mM PB (pH 7.0) kullanılarak ekstrakte edildi. Toplam çözünür protein (G) ve GFP-His (H) istatistiksel analiz için ölçüldü. (I) AWF GFP'nin toplam GFP'ye oranının istatistiksel analizi. (J) GFP-His'in N. benthamiana veya AWF'nin toplam çözünür proteinlerinden saflaştırılması. Proteinler 100 mM PB (pH 7.0) kullanılarak ekstrakte edildi ve GFP-His, Ni afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Saflaştırma SDS-PAGE ile analiz edildi. En sağdaki şerit 1 μg BSA standardıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapötik proteinler üretmek için bitkilerin kullanılması son yıllarda hızla genişledi 1,2,3,4,5,6. Protein kodlayan genler, ekspresyon vektörlerine klonlanır ve agroinfiltrasyon yoluyla bitki dokularına verilir. Bitki hücreleri tarafından üretildikten sonra, proteinler sonraki uygulamalar için saflaştırılır. Tipik olarak, rekombinant proteinler TSP ekstraktlarından saflaştırılır. Bununla birlikte, ekstraksiyon sırasında bitki hücrelerinden salınan bol miktarda bitki proteinleri ve sitokromlar saflaştırmayı engelleyebilir33. Bir yandan, bitki sitokromları ayırma kolonlarını tıkayarak işlemeyi yavaşlatabilir17; Öte yandan, RuBisCO gibi bol miktarda bulunan proteinlerin çıkarılması zordur ve saflığı azaltır18,19. Hedef proteinler düşük seviyelerde eksprese edildiğinde bu sorunlar daha sorunlu hale gelir. AWF'den saflaştırma, bu sorunları atlayarak daha yüksek saflık sağlar (Şekil 2J).

AWF ekstraksiyonu bitki biyolojisinde yaygın olarak kullanılırken 24,25,26,27, moleküler tarım boru hatlarında nadiren kullanılmaktadır. Burada, AWF bazlı protein saflaştırmasını göstermek için bitki yapımı bir GFP modeli kullanıyoruz. AWF'den GFP'nin ekstraksiyonu, GFP'nin apoplast boşluğuna salgılanmasını sağlamak için bir sinyal peptidi eklenerek gerçekleştirildi. Bu yöntem, daha yüksek homojenliğe sahip proteinleri ekstrakte eder ve sonraki protein işleme maliyetlerini azaltır. Tesis biyoreaktörlerinde AWF saflaştırmasının uygulanması için gelecekte araştırılması gereken birkaç husus vardır. İlk olarak, verimli sekresyon, spesifik N-terminal sinyal peptitlerinin füzyonunu gerektirir. İkincisi, AWF kalitesini korumak için, bozulmamış yapraklar hasattan sonra donmadan hızlı bir şekilde işlenmelidir, bu da hücre içi içeriği serbest bırakır. Üçüncüsü, PB, AWF proteinlerini34 etkili bir şekilde ekstrakte eder, ancak tampon pH ve tuz konsantrasyonu, bireysel rekombinant proteinler için uyarlanmalıdır (Şekil 2C-D). Dördüncüsü, 200 g N. benthamiana'dan laboratuvar koşullarında birçok kez stabil saflık ve verimle saflaştırılmış protein elde ettik. Fabrikada kullanılmak üzere ölçeklendirilmek için daha büyük kaplar ve vakum pompaları ve daha etkili bir saflaştırma yöntemi istenir ve vakum süresi, geri kazanım sayısı vb. koşulların optimize edilmesi gerekebilir.

Bu yöntem, ekzojen proteinlerin AWF'ye salgılanması ve plazma zarı içindeki proteinlerin terk edilmesi gerçeğiyle sınırlıdır (Şekil 2H-I). Doğru modifikasyonla, ancak daha yüksek bir verim maliyetiyle daha yüksek saflaştırılmış proteinler elde etmenin faydasını sağlar. AWF bazlı saflaştırma için en büyük teknik darboğaz, AWF içindeki hedef protein seviyesinin iyileştirilmesidir. Güçlü destekleyiciler ve optimize edilmiş salgı sistemleri ile birleştirme, hem yüksek saflık hem de daha yüksek verim için bitki ifade platformlarını iyileştirecektir. Bu darboğazın üstesinden gelmek için, gelecekteki çalışmalarda daha yüksek bir üretim sistemi ve daha etkili bir salgılama sistemi istenmektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Gençlik İnovasyonu Teşvik Derneği CAS (2021084) ve Çin Bilimler Akademisi Mikrobiyoloji Enstitüsü Üç Yıllık Eylem Planının Anahtar Dağıtım Projesi Destek Fonu tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 örgü naylon ince örgü iplikGuangzhou Huayu Ticaret limited şirketihy-230724-2AWF protein ekstraksiyonu için
50 ml santrifüj tüpleriVazymeTCF00150Santrifüj için
ClonExpress II tek adımlı klonlama kitiVazymeC112-02Klon
FastDigest için Sac1NEBR3156S Klon
FastDigest XbaINEB içinFD0685Klon
için ImageJ 1.5.0//Gritonlama analizi için
Büyük filtreThermo FisherNESTFiltreleme için
Lazer taramalı konfokal mikroskopiLeica SP8Hücre altı lokalizasyonu için
Ni sefaroz excelCytiva10339806Protein saflaştırması için
Prekast protein artı jelSDS-PAGE için36246ES10
Küçük filtreNalgene1660045Filtreleme için
SuperSignal West Femto Yüzey Deneme KitiThermo Fisher34076Batı lekeleme için
Triton X-100SCR30188928Ekstraksiyon tamponunu yapılandırmak için
Tipi döner vakum pompasıZhejiang taizhouqiujing vakum pompası limited şirketi2XZ-2Vakum sızması için
Dikey karıştırıcıHaimen Qilinbel Enstrüman İmalatı limited şirketiBE-1200Karıştırma
ve beta;-merkaptoetanoliçin SIGMABCBK8223VEkstraksiyon tamponunu yapılandırmak için
YEASEN

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zahmanova, G., et al. Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (24), 1757(2023).
  2. PREVAIL II Writing Group. A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection. N Engl J Med. 375 (15), 1448-1456 (2016).
  3. Ma, J. K. C., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol J. 13 (8), 1106-1120 (2015).
  4. Shanmugaraj, B., Rattanapisit, K., Manopwisedjaroen, S., Thitithanyanont, A., Phoolcharoen, W. Monoclonal antibodies B38 and H4 produced in Nicotiana benthamiana neutralize SARS-CoV-2 in vitro. Front Plant Sci. 11, 589995(2020).
  5. Takeyama, N., Kiyono, H., Yuki, Y. Plant-based vaccines for animals and humans: Recent advances in technology and clinical trials. Ther Adv Vaccines. 3 (5-6), 139-154 (2015).
  6. Ward, B. J., Séguin, A., Couillard, J., Trépanier, S., Landry, N. Phase III: Randomized observer-blind trial to evaluate lot-to-lot consistency of a new plant-derived quadrivalent virus like particle influenza vaccine in adults 18-49 years of age. Vaccine. 39 (10), 1528-1533 (2021).
  7. Siriwattananon, K., et al. Plant-produced receptor-binding domain of SARS-CoV-2 elicits potent neutralizing responses in mice and non-human primates. Front Plant Sci. 12, 682953(2021).
  8. Leblanc, Z., Waterhouse, P., Bally, J. Plant-based vaccines: The way ahead. Viruses. 13 (1), 5(2020).
  9. Sethi, L., Kumari, K., Dey, N. Engineering of plants for efficient production of therapeutics. Mol Biotechnol. 63 (12), 1125-1137 (2021).
  10. Webster, D. E., Thomas, M. C. Post-translational modification of plant-made foreign proteins; glycosylation and beyond. Biotechnol Adv. 30 (2), 410-418 (2012).
  11. Streatfield, S. J. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  12. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  13. Ullrich, K. K., Hiss, M., Rensing, S. A. Means to optimize protein expression in transgenic plants. Curr Opin Biotechnol. 32, 61-67 (2015).
  14. Su, H., et al. Plant-made vaccines against viral diseases in humans and farm animals. Front Plant Sci. 14, 1170815(2023).
  15. Agrawal, G. K., Jwa, N. S., Lebrun, M. H., Job, D., Rakwal, R. Plant secretome: Unlocking secrets of the secreted proteins. Proteomics. 10 (4), 799-827 (2010).
  16. Kim, T., Gondré-Lewis, M. C., Arnaoutova, I., Loh, Y. P. Dense-core secretory granule biogenesis. Physiology. 21, 124-133 (2006).
  17. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  18. Kim, S. T., Cho, K. S., Jang, Y. S., Kang, K. Y. Two-dimensional electrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays. Electrophoresis. 22 (10), 2103-2109 (2001).
  19. Xi, J., et al. Polyethylene glycol fractionation improved detection of low-abundant proteins by two-dimensional electrophoresis analysis of plant proteome. Phytochemistry. 67 (21), 2341-2348 (2006).
  20. Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
  21. Delaunois, B., et al. Uncovering plant-pathogen crosstalk through apoplastic proteomic studies. Front Plant Sci. 5, 249(2014).
  22. Andreasson, E., Abreha, K. B., Resjö, S. Isolation of apoplast. Methods Mol. Biol. 1511, 233-240 (2017).
  23. Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann, M. K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiol Plant. 111 (4), 457-465 (2001).
  24. Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant Cell Physiol. 53 (9), 1659-1668 (2012).
  25. Rumyantseva, N. I., Valieva, A. I., Kostyukova, Y. A., Ageeva, M. V. The effect of leaf plasticity on the isolation of apoplastic fluid from leaves of tartary buckwheat plants grown in vivo and in vitro. Plants. 12 (23), 4048(2023).
  26. Ekanayake, G., Gohmann, R., Mackey, D. A method for quantitation of apoplast hydration in Arabidopsis leaves reveals water-soaking activity of effectors of Pseudomonas syringae during biotrophy. Sci Rep. 12 (1), 18363(2022).
  27. Preston, G. M., Fones, H. N., Mccraw, S., Rico, A., O'leary, B. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example. J Vis Exp. (94), e52113(2014).
  28. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  29. Menkhaus, T., et al. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  30. Streatfield, S. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  31. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Sci Rep. 8 (1), 4755(2018).
  32. Zhao, J., et al. Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina. Front Plant Sci. 12, 771806(2021).
  33. Venkataraman, S., et al. Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines. Front Plant Sci. 14, 1273958(2023).
  34. Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., Mühling, K. H. Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves. Plant Meth. 7, 48(2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Rekombinant Protein Safla t rmasBitki Ekspresyon SistemiNicotiana benthamianaVakum nfiltrasyonuAfinite KromatografisiYe il Florasan ProteinApoplastik Y kama S v sProtein SekresyonuWestern Blot

İlgili makaleler