Yöntem makalesi

Baker'da Mitokondriyal Dönüşüm

2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66856

⸱

7 Haziran 2024

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, maya mitokondrisinin biyolistik bir yöntem kullanılarak nasıl dönüştürüleceğini açıklamaktadır. Ayrıca, transformantların nasıl seçileceğini ve saflaştırılacağını ve mitokondriyal genom içinde hedef pozisyonda istenen mutasyonun nasıl tanıtılacağını da gösteriyoruz.

Özet

Ekmek mayası Saccharomyces cerevisiae , onlarca yıldır mitokondriyal biyolojiyi anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu model, ökaryotlar arasındaki temel, korunmuş mitokondriyal yollar ve mantarlar veya mayaya özgü yollar hakkında bilgi sağlamıştır. S. cerevisiae'nin birçok yeteneğinden biri, şimdiye kadar sadece S. cerevisiae ve tek hücreli algler Chlamydomonas reinhardtii'de mümkün olan mitokondriyal genomu manipüle etme kapasitesidir. Maya mitokondrisinin biyolistik dönüşümü, bölgeye yönelik mutasyonları tanıtmamıza, gen yeniden düzenlemeleri yapmamıza ve muhabirleri tanıtmamıza olanak tanır. Bu yaklaşımlar esas olarak mitokondrideki yüksek derecede koordineli iki sürecin mekanizmalarını anlamak için kullanılır: mitoribozomlar tarafından translasyon ve solunum komplekslerinin ve ATP sentazın montajı. Bununla birlikte, mitokondriyal dönüşüm potansiyel olarak diğer yolları incelemek için kullanılabilir. Bu çalışmada, maya mitokondrisinin yüksek hızlı mikromermi bombardımanı ile nasıl dönüştürüleceğini, amaçlanan dönüştürücünün nasıl seçileceğini ve saflaştırılacağını ve mitokondriyal genomda istenen mutasyonun nasıl tanıtılacağını gösteriyoruz.

Giriş

Saccharomyces cerevisiae mayası, mitokondriyal biyogenezi incelemek için kullanılan, yaygın olarak tanınan bir modeldir. Maya anaerobik, fakültatif bir organizma olduğundan, solunumu bozan mutasyonların ortaya çıkmasının nedenlerini ve sonuçlarını kapsamlı bir şekilde incelemek mümkündür. Ek olarak, bu organizma mitokondriyal yolları incelemek için dost genetik ve biyokimyasal araçlara sahiptir. Bununla birlikte, solunum kompleksi montajı ve mitokondriyal protein sentezi mekanizmalarını keşfetmek için en güçlü kaynaklardan biri, mitokondriyi dönüştürme ve organelin genomunu değiştirme yeteneğidir. Daha önce, mitokondriyal DNA (mtDNA) nokta mutasyonları veya küçük delesyonlar/eklemeler 1,2,3,4,5, genleri silmek 6,7, gen yeniden düzenlemeleri yapmak 7,8, mitokondriyal proteinlereepitoplar eklemek 9,10, genleri çekirdekten mitokondriyetaşımak 11,12 ve BarStar13, GFP14,15, lusiferaz16 ve en yaygın kullanılan ARG8m17,18 gibi muhabir genlerini tanıtın. Mitokondriyal genom modifikasyonları, aksi takdirde anlaşılması zor olan mekanizmaları incelememize ve tanımlamamıza izin verdi. Örneğin, mitokondriyal DNA'daki COX1 lokusuna yerleştirilen ARG8m raportör geni, Mss51'in Cox1 biyogenezinde ikili bir role sahip olduğunu anlamak için çok önemliydi. Birincisi, COX1 mRNA'nın translasyonel bir aktivatörüdür ve ikincisi, yeni yapılan Cox1 proteini 7,19 için bir montaj şaperonudur. Bu çalışma, S. cerevisiae mitokondrisini dönüştürmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır. Mitokondriyal dönüşüm protokolü daha önce yayınlanmış olsa da 16,20,21,22,23, yöntemin farklı aşamalarını ve ayrıntılarını tam olarak anlamak için bir video aracılığıyla görsel bir yaklaşım şarttır. Yöntem çeşitli adımlardan oluşur ve dört genel aşamaya ayrılır:

Gen düzenleme süreç diyagramı; tungsten parçacıkları, DNA kaplama, mitokondriyal genom entegrasyon basamakları.
Şekil 1: Yüksek hızlı mikromermi bombardımanı ile mitokondriyal dönüşüm prosedürüne genel bakış: 1) Tungsten parçacıkları sterilize edilir ve DNA kaplamasından önce hazırlanır. 2) WP'lerin yüzeyinde iki farklı plazmit çökeltilir. Biri, mitokondriyal matrise yönlendirilecek yapıyı içeren bir bakteri plazmitidir. Diğeri, bir oksotrofi markörü taşıyan bir nükleer maya ekspresyon vektörüdür. 3) Mitokondriyal DNA'dan (rho0) yoksun bir reseptör maya suşu, mitokondriyal gen ekspresyonunun34,35 herhangi bir glikoz baskılamasını uygulamayan galaktoz veya rafinoz gibi fermentatif bir karbon kaynağı üzerinde büyütülür. Kültür, bombardıman ortamını içeren petri kaplarına yayılır. 4) Plazmitlerle kaplanmış WP'ler, yüksek hızlı mikromermi bombardımanı ile reseptör suşuna vurulur. 5) Mitokondriyal plazmid içeren pozitif sentetik rhokoloniler, bir test edici suşla eşleştirilerek seçilir. 6) Mitokondriyal yapı, sentetik rho-suşun (donör) alıcı suş ile sitodüksiyon olarak bilinen bir işlemle çiftleştirilmesiyle istenen lokusta mitokondriyal genoma entegre edilir. 7) Mitokondriyal yapıyı taşıyan pozitif reseptör, haploid suş seçilir ve farklı ortamlarda saflaştırılır. Kısaltmalar: WP'ler = tungsten parçacıkları; mtDNA = mitokondriyal DNA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mitokondriyal genoma entegre olması amaçlanan DNA yapısı ile hücrelerin dönüşümü (Şekil 1, adım 1-4)
Tam bir mitokondriyal genom (rho+) içeren bir mayayı doğrudan dönüştürmek mümkün olsa da, hücrelerde mitokondriyal DNA (rho0) yoksa dönüşüm 10-20 kat daha verimlidir.24. Tungsten parçacıkları (WP'ler), birlikte dönüştürülecek iki farklı plazmit ile kaplanır. Birincisi, LEU2 veya URA3 gibi bir oksotrofi belirteci taşıyan bir maya 2 μ ekspresyon vektörüdür (örneğin, sırasıyla YEp351 veya YEp352). DNA'nın maya hücrelerine biyolistik girişi başarılı olursa, dönüştürücüler oksotrofi ortamında (yani, lösin veya urasil içermeyen bir ortam) büyüyecektir. Bu plazmit, nükleer plazmidi edinen hücrelerin ilk seçiminin yapılmasında yardımcı olur; Aksi takdirde, ortaya çıkan kolonilerin sayısı plakayı doyurur. İkinci plazmit, mitokondriyal genoma entegre edilmesi amaçlanan mitokondriyal yapıyı içeren bir bakteri plazmitidir (pBluescript veya benzeri gibi). Yapı, ilgilenilen mitokondriyal bölge ile rekombinasyon için en az 100 nt 5' ve 3' yan mitokondriyal dizi içermelidir. Deneyimlerimize göre, daha büyük yan dizilerin mitokondriyal genomdaki hedef lokus ile başarılı bir şekilde yeniden birleşme olasılığı daha yüksektir.

Spesifik bir örnek Şekil 225'te gösterilmiştir. Bu örnekte amaç, karşılık gelen proteinin (Cox1ΔC15) son 15 amino asidini kodlayan mitokondriyal COX1 geninin bölgesini silmekti (Şekil 2A). COX1ΔC15 mutasyonunu taşıyan bakteri plazmidi, genin 5' ve 3' çevrilmemiş bölgelerinin sırasıyla 395 nt ve 990 nt'sini içeriyordu. Plazmit, pBluescript'ten (pXPM61) türetildi ve 2 μ plazmid YEp352 ile birlikte WP'lerin yüzeyinde birlikte çökeltildi (Şekil 2B). WP'ler daha sonra mikromermi bombardımanı ile seçilen alıcı suşuna sokuldu (Şekil 2C). NAB6926 olarak adlandırılan bu suş, kar1-1 ve ade2 alellerini taşıyan bir MATa, rho0 suşudur (bu özelliklerin önemi aşağıda tartışılmıştır). Hücreler, 2 μ plazmidi edinenleri seçmek için urasil içermeyen bombardıman ortamı üzerine kaplandı (Şekil 2C). Hücreler 30 ° C'de 5-7 gece büyütüldü.

Mitokondriyal yapıyı içeren bakteri plazmidini ve oksotrofi markörünü taşıyan nükleer 2 μ plazmiti edinen hücrelerin seçimi (Şekil 1, adım 5)
Pozitif koloniler, mitokondrilerinde bakteri plazmidinin birçok kopyasını tutacaktır22. Dönüştürülmüş hücreler orijinal olarak rho0 olduğundan, plazmidde bulunan mitokondriyal yapının translasyonunu destekleyen hiçbir mitokondriyal dizi; bu nedenle, dönüştürülmüş mitokondriyal gen ifade edilmeyecektir. Mitokondriyal plazmidi elde eden maya kolonilerini tespit etmek için transformatörleri bir test suşu ile eşleştirmek gerekir. Test edici suşun mitokondriyal genomu, ilgilenilen genin işlevsel olmayan mutasyona uğramış bir versiyonunu içerir. Çiftleşmeden sonra, mitokondri birleşecek ve dönüştürülmüş plazmide dahil edilen mitokondriyal dizi, test edici suştan mutasyona uğramış mitokondriyal gen ile yeniden birleşecektir; sonuç olarak, WT geninin geri kazanılması, işlevi yeniden oluşturacaktır. Ortaya çıkan diploid, saptanabilir bir pozitif fenotipe sahip olacaktır (genellikle solunum ortamında veya arginin içermeyen bir ortamda büyüme kapasitesi). Mitokondride bakteri plazmidini taşıyan pozitif hücrelere "sentetik rho- hücreleri" adı verilir. Şekil 2D'nin spesifik örneğinde, COX1ΔC15 yapısını (XPM199 olarak adlandırılır) taşıyan sentetik rho- hücreleri, urasil içermeyen bir ortam üzerinde replika kaplanmıştır (bu, pozitif kolonilerin saflaştırıldığı ana plakadır). Ayrıca, işlevsel olmayan mutasyon cox1D369N içeren bir test cihazı suşu L4527 çimi üzerinde replika kaplandılar. İki gece çiftleştikten sonra, L45 ve XPM199'un mitokondriyal genomu yeniden birleşti ve fonksiyonel bir COX1 geni ile sonuçlandı; Bu nedenle, diploidler solunum ortamında büyüme yeteneğini geri kazandı. Ana plakadan pozitif kolonileri seçtik. Urasil içermeyen plakalar üzerine çizildiler ve saf sentetik rho-hücreleri elde etmek için seçici testler tekrarlandılar (Şekil 2E). Test plakasının sadece sentetik rhokolonilerin tanımlanması için olduğunu ve mutantların bu plakalardan geri kazanılamayacağını belirtmek önemlidir.

Yapının, amaçlanan suşun mitokondriyal genomuna entegrasyonu
Bu adım, sitodüksiyon28,29 adı verilen bir işlemle gerçekleştirilir (Şekil 1, adım 6). Bu yaklaşımda, sentetik rho- suşu (donör suşu), zıt eşleşme tipinin amaçlanan alıcı suşu ile eşleştirilir. Temel bir gereklilik, iki çiftleşme suşundan en az birinin nükleer füzyonu30 engellemek için kar1-1 mutasyonunu taşımasıdır. Bu nedenle, iki hücrenin çiftleşmesi iki çekirdekli bir zigot üretir (Şekil 3). Ebeveyn hücrelerden (verici ve alıcı) gelen mitokondriyal ağ birleşir ve mitokondriyal DNA molekülleri yeniden birleşir. İki çekirdekli zigotlar, haploid hücreler üretecek olan tomurcuklanmaya izin vermek için inkübe edilir/geri kazanılır. Bu haploidler, ebeveyn hücrelerinden birinin nükleer arka planını taşır. Benzer şekilde, haploidler mitokondriyal DNA'yı ebeveyn hücresinden veya ilgilenilen rekombine mitokondriyal DNA'dan taşıyabilir. Bununla birlikte, kar1-1 mutasyonu% 100 etkili değildir ve çiftleşme sırasında bazı gerçek diploidler oluşacaktır28,29. Sentetik rho- suşu (donör, XPM199) örnekteki kar1-1 alelini taşıdı. Seçici bir belirteç olarak, ade2 aleline sahipti ve bu da onu adenin için bir oksotrof haline getirdi (Şekil 4). Alıcı suş, raportör ARG8m'nin mitokondriyal genom 7'deki COX1 kodonlarının yerini aldığı cox1Δ::ARG8m yapısını taşıyan bir rho+ suşu olanXPM10 idi. Her iki hücre kültürünün karışımı, çiftleşmeye izin vermek için bir damla olarak bir YPD plakasına eklendi. 3-5 saat sonra, hücreler, çiftleşme ile ilişkili bir hücre şekli olan shmoos oluşumunu tespit etmek için bir ışık mikroskobu altında gözlemlendi (Şekil 3B). Kuluçka / geri kazanım süresinden sonra, binükleer zigotlar, donör hücrelerin büyümesini önlemek için adenin içermeyen bir ortam üzerine kaplandı.

İlgilenilen mitokondriyal genomu taşıyan haploid suşun seçimi (Şekil 1, adım 7)
Sitodeksiyondan sonra donör, alıcı ve diploid hücrelerin bir karışımı mevcuttur. Bu nedenle, iki çekirdekli zigotların inkübasyonundan/geri kazanımından sonra, ilgilenilen haploidleri tanımlamak ve saflaştırmak için hücrelerin farklı seçici ortamlarda büyütülmesi gerekir. Seçici ortam, vericinin genotiplerine, alıcı suşlara ve amaçlanan mitokondriyal yapıya bağlıdır. Bununla birlikte, genel olarak, seçici ortamın seçilmesinin mantığı şudur: i) inkübasyon / geri kazanımdan sonra, sitüldüksiyon karışımı, donör ebeveyn suşunun büyüyemediği seçici ortamda büyütülür. Şekil 4A,B'deki spesifik örnekte, donör (sentetik rho-suş) fonksiyonel olmayan ade2 alelini taşır. Bu nedenle, sitodüksiyon karışımı, adenin içermeyen orta boy bir plaka üzerinde inkübe edilmelidir. Bu ana plakadır. ii) Koloniler büyüdükten sonra, ana plaka, adenin içermeyen bir ortamda (ilgilenilen pozitif kolonilerin saflaştırılacağı yeni bir ana plaka oluşturmak için) ve daha sonra sadece diploidlerin büyüyebileceği bir ortamda tekrar kopyalanır. Bu, diploid kolonilerin yanlışlıkla daha fazla saflaştırılmasını önlemek için gereklidir. Şekil 4C'deki örnekte olduğu gibi, lösin içermeyen ortamlarda sadece diploidler büyüyebilir. iii) Ana plaka, yalnızca ilgilenilen mitokondriyal DNA'yı içeren alıcı haploidlerin büyüyeceği ortamda da çoğaltılır. Şekil 4C örneğinde, Cox1ΔC15 proteini işlevsel olduğundan, haploidler karbon kaynağı olarak etanol/gliserol içeren solunum ortamlarında büyür. İlgilenilen mtDNA'yı taşıyan ortaya çıkan rho+ suşu XPM20925 olarak adlandırıldı. Şekil 2 ve Şekil 4'te kullanılan suşlar Tablo 1'de listelenmiştir.

Maya geni düzenleme süreci, mtDNA ve COX1ΔC15 ile diyagram, URA3 plazmid, sentetik rho⁻ suşu.
Şekil 2: Mitokondriyal dönüşümün belirli bir örneğini ve pozitif rho hücrelerinin seçimini açıklayan diyagram. (A) Mitokondriyal genomun amaçlanan modifikasyonu, Cox1 alt biriminin (Cox1ΔC15) son 15 amino asidini kodlayan bölgenin silinmesiydi. (B) WP'ler, maya hücrelerini dönüştürmek için iki plazmit ile kaplandı. Biri, çekirdekte yönlendirilen ve eksprese edilen 2 μ plazmid Yep352 idi. Diğeri, COX1ΔC15 alelini artı COX1 5' ve 3'-UTR'lerin sırasıyla 395 nt ve 990 nt'sini içeren plazmid pXPM61 idi. (C) WP'ler, mitokondriyal DNA'dan (rho0 suşu) yoksun olan NAB69 suşundan hücrelere sokuldu. Bombardıman plakalarından elde edilen transformant koloniler, nükleer plazmid YEp352'nin oksotrofik belirteci olan urasil içermeyen bir ortam üzerinde çoğaltıldı. (D) Pozitif rhokolonileri seçmek için, -URA plakası urasil içermeyen bir ortam üzerinde çoğaltıldı. Bu, pozitif kolonilerin toplandığı ve izole edildiği ana plakaydı. Ayrıca zengin ortam (YPD) ve bir test cihazı suşunun çimi olan plakalar üzerinde de çoğaltıldı. Çiftleşme sırasında, sentetik rho-mitokondriyal DNA, COX1 geninde (D369N) bir mutasyon taşıyan test edici suş L4527'den mitokondriyal DNA ile yeniden birleştirildi. Solunum ortamında büyüyen diploidler, dönüştürülmüş DNA'yı içeriyordu. Karşılık gelen koloniler, yeniden doldurmak ve saflaştırmak için ana plakadan toplandı. Tüm replika kaplama boyunca ana plakadaki pozitif kolonileri tanımlamaya yardımcı olmak için, plakaların kenarlarında kalıcı bir işaretleyici ile işaretler yapıldı (yeşil çizgiler). (E) Seçilen pozitif koloniler, urasil içermeyen bir ortam üzerinde yeniden yerleştirildi. Bu yeni ana plakaydı. D'de olduğu gibi, sentetik rhokolonileri saflaştırmak için iki tur daha test yapıldı. Kısaltmalar: WP'ler = tungsten parçacıkları; mtDNA = mitokondriyal DNA; -URA/Sorb = urasil eksikliği/ Sorbitol içeren; WT = vahşi tür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Maya hücresi füzyon süreci; diyagram ve mikroskop görüntüsü; RHO+ Transferi; çiftleşme aşamaları; Hücresel biyoloji.
Şekil 3: Sitülasyon prosedürünü açıklayan diyagram. (A) Sitülasyon sırasında hücrelerin nasıl çiftleştiğine genel bakış. Sitoddüksiyon sırasında, donör ve alıcı suşlardan gelen mitokondri birleşir, böylece her iki suştan gelen mitokondriyal DNA yeniden birleşir. Kar1-1 mutasyonu30 nedeniyle nükleer füzyon azaldığından, binükleer zigotlar oluşur. Bir miktar inkübasyon/iyileşme süresinden sonra, amaçlanan mitokondriyal mutasyonu içeren binükleer zigot tomurcuğu ve haploid alıcıları seçilir. (B) Sentetik rho-suş (donör) ve alıcı suşun sitodüksiyon yoluyla çiftleşmesi, çiftleşme mayasının karakteristik bir şekli olan shmoos (kırmızı oklar) oluşumuna izin verir. Görüntü, 100x objektif ile ışık mikroskobu altında çekildi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Donör XPM199 ve alıcı XPM10'u gösteren, DNA entegrasyonu için ADE ana kaplamasını ve rekombinant büyüme sürecini vurgulayan maya genetik çaprazlama diyagramı.
Şekil 4: COX1ΔC15 mutasyonunu mitokondriyal genoma entegre etmek için spesifik bir sitodüksiyon örneğini açıklayan diyagram. (A) Sentetik rho- suşun (donör, XPM199) ve ilgilenilen suşun (alıcı, XPM10) sıvı kültürleri çiftleşmek için karıştırıldı. Shmoo oluşumundan sonra, karışım 2-4 saat boyunca sıvı bir kültürde geri kazanıldı. Daha sonra, sitodüksiyon karışımı, donör hücrelerin büyümesini önlemek için orta derecede adenin içermeyen bir plaka üzerine yayıldı. (B) Sitodüksiyon sırasında donörden (XPM199) ve alıcıdan (XPM10) mitokondriyal DNA'nın rekombinasyon olaylarının şematik gösterimi. (C) Ana plaka, amaçlanan mitokondriyal geni organelin DNA'sına entegre eden haploidleri tanımlamak ve saflaştırmak için farklı seçici ortamlarda çoğaltıldı (XPM209)25. Kısaltmalar: -ADE = adenin eksikliği; -LEU = lösin eksikliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

NOT: Mitokondriyal dönüşüm verimliliği genellikle düşük olduğu için her yapı için altı dönüşüm yapmanızı öneririz. Farklı büyüme ortamlarının bileşimi Tablo 2'de gösterilmektedir.

1. Tungsten parçacık hazırlama

  1. Bir mikrotüpte 30 mg 0.7 μm tungsten parçacıkları (WP'ler, mikro taşıyıcılar) tartın. Sterilize etmek için 1,5 mL %70 etanol (EtOH) ekleyin. WP'leri vorteksleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin.
  2. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 13.200 x g'da santrifüjleyin. WP'leri partiküllere 1,5 mL steril su ekleyerek, girdaplayarak ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 13.200 × g'da santrifüjleyerek yıkayın. Süpernatanı atın.
  3. 500 μL steril% 50 gliserol ekleyin (nihai konsantrasyon 60 μg WP / μL'dir).
    NOT: WP'ler -20 °C'de en az 6 ay saklanabilir. Bu stoktan altı dönüşüm (100 μL) için gerekli miktarı alın.

2. WP'lerin DNA kaplaması

  1. 5 μg 2 μ plazmid ve mitokondriyal diziyi içeren 15 μg bakteri plazmidini buz üzerindeki bir mikrotüpe ekleyin.
    NOT: DNA kaplaması için gerekli reaktiflerin daha fazla seyreltilmesini önlemek için nihai hacim 50 μL'yi geçmemelidir.
  2. 100 μL WP süspansiyonu ekleyin ve 5 saniye boyunca girdap yapın (6 mg WP).
  3. 4 μL 1 M spermidin ekleyin. Kısaca girdap.
  4. 100 μL buz gibi soğuk 2.5 M CaCl2, kısaca girdap ekleyin. Buz üzerinde 10 dakika inkübe edin; Karışımı her 3 dakikada bir kısaca girdaplayın.
    NOT: CaCl2 çözeltisi filtre ile sterilize edilmiştir ve otoklavlanmamalıdır.
  5. WP'leri 4 ° C'de 13.200 × g'da 30 saniye santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Partikülleri -20 °C'de 200 μL %100 EtOH içinde nazikçe yeniden süspanse ederek yıkayın.
  6. WP'leri 4 ° C'de 13.200 × g'da 30 saniye santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Yıkamayı tekrarlayın.
  7. WP'leri bir pipet ucu kullanarak 60-70 μL oda sıcaklığında %100 EtOH'de yeniden süspanse edin; girdap yapmayın.
    NOT: Plazmitlerin kalitesini sağlamak için, DNA kaplaması biyolistik dönüşüm ile aynı gün yapılmalıdır.

3. Biyolistik materyal hazırlama

  1. Bombardımandan önce, altı makro taşıyıcı tutucuyu (Şekil 5) bir otoklavda sterilize edin ve iyice kurulayın. Alternatif olarak, onları EtOH'ye batırın ve forseps yardımıyla bir alev kullanarak sterilize edin. Onları steril bir cam tabağa koyun.
  2. DNA çökeltme sırasında (adım 2.4'te buz üzerinde 10 dakikalık inkübasyon), steril forseps yardımıyla altı makro taşıyıcı tutucunun her birine altı makro taşıyıcı (veya uçan disk) yerleştirin.
    NOT: Makro taşıyıcıları sterilize etmeyin.
  3. DNA kaplı WP'leri pipetle karıştırın. Her bir makro taşıyıcı yüzeye 10 μL WP ekleyin ve pipet ucu ile tüm yüzeye dağıtın. Gerekirse, WP'lerin eşit şekilde yayılmasını sağlamak için makro taşıyıcı yüzeyine birkaç ekstra mikrolitre %100 EtOH ekleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında ~ 20 dakika kurumaya bırakın.

4. Maya hücrelerinin ve bombardıman plakalarının hazırlanması

  1. Rho0 reseptör suşunu 2 mL YPR ortamına aşılayın (Tablo 2). Dönen bir tekerlekte 30 ° C'de bir gece büyütün.
  2. Kültürün 300 μL'sini 30 mL taze YPR ortamında seyreltin. Kültür doygun hale gelene kadar iki gece boyunca döner bir çalkalayıcıda 30 °C ve 200 rpm'de büyütün.
  3. Maya hücrelerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve maya hücrelerini 600 μL YPD ortamında yeniden süspanse edin (Tablo 2).
  4. Steril bir cam sap kullanarak, maya hücresi süspansiyonunun 100 μL'sini katı bir bombardıman ortamı plakasına yayın.
    NOT: Bombardıman ortamı, dönüşüm için kullanılacak 2 μ plazmitinin seçim işaretleyicisinden yoksun olmalıdır.
  5. Diğer beş plaka için adım 4.4'ü tekrarlayın.
  6. Sıvı ortamın plakanın yüzeyinde tamamen emildiğinden emin olmak için bombardımandan önce oda sıcaklığında 1-3 saat inkübe edin.

5. Biyolistik transformasyon ile sentetik bir rho-suş oluşturulması

NOT: Başlamadan önce, biyolistik ekipmanın kullanım kılavuzunu okuduğunuzdan emin olun. Referans verilen ekipmanın protokolünü açıklayacağız (Malzeme Tablosu ve Şekil 5).

  1. Kontaminasyonu önlemek için biyolistik partikül dağıtım sisteminin haznesini %70 etanol ile temizleyin ve en az 10 dakika bekletin. Bombardımandan hemen önce, yüzeyi temiz bir kağıt havluyla silin.
  2. Yaklaşık 2.000 psi'yi ayarlamak için helyum tankı valflerini açın.
  3. Ekipmanı açın ve vakum kaynağını açın.
  4. Forseps kullanarak, makro taşıyıcıyı makro taşıyıcı tutucusuna aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
    NOT: Ekipmanla birlikte gelen durdurma ekranını kullanmayın.
  5. Makro taşıyıcı kapağını makro taşıyıcının üstüne vidalayın. Tüm parçalar birlikte mikro taşıyıcı fırlatma sistemini oluşturur (Şekil 5).
  6. Mikro taşıyıcı fırlatma sistemini alttan beşinci seviyede vakum odasının içine yerleştirin.
  7. Rho0 suş çimini içeren plakalardan birini haznenin altından ikinci seviyeye yerleştirin. Plakanın yukarı baktığından ve kapaksız olduğundan emin olun.
  8. Steril forseps kullanarak, tutma kapağına bir yırtılma diski yerleştirin. Tutma kapağını hızlanma borusuna vidalayın; Tutma kapağının tam oturduğundan emin olun.
    NOT: Dönüşüm verimliliğinin düştüğünü gözlemlediğimiz için yırtılmış diskleri kılavuzda önerildiği gibi izopropanol ile tedavi etmeyin.
  9. Vakum odasının kapısını kapatın.
  10. VAC/VENT/HOLD anahtarını VAC konumuna getirin. 25-28 inHg vakuma ulaşıldığında, VAC/VENT/HOLD anahtarını HOLD konumuna getirin.
    NOT: Ulaşılabilir vakumun deniz seviyesine göre değişebileceğini unutmayın. 25 inHg'ye ulaşan başarı bulduk.
  11. WP'leri çekmek için FIRE anahtarına basın. Patlama diski kırıldığında 1.300 psi'ye ulaşana kadar hızlanma tüpünde basıncın oluşmasını bekleyin ve bir patlama sesi çıkarın.
  12. Yırtılma diski kırıldıktan hemen sonra, VAC/VENT/HOLD anahtarı HAVALANDIRMA konumuna getirilerek YANGIN anahtarı ve vakum serbest bırakılır.
  13. Dikkatlice, steril forsepslerle, plakanın yüzeyinde bulunan yırtılma diskinin kalıntılarını temizleyin ve plakayı kapağıyla örtün.
  14. Kalan beş plaka için prosedürü tekrarlayın, her turda yeni bir yırtılma diski ve makro taşıyıcı yerleştirin.
  15. Sonunda, helyum tankının ana valfini kapatın.
  16. Hazneyi kapatın ve VAC/VENT/HOLD anahtarını VAC konumuna getirerek bir vakum oluşturun. FIRE anahtarına birkaç kez basıp bırakarak sistemi herhangi bir helyum basıncından kurtarın. Kapı açıkken tekrarlayın.
  17. Vakum pompasını ve bombardıman ekipmanını kapatın.
  18. Dağıtım sistemini %70 EtOH ile temizleyin. Makro taşıyıcı desteklerini% 0.1 SDS çözeltisi ile yıkayın; steril damıtılmış su ve% 100 EtOH ile durulayın.

6. Sentetik rho-koloni seçimi

  1. Bombardıman plakalarını 30 ° C'de 5-7 gece inkübe edin.
    NOT: Plakaları kirlenme açısından günlük olarak kontrol etmek önemlidir. Gerekirse, daha fazla kontaminasyonu önlemek için kontamine bölge steril bir spatula ile kesilebilir.
  2. Zıt eşleşme tipindeki test cihazı suşunu gece boyunca 2 mL YPD ortamında aşılayın ( Şekil 2D, E'deki özel örneğe bakın).
  3. Test cihazı gerinim kültürünün 150 μL'sini bir YPD plakasına aşılayın. Steril bir cam sap kullanarak, test cihazını plaka yüzeyine eşit şekilde yayın. Plakayı en az 5 dakika kurumaya bırakın.
  4. Kadife çoğaltma pedleri ve bir çoğaltıcı damgası kullanarak bombardıman plakalarının kopyalarını yapın.
    1. Dönüştürülmüş 2 μ plazmid oksotrofi işaretleyicisine karşılık gelen bir bırakma orta plakası üzerinde çoğaltın. Büyüme, 30 ° C'de bir gece inkübasyon gerektirir. Daha sonra, daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklayın. Bu plaka ana plakadır.
    2. Adım 6.3'ten itibaren test cihazının çimini içeren YPD plakası üzerinde çoğaltın. 30 °C'de iki gece inkübe edin. Daha sonra, ilgilenilen mitokondriyal genin, örneğin solunum ortamının veya arginin içermeyen bir ortamın varlığını tespit etmek için bu plakayı seçici ortam üzerinde çoğaltın ve gece boyunca 30 ° C'de inkübe edin. Sadece mitokondride sentetik bakteri plazmidini barındıran hücreler, test edici suşu ile çiftleştikten sonra seçici ortamda büyüyecektir.
  5. Ana plaka üzerinde (adım 6.4.1) adım 6.4.2'de büyüyen karşılık gelen kolonileri tanımlayın.
    NOT: Bombardıman plakası (ve dolayısıyla ana plaka) dönüştürücü kolonilerle dolu olduğundan, test cihazının eşleşme plakasında gözlemlenen bu pozitif kolonileri tanımlamak zor olabilir. Bu nedenle, tüm plakaların her iki tarafına kalıcı bir işaretleyici ile birkaç küçük çizgi çizilmesi şiddetle tavsiye edilir. Çoğaltma damgasının halkasına da benzer çizgiler çizin. Bu çizgiler, ana plaka üzerindeki pozitif kolonilerin yönlendirilmesinde ve konumlandırılmasında yardımcı olacaktır ( Şekil 2D'deki örneğe bakın).
  6. Pozitif kolonileri, adım 6.4.1'de olduğu gibi, ana plakadan ikinci bir seçici bırakma plakasına çizerek saflaştırın. 30 °C'de iki gece inkübe edin.
    NOT: Saf bir suş sağlamak için çizginin tek kolonilerin büyümesine izin vermesi esastır.
  7. Mitokondride bakteri plazmidinin varlığını doğrulamak için seçim işlemini tekrarlayın (adım 6.2-6.5).
    NOT: Genellikle, stabil sentetik rho- suşları seçmek için bu işlem iki kez daha tekrarlanabilir.
  8. Sentetik rho-suş , plazmit DNA'yı mitokondride stabil bir şekilde koruduktan sonra, 3-5 farklı pozitif koloni seçin ve bunları 2 mL YPD içinde aşılayın. Bu kültürü, bir kriyoviyal stok hazırlamak (-70 °C'de korumak için 600 μL kültür ve 600 μL %50 gliserol karıştırarak) ve plazmit dizisini sitodüksiyon yoluyla ilgilenilen mtDNA'ya yerleştirmek için kullanın (adım 6.7).
    NOT: Mitokondride dönüştürülmüş plazmiti sentetik rho-suştan korumak için seçici bir baskı olmadığından, plazmit kolayca kaybolabilir. Bu nedenle, sitüldüksiyonu mümkün olan en kısa sürede yapmanızı öneririz.

7. Sentetik rho-suşta bulunan yapının sitokondriyal genomdaki hedef bölgeye sitodüksiyon yoluyla entegrasyonu

  1. İki tüpü 3 mL YPD ortamı ile, biri donör hücrelerle (sentetik rho hücreleri) ve diğeri alıcı hücrelerle (nihai yapının beklendiği maya hücresi) aşılayın. Gece boyunca 30 °C'de inkübe edin.
  2. 750 μL donör suşu ve 250 μL reseptör suşunu steril bir mikrotüpte (3: 1 oranında) karıştırın.
  3. Karışımı 1 dakika 13.200 × g'da santrifüjleyin; Süpernatanı atın. Ucu kesilmiş 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak, hücre peletinden bir damla alın ve bir YPD plakasına yerleştirin. 30 ° C'de 2-4 saat inkübe edin.
    NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için, tek bir plakaya ikiden fazla hücre süspansiyonu koymayın ( Şekil 4A'daki örneğe bakın).
  4. Hücre karışımından az miktarda alın, bir slayt üzerinde 15 μL steril su içinde tekrar süspanse edin ve bir kapak fişi yerleştirin. Işık mikroskobu altında 40x veya 100x objektifli shmoos'un varlığını kontrol edin; bu karakteristik şekil, iki çiftleşme türü mevcut olduğunda ortaya çıkar (Şekil 3B).
  5. Shmoos varsa, hücre kütlesinin küçük bir miktarını (~ 0.5 mm3) 2 mL YPD ortamında yeniden süspanse edin. Binükleer zigotların iyileşmesini sağlamak için dönen bir tekerlekte 30 ° C'de 2 saat inkübe edin.
  6. Karışımı vorteksleyin ve 10 μL hücre süspansiyonunu 990 μL steril suda (1:100 seyreltme) seyreltin. 100 μL hücre seyreltmesini yalnızca alıcı suşun (ve sporadik diploidlerin) büyüdüğü bir bırakma ortamına yaymak için cam boncuklar veya steril bir cam sap kullanın. 30 °C'de 2-3 gece inkübe edin.
  7. Elde edilen kolonileri, giriş bölümünde açıklandığı gibi gerekli seçici ortam üzerinde çoğaltın (aşama 4; belirli bir örnek için Şekil 4C'ye bakınız).
  8. Pozitif kolonilerin tanımlanmasından sonra, ilgilenilen mtDNA'yı taşıyan haploid suşu saflaştırmak için bunları aynı seçici ortam üzerinde yeniden canlandırın.
  9. En az iki pozitif koloni seçin ve bunları gece boyunca 30 ° C'de 2 mL YPD ortamında büyütün. 600 μL %50 gliserolü 600 μL doymuş YPD kültürü ile karıştırarak kriyojenik bir yedekleme yapın. -70 °C'de saklayın.
  10. Elde edilen suşların DNA'sını izole edin31,32. Mitokondriyal mutasyonun varlığını doğrulamak için istenen bölgeyi PCR ve sekans ile çoğaltın.
    NOT: Her pozitif koloni, mitokondriyal genomda doğru diziyi sağlamak için bağımsız olarak doğrulanması gereken teknik bir kopyadır.

Sonuçlar

Bu bölüm, mitokondriyal dönüşümün farklı aşamalarından bazı temsili sonuçlar sunmaktadır. Şekil 6'da bir bombardıman prosedürü gösterilmektedir. Sentetik rho hücreleri, bir mitokondriyal genin kodlama dizisinin yerini alacak olan raportör gen ARG8m ile bir bakteri plazmidi taşıdı (Şekil 6A). Bombardımandan sonra, plaka urasil (-URA) içermeyen bir ortam üzerinde çoğaltıldı; bu ana plakadır (Şekil 6B). Büyüyen koloniler, URA3 oksotrofi markörü ile maya ekspresyon vektörüne sahiptir. Protokol bölüm 6'ya göre, bombardıman plakası, test cihazı suşunun bir çimini içeren bir YPD ortamı üzerinde de çoğaltıldı. Bu durumda, test edici suşu, mitokondriyal genomda (ARG8m-1)1 ARG8m geninin kusurlu bir alelini barındırıyordu. 2 gecelik inkübasyondan sonra, test çimi ve dönüştürücü hücreler çiftleşti ve mitokondri kaynaştı. Bu plaka, arginin içermeyen bir ortam üzerinde tekrarlandı. Sadece mitokondriyal plazmid içeren diploidler bu seçici ortamda büyüyebildi, çünkü sentetik rho-suşta bulunan ARG8m geni, test edici suşun mitokondriyal genomundan kusurlu ARG8m-1'in yerini aldı.

Pozitif kolonilerin sayısı genellikle plaka başına sıfır ila 20 arasında değişir. Mevcut örnekte, dört pozitif sentetik rhokoloni elde edildi ve bunlar orta derecede eksik urasil üzerine çizilerek saflaştırıldı. İlk saflaştırma turunda, pozitif olanlarla birlikte birçok negatif koloni elde edildi. Bununla birlikte, iki veya üç tur saflaştırmadan sonra, saf pozitif sentetik rhosstrain elde etmek mümkündür. Şekil 6C'de, üç tur saflaştırma ve testten sonra birkaç pozitif sentetik rho-koloni gösterdik. -URA ana plakasından gelen çoğu koloni, test probu için pozitiftir. İlginç bir şekilde, pozitif bir koloninin tüm hücreleri mitokondriyal plazmidi içermez, bu da dönüştürülmüş plazmitin koloninin bir popülasyonunda kaybolduğunu gösterir. Mitokondriyal plazmidi tutmak için seçici bir baskı olmadığı için bu sonuç beklenir, bu da onu kararsız hale getirir. Bununla birlikte, Şekil 6C'de gösterilenler gibi bir sentetik rodos suşu, bir sonraki adım olan sitülasyona (protokol bölüm 7) götürülebilir ve -70 °C'de depolanacak stoğu hazırlamak için kullanılabilir. Şekil 6D ayrıca sentetik bir rodosun üçüncü saflaştırma turunu da göstermektedir. Bununla birlikte, bu durumda, dönüştürücüler mitokondriyal plazmiti pratik olarak koruyamadıkları için atıldılar.

Şekil 7A'da sunulan pozitif sentetik rhokolonileri seçmek için genel bir strateji tanımladık. Bu durumda, sentetik rho- hücrelerinde bulunan mitokondriyal yapı, test edici suştan mitokondriyal DNA ile yeniden birleşmek için birkaç yüz nükleotite sahiptir (örneğin, sentetik rho- suştaki COX1ΔC15 yapısı, test cihazının mitokondriyal DNA'sı üzerindeki mutasyona uğramış gen cox1D369N ile yeniden birleşir (Şekil 2D); veya mutasyona uğramış gen ARG8 ile sentetik rho- suştaki cox1Δ::ARG8 m yapısıtest cihazının mitokondriyal DNA'sında m-1 (Şekil 6A). Bununla birlikte, ilgilenilen pozitif sentetik rho- hücreleri seçmek için bir test cihazı suşu mevcut değilse, bunları seçmek için dolaylı bir yaklaşım vardır33. Bu durumda, bakteri plazmidi ayrıca COX2 veya COX3 gibi bir mitokondriyal genin bir parçasını içermelidir.Test edici suşu, mitokondriyal cox2 veya cox3 geninin işlevsel olmayan bir kopyasını içerir. Verilen örnekte, bakteri plazmidinde bulunan cox3 fragmanının dizisi, test cihazının mitokondrisinde bulunan cox3 dizisini tamamlayabilir ve rekombinasyondan sonra fonksiyonel bir COX3 geni sağlayabilir. Sentetik rho- hücreleri test edici suşu ile çaprazladıktan sonra, diploidler ancak sentetik rho- hücreleri mitokondri içinde bakteri plazmidi içeriyorsa solunum yapabilir (Şekil 7B).

Şekil 8 , sitodüksiyon sürecini örneklemektedir. Donör ve alıcı suşlar sırasıyla lösin ve adenin oksotrofisine sahiptir. Bu nedenle, sitodüksiyondan sonra, karışım, donör hücrelerin büyümesini önleyen, lösin içermeyen bir ortam üzerine kaplandı. Bu ana plakadır. Bu noktada, sadece alıcı suşun nükleer arka planına sahip haploidler ve sporadik diploidler büyüyecektir. Diploidleri ekarte etmek için, ana plaka, yalnızca diploidlerin büyüyebileceği adenin içermeyen ortamlarda çoğaltıldı. Bu örnekte, sitodüksiyondan sonra ortaya çıkan mitokondriyal DNA mutasyona uğrar ve amaçlanan haploidler, etanol/gliserolün solunum ortamında büyüyemez. Bu nedenle, ana plakanın, bir test cihazı suşunun çimi ile YPD plakaları üzerinde çoğaltılması gerekir. Pozitif solunum diploidlerinin konumu, ana plakadan hangi kolonilerin saflaştırılacağını gösterir. Nihai, saf suşu elde etmek için iki tur saflaştırma gereklidir. Mitokondriyal entegrasyon genellikle çevredeki ilgilenilen bölgenin PCR amplifikasyonu ve dizileme ile doğrulanır.

Son olarak, genler mitokondriyal genomdaki spesifik lokusa yerleştirilebilir. Örneğin, raportör genler, diğer seçeneklerin yanı sıra bir mitokondriyal genin kodlama dizisinin 3' ucuna yerleştirilebilir veya mitokondriyal genin kodlama bölgesini değiştirebilir (Şekil 9A). Bununla birlikte, genler, mitokondriyal genomun kodlamayan bölgelerindeki ektopik bölgelere de yerleştirilebilir. Yaygın olarak kullanılan bölge, COX2 geninin başlangıç kodonunun 295 nt yukarısıdır. Bu kodlamayan bölgedeki değişiklik zararsızdır13. Ektopik bölgedeki geni başarılı bir şekilde ifade etmek için, bir mitokondriyal promotör ve sonlandırıcı ile kuşatılmalıdır. COX2, en kısa 5' ve 3' çevrilmemiş dizilere sahip mitokondri geni olduğundan, COX2 yan dizileri en uygun olanlardır (5' UTR'nin 73 nt'si ve 3' UTR'nin 119 nt'si) (Şekil 9B). Bu yapı için, bakteri plazmidi aşağıdaki özelliklere sahiptir: şablon, pXPM2 1120 olarak adlandırılan, durdurma kodonunun aşağı akışında 1120 nt ve AUG başlangıç kodonunun 670 nt yukarı akışında olmak üzere COX25 kodlama bölgesini içeren bir plazmittir. İlgilenilen gen, COX2 5'-UTR'nin 73 nt'si ve COX2 3'-UTR'nin 119 nt'si ile çevrili olacak şekilde tasarlanmıştır. Daha sonra, daha önce belirtildiği gibi, kodlamayan bir bölge olan COX2 AUG başlangıç kodonunun 295 nt yukarı akışında yerleştirildi (Şekil 9B). Bu plazmidin ve sonuç olarak ortaya çıkan mitokondriyal genomda COX2 5' ve 3' UTR'lerin kopyalandığına dikkat edin. Bu plazmidin bombardımanından sonra, sentetik rho-hücreler, COX2 bölgesinin (cox2-62 aleli) geniş bir delesyonuna sahip bir reseptör suşu ile sitodüksiyon için eşleştirilir1. Sitüldüksiyon sırasında, sentetik rho-suşun mitokondriyal plazmidi, alıcıdan gelen mitokondriyal DNA ile yeniden birleşir. Elde edilen mitokondriyal genom, ektopik yapıya ve bir WT COX2 genine sahiptir. Bu nedenle, pozitif koloniler bir solunum ortamında büyüyebilecektir (Şekil 9B).

Mikro taşıyıcılar fırlatma sistemi şeması, helyum basınç ayarı, numune plakası, hızlanma tüpü.
Şekil 5: Yüksek hızlı mikromermi bombardıman ekipmanının şematik gösterimi. Laboratuvarımızda Biolistic-PDS-1000/He Partikül Taşıyıcı Sistem (Malzeme Tablosu) kullanılmaktadır. Kısaltma: WP'ler = tungsten parçacıkları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sentetik mtDNA'da ARG gen işlevselliğini gösteren maya transformasyon diyagramı ve petri kabı sonuçları.
Şekil 6: Yüksek hızlı bir mikromermi dönüşüm plakası örneği. (A,B) Bombardımandan sonra plakalar 30 °C'de 5-7 gece inkübe edildi. Bir kirletici büyürse (mavi okla gösterilir), steril bir spatula ile kesilebilir. Plakaları seçim işaretleyici ortamı (bu durumda -URA) üzerinde çoğalttıktan sonra, ana plaka ayrıca bir test cihazı suşu ile eşleşerek mitokondriyal plazmitin varlığı açısından test edildi. Bu durumda, test cihazı suşu, işlevsel olmayan alel ARG8m-1 1'e sahiptir. 2 gece çiftleştikten ve plakayı orta derecede arginin (-ARG) içermeyen bir ortam üzerinde çoğalttıktan sonra, dört pozitif koloni ortaya çıktı (kırmızı oklarla gösterilir). (C) Pozitif sentetik rhokoloniler , -URA ortamı üzerinde dinlendirilerek saflaştırıldı ve daha önce tarif edildiği gibi replika testi yapıldı. Bu plakalar üçüncü saflaştırma turunu temsil eder. (D) Bazı pozitif sentetik rho- koloniler mitokondriyal yapıyı kaybetti. Kısaltmalar: mtDNA = mitokondriyal DNA; -URA = urasil eksikliği; -ARG = arginin eksikliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bakteriyel plazmid entegrasyon süreç diyagramı; mtDNA'ya gen transferi; Genetik mühendisliği kavramı.
Şekil 7: Bombardıman sonrası pozitif sentetik rhokolonilerin nasıl seçileceğini gösteren diyagram. (A) Bakteri plazmidi, bir mitokondriyal genin işlevsel olmayan mutasyona uğramış bir versiyonunu içerir. Tespit için, sentetik rhokoloniler, mitokondriyal DNA'da aynı genin farklı bir işlevsel olmayan mutasyonunu içeren bir test edici suşla eşleştirilir. Çiftleşmeden sonra, mutant mtDNA'lar yeniden birleşir ve fonksiyonel bir gen, tamamlama yoluyla geri kazanılabilir. Burada diploid, ne sentetik rho-suşun ne de test cihazının büyüyemeyeceği seçici bir ortamda büyür. (B) Bu durumda, plazmit ek bir mitokondriyal gen dizisi (yani bir COX3 parçası) içerir. Dönüşümden sonra, sentetik rho-suşu, test cihazı suşundaki bir COX3 mutasyonunu tamamlama kabiliyeti ile seçilir, böylece seçici bir ortamda (yani solunum ortamı) yalnızca diploidler büyüyebilir. Bu yöntem, ilgilenilen gen için bir test edici suşu mevcut değilse kullanışlıdır. Bu durumda pozitif sentetik rho-kolonilerin tespiti dolaylıdır. Kısaltma: mtDNA = mitokondriyal DNA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Petri kabı deneyi; sitodüksiyon süreci; maya büyüme gözlemi; genetik transfer değerlendirmesi.
Şekil 8: Mitokondriyal DNA'daki hedef lokusa bir yapıyı entegre etmek için sitoksiyon örneği. Çiftleşme ve iyileşmeden sonra, karışık hücreler ve binükleer zigotlar, lösin içermeyen bir ortam üzerine kaplandı. Bu durumda, donör suşu leu2,3-112 aleline sahip olduğundan, bu besiyeri donör büyümesini engeller. Bu plaka, aynı ortamda (ana plaka), yalnızca diploidlerin büyüyebileceği bir ortamda (-ADE) ve amaçlanan mutasyona sahip alıcının büyüyebileceği bir ortamda (kırmızı oklar) çoğaltıldı. Bu durumda ne donör ne de reseptör hücreleri solunum ortamında büyüyemez. Sadece bir test cihazı suşunun bir çimi ile çiftleştikten sonra ortaya çıkan diploid, bir solunum ortamı üzerinde büyüyebilir. Bu solunum yapan diploid koloniler, ana plakadan pozitif kolonilerin seçilmesi ve saflaştırılması için bir kılavuzdur. Kısaltmalar: -LEU = lösin eksikliği; -ADE = adenin eksikliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sentetik rho donörü ile mtDNA alıcı sürecine mitokondriyal gen transfer diyagramı.
Şekil 9: Mutasyona uğramış mitokondriyal yapının (sentetik rho-suşta bulunan) alıcı suşa nasıl entegre edileceğini gösteren diyagram. (A) Bu örnekte, alıcı suş, ilgilenilen genden kodonların yerini alan ARG8m raportör genini taşır. Sentetik rho-DNA, bu genin mutasyona uğramış bir versiyonunu içerir. Plazmit ve mitokondriyal DNA, 5' ve 3' yan bölgeler boyunca yeniden birleşir ve ARG8m raporlayıcısı, ilgilenilen genin mutasyona uğramış dizisi ile değiştirilir. (B) Yabancı genler, mitokondriyal genomun belirli bölgelerine ektopik olarak yerleştirilebilir 7,13,36. Bu örnekte, bir gen, COX2 geninin 295 nt yukarısındaki bir pozisyonda tanıtılabilir. Bu, mtDNA'nın kodlamayan bir bölgesidir. İlgilenilen yabancı bir gen, COX2 5' UTR ve 3' UTR'nin sırasıyla 73 nt ve 119 nt'si ile çevrilidir. Bu yapı, COX2 geni artı 5' ve 3' UTR bölgelerinin 670 nt ve 1120 nt'sini içeren bir plazmide yerleştirilir. Sentetik rho-suş (donör) bu yapıyı mitokondride taşır. Bu durumda, alıcı suş (XPM13)7, cox2 geninin (alel cox2-62)1 önemli bir silinmesine sahiptir. Sitodeksiyondan sonra, donör ve alıcıdan gelen mitokondriyal DNA yeniden birleşir. COX2 geni restore edilir ve ilgilenilen gen ektopik bölgeye yerleştirilir (COX2 geninin 295 nt yukarısında). Kısaltmalar: mtDNA = mitokondriyal DNA; nt = nükleotidler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Maya suşuGenotipREF
NAB69 SerisiMata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
NB71 SerisiMatα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
XPM209 SerisiMatα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199 SerisiMata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
XPM13 SerisiMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
L45 SerisiMatα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)28

Tablo 1: Biyolistik transformasyon ve sittodüksiyonda kullanılan maya suşu örnekleri.

Büyüme ortamıBileşen
YPD (YPD)%2 Glikoz, %2 baktopepton, %1 maya özü
YPR (Türkçe)%2 Rafinoz, %2 baktopepton, %1 maya özü
YPEG*%3 Gliserol, %3 etanol*1, %2 baktopepton, %1 maya özü
Bırakma medyası%2 Glikoz, %6,8 Maya azot bazı (NH4)2S04, bırakma amino asit karışımı*2
Bombardıman medyası%5 Glikoz, (NH4)2S04, 1 M sorbitol ile %6,8 maya azot bazı, damla amino asit karışımı*2,3.
*1 Ortam sıcakken otoklavladan sonra etanol ekleyin.
*2 Amino asit karışımının miktarı, mevcut stoklara veya üretici tarafından belirtilen miktara göre değişebilir.
*3 Bombardıman ortamı için, maya suşuna bağlı olarak gerektiği kadar amino asitleri ve nitrojen bazlarını ekleyin. Bileşimin, seçim için kullanılan 2μL plazmit üzerindeki oksotrofi için spesifik olduğundan emin olun.

Tablo 2: Bu protokolde kullanılan maya büyüme ortamı.

Tartışma

Bu çalışma, S. cerevisiae mayasından mitokondrinin nasıl başarılı bir şekilde dönüştürüleceğini açıklamıştır. Yüksek hızlı mikromermi bombardımanından amaçlanan maya suşunun saflaştırılmasına kadar olan süreç, sentetik rho-suşun kaç tur saflaştırılmasının gerekli olduğuna bağlı olarak ~ 8-12 hafta sürer. Yöntemin kritik adımlarından bazıları aşağıdaki gibidir. İlk olarak, mitokondriyal gen yapısındaki mutasyon bölgesinin etrafına eklenen yan bölgeler ne kadar büyükse, hedef mutasyonun başarılı bir şekilde entegre olma olasılığı o kadar yüksek olur. Yan bölgelerin minimum boyutu ~ 100 nt'dir; Bununla birlikte, mutasyonun her iki tarafında 500'den fazla nt kullanılması şiddetle tavsiye edilir. İkincisi, dönüşümden sonra sentetik rho kolonilerini seçerken, 3-4 turdan fazla saflaştırma yapılmaması önerilir; Aksi takdirde, plazmidi mitokondride tutmak için seçici bir baskı olmadığından, sonunda mitokondriyal yapının kaybolma riski yüksektir. Üçüncüsü, kullanıcıya veya ekipmana zarar vermemek için, işleme başlamadan önce bombardıman makinesinin kılavuzunu dikkatlice okumalısınız. Bu ekipman hassastır ve yüksek basınç ve vakum kullanır.

Bu prosedürün bir sınırlaması, şimdiye kadar sadece maya ve yeşil algler C. reinhardtii'nin bu yöntemle mitokondriyi dönüştürmeye aday olmasıdır. Diğer organizmalardan mitokondriyal genom üzerinde bölgeye yönelik mutasyonlar tanıtabilirsek uygun olacaktır. Diğer bir sınırlama, aynı oturumda birçok farklı yapıyı dönüştürmenin zor olmasıdır. Her yapı için her biri test edilmesi, seçilmesi ve saflaştırılması gereken altı dönüşüm yapılması önerilir. Bu, yalnızca tek bir mitokondriyal mutasyonun saf rhokolonilerini elde etmek için 50'den fazla medya plakası ile sonuçlanır.

Bu sınırlamalara rağmen, maya mitokondriyal genomunu manipüle etme yeteneği, solunum kompleksleri biyogenezinin birçok yolunun anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Bu yaklaşım, mitokondriyal translasyonu izlemek ve ölçmek için raportör genleritanıtmak 1,7,36,37, mitokondriyal genleri kesmek 38, solunum komplekslerinin montaj şaperonlarını tanımlamak39, birleştirilmiş mitokondriyal translasyon ve montaj mekanizmalarını daha iyi anlamak için kullanılabilir 7,11,12,36ve mutasyona uğramış bir mitokondriyal genin40 ekspresyonunu takip ederken baskılayıcıları arayın. Şimdiye kadar, memelilerde mitokondriyal genomu manipüle etmek için bazı yaklaşımlardaha önce bildirilmiş olsa da, bu organizmalar için mitokondriyal DNA'yı dönüştürmek için yaygın bir yöntem yoktur.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu yayın, Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 to XP-M] tarafından desteklenmiştir. UPD bir CONAHCYT üyesidir (CVU:883299). Işık mikroskobu görüntüleriyle ilgili teknik yardım için Dr. Ariann Mendoza-Martínez'e teşekkür etmek istiyoruz. Biorender lisansları: DU26OMVLUU (Şekil 2); BK26TH9GXH (Şekil 3); GD26TH80R5 (Şekil 4); PU26THARYD (Şekil 7); ML26THAIFG (Şekil 9).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL pipet uçlarıAxygenT-1000-B
1,5 mL MikrotüpAxygenMCT-150-C
10 & mu; L pipet uçlarıAxygenT-10-C
15 mL konik tabanlı boru AxygenSCT-25ML-25-S
200 & L pipet uçlarıAxygenT-200-Y
50 mL konik alt ve nbsp tüpAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
AgarozSeaKem50004
Analitik dengeOHAUSARA520
OtoklavTOMYES-315
Bacto agarBD214010
Bacto peptonBD211677
Biyolisitik Makrotaşıyıcı tutucu BIO-RAD1652322
Bunsen brülörVWR89038-528
Kalsiyum klorürFisher ScientificC79-500
CSM -ADE FormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormedium
Kültür cam şişesiKIMAX KIMBLE25615
Kültür cam tüpPyrex9820
DekstrozBD215520
EtanolJT Fırıncı 9000
ForsepsKırlangıç620006
Cam boncuklarSigmaZ265926
Cam sapSigmaS4647
GliserolJT BAKER2136-01
Helyum tankı sınıf 5 (% 99,99)-
HSTaq  KitPCR BIO
Mikrosantrifüj Eppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
Orbital çalkalayıcıNew Brunswick bilimselNB-G25
PCR tüpleriAxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM Biyolistik Parçacık Dağıtım SistemiBIO-RAD165-2257
Petri kapları (100X10)BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RafinozFormediumRAF03
Replika platerSciencewareZ363391
Yırtılma diskleri 1350 psiBIO-RAD1652330
SorbitolSigmaS7547
SpermidinSigmaS0266
T4 DNA LigazTermo BilimselEL0011
Doku Kültürü DöndürücüThermo Scientific88882015
Tungsten mikro taşıyıcılar M10BIO-RAD1652266
100L / dak kapasiteli vakum pompası-
Kadife pedlerBel-ArtH37848-0002
Girdap Scientifc IndustriesSI-0236
Ahşap aplikatör çubuğuPROMA1820060
Maya özüBD212750
Maya Aminoasit içermeyen azot bazıBD291920
DCS0169

Kaynaklar

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Saccharomyces cerevisiaeMitokondriyal TranslasyonBiyolistik Bombard manMitoribozom FonksiyonuOksidatif FosforilasyonMitokondriyal Genom D zenlemeMaya Mitokondrileri

İlgili makaleler