Bu protokol, bir sıçan modelinde optimize edilmiş iki aşamalı kollajenaz karaciğer perfüzyon tekniği sunar ve in vitro uzun süreli 3D organoid kültürü için izole hepatositlerin kullanımını gösterir.
Yöntem makalesi
Sıçan Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepatosit İzolasyonu: Son Teknoloji 3D Organoid Kültürü İçin Çok Önemli Eski Bir Prosedür
Bu makalede
Özet
Özet
Primer hepatositler, in vitro karaciğer ile ilgili çalışmalar için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Bununla birlikte, kültürdeki hızlı morfoloji, canlılık ve işlevsellik kaybı nedeniyle bu hücrelerin bakımı her zaman bir zorluk olmuştur. Uzun vadeli kültüre yeni bir yaklaşım, karaciğerin kendini yenileme konusundaki muhteşem yeteneğine dayanan bir tabaktaki dokuları özetleyebilen bir in vitro araç olan üç boyutlu (3D) organoidlerin üretilmesidir. Yayınlanmış protokoller, primer erişkin hepatositlerden (Hep-Orgs) uzun süreli fonksiyonel 3D organoidler elde etmek için tasarlanmıştır. 3D organoid son teknoloji araç, hücreleri yetişkin dokusundan izole etme yeteneği gerektirir ve bu ilk adım, yüksek kaliteli bir nihai sonuç için çok önemlidir. 1970'lerde tanıtılan iki aşamalı kollajenaz perfüzyonu, tek hepatositler elde etmek için hala geçerli bir prosedürdür. Bu makale, cerrahi prosedürün tüm önemli adımlarını tanımlamayı ve böylece sıçan modelinde primer hepatosit izolasyon prosedürünü optimize etmeyi amaçlamaktadır. Ayrıca, başarılı prosedürlerin olasılığını artırmak ve yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için PREPARE yönergelerine özellikle dikkat edilir. Ayrıntılı bir protokol, araştırmacıların birincil yetişkin sıçan hepatositlerinden 3D organoidler oluşturmak için aşağı akış çalışmasını hızlandırmasına ve optimize etmesine olanak tanır. 2D hepatositlerle karşılaştırıldığında, Hep-Org'lar hala yaşayabilir ve 15. günde aktif proliferasyondaydı ve uzun vadeli bir potansiyel gösterdi.
Giriş
Primer hepatositler, in vitro karaciğer ile ilgili çalışmalar için önemli ve yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Bununla birlikte, kültürde birkaç gün geçirdikten sonra morfolojilerini ve işlevselliğini kaybettikleri için genişlemeleri ve bakımları tarihsel olarak zor olmuştur1. 2D kültür, özellikle poligonal bir şekle ve farklılaşmış apikal ve bazolateral membranlara sahip polarize yapıya sahip hepatositler için sınırlayıcı bir durumdur. Aslında, hepatositlerin plakaya yapışması normal aktivitelerine müdahale eder, çünkü hücreler arasında ve hücreler ile hücre dışı matris (ECM) arasında sınırlı etkileşime sahip düz bir hücre iskeletine yol açar, polarizasyonu ve ilgili sinyal yollarını azaltır2.
Bu yöntemin sınırlamalarını aşmak için, Dunn ve meslektaşları3 önce kollajen çift tabakasını kullandılar. "Sandviç kültürü yöntemi" olarak bilinen bu kültür yöntemi, matrisin iki tabakası arasındaki birincil hepatositlerin tohumlanmasına dayanır. Bu yöntemin, uzun süreli kültür, poligonal morfolojinin sürdürülmesi ve taze izole edilmiş hepatositlerinkiyle karşılaştırılabilir transkripsiyonel aktiviteler dahil olmak üzere birçok avantajı vardır4. Aynı prensibe dayanan, alt tabakanın Matrigel'den oluştuğu, kollajen kaplamasının ise iyi kurulmuş bir kanaliküler ağın varlığını kanıtlamıştır5.
Hepatosit büyümesi için sandviç kültür yönteminin güvenilirliğine rağmen, bu çalışma, bir tabaktaki dokuları özetlemek ve kişiselleştirilmiş tıbba doğru potansiyel bir köprü oluşturmak için kullanılan bir in vitro araç olan 3D organoid kültürün kurulmasını, hastalığa özgü biyolojik içgörülerin üretilmesine, moleküler hedeflerin belirlenmesine, ilaçların test edilmesine, biyobankaların kurulmasına ve çip üzerinde organ gibi yenilikçi teknolojiler için yeni ufuklar açılmasına izin vermeyi dört gözle beklemektedir6. Birincil hepatositler, kubbelerin içinde organoidlerin sağlam bir şekilde büyümesine izin vermek ve hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve epidermal büyüme faktörü (EGF) dahil olmak üzere çözünür faktörlerin kültür ortamından akışını garanti etmek için "kubbeler" olarak bilinen yarım küre matris damlacıklarına gömüldü. Bu büyüme faktörleri, hepatositlerin hayatta kalmasını sağlamak için sinyal yollarını doğrudan aktive eder7. Karaciğer organoidleri genellikle embriyonik aşamalardan veya yetişkin sıçanlardan, farelerden, insan (ve ayrıca köpekler ve kediler) karaciğerinden izole edilen kök/progenitör hücrelerden elde edilir8. 3D konformasyon, kök hücrelerin yetişkin hepatositlere farklılaşmasını iyileştirse bile, bu araç hala orijinal birincil dokununolgunluğundan yoksundur 9. Bu sorunun üstesinden gelmek için, 2018'de iki farklı grup 9,10 aynı anda yetişkin birincil fare hepatositlerinden (Hep-Orgs olarak anılır) başlayarak uzun vadeli bir 3D karaciğer organoidleri kültürü elde etmek için bir protokol yayınladı. Protokolleri, karaciğer rejenerasyonunun proliferatif hasar yanıtını, parsiyel hepatektomi sonrası ortaya çıktığı gibi yüksek düzeyde inflamatuar sitokin ile büyüyen hepatositleri özetlemektedir. Gerçekten de, yukarıdaki çalışmalar, hepatositlerin yaralanmayı12 takiben veya kolanjiyosit proliferasyonu baskılandığında13 duktal duruma geçebileceğini göstermektedir. Bipotent kapasiteleri, organoidler gibi karmaşık yapılar için önemli olan hücresel plastisiteye izin verir. Bu nedenle, bu protokoller primer hepatositlerin in vitro olarak genişletilememesi sorununun üstesinden gelir.
3D organoid son teknoloji araç, hücreleri yetişkin dokusundan izole etme yeteneği gerektirir ve bu ilk adım, yüksek kaliteli bir nihai sonuç için çok önemlidir. 3D organoid preparasyonu yeni ve gelişmekte olan bir teknik olarak kabul edilebilirken (organoid tanımı sadece on yıl önce Lancaster14 ve Huch15 tarafından icat edildiği için), iki aşamalı kollajenaz perfüzyonu, 1970'lerde Seglen tarafından tanıtılan eski bir prosedürdür16. Alandaki en son yayınlara odaklanarak, Ng17 ve Shen18'in protokolleri, fareler için Cabral19 ve Charni-Natan20'nin protokolleri sıçanlarda prosedürü gerçekleştirmek için altın standart olarak kabul edilebilir. Araştırmacıların, 3D organoidleri geliştirmek için en iyi hücre dışı matrisi (ECM) ve büyüme faktörlerini seçmeye odaklanmaları, ancak yanlış cerrahi prosedür, düşük hepatosit canlılığı ve verimi veya yüksek düzeyde bakteriyel kontaminasyon gibi başarısızlıklarla karşılaşmaları alışılmadık bir durum değildir. Bu problemler, aşağı akış deneylerini uzatır ve sonraki deneyler için gereken hayvan sayısını artırır. Tersine, cerrahi ve izolasyon prosedürleri iyi kurulmuşsa, elde edilen yüksek sayıda canlı hepatosit, çok sayıda organoidin hazırlanmasına izin verir, böylece hayvanların kullanımını sınırlar. Mevcut protokol esas olarak ticari çözümler kullanarak ve karaciğer in situ ile optimal perfüzyon ve sindirim adımlarını sağlayan hassas bir portal ven kanülasyonunu optimize ederek bu sorunları ele almaktadır.
Hayvan araştırmalarımızın kalitesini, tekrarlanabilirliğini ve tercüme edilebilirliğini geliştirmek için PREPARE yönergelerini dikkatlice değerlendirdik: Hayvanlar Üzerinde Araştırma ve Deneysel Prosedürlerin Planlanması: Mükemmellik için Öneriler21. Bu raporlama yönergeleri, planlama yoluyla başarı olasılığını artırmaya çalışır ve Russel ve Burch'un 3R'lerinin (değiştirme, azaltma ve iyileştirme) uygulanmasında önemli bir adımı temsil eder. PREPARE kılavuzu, her bir araştırma projesine göre ele alınması gereken 15 ana konuyu kapsamaktadır. Projenin planlanması ve hazırlanması sırasında odaklandığımız konuları anlatacağız.
Bu çalışma, araştırmacıların aşağı akış çalışmasını hızlandırmalarına ve optimize etmelerine izin vermek için sıçan modelindeki cerrahinin önemli adımlarını kapsamlı, ayrıntılı ve sonuç olarak ortaya çıkan bir protokolde tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu protokollere ilk başta yaklaştığımızda, tekniğin başarısını kolayca etkileyebilecek bakteriyel kontaminasyon, düşük karaciğer sindirim etkinliği, düşük primer hepatosit verimi ve düşük hepatosit canlılığı sorunları yaşadık. Kritik özelliklerin nasıl ele alınacağını ve çözüleceğini gösteren bu protokol, birincil sıçan hepatosit izolasyonu prosedürünü optimize etti. Sıçan karaciğer perfüzyonu ve müteakip primer erişkin hepatosit izolasyonu, farklı uygulamalar için ana ön adımlardır. Özellikle, bu protokol, yüksek kaliteli ve yüksek canlılığa sahip yetişkin hepatositlerin iyi bir verimini gerektiren tüm prosedürler için uygundur. Protokol sonuçları, karaciğer fizyolojisi ve patolojisini incelemek için in vitro modeller oluşturmak için uygundur.
Protokol
Tüm prosedürler ve hayvan barınağı, İtalyan Hukuku ve Avrupa Topluluğu direktifinin yönergelerine göre yürütülmüştür. Deney protokolü, yerel Hayvan Bakım Komitesi ve İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından 26/2014 sayılı kararnamenin 31. maddesine göre (izin no/321/2022-PR) onaylanmıştır.
1. Hayvan prosedürü için hazırlık
NOT: Ortam ve tampon bileşimi için lütfen Tablo 1'e ve ticari ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
- Su banyosunu 42 °C'de ısıtın ve ardından Perfüzyon tamponunu ve 1x PBS'yi yaklaşık 20 dakika su banyosuna yerleştirin.
NOT: Enzim duyarlılığı nedeniyle, Sindirim tamponu yalnızca Perfüzyon prosedürü başarıyla başlatıldığında ısıtılır. Perfüzyon prosedürü sırasında, çözeltileri su banyosunda tutun. - William'ın tam ortamını ve PBS +% 3 P / S'yi buzun üzerine yerleştirin.
- Peristaltik pompayı hazırlayın ve boruyu, her ikisi de Perfüzyon tamponu ile doldurulmuş cam şişe ve kabarcık kapanı ile bağlayın.
- Pompayı doldururken, havayı çıkarmak ve kalan etanolü yıkamak için boruyu ılık Perfüzyon tamponu ile doldurun (düşük pompa hızı). Bu adım, pompanın doğru çalışıp çalışmadığını ve olası boru sızıntısını kontrol etmek için de önemlidir.
2. Hepatosit izolasyonu için hazırlık
- Hayvan prosedürü sırasında, aşağıdaki aletleri UV ışığına maruz bırakın: Petri kabı 100 mm, hücre süzgeci 100 μm, sıyırıcı boyutu M, büyük cımbız, buz için beher, buz tepsisi.
3. İlk hayvan prosedürü ve anestezi
- Yetişkin sıçanı (250-350 g vücut ağırlığı; 10-12 haftalık) anestezik karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezik hale getirin (ksilazin için son konsantrasyon: 22.5 mg / kg; ketamin için: 112.5 mg / kg; yaklaşık son hacim: 0.8-1.0 mL).
- Sıçan artık zararlı uyaranlara cevap vermeyene kadar ayak parmağınızı sıkıştırarak anestezi derinliğini izleyin. Genellikle 5 dakika sürer. Anestezik doz, işlem sırasında acı veya sıkıntı riskini en aza indiren derin, cerrahi anestezi sağlar
NOT: Kan kaybı, bu deneyde kullanılan ikincil sıçan ötenazi yöntemidir ve hayvanın etkili bir şekilde ötenazi yapılmasını sağlar. - Ameliyat sırasında bakteriyel kontaminasyonu azaltmak için karnı tıraş edin ve %70 etanol ile temizleyin.
NOT: Bu hayatta kalmayan bir ameliyattır, bu nedenle tam asepsi sürdürülmez. - Fareyi diseksiyon tepsisinin ortasına yerleştirin ve uzuvları iğneler kullanarak sabitleyin.
- Alt karnın merkezinden göğüs kafesine kadar deri ve kas boyunca U şeklinde bir kesi yapın, cildi sıkıştırın ve bağırsakları açığa çıkaracak şekilde başa doğru katlayın.
- Bağırsakları dikkatlice hayvanın sol tarafına, karın boşluğundan dışarı doğru hareket ettirin ve hepatik portal ven ve vena kava'yı açığa çıkarın.
- Pense kullanarak portal damarın altından bir pamuk ipliği geçirin ve damarın kendisini çevreleyen 1 cm olmak üzere 2 düğüm hazırlayın.
NOT: Siyah bir ipliğin görselleştirilmesi daha kolaydır. - Kan pıhtılaşmasını önlemek için 1x PBS'de (toplam hacim 300 μL) çözünmüş 100-150 IU heparini vena kavaya enjekte edin.
4. Kanülasyon ve karaciğer perfüzyonu
- Pompayı düşük hızda (1 mL/dk'dan az akış) açın.
- 18 G anjiyokatı, damara göre düz bir açıyla iplik seviyesinde portal damara yerleştirin.
- Kanülü damarda bırakmak için iç iğneyi manuel olarak çıkarın. İçine kan akacak, tapayı dolduracak ve bir sonraki adımda sıkışmış hava kabarcıklarını önleyecektir.
- Perfüzyon tamponu tüpte akarken, bir Luer kilit konektörü kullanarak C düğmesine basarak kanülü çıkış ucuna bağlayın.
- Bu noktada, tüpü doğru pozisyonda stabilize etmek için damara girmeden önce düğümleri biri damar içindeki kateterin etrafına ve diğeri kateterin etrafına bağlayın.
- Kanın çıkmasına izin vermek için vena kava'yı kesin. Karaciğerin 2-3 saniye içinde hızlı bir şekilde (saniye) şişmeye ve ağartmaya başladığından emin olun. Bu, perfüzyon tamponunun karaciğerden doğru şekilde aktığını doğrular.
NOT: Bazı loblar kırmızı kalırsa, anjiyokateter çok derine yerleştirilmiştir. Sadece kırmızı lekeler varsa, karaciğere hafifçe vurmak belirli noktalarda perfüzyona yardımcı olabilir. Kanı hareket ettirmeye yardımcı olmak ve sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için açık karın üzerine biraz 1x PBS dökün. - Pompa akışını yavaşça 10 mL / dk'ya yükseltin ve karaciğerin kandan temizlenmesini sağlamak için en az 10 dakika koruyun.
- Perfüzyon sırasında, vena kavaya bir pamuklu çubuk ile 10 saniye aralıklarla baskı uygulayın: Karaciğerin klempleme sırasında şiştiğinden ve serbest bırakıldığında gevşediğinden emin olun. Basıncı periyodik olarak (5-10 kez) tekrarlayın ve karaciğer şişmesi ve gevşemesi olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Bu adım, perfüzyonu gözle görülür şekilde doğrulamak için çok önemli bir kontrol noktası görevi görür. Yüksek hepatosit canlılığının sağlanmasında ve nihai verimin en üst düzeye çıkarılmasında gerekli olmuştur. Bu işlemi aktif olarak doğrulayarak, tampon karaciğer damar sisteminin tüm kısımlarına etkili bir şekilde ulaşabilir, bu da pasif kan temizlemenin tek başına başaramayacağı bir durumdur.
5. Karaciğer sindirimi
- Perfüzyondan sonra, akışı kesintiye uğratmadan ve borudaki hava kabarcıklarını önlemeden önceden ısıtılmış Sindirim tamponuna geçin.
NOT: Akışın geçici olarak azaltılması bu geçişin gerçekleştirilmesine yardımcı olabilir. Sindirim tamponu, Perfüzyon tamponundan Sindirim tamponuna geçişin görselleştirilmesini kolaylaştıran fenol kırmızısı içerir. - Pompa hızını 20 mL/dk'ya yükseltin ve karaciğer şişmesi ve rahatlaması için çubukla periyodik olarak bastırın.
- Bu adımdan sonra (yaklaşık 15 dakika süren), karaciğerin giderek daha duygusal hale geldiğinden emin olun. Bu noktada, iğne çıkarılabilir ve pompa durur.
- Karaciğer kapsülü sindirimden sonra kırılgan olduğundan, karaciğeri nazikçe ve dikkatlice inceleyin: loblar arasındaki merkezi bağ dokusunu forseps ile tutun. Diğer organlarla olan tüm bağlantıları kesin ve karaciğeri kaldırın.
- Karaciğeri yıkayın, önceden soğutulmuş PBS +% 3 P / S çözeltisine birkaç saniye batırın. Ardından, önceden soğutulmuş William'ın orta içeren tam tüpüne yerleştirin.
NOT: Kan kaybı ve ölüm, vena kava yoluyla perfüzyonu sağlar. Hayvanın ölümünün teyidi, karaciğerin ekildiği anda indüklenen pnömotorakstan gelir ve diyafram tamamen disseke edilir ve muayene üzerine solunum ve kalp atışı artık işlevsel değildir.
6. Hepatosit saflaştırma
- Biyolojik kaputun altında, karaciğeri 15 mL soğuk William'ın tam ortamı ile 100 mm petri kabına buz dolu bir tepsi üzerine aktarın.
- Ortamdaki hücreleri serbest bırakmak için organa kazıyıcı ile kuvvetlice bastırın.
NOT: Sindirim aşaması doğru bir şekilde yürütülürse, hücre salınımı kolay olmalı ve karaciğer üzerinde fazla baskı gerektirmemelidir. Karaciğeri parçalara ayırmayın; Olduğu gibi bırakın. Karaciğeri ortama batırılmış tutmak hücre salınımını iyileştirir. - Ortam içeren hücreleri toplayın ve steril bir konik tüpe aktarırken 100 μm filtre ile filtreleyin. Filtrasyon, bağ dokularının ve sindirilmemiş doku parçalarının uzaklaştırılmasına izin verir.
- Daha fazla hücrenin salınmasına yardımcı olmak için yaklaşık 15 mL soğuk William'ın tam ortamını Petri kabındaki parçalanmış karaciğerin üzerine dökün. 6.2 ve 6.3 adımlarını tekrarlayın.
- Tüm hücreler serbest kalana kadar 6.4 noktasını en az bir kez tekrarlayın. Gerekirse, ortamı daha konik tüplere bölün ve birden fazla 100 μm filtre kullanın.
NOT: Hepatositler serbest bırakıldıktan sonra ve filtrelemeden önce, hepatositlerin varlığı nedeniyle ortam opak görünmelidir. Kalan karaciğer lifli görünmeli ve atılacaktır. - Hepatik hücreler içeren filtrelenmiş ortamı 50 x g'da 3 dakika boyunca 4 ° C'de düşük hızlı bir frenle santrifüjleyin.
NOT: Hepatositler diğer karaciğer hücrelerinden daha yoğundur. Düşük santrifüjleme kuvveti nedeniyle, pelette sadece hepatositler bulunurken, diğer hücreler süpernatantta kalacaktır. - Hücre peletini bozmadan süpernatanı atın. Tüpe yaklaşık 40 mL buz gibi soğuk William'ın tam ortamını nazikçe ekleyin ve hücre peletini yeniden süspanse etmek için 2 ila 3 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
NOT: Hücrelere zarar vermemek için hücre peleti dikkatli bir şekilde yeniden süspanse edilmelidir. - 50 x g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
NOT: İlk denemeler için, sonraki adımlara geçmeden önce ikinci santrifüjlemeden sonra 1:10 tripan mavisi testi ile canlı hücreleri sayın. Bu, tüm hücreler ölmüşse medya ve zaman israfını önleyebilir. - Süpernatanı atın ve hücre peletini buz gibi soğuk William'ın tam ortamının 25 mL'sinde yeniden süspanse edin.
- Tüpe 25 mL% 90 yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırın.
NOT: Bir yoğunluk gradyan çözeltisi, canlı hepatositleri yoğunluklarına bağlı olarak ölü hepatositlerden ve hücre kalıntılarından ayırır. - 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Tüpün alt kısmında, canlı hepatositlere karşılık gelen görünür bir pelet ve ölü hepatositlerden oluşan gradyanın üstünde şeffaf bir tabaka elde edilmelidir.
NOT: Hiç pelet yoksa, çözeltiyi döndürerek tekrar karıştırmayı deneyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. - Ölü hücre tabakasını gradyanın üstünden aspire edin ve peletle birlikte ortamın 1-2 mL'sini bırakın.
- Pelet, William'ın tam ortamının 30-40 mL'sinde yeniden süspanse edin.
NOT: Tüm prosedür için sadece 25 mL serolojik pipetler kullanın. Daha küçük delikli pipetler hepatosit canlılığını azaltabilir. +4°C'yi korumak için tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır. - 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı aspire edin.
7. Hepatosit kültürü ve RNA toplanması
- Hücre sayımı için uygun miktarda ortam ekleyin. 1:10 Tripan mavisi ile hücre canlılığını sayın.
- 2D hepatosit kültürü
- Önceden ısıtılmış William'ın tam ortamı ile kollajen kaplı bir hücre plakası üzerinde 500.000 hücre / kuyu 6 oyuklu tabak konsantrasyonunda plaka hücreleri.
- Hücre kültürünü 37 ° C'de% 95 hava,% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
- 4 saat sonra, ortamı önceden ısıtılmış yeni William'ın tam ortamıyla değiştirin.
- Hücreleri inkübatörde tutun. Ortamı günlük olarak değiştirin.
- Kaplamadan önce (0. gün) ve kültürün 1. ila 3. günlerinde RNA ekstraksiyonu için bir reaktifte birincil hepatositleri toplayın.
- RNA'yı üreticinin protokolüne göre çıkarın ve hepatik belirteç genlerinin RT-qPCR ile değerlendirilmesi için cDNA'ya ters transkribe edin. Astar listesi Tablo 2'de sunulmuştur.
- 3D uzun süreli hepatosit kültürü için:
- Soğuk saf matristeki hücreleri 20 μL'de 1.000-10.000 hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.
NOT: Matris baloncukları yapmaktan kaçının. - Önceden soğutulmuş pipet uçlarını kullanarak, plaka matrisi içeren hücre damlacıklarını önceden ısıtılmış hücre kültürü plakasına yerleştirin.
- Plakayı ters çevirin ve hücre kültürü inkübatöründe 20-30 dakika bekletin.
- Açın ve Peng'in çalışmasına göre önceden ısıtılmış 3D uzun süreli hepatosit ortamını ve özel kültür ortamını ekleyin22. Hücreleri inkübatörde tutun.
- 3D uzun süreli hepatosit ortamını her 2-3 günde bir değiştirin.
- En az 14 günlük kültürden sonra, Hep-Org'lar matriksten ayrılır ve canlı Hep-Org'lar Tripan mavisi ve EdU proliferasyon testi ile değerlendirilir ve Peng'in çalışmasına göre geçer.
- Soğuk saf matristeki hücreleri 20 μL'de 1.000-10.000 hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.
Sonuçlar
Tartışma
3D organoidler, kişiselleştirilmiş tıp için bir sınırdır ve uzun süreli bir hepatosit kültürüne izin verir. Bu yenilikçi tekniğin kalitesi, iyi bir canlı primer hepatosit verimi ve iyi uygulanmış karaciğer perfüzyonu ve hepatosit izolasyonu gerektirir. Bu eski prosedür hala yaygın olarak kullanılmaktadır; ancak, zorlayıcı olabilecek farklı adımlardan oluşur. Prosedüre yaklaşırken, bakteriyel kontaminasyon, düşük karaciğer sindirim verimliliği, düşük primer hepatosit verimi ve düşük hepatosit canlılığı gibi kritik sorunlar yaşadık ve bunların tümü tekniğin başarısını kolayca etkileyebilir. Altın standart protokoller 17,18'den başlayarak, burada yaygın sorunların nasıl üstesinden gelineceğini vurguluyor, primer sıçan hepatosit izolasyonundaki en kritik adımları açıklığa kavuşturuyor ve sıçan modelinde tekniğin başarısını kolayca etkileyebilecek dağınık ipuçlarını özetliyoruz. Karaciğer perfüzyonu prosedürü oldukça zorlu olmasına ve operatörden hassas uzmanlık gerektirmesine rağmen, primer hepatositlerin verimi, bütünlüğü, canlılığı ve işlevselliği açısından yüksek kaliteli sonuçları garanti eder. Bu özellikler sonraki aşamalar için gereklidir.
Projenin planlanması sırasında, PREPARE kılavuz kontrol listesi21'i dikkatlice dikkate aldık. Geçmiş literatüre özel önem verildi, önceki farklı çalışmalar karşılaştırıldı ve bazı yazarlarla temasa geçildi (PREPARE guidelines kontrol listesi _topic A1). Organoid aracın kendisi, hücreler kültürde 7 aya kadar çoğaltılabildiğinden, hayvan sayısını azaltmanın önemli bir yoludur (PREPARE kılavuzları kontrol listesi _topic A3). Hayvan tesisi personeli ile diyalog kurarak, prosedüre yardımcı olan ve fazla deney hayvanlarının kullanımından kaçınılmasına katkıda bulunan deneyimli bir teknisyen seçtik (PREPARE yönergeleri kontrol listesi _topic B5). Karaciğer perfüzyonu yapmak için gerekli uygun bir peristaltik pompa elde edildi (PREPARE kılavuzları kontrol listesi _topic B6).
Ng17 ve Shen18'in yayınları, sıçanlarda prosedürü açıklayan en son yayınlardır. Bu protokol tarafından ele alınan, daha öncekiler tarafından ele alınmayan ana sorular, ticari çözümlerin kullanımı ve karaciğeri yerinde tutan optimal perfüzyon ve sindirim adımlarını sağlayan kesin bir portal ven kanülasyonunun optimizasyonu ile ilgilidir. Shen18 ve Ng17'nin protokolleri ev yapımı solüsyonlar kullanırken, protokolümüz tampon hazırlamada azaltılabilirlik için ticari perfüzyon ve sindirim solüsyonlarına dayanmaktadır. Aşırı sindirim enzimi konsantrasyonu hepatositlere karşı agresif olabilir ve hücrenin kalitesini ve canlılığını etkileyebilir25. Ticari çözümlerin kullanılması, protokolün tekrarlanabilirliğini artırmak ve standardizasyonu garanti etmek için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, Ng17 tarafından gerçekleştirilen protokol, sindirim aşamasından önce karaciğerin çıkarılması gerekliliği nedeniyle zor olabilir. Protokolümüz, her iki faz da gerçekleştirilene kadar karaciğerin çıkarılmadan perfüzyonu ve sindirimi üzerine kuruludur, bu da prosedürü basitleştirir. Hücre verimi ve hücre canlılığı açısından protokolümüzün sonuçları önceki çalışmalarla karşılaştırılabilir.
İşlem öncesi ve sonrası perfüzyon tüplerinin temizlenmesi ve dezenfeksiyonu, ameliyata başlamadan önce cilt dezenfeksiyonu ile birlikte bakteriyel kontaminasyonu sınırlamak için çok önemlidir. Ayrıca, etanol temizliğinden sonra borunun tamamen kurutulması ve ardından ortamla yıkanması, hücre canlılığını artırmak için çok önemlidir. Aslında, karaciğere enjekte edilen tek bir etanol atışı bile işlem sırasında hücre ölümüne neden olur.
Enjekte edilen çözeltinin sıcaklığı önemlidir, ancak aynı zamanda kollajenaz enziminin sıcaklığa duyarlılığı da dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, cerrahi işleme başlamadan önce Perfüzyon tamponunu 42 °C'de önceden ısıtırken, Sindirim tamponunu sadece perfüzyon adımı sırasında ısıtma banyosuna koyduk. Kateterin yukarı akışındaki boruya bir baloncuk kapanı eklemek, kaçan kabarcıkların katetere ulaşmasını ve perfüzyon solüsyonu bittiğinde havanın karaciğere girmesini önler17.
Tampon bileşimi, perfüzyon basıncı ve akış hızı uygun aralıktaolmalıdır 17. Düşük basınç ve düşük akış hızının düşük verime neden olduğunu ve tamponun küçük damarlara ulaşamaması nedeniyle hücre canlılığını olumsuz etkilediğini deneyimledik. Öte yandan, Glisson kapsülünü sağlam tutmak için akış hızı çok yüksek olmamalıdır. Hücre yapışmasının bütünlüğü Ca2 + 18 gerektirdiğinden, perfüzyon tamponu, hücreler arasındaki kalsiyum içeren köprülere saldırmak için EDTA içeren Ca2 + içermeyen bir çözeltidir, bu nedenle kalsiyumun uzaklaştırılması ve karaciğerden kanın yıkanması için gereklidir. 10 mL / dk'lık bir akış hızı ile 8-15 dakikalık perfüzyon süresi, tüm hücrelere EDTA, Ca2 + içermeyen çözelti ile ulaşılmasını sağlamak için çok önemlidir. Optimal olmayan bir perfüzyon, sindirimin azalmasına neden olabilir.
Sindirim tamponu Ca2+ içerir, çünkü kollajen matrisini sindiren kollajenaz Ca2 + 'ya bağımlıdır. Sindirim tamponunun akış hızı en az 20 mL / dk'da tutulmalıdır ve süre kollajenaz kapasitesine bağlıdır. Kullandığımız spesifik Sindirim tamponu durumunda, 300 mL'lik bir çözeltinin son hacmi için 15 dakika perfüze etmemiz gerekir. Sindirim tamamlanmazsa, hücre-hücre bağlantıları korunur ve ardışık mekanik basınç hücrelere zarar vererek canlılığı azaltır. Akış hızının yavaşça arttırılması, perfüzyonun hücrelere olan stresli etkisinin azalmasına katkıda bulunur. Ameliyat sırasında, geçici inferior vena kava klemplenmesine ve ardından karaciğer şişmesine odaklandık: bu geçiş hem sindirim verimliliğini hem de hücre iyileşmesini önemli ölçüde iyileştirdi. Sindirimin sonunda karaciğer açık kahverengi ve yumuşak görünmelidir. Karaciğer rezeksiyonu tamamlandığında, izole edilen karaciğerin PBS +%3 P/S'de yıkanması bakteri unvanını azaltır ve işlemin sonraki kısmında kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur.
Biyolojik başlığın altındaki hepatosit izolasyon adımları için, 25 mL serolojik pipetlerin kullanılması, daha küçük delikli pipetler tarafından hepatosit canlılığının azaltılmasını önler. Birincil hepatosit verimini artırmak için isteğe bağlı bir adım ekledik, bu da William'ın tam ortamının kaputun altındaki kazıma adımını tekrarlamak için parçalanmış karaciğerin üzerine dökülmesidir. Bu adım, hücre tarafından salınan ortamın izole edilmiş karaciğerden filtrelenmesinden sonra yapılır ve Petri'nin temizlenmesine ve karaciğer kapsülünden daha fazla hücrenin geri kazanılmasına yardımcı olur. Hepatositleri filtrelerden geçirmek için yüksek basınç uygulamak gerekirse, hücre canlılığı düşük olacaktır19.
Hepatositlerin 2 günden fazla bir süre 2 boyutlu olarak kültürlenememesi, bizi alternatif bir uzun dönem kültür modeli bulmaya yöneltti. Hepatositleri daha uzun süre kültürlemek için uygun bir model erişkin Hep-Org'dur. 2D hepatositlerle karşılaştırıldığında, Hep-Org'ların 15. günde hala canlı ve aktif proliferasyonda olduğu ortaya çıktı ve bu da uzun vadeli bir potansiyel gösterdi.
Sıçan karaciğer perfüzyonu ve müteakip primer erişkin hepatosit izolasyonu, farklı uygulamalar için ana ön adımlardır. Prosedür birçok adım ve değişken içerdiğinden tekrarlanabilirlik tekniğin bir sınırlaması olabilse de, prosedürün görsel tanımına dikkat etmek, yöntemin yüksek bir başarı oranı ile tekrarlanmasına yardımcı olur. Kritik aşamalara işaret eden ve bunların nasıl ele alınacağını gösteren bu protokol, primer sıçan hepatosit izolasyonu prosedürünü ve karaciğer fizyolojisi ve patolojisini incelemek için Hep-Orgs nesli olarak in vitro modeller oluşturmaya uygun sonuçları optimize eder.
Açıklamalar
Tüm yazarlar her türlü çıkar çatışmasını açıklamıştır.
Teşekkürler
Trieste Üniversitesi SorrentinoLab'dan Dr. Davide Selvestrel ve Prof. Giovanni Sorrentino'ya EdU proliferasyon testini gerçekleştirmemize yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Çalışma, Banca d'Italia ad hoc hibesi ve okul içi FIF hibeleri ile desteklendi.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| A83-01- ALK5 İnhibitörü IV | İkiz Sarmal | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi | Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | İkiz Sarmal | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 görüntüleme kiti | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| Kollajen, Tip I, sıçan kuyruğundan çözelti | Merck | C3867-1VL | |
| Deksametazon | Merck | D4902 | |
| EGF | Merck | E9644 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| Heparin Sodyum 25000 IU / 5 ml | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39H | |
| İnsülin-Transferrin-Selenyum çözeltisi 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
| L-Glutamin çözeltisi | Euroclone | ECB3000D | |
| Karaciğer Digest Ortamı | Thermofisher Bilimsel | 17703-034 | |
| Karaciğer Perfüzyon Ortamı | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
| N2 takviyesi | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-asetilsistein | Merck | A9165 | |
| Nikotinamid | Merck | N-0636 | |
| Esansiyel Olmayan Amino Asitler | Merck | M7145 | |
| Normosin | Aurogene | ant-nr-1 | |
| PBS tamponu 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| Penisilin-streptomisin çözeltisi 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A | |
| Peristaltik pompa | İsmalekt ve ticaret; | MS-4/12 Reglo Dijital Pompa | |
| TNFa | Peprotech | 300-01A | |
| TRI Reaktif | Merck | T9424 | |
| Boru ve nbsp; | İsmalekt ve ticaret; | ID.2,79mm | |
| Williams' E Medium, glutamin içermez | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | İkiz Sarmal | T1725 |
Kaynaklar
- Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
- Ietto, G., et al. Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components. Cells. 12 (10), 1429(2023).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
- Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. Primary Hepatocytes in sandwich culture. Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).
- Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).
- Thompson, W. L., Takebe, T. Human liver model systems in a dish. Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).
- Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).
- Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals. Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).
- Raju, R., et al. In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development. Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).
- Peng, W. C., et al. Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture. Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).
- Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures. Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science (New York, N.Y.). 345 (6194), 1247125(2014).
- Huch, M., Koo, B. -K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Ng, I. C., et al. Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control. J Vis Exp. (170), e62289(2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. J Vis Exp. (132), e56993(2018).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).
- Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
- Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).
- Knobeloch, D., et al. Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).
Yeniden basım ve izinler
