Yöntem makalesi

Fare Beyninden ve Kafatasından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

DOI:

10.3791/66861

⸱

26 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Brain Protection Program (MBPP), Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için yaygın bir yaklaşım, bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmektir. Burada, murin beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ve etkili protokol sağlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artan kanıtlar, beyin bozukluklarının (örneğin, beyin iskemisi ve otoimmün ensefalomiyelit) tetiklediği bağışıklık tepkisinin sadece beyinde değil, aynı zamanda kafatasında da meydana geldiğini göstermektedir. Beyin hasarından sonra hem beyin hem de kafatası kemik iliğindeki bağışıklık hücresi popülasyonlarındaki değişiklikleri analiz etmeye yönelik önemli bir adım (ör., felç), aşağı akış analizleri için yeterli sayıda yüksek kaliteli bağışıklık hücresi elde etmektir. Burada, bağışıklık hücrelerini beyinden ve kafatası kemik iliğinden izole etmek için optimize edilmiş iki protokol sağlanmıştır. Her iki protokolün avantajları, basitlikleri, hızları ve büyük miktarda canlı bağışıklık hücresi elde etmedeki etkinliklerine yansır. Bu hücreler, hücre sıralama, akış sitometrisi ve transkriptomik analiz gibi bir dizi aşağı akış uygulaması için uygun olabilir. Protokollerin etkinliğini göstermek için, akış sitometrisi analizi kullanılarak inme beyinleri ve normal beyin kafatası kemik iliği üzerinde immünofenotip deneyleri yapıldı ve sonuçlar yayınlanmış çalışmalardan elde edilen bulgularla uyumlu hale getirildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinir sisteminin merkezi merkezi olan beyin, kafatası tarafından korunur. Kafatasının altında meninksler olarak bilinen üç bağ dokusu tabakası vardır - dura mater, araknoid mater ve pia mater. Beyin omurilik sıvısı (BOS), araknoid mater ve pia mater arasındaki subaraknoid boşlukta dolaşır, beyni yastıklar ve ayrıca glifatik sistem 1,2 yoluyla atıkları uzaklaştırır. Birlikte, bu benzersiz mimari, beynin stabilitesini koruyan ve onu olası yaralanmalardan koruyan güvenli ve destekleyici bir ortam sağlar.

Beyin uzun zamandır bağışıklık ayrıcalığına sahip olarak kabul edildi. Bununla birlikte, artan kanıtlar, parankimdeki yerleşik mikrogliaya ek olarak, koroid pleksus ve meninksler de dahil olmak üzere beynin sınırlarının çok çeşitli bağışıklık hücrelerine ev sahipliği yaptığını gösterdiğinden, bu kavram kısmen terk edilmiştir3. Bu hücreler homeostazın korunmasında, beyin sağlığının izlenmesinde ve beyin hasarına karşı bağışıklık tepkisinin başlatılmasında kritik roller oynar. Özellikle, son bulgular kafatasının meninks bağışıklığında rol oynadığını ve yaralanma sonrası beyindeki bağışıklık tepkisine katkıda bulunabileceğini göstermektedir. 2018'de Herisson ve ark. kafatası kemik iliğini meninkslere bağlayan doğrudan vasküler kanalların ufuk açıcı bir keşfini yaptılarve böylece lökosit göçü için anatomik bir yol oluşturdular 4,5. Daha sonra Cugurra ve ark. meninkslerdeki birçok miyeloid hücrenin (örneğin monositler ve nötrofiller) ve B hücrelerinin kandan kaynaklanmadığını göstermiştir6. Yazarlar, kalvaria kemik flebi nakli ve seçici ışınlama rejimleri gibi teknikleri kullanarak, kafatası kemik iliğinin, CNS yaralanmasından sonra CNS parankiminin yanı sıra meninkslerdeki miyeloid hücreler için lokal bir kaynak olarak hizmet ettiğine dair ikna edici kanıtlar sağladılar6. Ayrıca, başka bir çalışma, meningeal B hücrelerinin sürekli olarak kafatası kemik iliği7 tarafından sağlandığını öne sürdü. Daha yakın zamanlarda, araknoid manşet çıkışı (ACE) olarak adlandırılan yeni bir yapı, bağışıklık hücresi kaçakçılığı için dura mater ile beyin arasında doğrudan bir geçit olarak tanımlanmıştır8.

Bu heyecan verici bulgular, bağışıklık hücrelerinin yaralı beyne sızmasının kökeni için önemli etkilere sahiptir (örneğin, iskemik inme sonrası). Çok sayıda kanıt, felçten sonra birçok bağışıklık hücresinin beyne sızdığını ve hem akut beyin hasarına hem de kronik beyin iyileşmesine katkıda bulunduğunu göstermiştir. Geleneksel fikir, bu hücrelerin beyne sızan kanda dolaşan lökositler olduğudur ve bu da büyük ölçüde inme kaynaklı kan-beyin bariyeri hasarı ile kolaylaştırılır. Ancak, bu fikre meydan okundu. Bir çalışmada, kafatasındaki ve farelerin tibiasındaki bağışıklık hücreleri farklı şekilde etiketlendi ve inmeden 6 saat sonra, kafatasında nötrofillerde ve monositlerde önemli ölçüde daha büyük bir azalma bulundu. iskemik beyinde tibia ve daha fazla kafatası kaynaklı nötrofil mevcuttu. Bu veriler, akut inme fazında, iskemik beyindeki nötrofillerin esas olarak kafatası kemik iliğindenkaynaklandığını göstermektedir 4. İlginç bir şekilde, CSF bu geçişe rehberlik edebilir. Gerçekten de, yakın tarihli iki rapor, BOS'un sinyal ipuçlarını beyinden kafatası kemik iliğine kafatası kanalları aracılığıyla doğrudan iletebildiğini ve CNS hasarından sonra kafatası kemik iliğinde hücre göçü ve hematopoez talimatı verebildiğini göstermiştir 9,10.

Bu son bulguların ışığında, beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini incelerken, hem beyindeki hem de kafatası kemik iliğindeki bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmek önemli hale gelmiştir. Bu tür araştırmalarda, hücre sıralama, akış sitometrisi analizi ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) gibi aşağı akış analizleri için yeterli sayıda yüksek kaliteli bağışıklık hücresine ihtiyaç vardır. Burada genel amaç, beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için optimize edilmiş iki prosedür sunmaktır. Kafatasının kalvaryasının (frontal kemik, oksipital kemik ve parietal kemikler) tipik olarak kemik iliğini çıkarmak için kullanıldığını ve bu kemik iliğinin bu çalışma boyunca özellikle kafatası kemik iliği olarak adlandırıldığını belirtmek önemlidir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, Duke Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Bu çalışmada erkek C57Bl / 6 fareler (3-4 aylık; 22-28 g) kullanıldı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Fare beyninden tek hücreli süspansiyon

NOT: Şekil 1 , beyin hücresi izolasyon protokolüne genel bakışı göstermektedir.

  1. Daha önce gösterildiği gibi fareyi uyuşturun, entübe edin ve sabitleyin11.
  2. Deriden ve alttaki kas katmanlarından bir üst karın kesisi yapın ve göğüs boşluğuna açıklık oluşturmak için diyaframı ve kaburgaları dikkatlice kesin.
  3. 30 mL'lik bir şırıngayı soğuk PBS ile doldurun ve silikon boru ile künt perfüzyon iğnesine takın. Perfüzyon iğnesini dikkatlice sol ventriküle yerleştirin.
  4. Kan drenajına izin vermek için sağ atriyumda küçük bir çentik uygulayın ve ardındanfareyi 12-3 dakika boyunca ~ 10 mL / dk akış hızında perfüze edin.
    NOT: Beyindeki kan klirensini iyileştirmek için perfüzyon solüsyonunun hacmini artırmak ve heparin eklemek düşünülebilir.
  5. Farenin kafasını kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için başın üst kısmındaki deriden orta hat kesisi yapın.
  6. Künt forseps kullanarak kafatasının üzerindeki bağ dokusunu dikkatlice kazıyın.
  7. Orta hat boyunca ve her iki taraftaki kafatası dikişlerini dikkatlice kesmek için keskin diseksiyon makası kullanın ve bir flep oluşturun.
  8. Beyni ortaya çıkarmak için kafatası kanadını yavaşça kaldırın ve beyni kraniyal boşluktan dikkatlice çıkarmak için künt forseps kullanın.
  9. Beyni buz gibi soğuk PBS içeren bir Petri kabına daldırın ve kalan meninks dokularını çıkarın.
    NOT: Hücre canlılığını daha iyi korumak için, aşağıdaki tüm adımların buz üzerinde veya 4 °C'de gerçekleştirilmesi önerilir.
  10. Beyni, 20 mL (tam beyin) veya 12 mL (yarım beyin) buz gibi HBSS tamponu içeren önceden soğutulmuş 15 mL cam Dounce homojenizatöre yerleştirin.
  11. Buz üzerinde yaklaşık 100-120 vuruşla beyin dokusunu nazikçe ve yavaşça ayırmak için gevşek Dounce havaneli kullanın.
    NOT: Bu adım, büyük miktarda sağlıklı beyin hücresi elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürer. Süspansiyonda önemli beyin dokusu parçaları görünmediğinde homojenizasyonu durdurun. Bu noktada, havaneli herhangi bir kuvvet olmadan kolayca aşağı hareket edebilir.
  12. Elde edilen beyin dokusu süspansiyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
  13. Dounce tüpünü 5 mL HBSS ile durulayın ve hücre toplanmasını en üst düzeye çıkarmak için filtrasyona devam edin.
  14. Filtrelenmiş doku süspansiyonunu 550 x g'da 4 ° C'de 6 dakika boyunca santrifüjleyin.
  15. Bir vakum aspiratörü kullanarak süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 1 mL% 30 izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
    NOT: 15 mL %30 izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi yapmak için, 4.5 mL %100 stok yoğunluğu gradyan ortamı, 1.5 mL 10× PBS ve 9 mL ddH2O karıştırın.
  16. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 9 mL (tam beyin) veya 6 mL (yarım beyin)% 30 yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin.
  17. İyice karıştırmayı sağlamak için tüpü yavaşça ters çevirin.
  18. Tüpü hızlanma ve fren seviye 3'teyken, 4 °C'de 20 dakika boyunca 845 x g'da hemen santrifüjleyin.
  19. Tüpü sallamadan santrifüjden nazikçe çıkarın ve vakuma bağlı 1 mL'lik bir uç kullanarak üst miyelin tabakasını dikkatlice aspire edin.
    NOT: Bu katmanı rahatsız etmemek son derece önemlidir. Kalan herhangi bir miyelin, hücre sağlığını olumsuz yönde etkileyebilir ve aşağı akış analizlerini tehlikeye atabilir.
  20. Süpernatanı aspire edin, 1-2 mL geride bırakın ve hücre peletini en az 10 mL soğuk HBSS ile yeniden süspanse edin.
  21. 550 x g'da 4 ° C'de 6 dakika santrifüjleyin.
  22. En az 7 mL soğuk HBSS ile bir kez daha yıkayın.
  23. Süpernatantın mümkün olduğu kadar çoğunu çıkarın ve 100-200 μL akış sitometrisi tamponu kullanarak akış sitometrisi analizi için hücreleri yeniden askıya alın.
    NOT: Bu çalışma için kullanılan akış sitometrisi FACS tamponu, 1× PBS'de %0,5 BSA ve 2 mM EDTA içerir. Yıkama adımları sırasında hücre kaybını en aza indirmek için hücre boyama için 96 oyuklu bir V-alt plakası önerilir.
  24. Bireysel laboratuvarlarda oluşturulan standart bir protokol kullanarak akış sitometrisi analizi yapın13.
    1. Kısaca, 80 μL hücre süspansiyonunu 20 μL antikor karışımı ile 96 oyuklu bir V-alt plakada karıştırın ve 4 ° C'de 25 dakika inkübe edin.
    2. 200 μL FACS tamponu ile yıkayın ve ardından hücreleri 100 μL HBSS artı hücre canlılığı boyama reaktifi ile yeniden süspanse edin.
    3. 4 ° C'de 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, FACS tamponu ile yıkayın ve hücreleri akış sitometrisi analizi için 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

2. Fare kalvaryasından kemik iliği tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

NOT: Şekil 2 , kafatası kemik iliği izolasyon prosedürüne genel bakışı göstermektedir.

  1. Fareyi adım 1.4'te açıklandığı gibi perfüze edin.
  2. Farenin kafasını kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisinde orta hatta bir cilt kesisi yapın.
  3. Foramen magnum'dan başlayarak ve keskin bir makas kullanarak kalvaria'nın yan tarafları boyunca ilerleyerek kafatasını kesin. Ardından, kalvaria'yı kaldırın ve çıkarın.
    NOT: Beyin aynı fareden alınabilir ve hem beyin hem de kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerinin analizini sağlayan adım 1 kullanılarak işlenebilir.
  4. Künt forseps kullanarak diseksiyon mikroskobu altında dura materini kafatasından dikkatlice soyun.
    NOT: Oksipital kemiğin kenarlarından başlamak, yavaşça ayrılmak ve içe doğru çalışarak ön bölgeye doğru istikrarlı bir şekilde ilerlemek daha kolaydır.
  5. Calvaria'yı buz üzerindeki tabağa koyun ve calvaria'yı durulamak için 1 mL'lik bir pipet kullanın, böylece yüzeyindeki kan kalıntılarının giderilmesini sağlayın.
  6. Calvaria'yı, calvaria'yı daldırmaya yetecek kadar taze, soğuk PBS ile yeni bir tabağa aktarın.
  7. Calvaria'yı soğuk PBS'de yaklaşık 3 mm x 3 mm'lik parçalar halinde kesmek için steril makas kullanın.
    NOT: Kırpma yöntemleri, kalvaria kemik iliği ekstraksiyonunun etkinliğini etkileyebilir. Değişkenliği en aza indirmek için aynı kırpma yönteminin kullanılması önerilir. Dikişlerin kesilerek açılması da önemlidir. Şekil 2B'de bir yaklaşım gösterilmektedir.
  8. 18 G'lik bir iğne kullanarak 500 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün dibine bir delik açın.
  9. Bu tüpü 20 μL soğuk PBS içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
  10. Calvaria parçalarını 500 μL'lik tüpe aktarın.
    NOT: Ekstraksiyon verimliliğini artırmak için kemik parçaları gevşek bir şekilde paketlenmelidir.
  11. 4 °C'de 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Hücre iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için, kalvaria parçalarını hafifçe karıştırmak için 18 G'lik bir iğne kullanın ve bu adımı 1-2 kez daha tekrarlayın.
  12. Toplanan kalvaria kemik iliği hücrelerini 500 μL Kırmızı Kan Hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.
  13. Süspansiyonu 4 mL soğuk PBS içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  14. 4 ° C'de 6 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
  15. 5 mL soğuk PBS ile bir kez daha yıkayın.
  16. Hücre peletini uygun bir tamponda yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi için tipik olarak 500 μL FACS tamponu kullanırız.
  17. Akış sitometrisi analizi için hücre sayımı yapın ve antikor boyaması için yaklaşık 1 x 106 hücre kullanın.
    NOT: Antikor boyamadan önce Fc blok adımınıeklediğinizden emin olun 13.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare beyin dokusundan bağışıklık hücreleri hazırlamak için, protokol genellikle yüksek canlılığa sahip hücreler verir (% 84.1 ±% 2.3 [ortalama ± SD]). Bu hücrelerin yaklaşık %70-80'i CD45 pozitiftir. Normal fare beyninde, neredeyse tüm CD45 + hücreleri beklendiği gibi mikrogliadır (CD45DüşükCD11b +). Bu protokol, laboratuvarda akış sitometrisi analizi, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) ve scRNA-seq analizi dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılmıştır. Örnek olarak, bir inme modelinde bir akış sitometrisi analizi yapılmıştır (Şekil 3). Fareler, 30 dakikalık filament orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) olan geçici bir inme modeline tabi tutuldu14. İnmeden sonraki 3. günde, hücreler fare beyinlerinden hazırlandı ve ortak bağışıklık hücresi yüzey belirteçleri ile boyandı. Geçit stratejisi Şekil 3A'da gösterilmiştir. Önceki araştırmalarlatutarlı olarak 13,15, ipsilateral hemisferdeki CD45Yüksek hücrelerinde belirgin bir artış gözlenmiştir (Şekil 3B,C), bu da bağışıklık hücresinin beyne infiltrasyonunu gösterir.

Kafatası kemik iliği protokolü için, kafatası kemik iliği hücrelerinin (yaklaşık 2 x 106 hücreli) önemli bir verimi, mükemmel canlılıkla tutarlı bir şekilde elde edildi (% 93.8 ±% 1.8 [ortalama ± SD]). Beklendiği gibi, bu hücrelerin çoğu CD45 pozitiftir. Bu protokolün faydasını göstermek için, naif farelerin hem femur hem de kafatası kemik iliğindeki bağışıklık hücresi bileşimini karakterize etmek için karşılaştırmalı bir çalışma yapılmıştır (Şekil 4). Temsili grafiklerde gösterildiği gibi, bağışıklık hücresi bileşimi femur ve kafatası kemik iliği arasında benzerdi (Şekil 4A,B). İlginç bir şekilde, nötrofillerin sıklığı uyluk kemiğinde kafatası kemiğinden daha yüksek görünmektedir (Şekil 4C). Bununla birlikte, bu pilot çalışma için örneklem büyüklüğü küçük olduğu için bu bulgu daha fazla doğrulama gerektirmektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Beyin hücresi izolasyon protokolüne genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Kafatası kemik iliği hücre izolasyon protokolü. (A) Prosedüre genel bakış. (B) Kafatası kesimi için önerilen model. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İnme beynindeki bağışıklık hücrelerinin temsili akış sitometrisi analizi. (A) Geçit stratejisine bir örnek. Çizimler aşağıdaki bağışıklık hücresi popülasyonlarını göstermektedir: mikroglia (CD45DüşükCD11b +), NK hücreleri (CD45YüksekNK1.1 +), nötrofiller (CD45YüksekLy6G +), T hücreleri (CD45YüksekCD11b-CD3 +) ve B hücreleri (CD45 YüksekCD11b-CD19 +). Bu örnek, inmeden sonraki 3. günde ipsilateral hemisferdeki beyin bağışıklık hücrelerinin bir analizini temsil eder. (B,C) Bağışıklık hücrelerinin inme beynine sızması. Genç erkek fareler geçici orta serebral arter tıkanıklığına (MCAO) tabi tutuldu. 3. günde, beyinler toplandı ve sol (kontralateral) ve sağ (ipsilateral) hemisferlere ayrıldı. Beyin hücreleri tarif edilen protokole göre hazırlandı ve daha sonra akış sitometrisi analizine tabi tutuldu. Temsili grafikler, ipsilateral hemisfere artan sızan bağışıklık hücrelerini göstermektedir (CD45Yüksek hücreler; B). Nicel veriler çubuk grafiklerde (C) gösterilmiştir. Hücre sayıları, akış sitometrisi verilerinde kaydedilen hücre sayısı ve hacmine göre hesaplandı. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. *p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kafatası kemik iliği hücrelerinin temsili akış sitometrisi analizi. Karşılaştırma için, femurdan alınan kemik iliği hücrelerinin analizi dahil edildi. Grafikler aşağıdaki bağışıklık hücresi popülasyonlarını göstermektedir: NK hücreleri (CD45 + NK1.1 +), nötrofiller (CD45 + CD11b + Ly6G +), T hücreleri (CD45 + CD11b-CD3 +) ve B hücreleri (CD45 + CD11b-CD19 +). (A) Femur kemik iliği için temsili çizimler. (B) Kafatası kemik iliği için temsili çizimler. (C) Femur ve kafatası kemik iliği arasındaki bağışıklık hücresi bileşiminin karşılaştırılması. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. *p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, beyin ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ama etkili protokol sunulmaktadır. Bu protokoller, özellikle akış sitometrisi olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları için uygun olabilecek büyük miktarda canlı bağışıklık hücresini güvenilir bir şekilde verebilir.

Çeşitli beyin bozukluklarında nöroinflamasyonu incelemek için, beyinden bağışıklık hücresi preparatları için birçok protokol oluşturulmuş ve farklı laboratuvarlarda kullanılmıştır 15,16,17. Yaygın yaklaşımlar, enzim bazlı hücre ayrışmasını ve ardından gradyan ayrımını içerir. Tipik olarak, bu protokollerde, beyin dokusu kıyılır ve daha sonra hem kollajenaz hem de DNaz içeren bir enzim sindirim solüsyonunda 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca hafifçe çalkalanarak inkübe edilir. Sindirimden sonra hücreler, pipetleme veya Dounce homojenizasyonu gibi mekanik bir yöntem kullanılarak daha fazla ayrışmaya uğrar. Bir hücre süzgecinden (örneğin, 70 μm süzgeç) geçtikten sonra, hücreler daha sonra miyelini, kırmızı kan hücrelerini ve kalıntıları uzaklaştırmak ve lökositleri zenginleştirmek için gradyan santrifüjlemeye (genellikle% 30 /% 70 yoğunluk gradyan çözeltisi) tabi tutulur. Bununla birlikte, bu yaklaşım, beyin bağışıklık hücrelerinin transkriptomunu ve proteomunu önemli ölçüde değiştirebilecek 37 ° C'de uzun süreli bir enzimatik inkübasyon gerektirir. Gerçekten de, sistematik bir araştırma, enzimatik yaklaşımın, belirli beyin hücrelerinin transkriptomunda ve proteotipinde derin değişiklikler meydana getirdiğini ileri sürdü18. Bu, scRNA-seq gibi sonraki transkriptomik analizlerde artefaktlara yol açabilir. Buna karşılık, burada bildirilen protokol, prosedür boyunca soğuk sıcaklıklarda mekanik bir ayrışma yaklaşımı kullanır, böylece hücresel metabolizmayı baskılar. Bu, transkripsiyonel ve proteomik durumun daha iyi korunmasını sağlayarak potansiyel artefaktları en aza indirir. Protokol geliştirme sırasında, beyin dokusunu homojenize etmek için büyük bir Dounce homojenizatör kullanmanın, daha düşük hücre ölümü ile daha yüksek hücre sayıları elde etmek için kritik öneme sahip olduğunu fark ettik. Dounce homojenizasyonu sırasında, hücre dışı matrislerin, hücre kalıntılarının ve sitoplazmik bileşenlerin büyük varlığının hücreler için toksik olması muhtemeldir. Aşırı miktarda tampon kullanmak, bu toksik maddelerin seyreltilmesine yardımcı olur ve böylece zararlı etkilerini azaltarak daha iyi hücre canlılığına yol açar. Akış sitometrisi verileri, bu protokolle hazırlanan bağışıklık hücrelerinin yaklaşık% 85'lik bir canlılık oranını doğruladı. Ayrıca, sadece% 30'luk bir yoğunluk gradyan çözeltisi ile santrifüjlemenin beyin bağışıklık hücrelerini etkili bir şekilde zenginleştirdiği ve miyelini uzaklaştırdığı dikkate değerdir. Bu aynı zamanda hücre hazırlama maliyetini de azaltabilir.

Kafatası kemik iliğindeki bağışıklık hücreleri ile ilgili çalışmalar hala sınırlıdır. Fare kafatası calvarium'dan hücreleri izole etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, kafatasının küçük parçalara ayrılmasını ve ardından parçaların bir havaneli6 ile mekanik olarak ezilmesini içerir. Mevcut protokolde kısa santrifüjleme kullanılmaktadır. Bu yöntem, femur ve tibialardan kemik iliği hazırlamak için yayınlanmış bir protokolden uyarlanmıştır19. Bu uzun kemikler için, santrifüj ile kemik iliğini toplamak için kemiğin sadece bir ucunu kesmek yeterlidir. Kafatası için bu adım, ilik boşluğunu açmak için birkaç küçük parçaya bölünerek değiştirilir. Tekrarlanabilir hücre sayıları elde etmek için kafatasını kesmek için tutarlı bir model kullanılması önerilir. Ayrıca, kemik iliği hücrelerinin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için, kafatası parçaları, her santrifüjleme arasında karıştırılarak 2-3 tur santrifüjlemeye tabi tutulabilir.

Her iki protokolün de sınırlamaları vardır. İlk olarak,% 30 yoğunluk gradyan çözeltisi santrifüjlemesinin kullanılması, beyinde kalan kırmızı kan hücrelerini etkili bir şekilde çıkaramayabilir, bu da eksik perfüzyon nedeniyle ortaya çıkabilir. Ayrıca, miyelin yapısı belirli koşullar altında modüle edilirse,% 30'luk bir yoğunluk gradyan çözeltisi, bunların uzaklaştırılması için optimal bir konsantrasyon olmayabilir. Bu durumda, yoğunluk gradyan çözeltisinin başka bir çalışma konsantrasyonunun oluşturulması gerekir. İkincisi, akış sitometrisi analizi, tarif edilen protokolü kullanarak beyin bağışıklık hücrelerinin iyi hücre canlılığını gösterse de, aktinomisin D'nin kullanılabileceği transkriptomik analiz gibi diğer uygulamalar için hala değerlendirilmesi gerekir. Üçüncüsü, calvaria kafatası kemik iliğini hazırlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bağışıklık hücrelerinin kafatasının diğer birçok yerinde bulunduğuna dikkat edilmelidir. Son olarak, meninksler, özellikle dura mater, çeşitli bağışıklık hücrelerini barındırır ve beyin homeostazı ve işlev bozukluğunda rol oynar20. Meninkslerin immün analizi için, başka bir yerde yayınlanan bir protokol kabul edilebilir 17,21,22,23.

Özetle, hem fare beyninden hem de kafatasından bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki sağlam protokol tanımlanmıştır. Bu protokollerin, çeşitli aşağı akış uygulamaları için uygun, büyük miktarda yüksek kaliteli hücre elde etmek için yararlı olması beklenmektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mükemmel editoryal katkısı için Kathy Gage'e teşekkür ederiz. İllüstrasyon figürleri BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Anesteziyoloji Anabilim Dalı (Duke Üniversitesi Tıp Merkezi) ve NIH hibeleri NS099590, HL157354 ve NS127163 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 mL mikrosantrifüj tüpleriVWR76332-066
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleriVWR76332-068
15 mL konik tüplerThermo Fisher Scientific339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide İğneBD Biosciences305195
1x HBSSGibco14175-095
50 mL konik tüplerThermo Fisher Scientific339653
96 kuyuluk V tabanlı mikroplaka SARSTEDT82.1583
AURORA  akış sitometrisiCytek bioscience
BSAFisherBP9706-100
CD11b-AF594BioLegend1012541:500 seyreltme
CD19-BV785BioLegend1155431:500 seyreltme
CD19-FITCBioLegend1155061:500 seyreltme
CD3-APCBioLegend1003121:500 seyreltme
CD3-PEBioLegend1002061:500 seyreltme
CD45-Alex 700BioLegend1031281:500 seyreltme
CD45-BV421Biolegend1031331:500 seyreltme
Hücre Süzgeci 70 umAvantor732-2758
Dikiş ForsepsV. MuellerNL1410
EDTAInvitrogen15575-038
Fc BlokBiolegend1013201:100 seyreltme
ForsepsRobozRS-5047
LIVE/DEAD Fixable Mavi Hücre Ölüm Boyama KitiThermo Fisher ScientificN71671:500 seyreltme
Ly6G-BV421BioLegend1276281:500 seyreltme
Ly6G-PerCp-cy5.5BioLegend1276151:500 seyreltme
NK1.1-APC-cy7BioLegend1087231:500 seyreltme
Percoll (yoğunluk gradyan ortamı)Cytiva17089101
Fosfat tamponlu salin (10x)Gibco70011-044
RBC Lizis Tamponu (10x)BioLegend420302
MakasSKLAR64-1250
WHEATON Dounce Doku, 15 mL BoyutuDWK Life Sciences357544

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).">Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).
  2. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).">Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
  3. Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).">Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
  4. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).">Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
  5. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).">Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
  6. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), 7844(2021).">Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), 7844(2021).
  7. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), 9277(2021).">Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), 9277(2021).
  8. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).">Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
  9. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).">Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
  10. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).">Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
  11. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340(2023).">Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340(2023).
  12. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).">Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).
  13. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).">Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
  14. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).">Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
  15. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. (108), e53658(2016).">Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. (108), e53658(2016).
  16. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).">Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
  17. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. (159), e61166(2020).">Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. (159), e61166(2020).
  18. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).">Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  19. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).">Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).
  20. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).">Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).
  21. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).">Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).
  22. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).">Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).
  23. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).">Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

m n H cre zolasyonuBeyin skemisiKafatas Kemik li iAk SitometrisiTek H cre S spansiyonuMekanik DisosyasyonYo unluk GradyanN roinflamasyonBeyin Dokusumm nofenotipleme

İlgili makaleler