Canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını izlemek için bölünmüş lusiferaz yeniden birleştirme testi oluşturduk. Bu tahlili kullanarak, kimyasal işlem koşulu altında HEK293T hücrelerdeki bu organeller arası eşleşmelerin seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Endoplazmik retikulum (ER)-mitokondri temas bölgeleri,Ca2+ ve lipid homeostazının düzenlenmesi, mitokondriyal dinamikler, otofagozom ve mitofagozom biyogenezi ve apoptoz gibi hücre sağlığı ve homeostazda kritik bir rol oynar. Normal ER-mitokondriyal eşleşmenin sürdürülememesi, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz ve kalıtsal spastik parapleji gibi birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynar. ER-mitokondriyal temasların düzensizliğinin hücre ölümüne nasıl yol açabileceğini ve bu temasların normal seviyeye onarılmasının nörodejeneratif durumları iyileştirip iyileştiremeyeceğini araştırmak büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, bu temasların seviyesini ölçen gelişmiş tahliller, bu hastalıkların patojenik mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Sonuç olarak, basit ve güvenilir tahlillerin oluşturulması, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır. Burada, canlı hücrelerdeki ER-mitokondri temaslarının seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir bölünmüş lusiferaz testini açıklıyoruz. Bu test, bu temasların patofizyolojik rolünü incelemek ve yüksek verimli taramada modülatörlerini tanımlamak için kullanılabilir.
Giriş
ER ve mitokondri arasındaki etkileşimler hücresel homeostaz ve sağkalım için hayati önem taşır 1,2,3,4. Önceki kanıtlar, ER-mitokondri temas bölgelerindeki herhangi bir bozulma veya düzensizliğin çeşitli nörodejeneratif, metabolik ve kardiyovasküler hastalıkların yanı sıra kansere katkıda bulunabileceğini göstermektedir 5,6,7,8,9,10.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre bakımı ve tohumlama (1. Gün)
- %10 fetal sığır serumu (FBS) ile (100 mm kültür kaplarında) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren hücre kültürü ortamındaki hücre kültürü ortamındaki HEK293T hücrelerini, 37 ° C'de% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatördekoruyun.
- Başlamadan önce, mikroskop altında görüntüleyerek plakanın birleşip birleşmediğini kontrol edin. Hücreler yaklaşık% 80-90 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkararak ve 10 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile yıkayarak hücreleri 6 oyuklu bir kültür plakasında tohumlamaya hazırlanın.
- DPBS....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Spesifik GTPazları inhibe ettiği bilinen üç bileşiğin eklenmesi üzerine ER-mitokondri temaslarının seviyesini ölçmek için yukarıda açıklanan protokolü kullandık. CDC42, RHO ve RAC, aktive edildiğinde aktin polimerizasyonunu28 destekleyen ve sırasıyla ZCL278, Rhosin ve Ehop-016 tarafından inhibe edilenGTPazlardır 24. Split-Rluc ile transfekte edilen HEK293T hücreler DMSO (kontrol), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) veya Ehop-016 (25 μM) ile muamele edildi ve 1 saat, 2 .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
ER-mitokondri eşleşmelerinin seviyesini ölçmek için bir bölünmüş Renilla lusiferaz 8 yeniden birleştirme testi (split-Rluc testi) kullandık. Bu çalışmada, tek bir vektör, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry üreterek, her bir split-Rluc bileşenini kodlayarak orijinal split-Rluc yapısını24 değiştirdik (MitoRlucN ve RlucCER) ve lusiferazın her böl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, makalenin eleştirel incelemesi için Dr. Jeffrey Golden'a (Cedars-Sinai Tıp Merkezi) müteşekkirdir. Bu çalışma kısmen Ulusal Nörolojik Hastalık ve İnme Enstitüsü (NINDS, R01NS113516) tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,7 mL SafeSeal Mikrosantrifüj Tüpü | Sorenson | 16070 | |
| 6 oyuklu plaka TC İşlem Görmüş | ABD Bilimsel | CC7682-7506 | |
| 10 mL Pipet Uçları OneTip | ABD Bilimsel | 1110-3700 | |
| 10 μ L pipet uçları OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 20-200 & L Eğimli uçlar OneTip | USA Scientific | 1111-1210 | |
| 50 mL Polipropilen Konik Boru | Falcon | 352070 | |
| 96 Kuyulu Flipper Mikrotüp Rafları | ThermoFisher Scientific | 8770-11 | |
| 96 oyuklu plaka TC Işlenmiş | ABD Bilimsel | CC7682-7596 | |
| 100 mm x 20 mm TC İşlenmiş Tabak | ABD Bilimsel | CC7682-3394 | |
| 1250 & L İpuçları OneTip | USA Scientific | 1112-1720 | |
| Santrifüj 5910 Ri - Soğutmalı Santrifüj | Eppendorf | 5943000131 | |
| Dimetil sülfoksit, susuz vb; % 99,9 | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM, yüksek glikoz | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| EHop 016 | Bio-Techne Tocris | 6248 | DMSO'da çözün; -70 °C'de saklayın; C |
| EnduRen Canlı Hücre Substratı | Promega | E6481 | Alikotları -70 ° C'de saklayın; C |
| Eppendorf 2-20 μ L pipet | Eppendorf | 3123000039 | |
| Eppendorf Research plus 100-1000 μ L pipet | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus 1-10 & mikro; L pipet | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus 12 kanallı | Eppendorf | 3125000028 | |
| Eppendorf Research plus 200 μ L pipet | Eppendorf | ||
| Fetal Sığır Serumu, nitelikli, USDA onaylı bölgeler | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 İnkübatör, 184 L, Cilalı Paslanmaz | Çelik ThermoFisher Scientific | 381 | |
| El çetele sayacı | Sigma-Aldrich | HS6594 | |
| HEK 293T Hücreleri | ATCC | CRL-3216 | |
| Hemasitometre - Neubauer Parlak Çizgi, Çift Sayma Odası | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
| Invitrogen TE Tamponu | ThermoFisher Scientific | 8019005 | |
| Mikroskop | Zeiss | Axiovert 25 CFL | |
| Mini santrifüj | Benchmark Scientific | C1012 | |
| 50ml Konik, 15ml Konik ve Mikrosantrifüj Tüpleri İçin Çok Tüplü Raf | Boekel Scientific | 120008 | |
| PEI MAX - Transfeksiyon Sınıfı Lineer Polietilenimin Hidroklorür (MW 40.000) | Polysciences | 24765-100MG | |
| Pipet-Aid XP | USA Scientific | 4440-0101 | |
| Poli-D-lizin hidrobromür | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Rhosin hidroklorür | Bio-Techne Tocris | 5003 | DMSO'da çözün; -70 ° C'de saklayın; C |
| Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Varioskan LUX çok modlu mikroplaka okuyucu | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | |
| Vortex ThermoFisher Scientific | 2215365 | seviye 8 | |
| VWR Vakum Aspirasyon Sistemi | VWR | 75870-734 | |
| ZCL 278 | Bio-Techne Tocris | 4794 | DMSO'da çözün; -70 ° C'de saklayın; Ç |
Kaynaklar
- Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
- Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitoc....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
