Yöntem makalesi

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

2.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66862

⸱

11 Ekim 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını izlemek için bölünmüş lusiferaz yeniden birleştirme testi oluşturduk. Bu tahlili kullanarak, kimyasal işlem koşulu altında HEK293T hücrelerdeki bu organeller arası eşleşmelerin seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Endoplazmik retikulum (ER)-mitokondri temas bölgeleri,Ca2+ ve lipid homeostazının düzenlenmesi, mitokondriyal dinamikler, otofagozom ve mitofagozom biyogenezi ve apoptoz gibi hücre sağlığı ve homeostazda kritik bir rol oynar. Normal ER-mitokondriyal eşleşmenin sürdürülememesi, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz ve kalıtsal spastik parapleji gibi birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynar. ER-mitokondriyal temasların düzensizliğinin hücre ölümüne nasıl yol açabileceğini ve bu temasların normal seviyeye onarılmasının nörodejeneratif durumları iyileştirip iyileştiremeyeceğini araştırmak büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, bu temasların seviyesini ölçen gelişmiş tahliller, bu hastalıkların patojenik mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Sonuç olarak, basit ve güvenilir tahlillerin oluşturulması, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır. Burada, canlı hücrelerdeki ER-mitokondri temaslarının seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir bölünmüş lusiferaz testini açıklıyoruz. Bu test, bu temasların patofizyolojik rolünü incelemek ve yüksek verimli taramada modülatörlerini tanımlamak için kullanılabilir.

Giriş

ER ve mitokondri arasındaki etkileşimler hücresel homeostaz ve sağkalım için hayati önem taşır 1,2,3,4. Önceki kanıtlar, ER-mitokondri temas bölgelerindeki herhangi bir bozulma veya düzensizliğin çeşitli nörodejeneratif, metabolik ve kardiyovasküler hastalıkların yanı sıra kansere katkıda bulunabileceğini göstermektedir 5,6,7,8,9,10. Örneğin, mitokondriye Ca2+ alımının anormal bir şekilde artması, Alzheimer hastalığının bazı modellerinde yaygın olarak görülen mitokondri geçirgenlik geçiş gözeneklerini açarak hücre ölümüne yol açabilir 5,11. Benzer şekilde, azalmış ER-mitokondri temasları, amyotrofik lateral skleroz 5,11,12 modellerinde görüldüğü gibi, ATP üretiminde bir azalmaya ve Ca2+ alımının bozulmasına neden olabilir. ER-mitokondri temasları alanında daha fazla çalışma yürütülürken, bu temasları etkileyebilecek hastalıkla ilgili ek proteinler ve genler keşfedilmektedir. ER-mitokondri temas bölgelerinin rolünü gösteren mevcut bilgi ve kanıtlara rağmen, bu temasların hücresel fonksiyon kaybına ve nihayetinde hücre ölümüne nasıl yol açabileceğini aydınlatmak için hala çok çalışmaya ihtiyaç vardır.

İki zarın yakınlığını, yapısal morfolojiyi ve iki organel temas bölgesi arasındaki mesafeyi değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir 3,4,13. ER-mitokondri eşleşmesini izleme yaklaşımları, epifloresan ve konfokal mikroskopi kullanan floresan işaretleyici tabanlı görüntüleme14,15, FRET-raportör tabanlı görüntüleme16 ve bölünmüş floresan prob tabanlı görüntüleme 17,18'i içerir. Süper çözünürlük ve atomik çözünürlük mikroskobu da organeller arası temasları doğru bir şekilde görselleştirmek için güçlü araçlardır, ancak temas bölgesi analizinde kullanımları, son derece özel mikroskoplar ve teknik uzmanlık gerektirdiğinden hala sınırlıdır19. Ek olarak, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve elektron tomografisi (ET) ve kriyo-elektron mikroskobu gibi diğer EM teknikleri, temas bölgelerinin yüksek çözünürlüklü ultrastrüktürel görüntülemesini sağladıkları için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bunlar genellikle diğer deneysel yaklaşımlar kullanılarak keşfedilmesi imkansızdır 20,21,22. Bununla birlikte, bu EM tabanlı yöntemler, kimyasal fiksasyon prosedürlerinden de etkilenebilen çok düşük verimli bir tekniktir. Daha yakın zamanlarda, temas bölgelerini tespit etmenin yanı sıra yeni temas bölgesi proteinlerini tanımlamak için yakınlık etiketleme tabanlı yöntemler kullanılmıştır. Örneğin, organel yakınlıklarını23,24 ölçmek için yakınlık ligasyon testi (PLA) kullanılırken, yeni temas bölgesi proteinlerinin 25,26 tanımlanmasında askorbat peroksidaz (APEX) testinin gözden geçirilmiş bir versiyonu kullanılmıştır. Yukarıda açıklanan tüm bu yöntemlerin, organeller arasındaki temasları tespit etmede güçlü yönleri ve içsel sınırlamaları olduğunu bilmek önemlidir. Bu nedenle, organel temas bölgelerinin kapsamlı bir yorumunu elde etmek için farklı tekniklerin eşleştirilmesi gerekir.

Daha önce, ER-mitokondri membran temaslarının seviyesini izlemek için bölünmüş Renilla lusiferaz 8 yeniden birleştirme testini (split-Rluc testi) kurduk (Şekil 1A)24,26,27. Kısaca, Renilla lusiferazın her bölünmüş yarısı, bir ER veya mitokondri hedefleme dizisi ile konjuge edilir. Birlikte transfekte edildiğinde, enzimin her bölünmüş yarısı ya ER ya da mitokondriyal membranda eksprese edilir. ER ve mitokondri birbirine yakın konumlandırıldığında, bölünmüş yarımlar bir araya gelir ve lusiferaz aktivitesi ile tüm enzimi yeniden oluşturur. Split-Rluc yapısı için, ilk şablon için pBAD/Myc-His27'de Renilla lusiferaz 8 (Rluc8) kullandık. Bölünme bölgesi (91 ve 92 amino asitleri arasında) önceki raporlara27 dayanarak belirlendi. Rluc8'in N-terminal yarısı için, Rluc8'in 1-91 amino asitleri için DNA dizileri, FLAG etiketinin 3' ucuna ve PCR27 ile pcDNA3.1 TOPO vektöründe fare AKAP1 mitokondriyal hedefleme dizisine kaynaştırıldı. ER'ye hedeflenen C-terminal yarısı için, 92-311 amino asitlerini kodlayan DNA dizileri, myc etiketinin 5' ucuna ve maya UBC6 ER lokalizasyon dizisine kaynaştırıldı. Burada, split-Rluc plazmit yapısını, Renilla lusiferazın bölünmüş yarılarının aynı promotör altında tek bir vektörde (pCAG) ifade edileceği ve daha sonra Thosea asigna virüsünden kendi kendine bölünen bir peptit 2A dizisi olan T2A olarak iki parçaya bölüneceği şekilde yükselttik, iki bölünmüş yarı arasına yerleştirilir (Şekil 1B). Plazmid DNA haritası ve dizileri Ek Dosya 1 ve Ek Şekil S1'de verilmiştir. Bu sistemi kullanarak, üç kimyasalın (aktin polimerizasyonunda yer alan GTPazları inhibe eden) ER-mitokondri kontakları üzerindeki etkilerini ölçtük. Bu split-Rluc testi, organeller arası temas modülatörleri24 için yüksek verimli tarama için basit ama sağlam bir test sistemidir.

Protokol

1. Hücre bakımı ve tohumlama (1. Gün)

  1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile (100 mm kültür kaplarında) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren hücre kültürü ortamındaki hücre kültürü ortamındaki HEK293T hücrelerini, 37 ° C'de% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatördekoruyun.
  2. Başlamadan önce, mikroskop altında görüntüleyerek plakanın birleşip birleşmediğini kontrol edin. Hücreler yaklaşık% 80-90 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkararak ve 10 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile yıkayarak hücreleri 6 oyuklu bir kültür plakasında tohumlamaya hazırlanın.
  3. DPBS'yi kültür kabından çıkarın ve hücrelere 1 mL %0.05 Tripsin-EDTA fenol kırmızısı uygulayın. 3 dakika inkübe edin, daha sonra plakayı inkübatörden çıkarın ve tripsin reaksiyonunu durdurmak için 9 mL kültür ortamı (% 10 FBS ile DMEM) ekleyin. Plakaya hala yapışmış olan hücrelerin yerinden çıktığından emin olmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Ortamı çıkarın ve hücre peletlerini 1 mL taze ortam (DMEM +% 10 FBS) ile yeniden süspanse edin.
  5. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.
    1. Tüpü hafifçe döndürerek hücrelerin eşit dağılımını sağlayın. Hemen 10 μL hücre süspansiyonunu çıkarın ve 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Aynı tüpe 90 μL ortam ekleyin.
    2. Hücreleri ve ortamı nazikçe karıştırdıktan sonra, hücre süspansiyonunu alın ve lamel altına hafifçe pipetleyerek hemositometrenin her bir odasına 10 μL uygulayın.
    3. 10x'lik bir objektif kullanarak, hemositometrenin ızgara çizgilerini mikroskop altında odaklayın. Odaklandıktan sonra, bir el çetele sayacı kullanarak 16 kareden (4 x 4 kare) oluşan bir kümedeki hücre sayısını sayın. 16 kareden oluşan dört setin tümü sayılana kadar tekrarlayın.
    4. Ortalama hücre sayısını (16 köşe karenin her birinden) alarak ve bunu 105 ile çarparak toplam hücre sayısını/mL'yi hesaplayın.
      NOT: Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanmak yerine, üreticinin talimatlarına göre otomatik bir hücre sayacı kullanılabilir.
  6. Hücre sayımı tamamlandıktan sonra, hücreleri 2 mL ortam/kuyucuk ile 7,5 × 105 hücre/kuyu yoğunluğunda 6 oyuklu bir plakada plakalamaya hazırlayın. 50 mL'lik bir tüpte, 13 mL ortam ile birlikte gerekli hacimde hücre ekleyin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 2 mL'sini 6 kuyucuğun her birine dağıtın.
    1. Kaplamadan önce, C1V1 = C2V2 kullanarak 7.5 × 105 hücre / kuyu için gerekli hücre sayısını hesaplayın, burada C1 ilk hücre sayısıdır (hücre sayısı / mL), V1 ilk hücre süspansiyonundan gereken hacimdir, C2 istenen hedef hücre yoğunluğudur (hücre sayısı / mL), ve V2, hücre tohumlaması için gereken son hacimdir.
  7. Dağıttıktan sonra, hücreleri yaymak için plakayı her tarafına hafifçe vurun ve ardından gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.

2. Polietilenimin (PEI) aracılı hücre transfeksiyonu ve transfeksiyon sonrası hücre tohumlaması (2. Gün)

  1. 6 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve mevcut kültür ortamını her bir oyuktan aspire edin. Oyuk başına 2 mL taze ortam ekleyin.
  2. Hücreleri, TE tamponunda (pH 8.0) çözünmüş bölünmüş Rluc plazmid DNA (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry) ile transfekte edin.
    1. Her kuyucuk için, DNA (750 ng) ve PEI'yi (DNA / PEI oranı = 1: 3) 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL DMEM'de karıştırın. Kompleks oluşturmak üzere birlikte iyice karışmalarını sağlamak için DNA/PEI'yi 8. seviyede yaklaşık 2 saniye boyunca hızlı bir şekilde girdaplayın. Bundan sonra, mini bir santrifüjde kısa bir süre (<3 sn) döndürün.
    2. DNA / PEI karışımının oda sıcaklığında 15 dakika inkübe etmesine izin verin ve ardından karışımı (düşürerek) hücreleri içeren 6 oyuklu plakadaki kültür ortamının yüzeyine ekleyin. Plakaya hafifçe vurun (karışımı eşit şekilde dağıtmak için) ve 37 ° C'de 5 CO2 ile 6 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
  3. İnkübe edilirken, önce her bir oyuğa 70 μL PDL (DPBS'de 50 μg/mL) ekleyerek ve en az 1 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe ederek Poli-D-Lizin (PDL) kaplı 96 oyuklu bir plaka hazırlayın. PDL solüsyonunu çıkarın ve ardından her bir kuyucuğu 2x 100 μL DPBS ile yıkayın. İkinci yıkamanın sonunda, kalan tüm DPBS'nin çıkarıldığından emin olun.
  4. Transfeksiyondan 6 saat sonra, transfekte edilmiş hücreleri PDL kaplı 96 oyuklu bir plakada tohumlamaya hazırlanın.
    1. İnkübatörden transfekte edilmiş hücreleri içeren 6 oyuklu plakayı çıkarın, ortamı aspire edin ve her bir kuyucuğu 2 mL DPBS ile yıkayın. DPBS'yi çıkardıktan sonra, 350 μL% 0.05 Tripsin-EDTA fenol kırmızısı ekleyin ve 1-2 dakika inkübe edin. Tripsin reaksiyonunu durdurmak için, her oyuğa 1.7 mL ortam ekleyin.
    2. Hücreleri ortamla birlikte 50 mL'lik bir tüpe aktardıktan sonra, tüpü bir masa üstü santrifüjde 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Ortamı aspire edin ve hücre peletini 1 mL taze ortam ile yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın (adım 1.5'te açıklandığı gibi).
  5. Hücreleri, 100 μL kültür ortamında 4 ×10 4 hücre / kuyu yoğunluğunda PDL kaplı 96 oyuklu bir plakada tohumlayın. Bunun için, 50 mL'lik bir tüpe, uygun hacimde ortam (12 mL toplam hacim) ile birlikte gerekli hücre hacmini (hesaplama için aşağıya bakın) ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuğun her birine 100 μL seyreltilmiş hücre süspansiyonu dağıtın. Hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 18 saat inkübe edin.
    1. C1V1 = C2V2 kullanarak 4 × 104 hücre / kuyu için gerekli hücre sayısını hesaplayın, burada C1 ilk hücre sayısıdır (hücre sayısı / mL), V1 ilk hücre süspansiyonundan gereken hacimdir, C2 istenen hedef hücre yoğunluğudur (hücre sayısı / mL) ve V2 hücre tohumlaması için gereken son hacimdir.

3. Canlı hücrelerde kimyasal arıtma ve lusiferaz deneyi (3. Gün)

  1. 1.7 mL'lik bir mikrofüj tüpünde, 50 μM Rhosin (DMSO'da 50 mM stok), 25 μM Ehop-016 (DMSO'da 25 mM stok) ve 50 μM ZCL278'den oluşan üç taze çözeltiyi hazırlayın (DMSO'da 50 mM stok) her bir stok çözeltisini (50 mM Rhosin, 25 mM Ehop-016 ve 50 mL ZCL278; tümü DMSO'da) 1: 1.000 gerekli miktarda (50 μL / kuyu × kuyu sayısı) kültür ortamı. Her çözeltiye, 1: 2.000 oranında 25 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltilmiş Renilla lusiferaz için canlı hücre substratı (DMSO'da 50 mM stok) ekleyin. 0.5, 5 ve 50 μM ZCL278 çözeltileri yapmak için, kültür ortamında ilk 50 μM ZCL278'i kullanarak seri seyreltmeler gerçekleştirin.
    NOT: Kimyasal inkübasyon süresi 1-1.5 saatten daha az bir süre için isteniyorsa, hücreler her bir kimyasal ile muamele edilmeden önce 1-1.5 saat boyunca canlı hücre substratı ( Renilla lusiferaz için) ile ön inkübe edilebilir. Yüksek verimli ilaç taraması protokolünü optimize etmek için kimyasallar ve canlı hücre substratını aynı anda ekliyoruz.
  2. Transfekte edilmiş hücreler içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan ortamı çıkarın ve her oyuğa 50 μL kimyasal ve substrat ortamı karışımı ekleyin.
  3. Hücreleri 1 saat, 2 saat veya 5 saat inkübe ettikten sonra, kültür plakasını inkübatörden çıkarın, lüminesans plakası okuyucusuna yükleyin ve lüminesansı ölçün.
    1. Başlamadan önce plaka okuyucunun açık olduğundan emin olun. Mikroplaka okuyucu yazılımına erişin ve Yeni Oturum'a tıklayarak yeni bir dosya oluşturun. İnkübatör'e tıklayarak, sıcaklık seçeneğini kontrol ederek ve 37 °C yazarak plaka okuyucunun sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın. Plaka Düzeni altında, Bilinmeyen seçeneğini belirleyin ve tıklayıp sürükleyerek ölçülecek kuyuları belirtin.
    2. Protokol altında, Lüminesans'ı tıklatın ve varsayılan ayarlara devam edin. Kurulumu tamamladıktan sonra, plakayı kapağı kapalı olarak plaka okuyucuya yükleyin ve Plakayı İçeri Çalıştır'ı seçin. Başlat'a tıklayın ve dosyayı kaydet penceresi görünecektir. Dosyayı yeniden adlandırıp Kaydet'i tıklatarak masaüstünüze kaydedin.
      NOT: Lüminesans, canlı hücre substratının eklenmesinden sonra >24 saat boyunca üretilmeye devam edecektir.
  4. Okuma tamamlandığında, plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve ardından okuyucuyu tekrar takmak için Plakayı Çalıştır'a tıklayın. Tamamlandığında, plakayı bir sonraki okumaya kadar nemlendirilmiş inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) geri yerleştirin.
  5. Bitirdiğinizde, her değişken (örneğin, kimyasallar veya konsantrasyonlar) (x ekseni) için bağıl lüminesans birimini (RLU) (y ekseni) çizmek ve verileri analiz etmek için lüminesans verilerini bir grafik programına aktarın.

4. Split-Rluc testinin diğer yöntemlerle doğrulanması.

  1. Daha önce açıklandığı gibi split-Rluc testinden elde edilen sonuçları doğrulamak için yakınlık ligasyon testi (PLA), transmisyon elektron mikroskobu ve mitokondriyal kalsiyum alım izleme gibi diğer testleri gerçekleştirin24.

Sonuçlar

Spesifik GTPazları inhibe ettiği bilinen üç bileşiğin eklenmesi üzerine ER-mitokondri temaslarının seviyesini ölçmek için yukarıda açıklanan protokolü kullandık. CDC42, RHO ve RAC, aktive edildiğinde aktin polimerizasyonunu28 destekleyen ve sırasıyla ZCL278, Rhosin ve Ehop-016 tarafından inhibe edilenGTPazlardır 24. Split-Rluc ile transfekte edilen HEK293T hücreler DMSO (kontrol), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) veya Ehop-016 (25 μM) ile muamele edildi ve 1 saat, 2 saat ve 5 saat inkübe edildi. Bir plaka okuyucu kullanarak, tanımlanmış zaman noktalarında split-Rluc aktivitesini ölçtük (Şekil 2).

Rhosin (RHO GTPaz inhibitörü) ile tedavi edilen hücreler, tedavinin 1 saat, 2 saat ve 5 saatinde kontrol DMSO ile tedavi edilen hücrelere kıyasla lusiferaz aktivitesinde önemli bir değişiklik göstermedi (p > 0.9999, p = 0.6956, p > 0.9999) (Şekil 2). Bu sonuçlar, Rhosin'in ER-mitokondri temaslarını etkilemediğini göstermektedir, bu da iki organel arasındaki temasların düzenlenmesinde RHO GTPase aktivitesinin hiçbir katılımı olmadığını düşündürmektedir.

Buna karşılık, RAC GTPaz inhibitörü Ehop-016, tedavinin 1 saat, 2 saat ve 5 saatinde DMSO'dan önemli ölçüde daha düşük lusiferaz aktivitesi gösterdi (p = 0.0106, p = 0.0009, p = 0.0024) (Şekil 2). Bu veriler, hücrede normal ER-mitokondri etkileşimini sürdürmek için RAC GTPaz aktivitesinin gerekli olduğunu göstermektedir.

Son olarak, CDC42 inhibitörü ZCL278, lusiferaz aktivitesinde en ciddi değişiklikleri gösterdi (Şekil 2). ZCL278 ile tedavi edilen hücreler, kontrol DMSO'ya kıyasla lusiferaz aktivitesinde önemli bir azalma gösterdi ve her üç zaman noktasında da en düşük p değerlerine sahipti ve boyunca 0.0001'< bir p değerini korudu. Verilerimiz, CDC42 GTPaz aktivitesi ZCL278 tarafından bloke edildiğinde, bölünmüş lusiferazın her bir yarısını ayrı ayrı kodlayan iki vektörle birlikte transfekte edilmiş hücrelerde gerçekleştirilen orijinal split-Rluc testini kullanan önceki raporumuzla tutarlı olarak, ER-mitokondri eşleşmesinin güçlü bir inhibisyonunu göstermektedir24.

ZCL278 ile çarpıcı sonuçlar göz önüne alındığında, özellikle diğer GTPase inhibitörleri ile karşılaştırıldığında, ZCL278 aktivitesi, bir DMSO kontrolüne karşı çeşitli konsantrasyonlarda [0.5 μM, 5 μM, 50 μM] daha fazla test edildi. Tedaviden 1 saat, 2 saat ve 5 saat sonra ölçülen lusiferaz aktiviteleri doza bağlı bir yanıt gösterdi; 0.5 μM ZCL278, lusiferaz aktivitesi üzerinde en zayıf etkiye neden olurken, 5 μM daha güçlü ve 50 μM, sulandırılmış enzim aktivitesinde en güçlü azalmayı gösterdi (Şekil 3). Birlikte, sonuçlarımız ZCL278'in split-Rluc aktivitesini doza bağlı bir şekilde aşağı regüle ettiğini ve zaman ilerledikçe, daha yüksek ZCL278 konsantrasyonlarının (CDC42 inhibitörü), daha düşük konsantrasyonlara kıyasla kontrol DMSO'suna göre hala önemli bir değişiklik gösterdiğini göstermektedir.

Split-Rluc testimizi doğrulamanın bir yolu olarak, yakınlık ligasyon testi (PLA), transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve mitokondriyal kalsiyum alımı izleme gibi iyi bilinen bağımsız testler yapılabilir (Şekil 4 ve veriler gösterilmemiştir)24. ER-mitokondri temas promotörleri için ekranımızda tanımlanan bileşiklerden biri olan bir β2 adrenerjik reseptör agonisti olan izoproterenol (Şekil 4A), izoproterenol tedavisi üzerine split-Rluc'un lusiferaz aktivitesinin, PLA sinyal yoğunluğunun yanı sıra mitokondriyal kalsiyum alımındaki değişikliklerle gösterildiği gibi gelişmiş ER-mitokondri temasları nedeniyle arttığını doğrulamak için kullanıldı (Şekil 4B-E).

figure-results-1
Şekil 1: split-Rluc yeniden birleştirme testi. (A) Split-R Luc testinin şematik gösterimi. Mitokondri ve endoplazmik retikulum arasında zar teması olmadığında, Mito-R lucN ve RlucC-ER etkileşime giremez ve bu nedenle Rluc8 aktivitesi yoktur. Bununla birlikte, ER ve mitokondri zarlarının temas ettiği Mito-R lucN ve RlucC-ER arasındaki etkileşim, substratın lüminesansa dönüştürülmesiyle tespit edilen tam enzimatik aktivite ile sonuçlanır. (B) Split-Rluc DNA yapısının şematik haritası (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (C) HEK293T hücrelerde split-Rluc testi için iş akışı şeması. Kısaltmalar: Mito = mitokondri; ER = endoplazmik retikulum; IRES, iç ribozomal giriş bölgesi; rb_glob pA, tavşan beta-globin poli adenilasyon sinyali; T2A, Thosea asigna virüsünden kendi kendine parçalanan bir peptit 2A dizisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: GTPaz inhibitörleri ile tedavi edilen hücrelerdeki ER-Mito temas seviyelerine karşılık gelen split-R luc aktiviteleri. (AC) DMSO (kontrol), Rhosin [50 μM], Ehop-016 [25 μM] veya ZCL278 [50 μM] tedavisinden (her grup için n = 12) sonra (A) 1 saat, (B) 2 saat veya (C) 5 saat sonra sulandırılmış lusiferaz aktiviteleri. Tüm veriler tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak ve çoklu karşılaştırmalar yapılarak analiz edilmiştir. P değerleri p > 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****) olarak rapor edildi. Hata çubukları± standart ölçüm hatasını gösterir. Kısaltmalar: Mito = mitokondri; ER = endoplazmik retikulum; RLU = bağıl ışık birimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: ZCL278 ile tedavi edilen hücrelerde ER-Mito kontaklarının seviyelerini ölçen split-R luc aktiviteleri. (A-C) DMSO'dan (kontrol) veya [0.5 μM], [5 μM] veya [50 μM] konsantrasyonda ZCL278'den (A) 1 saat, (B) 2 saat veya (C) 5 saat sonra sulandırılmış lusiferaz aktiviteleri (her grup için n = 12). Tüm veriler tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak ve çoklu karşılaştırmalar yapılarak analiz edilmiştir. P değerleri p > 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****) olarak rapor edildi. Hata çubukları± standart ölçüm hatasını gösterir. Kısaltmalar: Mito = mitokondri; ER = endoplazmik retikulum; RLU = bağıl ışık birimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: split-Rluc testinin doğrulanması. (A) ER-mitokondri temas destekleyicileri için bir bileşik ekranda tanımlanan izoproterenol dahil olmak üzere 11 ilaçla HEK293T hücrelerinin işlenmesinden sonra split-Rluc aktivitesinin nicelleştirilmesine bir örnek. (B) DMSO veya izoproterenol (1 μM) ile tedavi edilen HeLa hücrelerinde yakınlık ligasyonu testine bir örnek. PLA sinyali (kırmızı), ER ve Mito arasında yakın bir temas olduğunu gösterir. Sec61-GFP (yeşil): ER'yi etiketlemek için; DAPI (mavi): çekirdek. (C) A'da PLA sinyalinin nicelleştirilmesi (n = her biri 77-97 hücreli 4 deney; Mann-Whitney testi). (D) Histamine (100 μM) yanıt olarak mitokondriyal kalsiyum alımı. Mito-R-GECO1 floresan yoğunluk değişimi (ortalama birden fazla HeLa hücresi üzerinden alınmıştır) DMSO veya izoproterenol ile tedavi edilen hücrelerde her 2.5 saniyede bir çizilmiştir. Ok, histamin ilavesini gösterir. (E) Sol: A'da maksimum mitokondriyal kalsiyum alımının zirvesi. Eşleşmemiş iki kuyruklu t-testi (n = 10, DMOS; 14, Isoproterenol). Sağ: Mitokondriyal kalsiyum alım hızı ( A'da olduğu gibi; 7,5 ila 12,5 s). Mann-Whitney testi (n = 12, DMSO; 11, Isoproterenol). Bu rakam Lim ve ark.24'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RLU = bağıl ışık birimi; PLA = yakınlık ligasyon testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: ER-mitokondri kontakları için mevcut tekniklerin özeti. Her yöntem için avantajların ve sınırlamaların listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry'nin DNA dizisini (PDF ve GBK formatları) içeren zip dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry haritası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

ER-mitokondri eşleşmelerinin seviyesini ölçmek için bir bölünmüş Renilla lusiferaz 8 yeniden birleştirme testi (split-Rluc testi) kullandık. Bu çalışmada, tek bir vektör, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry üreterek, her bir split-Rluc bileşenini kodlayarak orijinal split-Rluc yapısını24 değiştirdik (MitoRlucN ve RlucCER) ve lusiferazın her bölünmüş yarısının aynı miktarının ekspresyonunu sağlamak için Thosea asigna virüsünden kendi kendine parçalanan bir peptit 2A dizisi. Renilla lusiferaz için bir substrat olarak, coelenterazine yerine, aşağıdaki nedenlerle modifiye edilmiş bir canlı hücre substratı (coelenterazine'nin korumalı türevi; Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıldı. Birincisi, sulu bir ortamda (özellikle serumda daha kötü) otolüminesans üreten coelenterazine'den farklı olarak, bu korumalı türev% 10 serum içeren ortamda çok düşük otolüminesans (genellikle tespit edilemez) üretir, bu nedenle sinyal-arka plan oranı coelenterazine tarafından üretilenden daha yüksektir. İkincisi, substrat eklendikten kısa bir süre sonra lüminesansın en güçlü olduğu ancak çok hızlı bir şekilde azalmaya başladığı coelenterazine'den farklı olarak, modifiye edilmiş canlı substrat tarafından üretilen lüminesans, substrat eklendikten yaklaşık 1,5 saat sonra ulaşılabilen en yüksek noktasına ulaşır ve 24 saatten fazla bir süre boyunca sürekli kalır. Reaksiyon kinetiğindeki bu değişiklikler, yüksek verimli tarama için çok yararlı olan çok kuyulu bir plakada lüminesansın ölçülmesini kolaylaştırır. Ayrıca, korunan substratın uzun vadede sabit kalması tarafından üretilen lüminesans, çeşitli zaman noktalarında kullanılan birden fazla numune setinin (numune başına tek nokta) ölçülmesinin aksine, tek bir numune setinin birden fazla zaman noktasında ölçülmesine izin verir.

Split-Rluc yapısının bu güncellenmiş sürümünü kullanarak, RHO, RAC ve CDC42 GTPazların ER-Mito temas oluşumuna katılıp katılmadığını test ettik. Split-Rluc bileşenlerini eksprese eden hücreleri HEK293T için GTPase inhibitörleri, Rhosin (RHO inhibitörü), Ehop-016 (RAC inhibitörü) ve ZCL278 (CDC42 inhibitörü) ekledik. Test sonuçlarımız, ZCL278'in ER-mitokondri temas oluşumunun en güçlü inhibitörü olduğunu ve Ehop-016'nın bir sonraki önemli inhibitör olduğunu, Rhosin'in ise temaslarını etkilemediğini göstermektedir. Bu veriler, hücredeki ER-mitokondri temaslarını sürdürmek için CDC42 aracılı aktin polimerizasyonunun (ve daha az ölçüde RAC aracılı olanın) gerekli olduğunu, RHO aracılı aktin polimerizasyonunun ise muhtemelen önemli olmadığını göstermektedir.

Maksimum verimliliği sağlamak için bu protokol için dikkate alınması gereken birçok kritik adım vardır. Her şeyden önce, çok fazla DNA'nın hücreler üzerinde toksik bir etkisi olabileceğinden, transfekte edilen yapı miktarı test edilmelidir. İkincisi, hücre sayısı ölçülen lusiferaz seviyeleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğinden, hücrelerin yoğunluğunu protokolde belirtilene yakın tutmak, hücrelerin ideal ve tutarlı% 80 birleşmesini sağlamada çok önemlidir. Kimyasal maruziyet süresi boyunca hücreler birleşirse lüminesansta bir azalma olabilir, çünkü birleşik hücreler genel olarak daha az protein üretir. Üçüncüsü, kimyasalların ve substratın eklenmesi sırasında hücrelerin dökülmemesini sağlamak için, Poli-D-Lizin ile önceden kaplanmış 96 oyuklu bir plaka kullanıyoruz. Dördüncüsü, bu protokolde kullanılan bileşikler (substrat dahil) için, bunları alikotlarda -20 °C veya daha düşük (-70 °C) tutmak ve hemen çözülen hücrelere eklemek önemlidir. Son olarak, lusiferaz aktivitesini etkileyebilecek olası sıcaklık dalgalanmaları nedeniyle, plakanın en içteki kuyucuklarını kullanmayı seçmek ve plakanın dışını kaplayan kuyucukları göz ardı etmek en iyisi olabilir.

Split-Rluc8 testi, yüksek verimli tarama için ideal olan ER-mitokondri kontaklarını belirlemek için kolay ama sağlam bir yöntem sunar; Ancak, dikkat edilmesi gereken bazı sınırlamalar vardır. Hücre fizyolojisi için, yapı DNA'sının sürekli aşırı ekspresyonu nedeniyle hücre davranışında değişiklikler sorunu vardır. Şu anda, sürekli aşırı ekspresyon nedeniyle hücre fizyolojisindeki potansiyel değişikliklerle mücadele etmek için indüklenebilir bir promotöre sahip bir yapı üzerinde çalışıyoruz. Ayrıca, bu test bir tarama amacıyla kullanıldığında, ilaçların i) ekspresyon seviyeleri, ii) söz konusu protein fragmanlarının organel hedefleme etkinlikleri veya iii) sulandırılmış lusiferazların enzimatik aktiviteleri üzerindeki herhangi bir dolaylı etkisinden yanlış pozitif sonuçların ortaya çıkabileceğine dikkat edilmelidir. Bu sınırlamalar nedeniyle, sonuçları daha fazla doğrulamak için bu tahlil diğer yöntemlerle birlikte test edilmelidir. Tablo 1, bu iletişim yerlerini avantaj ve dezavantajlarıyla birlikte test etmenin çeşitli yöntemlerini ifade etmektedir. Proteinler arasındaki yakınlığı tespit eden yakınlık ligasyon deneyleri (PLA) ve organel temaslarının net bir şekilde görselleştirilmesine izin veren transmisyon elektron mikroskobu (TEM) dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere diğer yöntemlerden de yararlandık.). Ayrıca ER-mitokondri kontaklarındaki değişiklik ile kalsiyum transferi ve mitokondriyal fisyon gibi fonksiyonel parametreler arasında bir korelasyon olduğunu gösterdik (Şekil 4 ve Lim ve ark.24). İlaçların split-Rluc aktivitesi üzerindeki etkisinin, split-Rluc geninin artan ekspresyonuna bağlı olmadığından emin olmak için, daha önce yaptığımız gibi ilaçlarla birlikte bir transkripsiyon veya translasyon inhibitörü eklenebilir24.

Transfeksiyon hızının düşük olduğu kültürde farklılaşmış nöronlarda split-Rluc sisteminin uygulanması için, viral enfeksiyon (split-Rluc bileşenlerini eksprese eden lentivirüs ile) alternatif bir yaklaşım olacaktır. Kullanımı, hücrelerin (örneğin, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler), viral enfeksiyon veya CRSPR aracılı gen düzenleme yoluyla split-Rluc, MitoRlucN ve RlucCER'nin her bir bileşenini kararlı bir şekilde ifade etmek üzere tasarlandığı bir tarama sistemi oluşturmak için genişletilebilir. Bununla birlikte, kararlı bir ekspresyon sistemi için, split-Rluc sistemini daha iyi tolere eden hücreler için normal fizyolojik durumu temsil etmeyebilecek bir seçim baskısı olabileceğinin farkında olunmalıdır. Bu adaptasyon veya seçim, deneysel sonuçlarda yanlılığa neden olabilir.

Özetle, yukarıda tartışılan bazı sınırlamalara rağmen, split-Rluc, önceki ilaç tarama çalışmamızda gösterildiği gibi, hücredeki organeller arası temasları düzenleyen küçük moleküller veya genler için yüksek verimli tarama için hızlı, basit ve güçlü bir testtir24.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, makalenin eleştirel incelemesi için Dr. Jeffrey Golden'a (Cedars-Sinai Tıp Merkezi) müteşekkirdir. Bu çalışma kısmen Ulusal Nörolojik Hastalık ve İnme Enstitüsü (NINDS, R01NS113516) tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,7 mL SafeSeal Mikrosantrifüj TüpüSorenson16070
6 oyuklu plaka TC İşlem GörmüşABD BilimselCC7682-7506
10 mL Pipet Uçları OneTipABD Bilimsel1110-3700
10 μ L pipet uçları OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 & L Eğimli uçlar OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL Polipropilen Konik BoruFalcon352070
96 Kuyulu Flipper Mikrotüp RaflarıThermoFisher Scientific8770-11
96 oyuklu plaka TC Işlenmiş ABD BilimselCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC İşlenmiş TabakABD BilimselCC7682-3394
1250 & L İpuçları OneTipUSA Scientific1112-1720
Santrifüj 5910  Ri - Soğutmalı SantrifüjEppendorf5943000131
Dimetil sülfoksit, susuz vb; % 99,9Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, yüksek glikozThermoFisher Scientific11965092
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248DMSO'da çözün; -70 °C'de saklayın; C
EnduRen Canlı Hücre SubstratıPromegaE6481Alikotları -70 ° C'de saklayın; C
Eppendorf 2-20 μ L pipetEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μ L pipetEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 & mikro; L pipetEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12 kanallıEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μ L pipetEppendorf 
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, USDA onaylı bölgelerThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2  İnkübatör, 184 L, Cilalı PaslanmazÇelik ThermoFisher Scientific381
El çetele sayacıSigma-AldrichHS6594
HEK 293T HücreleriATCCCRL-3216
Hemasitometre - Neubauer Parlak Çizgi, Çift Sayma OdasıLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE TamponuThermoFisher Scientific8019005
MikroskopZeissAxiovert 25 CFL
Mini santrifüjBenchmark ScientificC1012
50ml Konik, 15ml Konik ve Mikrosantrifüj Tüpleri İçin Çok Tüplü RafBoekel Scientific120008
PEI MAX - Transfeksiyon Sınıfı Lineer Polietilenimin Hidroklorür (MW 40.000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Poli-D-lizin hidrobromürSigma-AldrichP6407-5MG
Rhosin hidroklorürBio-Techne Tocris5003DMSO'da çözün; -70 ° C'de saklayın; C
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısıThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX çok modlu mikroplaka okuyucuThermoFisher ScientificVL0000D0
Vortex ThermoFisher Scientific2215365seviye 8
VWR Vakum Aspirasyon SistemiVWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794DMSO'da çözün; -70 ° C'de saklayın; Ç
3123000055

Kaynaklar

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Splt L siferaz AnaliziER Mitokondri TemaslarCanl H cre G r nt lemeMembran Temas B lgeleriN rodejeneratif Hastal klarY ksek Kapasiteli TaramaMitokondriyal DinamiklerKalsiyum HomeostazL minesans Plaka OkuyucuHEK293T H creleri
Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.