Yöntem makalesi

İyatrojenik Yaralanma Özetlendi: Sıçanlarda Üretra Darlığı Modellemesi için Elektroeksizyon Tekniği

1.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66864

⸱

11 Ekim 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, klinik ortamlarda gözlenen iyatrojenik hasarı etkili bir şekilde simüle eden, sıçan üretrasının elektroeksizyonu yoluyla oluşturulan üretra darlığının yeni, verimli ve stabil bir sıçan modelini sunuyoruz.

Özet

Üretra darlığı (US) ürolojide sık görülen, her yaşta yüksek prevalans ve morbidite ile karakterize bir klinik durumdur. Üretral dilatasyon ve internal üretrotomi gibi US için mevcut tedaviler durumu tam olarak çözmekte başarısız olmakta ve yüksek nüks ve komplikasyon oranları ile ilişkilidir.

Ek olarak, US'nin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır. US'nin patogenezini araştırmak ve yeni terapötik stratejiler geliştirmek için, klinik bulguları doğru bir şekilde yansıtan standart bir sıçan modeli oluşturmak çok önemlidir. Bu çalışma, yüksek frekanslı bir elektrikli bıçak kullanarak sıçanlarda US'yi indüklemek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntemi özetlemektedir. Yöntem, elektrikli bıçağın 4 W'ta tek kutuplu karışık kesme moduna ayarlanmış olmasıyla uzunlamasına bir kesi yapılmasını içerir ve bu da önemli üretral hasara neden olur. Histopatolojik analiz, ürotelyumun kalınlaşmasını, inflamatuar infiltrasyonu ve düzensiz kollajen liflerini gösterir. Bu model, sıçan üretrasında elektroeksizyon yoluyla iyatrojenik hasarı etkili bir şekilde çoğaltır. Özetle, bu çalışma, klinik senaryoyu yakından taklit eden yeni, verimli ve stabil bir US sıçan modelini başarılı bir şekilde oluşturmakta ve US için mekanizmalar ve yeni tedaviler hakkında daha fazla araştırma için değerli bir araç sağlamaktadır.

Giriş

Üretra darlığı (US) en eski ürolojik hastalıklar arasındadır ve yaygın olarak görülmeye devam etmektedir. Son veriler, 100.000 erkek başına 229 ila 627 ABD vakası olduğunu göstermektedir1. US'den muzdarip olanlar, alt idrar yolu semptomları2, ağrı3 ve cinsel işlev bozukluğu4 dahil olmak üzere bir dizi semptom yaşarlar. Üretrotomi, üretroplasti ve dilatasyon gibi çeşitli tıbbi tedaviler mevcuttur5. Bununla birlikte, bu tedaviler genellikle kanama, enfeksiyon ve idrar kaçırma gibi sorunlar nedeniyle karmaşıklaşır, hastalık yüküne katkıda bulunur ve değişen nüks oranları sergiler 6,7. Sonuç olarak, en etkili terapötik yaklaşımları belirlemek, araştırmacıları ve klinisyenleri meşgul eden kritik bir zorluk olmaya devam etmektedir.

US genellikle fibrozis ve üretra mukozası ile çevresindeki spongiozum dokunun sikatrizasyonuna bağlı anterior üretranın daralması ile karakterize edilir8. Yaygınlığına rağmen, US'nin altında yatan nedenler ve mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve derinlemesine çalışma için uygun hayvan modelleri eksikliği vardır. Esas olarak transüretral cerrahiden kaynaklanan iyatrojenik yaralanma, şu anda US'nin önde gelen nedenidir ve vakaların %41'ini oluşturmaktadır9. Bu nedenle, ABD araştırmaları için ideal bir hayvan modeli, yaygın klinik yaralanmaları doğru bir şekilde çoğaltmalı, insanlara yakın genomik ve proteomik benzerlikler sergilemeli ve hem verimlilik hem de stabilite göstermelidir. Böyle bir model, US patogenezi ile ilgili daha derin araştırmaları ve daha etkili tedavilerin geliştirilmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.

Yaygın klinik tiplerin patojenik sürecini ve mekanizmasını araştırmak için, elektrokoagülasyon, elektrorezeksiyon15 ve bleomisin enjeksiyonları16 gibi teknikler kullanılarak tavşan10,11, köpekler12 ve domuzlar13,14 gibi büyük hayvanlar kullanılarak çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modeller genellikle örneklem boyutu sınırlamaları ve insanlardan genetik farklılıklar nedeniyle zorluklarla karşı karşıyadır. Ek olarak, büyük hayvanların kullanılmasının maliyet etkinliği de dikkate alınmalıdır; Günlük bakımla ilişkili yüksek maliyetlere rağmen, büyük hayvanlar aynı zamanda önemli enfeksiyon riskleri taşır ve bu da kapsamlı ameliyat sonrası bakım ve önemli masraflar gerektirir. Kemirgenlerin birçok organ sisteminde insanlarla fizyolojik ve patolojik özellikleri paylaştığı iyi belgelenmiştir. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, kemirgen hayvanların ve insanların idrar yolu hücreleri arasında homoloji olduğunu göstermiştir17. Ayrıca, sıçanların satın alınması, barındırılması ve ameliyat sonrası bakım maliyetleri, büyük hayvanlarınkinden önemli ölçüde daha düşüktür18. Sonuç olarak, ABD'nin bir sıçan modeli uygun görülmektedir; Bununla birlikte, sıçanlarda bu tür modellerin gelişimi yetersiz bir şekilde tanımlanmıştır.

Önceki çalışmalar, sıçan modellerinde US'yi indüklemek için bıçaklar veya iğneler gibi cerrahi aletler kullanmıştır19. Bu yaklaşım, periüretral kan damarlarına zarar verme ve önemli kanamaya yol açma gibi risklerle ilişkilendirilmiştir. Bu cerrahi prosedürlerin subjektif doğası, modelleme için kantitatif kriterlerden yoksun olan mekanik yaralanma derecesinde değişkenliğe neden olabilir ve bu da sonraki terapötik çalışmalarda üretral onarım sonuçlarının değerlendirilmesini etkileyebilir.

Bu hususlar göz önüne alındığında, ek bir ABD sıçan modeli geliştirmeye açık bir ihtiyaç vardır. Sıçanlarda verimli, uygun maliyetli ve istikrarlı bir ABD modeli oluşturmak için araştırmamızda yüksek frekanslı bir elektrikli bıçak makinesi kullandık. Bu model, klinik çalışmalara geçmeden önce US'nin mekanizmalarına ilişkin daha fazla araştırmayı ve yeni terapötik yaklaşımların değerlendirilmesini kolaylaştıracaktır.

Protokol

Bu araştırmada, her biri 400-500 g ağırlığında yirmi adet 6 aylık erkek Sprague-Dawley sıçanı kullanıldı. Tüm hayvan prosedürleri, Sun Yat-Sen Üniversitesi Beşinci Bağlı Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Onay numarası: 00349). Hayvanlar, kontrollü sıcaklık ve aydınlatma koşullarına sahip bir tesiste barındırıldı. Üretra darlığının temel bir özelliği, üretra içinde yara izinin gelişmesidir. Tipik olarak yaralanmadan sonraki 4 hafta içinde ortaya çıkan skar oluşumu için belirlenen zaman çizelgesine dayanarak, deneysel son nokta olarak 4 haftalık postoperatif işarette üretrada fark edilebilir skar dokusunun varlığını belirledik.

1. Cerrahi aletlerin hazırlanması

  1. Aşağıdaki cerrahi malzemeleri hazırlayın: Teflon kaplı kateter (0,6 x 1 mm), emilebilir dikişler (6-0), dikiş makası, doku forsepsleri, iğne tutma pensesi, düz forseps, yüksek frekanslı elektrocerrahi ünitesi (Şekil 1), yüksek frekanslı elektrikli bıçak paneli, cerrahi elektrot yüksek frekanslı elektrocerrahi bıçağı ve anal iletken çubuk dahil (bkz.
  2. Ameliyat bölgesini %75 etanol içeren alkollü mendillerle temizleyiniz.
  3. Tek kutuplu elektrikli kesme modunda yüksek frekanslı bir elektrikli bıçak kullanmak için hazırlık.
    1. Yüksek frekanslı elektrikli bıçağı bir güç kablosu kullanarak topraklı 220 V ana güç kaynağına bağlayın.
    2. Sterilize edilmiş, elle kontrol edilen bıçak sapını ve iletken çubuğu ilgili yuvalarına takın (Şekil 1C).
      NOT: Ameliyatın güvenliğini sağlamak için tüm güç kablolarının güvenli bir şekilde bağlandığından emin olun.

2. Hayvanın hazırlanması

  1. Sodyum pentobarbitali (60 mg / kg) bir şırıngaya çekin.
  2. Sıkıca sabitlendiğinden emin olmak için baskın elinizle kuyruğunu kavrayarak ve baskın olmayan elinizle kulaklarının ve boynunun derisini tutarak fareyi sabitleyin.
  3. Farenin alt karnını açığa çıkarın ve% 75 etanole batırılmış pamuk topları kullanarak alanı dezenfekte edin.
  4. Şırınga iğnesini alt karın bölgesindeki karın orta hattının yaklaşık 1-2 mm yanına yerleştirin ve 45°'lik bir açıyla karın boşluğuna yönlendirin.
    NOT: İğne karın zarına girdiğinde direnç kaybı hissedeceksiniz.
  5. Şırıngada kan veya sıvı olmadığından emin olmak için şırınga pistonunu yavaşça geri çekin.
  6. Sodyum pentobarbitali yavaşça enjekte edin. İğneyi geri çekin, enjeksiyonu tamamlayın ve% 75 etanole batırılmış pamuk topları ile bölgeyi tekrar dezenfekte edin.
  7. Sıçanın solunum ritmini izleyin ve refleksleri kontrol etmek için arka pençesini sıkıştırın.
    NOT: Ameliyata devam etmeden önce farenin solunumunun sabit olduğunu ve hiçbir refleks göstermediğini onaylayın.
  8. Eritromisin merhemini sıkın ve merhemin içine pamuklu bir bez batırın. İşlem sırasında kornea kurumasını önlemek için merhemi pamuklu çubukla her iki gözün korneasına uygulayın.
  9. Anestezi onaylandıktan sonra alt karın ve perine bölgesini tıraş etmek için elektrikli tıraş makinesi kullanın.
  10. Traş edilen bölgedeki gevşek saçları tuzlu su ile nemlendirilmiş bir mendille silin.
  11. Cilt tahrişini en aza indirmek için iyodofora batırılmış bir gazlı bezle iki kez silerek alanı dezenfekte edin.
  12. Derin anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığına yerleştirin. Cerrahi işlemler sırasında tıbbi eldiven giyerek steriliteyi sağlayın.

3. Üretral kateterizasyon ve yaralanma prosedürü

  1. Yüksek frekanslı elektrikli bıçak makinesi için etkili bir kapalı döngü devresi oluşturmak için iletken çubuğu farenin anüsüne yerleştirin (Şekil 2A).
  2. Ameliyatın işlem sonrası adımlarında konumlandırmaya yardımcı olmak ve destek sağlamak için farenin üretrasını kateterize edin.
    1. İdrar sondasını parafin yağı ile yağlayın.
    2. Penisi, karından dışarı çıkarmak için etrafındaki cildi sıkarak ortaya çıkarın.
    3. Sıçanın penisini iyodofora batırılmış bir gazlı bez süngerle dezenfekte edin.
    4. Üretral deliği düz forseps ile nazikçe açın ve yağlanmış kateteri üretraya yerleştirin.
    5. Teflon kaplı kateteri, üretral kasılma ritmi ile üretraya dikkatlice yerleştirin; herhangi bir zorla yerleştirmeden kaçının (Şekil 2B).
    6. Dirençle karşılaşılırsa, penisin bükülme açısını ayarlamak için penisi ventral tarafa doğru nazikçe çekin ve idrar dışarı akana kadar kateteri mesaneye doğru ilerletmeye devam edin (Şekil 2C).
    7. Penisin karın ile yaklaşık 45°'lik bir açı oluşturmasını sağlayarak başarılı kateterizasyonu onaylayın (Şekil 2D).
  3. Yüksek frekanslı elektrikli bıçak makinesini açın, tek kutuplu karışık kesme modunu seçmek için yüksek frekanslı bıçak panelinin düğmelerine tıklayın ve penisi katman katman elektroeksize etmek için sonraki adımlar için gücü 4 W'a ayarlayın.
  4. İnsizyonu kateter ile hizalayın. Elektrocerrahi bıçak sapındaki sarı düğmeye basın ve üretra açığa çıkana kadar elektrikli bıçağı kullanarak penis derisinden üretranın dış tabakasına kateter işaretleme çizgisi boyunca bir kesi yapın (Şekil 3A,B).
    NOT: Elektrokoagülasyon için mavi düğmeye değil, elektroeksizyon için sarı düğmeye bastığınızdan emin olun.
  5. Elektrikli bıçakla üretrada 0,5 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapmaya devam edin, kateter görünene kadar 0,1 cm'lik enine bir çap sağlayın (Şekil 3C).
  6. Yarayı ve yüzeyel cildi emilebilir dikişler (6-0) kullanarak sürekli veya kesintili dikişlerle katman katman dikin (Şekil 3D,E).
  7. Üretra kateterini çıkarın ve penisi yeniden konumlandırın (Şekil 3F).
  8. Yüksek frekanslı elektrikli bıçağı kapatın ve iletken çubuğu farenin anüsünden çıkarın.
  9. Cerrahi malzemeleri alkol (%75 etanol) mendillerle temizleyiniz.

4. Ameliyat sonrası bakım

  1. Fareyi ısıtılmış bir ped (37 ° C) üzerine yerleştirin ve anesteziden iyileşmesini yakından izleyin. Solunum ritmi, vücut ısısı ve bilinç seviyesi dahil olmak üzere farenin fiziksel durumuna dikkat edin.
    NOT: Tam iyileşme gözlenene kadar fareyi kafesine geri koymayın.
  2. Fareleri temiz bir kafese koyun ve iyileşmeden sonra günlük ağrı yönetimi için su şişesini morfin çivili su (0.4 mg / kg) ile doldurun.
  3. Sıçanların postoperatif ağrıdan tam olarak iyileşmesi için steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (Carprofen, 0.5 mg / kg, deri altı enjeksiyon gibi) uygulayın.

5. Histolojik değerlendirme

  1. Ameliyattan dört hafta sonra, farelerin kuyruklarını kaldırarak işeme refleksini indükleyin. Fareyi bir ötenazi kutusuna yerleştirin, CO2 iletim borusu valfini açın ve fareleri aşırı dozda CO2 ile insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
  2. Farenin hareketsiz olduğunu ve nefes almadığını doğruladıktan ve göz bebeğinin genişlediğini gözlemledikten sonra valfi kapatın. Ötenazinin başarılı olduğunu doğrulamak için farenin fiziksel durumunu 2 dakika boyunca gözlemlemeye devam edin.
  3. Fareyi ötenazi kutusundan çıkarın.
  4. Cerrahi alanı ve cerrahi malzemeleri %75 etanole batırılmış mendillerle temizleyin.
  5. Mesane doldurma durumunu gözlemlemek için karnı diseke edin ve tüm üretrayı çıkarın.
  6. Üretrayı topladıktan sonra, fareyi bir sızdırmazlık torbasına koyun ve laboratuvar teknisyenleri tarafından işlenmek üzere 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
  7. Dokunun rengine ve pürüzsüzlüğüne odaklanarak ABD'yi brüt patoloji açısından morfolojik olarak değerlendirin.
  8. Yara yapısını ve ürotelyal hücre tabakasını görselleştirmek için üretra dokusunu hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyayın.
    1. Deparafinizasyon için slaytları ksilene batırın (2 x 5 dakika).
    2. Slaytları sırayla etanolde yeniden sulandırın (%100 1 x 3 dk, %95 1 x 3 dk, %85 1 x 3 dk, %75 1 x 3 dk).
    3. Slaytları deiyonize suda yıkayın (2 dakika).
    4. Slaytları hematoksilen ile boyayın (10 dakika).
    5. Slaytları deiyonize suda yıkayın (5 dakika).
    6. Numuneleri farklılaştırma çözeltisi (40 s) ile ayırt edin.
    7. Slaytları deiyonize suda yıkayın (2 x 3 dakika).
    8. Slaytları eozin ile boyayın (2 dakika).
    9. Slaytları bir sırayla etanol içinde rehidre edin (%100 1 x 3 sn, %95 1 x 3 sn, %85 1 x 3 sn, %75 1 x 3 sn)
    10. Slaytları %100 etanole (1 dakika) batırın ve slaytları ksilen (2 x 1 dakika) ile şeffaflaştırın.
    11. Nötr balsam ekleyin ve lamel ile kapatın.
  9. Kollajen lif yapısını vurgulamak için Masson'un trikrom boyasını üretra dokusuna uygulayın.
    1. Deparafinizasyon için slaytları ksilene batırın (2 x 5 dakika).
    2. Slaytları sırayla etanolde yeniden sulandırın (%100 1 x 3 dk, %95 1 x 3 dk, %85 1 x 3 dk, %75 1 x 3 dk).
    3. Slaytları deiyonize suda yıkayın (2 dakika).
    4. Slaytları Weigert'in Demir Hematoksilen solüsyonunda (5 dakika) boyayın.
    5. Slaytları deiyonize suda yıkayın (5 dakika).
    6. Slaytları Biebrich Scarlet-Acid Fucshin (5 dakika) ile boyayın.
    7. Slaytları deiyonize suda yıkayın (2 x 3 dakika).
    8. Slaytları Fosfomolibdik Asit çözeltisi (5 dakika) ile boyayın.
    9. Slaytları Anilin Mavisi çözeltisine yerleştirin (5 dakika). Çözeltiyi atın.
    10. Slaytları durulayın, alkolle kurutun ve ksilen içinde temizleyin.
    11. Nötr balsam ekleyin ve lamel ile kapatın.
  10. Ürotelyal hücre tabakasını değerlendirmek için bir TGF-β antikoru kullanarak immünofloresan boyama yapın.
    1. Düdüklü tencereye uygun antijen alma tamponunu ekleyin. Düdüklü tencereyi ocak gözünün üzerine yerleştirin ve tam güçte çalıştırın.
    2. Kaynadıktan sonra slaytları musluk suyundan düdüklü tencereye aktarın. Tencerenin üzerine soğuk su akıtın ve slaytları 10 dakika ısıtın.
    3. Düdüklü tencereyi kapatın ve kızakları çıkarın. Slaytları oda sıcaklığına soğutun.
    4. Slaytları PBS solüsyonu ile yıkayın.
    5. Numunelerin kenar boşluklarını sıvı engelleyici kalemle işaretleyin.
    6. Slaytları 30 dakika boyunca PBS artı %0,3 Triton X-100'e batırın.
    7. Slaytları PBS'de hafif çalkalayarak (2 x 5 dakika) yıkayın.
    8. Oda sıcaklığında (60 dakika) PBS'de% 10 keçi serumunu bloke edin.
    9. Bloke edici tamponu aspire edin ve gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor ile inkübe edin.
    10. Slaytları 1x PBS (3 x 5 dakika) ile yıkayın.
    11. Antikor seyreltme tamponunda seyreltilmiş florokrom işaretli ikincil antikor ile inkübe edin.
    12. Slaytları 1x PBS (3 x 3 dakika) ile yıkayın.
    13. Kızakları monte edin ve kapatın.
  11. Bir slayt tarayıcıda 40x objektif kullanarak lekeli slaytları dijital olarak tarayın.
  12. Görüntüleri analiz edin ve referans verilen yazılımı kullanarak ürotelyumun kalınlığını ölçün (Malzeme Tablosu).
    1. Yazılımı açın.
    2. Lekeli slayt görüntülerini seçmek için Yerel Bilgisayar'ı tıklatın.
    3. Ürotelyumun kalınlığını ölçmek için Mesafeyi Ölç'e tıklayın.
    4. Ürotelyum kalınlığı ile ilgili verileri kaydedin.

Sonuçlar

Bu çalışmada özetlenen protokol, sıçanlarda başarılı bir şekilde stabil üretral darlık sağladı ve yüksek tekrarlanabilirlik gösterdi. Ameliyatların ortalama süresi 20 dakika idi ve işlemler sırasında herhangi bir teknik sorun yaşanmadı. Üretral örnekler işlemden 4 hafta sonra başarılı bir şekilde toplandı.

Deney grubunda, sıçanların mesaneleri, mesanelerin boş olduğu kontrol grubunun aksine aşırı şişkinlik belirtileri gösterdi (Şekil 4). Bu gözlemler, deneysel modellemeyi takiben sıçanların işeme fonksiyonunda önemli bir bozulma olduğunu göstermektedir.

Ameliyattan dört hafta sonra, yara bölgeleri üretra yüzeyinden çıkıntı yapan mumsu beyaz skar dokusuna dönüşürken (Şekil 5B), kontrol grubundaki üretral bölümler pürüzsüz ve soluk kırmızı kontrol gibi görünüyordu (Şekil 5A).

Üretral kesitin hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması ile yapılan histolojik incelemede belirgin ürotelyum kalınlaşması ve lenfosit agregasyonu saptandı. Ek olarak, Masson boyama, düzensiz kollajen liflerinin eşlik ettiği belirgin bir kırmızımsı hiperplastik ve metaplastik üretral epitel dokusu alanı tanımladı (Masson boyamanın ayrıntılı görüntüleri için Ek Şekil S1'e bakın), bu da düz kas ve kollajen liflerinin yapısındaki anormallikleri gösterir (Şekil 6).

Kriyoseksiyonların immünofloresan analizi, ameliyat sonrası üretral dokuda artmış TGF-β gösterdi (Şekil 7), bu da üretral yapı oluşumunun yüksek TGF-β ekspresyonu ile ilişkili olduğunu düşündürdü.

figure-results-1
Şekil 1: ABD modelini oluşturmak için kullanılan temel araçlar. (A) Teflon kaplı kateter (0,6 x 1 mm); (B) emilebilir sütürler (6-0), doku forsepsleri, iğne tutan pense ve düz forsepsler (soldan sağa); (C) yüksek frekanslı elektrocerrahi kalemi ve anal iletken çubuk; (D) yüksek frekanslı elektrikli bıçağın paneli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Ameliyat için hazırlıklar. (A) Sıçanın alt yarısını tıraş edin ve anal iletken çubuğu bağlayın. (B-D) Üretral kateterin üretra içindeki yerleşimini gösterin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Elektrorezeksiyon işlemi. (A) Penis derisi üzerinde 0,8 cm ölçülerinde uzunlamasına bir kesi oluşturulduğunu gösterir; (B) üretranın maruz kalması; (C) üretra içindeki kateter görünene kadar üretral duvarın tüm katmanları boyunca elektrokesiti detaylandırır. (D,E) Üretral kateterin çıkarılmasını ve penisin yeniden konumlandırılmasını tasvir eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Anatomik koşullar altında sıçanlarda mesanenin doluluk durumu. (A) Kontrol grubundaki sıçanlardan boş bir mesane içerir; (B) deney grubundaki sıçanlardan aşırı doldurulmuş bir mesaneyi gösterir. Mesaneler kırmızı kesikli anahat içindedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Rezeke edilen üretral örneklerin makroskopik bulguları. (A) Normal üretra dokusu. (B) Üretral skar dokusu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Üretral örneklerin histoloji sonuçları. (A) Kontrol grubundan üretral doku H & E ile boyandı (orijinal büyütme, 100x). (B) Masson'un 100x orijinal büyütmede bir üretral kitlenin trikrom boyaması. (C) 85.9 μm olan normal ürotelyum kalınlığının genişlemesi ve ölçüm verileri. Ölçek çubuğu = 20 μm. (D) Deney grubundan üretral dokunun 100x orijinal büyütmede H&E boyamasını gösterir. (E) Masson'un deney grubundan üretral dokuyu trikrom boyamayı, yine 100x orijinal büyütmede tasvir eder. Ölçek çubukları = 100 μm. (F) Üretra yara izinin genişlemesi ve kalınlaşmış ürotelyum-231.2 μm'nin ölçüm verileri. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Eksize edilmiş üretral örneklerde immünohistokimya bulguları. TGF-β antikor etiketlemesi ürotelyal hücreleri vurgular; Antikorun hücrelere bağlanması üzerine yeşil bir floresan yayılır. (A-C) Kontrol grubunun ürotelyal hücrelerinde, deney grubunun ürotelyal hücrelerinde (DF) daha yüksek sinyal yoğunluğuna kıyasla daha düşük sinyal yoğunluğu gösterin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Üretra örneklerinin Masson boyamasının tam görüntüsü. (A) Kontrol grubunun masson boyaması; (B) Deney grubunun masson boyaması. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

ABD, hem psikolojik hem de fiziksel refahı olumsuz yönde etkileyen, önemli bir ekonomik etkiye sahip önemli bir sağlık yükü oluşturmaktadır20. Sadece US'yi tamamen iyileştirmekle kalmayıp aynı zamanda nüksünü etkili bir şekilde önleyen bir tedaviye hala ihtiyaç vardır.

Bu çalışmada, hastalarda üretral yaralanmayı taklit etmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmek için bir sıçan modeli kullandık ve bunu transüretral cerrahiye bağlı üretral yaralanma izledi. Sıçanlar, uygun maliyetli olmaları, kullanımı kolay olmaları, tekrarlanabilirlik sunmaları ve güvenilir veri sağlamaları nedeniyle hayvan modelleri olarak tercih edilmektedir. Bu çalışmada kullanılan sıçan modelinin diğer modellere göre çeşitli avantajları vardır: çeşitli omik analizlerde yaygın olarak kullanılır ve yönetimi kolaydır. Ek olarak, kemirgenler ve insanlar arasındaki idrar yolu epitel hücrelerinin gen ekspresyonundaki benzerlik, sıçan US modelini daha derin araştırmalar için özellikle uygun hale getirir21.

Şekil 7'de görüldüğü gibi, TGF-β hem kontrol hem de deney grubunda üretranın tüm çemberinde eksprese edildi ve deney grubunda TGF-β ekspresyonu kontrol grubuna göre belirgin olarak daha yüksekti. Önceki çalışmalar, yerleşik ürotelyum hücrelerinin, yaralanmadan sonra neredeyse miyofibroblastlara fenotipik bir geçiş geçirdiğini belgelemiştir, bu süreç esas olarak ECM (hücre dışı matris) üretimini, immün modülasyonu, hücre proliferasyonunu, göçünü ve farklılaşmasını düzenleyerek skar oluşumu üzerinde önemli etkiler gösteren TGF-β tarafından yönlendirilir22,23. Bulgularımız, TGF-β'ın aşırı ekspresyonunun üretral skar oluşumunu teşvik edebileceğini ve TGF-β salgılanmasının yara yüzeyindeki yerleşik hücrelerle sınırlı olmadığını, tüm üretranın katılımını gerektirdiğini göstermektedir.

Erkek sıçan üretrasının küçük çapı ve eğriliği, modellemeden sonra ürodinamimikteki değişiklikleri tespit etmede zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Erkek sıçanlarda idrar fonksiyonunu değerlendirme yöntemleri hakkında araştırma kıtlığı vardır. Bu çalışmada, ameliyattan 4 hafta sonra mesane dolum durumunu değerlendirerek üriner fonksiyondaki değişiklikleri gözlemlemek için indirekt yöntemler kullandık. İşeme refleksinin uyarılması üzerine, diseke edilmiş sıçan karnının gözlemlenmesi, deney grubunun, modelleme sonrası işeme fonksiyonunda önemli bir bozulmanın göstergesi olan kalıcı mesane dolgunluğu sergilediğini gösterdi. Bu bulgular, üretral stenozu olan hastaların yaşadığı zor idrara çıkmanın klinik semptomları ile tutarlıdır24. Bununla birlikte, erkek sıçanlarda işeme sıklığı, ortalama işeme hacmi ve işeme etkinliği gibi idrar parametreleri üzerinde fizyolojik çalışmalar yapmak için yöntemler geliştirmek bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Yüksek frekanslı elektrikli bıçakların mod ve güç ayarlarının seçimi, cerrahi prosedürlerde yaralanmanın boyutunu kritik derecede etkiler. Bu çalışma, sıçanlarda bir ABD modeli geliştirmek için uygun bir yaralanma seviyesi ve 4 W olan yüksek frekanslı elektrikli bıçağın yeterli derecesini sağlayan bir cerrahi teknik sunmaktadır. Sıçan US modellerinde en yaygın yöntem, bir iğne veya neşter ile kesiler yapmayı içerir25. Bununla birlikte, bir neşter kullanmak, farenin üretrasının pürüzsüz yüzeyi ve küçük çapı nedeniyle sürekli kanama olasılığını artırma eğilimindedir, bu da yanlışlıkla çevredeki kan damarlarına zarar verebilir.

Yüksek frekanslı bıçak, dokulara stabil ve ayarlanabilir bir elektrik akımı uygulayarak eş zamanlı hemostaz sağlayarak, prosedürün stabilitesini ve rahatlığını artırarak önemli bir avantaj sunar. Ek olarak, güç ayarının kontrol edilebilirliği, meydana gelen hasarın ölçülebilir bir değerlendirmesine olanak tanır.

İdeal bir deneysel protokol, sürekli olarak tek tip boyut ve derinlikte üretral yaralar üretecektir. Bu çalışmada, üretra hasarını indüklemek için unipolar mikst kesme modu seçildi. Öncelikle sıvı bileşenlerin buharlaşmasına, dokuların kurumasına, pıhtılaşmasına ve doku yırtılması olmadan kan damarlarının sızdırmazlığına neden olan ve hızlı doku kavrulmasına ve yapışmasına yol açan elektrokoagülasyon modunun aksine, kesme modu penis dokusuna hassas, katman katman kesiler sağlar. Elektrokoagülasyon, tavşan US modellerinde yaygın olarak kullanılmaktadır ve penisi radyumdan ayırmak ve diğer cerrahi aletlerlekesiler yapmak gibi ek adımlar gerektirir 26, bu da hayvan travması ve komplikasyon risklerini artırırken, unipolar karışık kesme modu, üretrayı ortaya çıkarmak için sünnet derisine doğrudan kesilere izin verir. Bu yöntem, operasyonel verimliliği artırır ve deney hayvanlarının maruz kaldığı travmayı en aza indirir.

Önceki çalışmadaki güç ayarı, tipik olarak deney hayvanlarının ağırlığına ve elektronik bıçak ile doku arasındaki temas alanına bağlı olduğu için ayrıntılı olarak belirtilmemiştir. Bu çalışmada, deney denekleri ağırlıkları 400 g ile 500 g arasında olan 6 aylık SD sıçanlardı. Bu koşullar için, optimum güç ayarının 4-7 W arasında olduğu belirlendi, bu da insizyonun boyutu ve derinliği üzerinde hassas kontrol sağladı. Operatörlerin, ABD sıçan modelini geliştirmek için yüksek frekanslı bıçağı ilk kez kullanırken daha düşük bir güç ayarıyla başlamalarını ve farklı koşullar için en uygun değeri bulmak için gerektiği gibi ayarlama yapmalarını öneririz.

Ayrıca, kritik bir adım, ameliyattan önce sıçanların üretralarının kateterizasyonudur. Kateter mesaneye doğru şekilde yerleştirildiğinde başarılı kateterizasyon onaylanır. Kateter geçici bir iskele görevi görse de, üretranın pozisyonunu korumalı ve cerrahi bölgenin belirlenmesine yardımcı olmalıdır. Erkek sıçanın üretrası nispeten küçük bir çapa sahiptir ve sünnet derisi ile penis dokusu arasında sınırlı bir boşluk vardır, bu da kateterin yanlışlıkla yanlış açıklığa yerleştirilmesini kolaylaştırır ve potansiyel olarak sonraki prosedürleri karmaşıklaştırır. Kateterin doğru yerleşimi, idrar dışarı aktığında doğrulanır, bu da mesanenin içinde güvenli bir şekilde olduğunu gösterir. Ek olarak, kateterize edilmiş penis, üretra içindeki stabiliteyi artırmak ve cerrahi prosedürü kolaylaştırmak için 45°'lik bir açıyla konumlandırılmalıdır.

Sonuç olarak, bu çalışma sıçanlarda bir ABD modeli oluşturmak için yeni, oldukça etkili ve uygun maliyetli bir yöntem göstermektedir. Bu yöntem, basitliği, yüksek başarı oranı ve stabilitesi ile karakterize edilir ve üretra darlığı için çok çeşitli yenilikçi tedavileri araştırmak için değerli bir araç sunar.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No.2019A1515012116 ve No.2022A1515012559) alınan hibelerle desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
emilebilir sütürler (6-0)KERONG COMPANYKR2230814
Guangdong İl Biyomedikal Görüntüleme Anahtar LaboratuvarıNA
CaseViewer 2.43DHISTECH Ltd.
CarprofenSigma-AldrichMFCD00079028
CoraLite488-konjuge Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)ProteintechSA00013-2
H & E Leke KitiAbcamab150669
  yüksek frekanslı elektrocerrahi ünitesiPekin Taktvoll Technology CompanyES-100v
Masson boyama kitiMerckHT15
iğne tutma pensesiRWD Life ScienceS15001-11
Parafin yağıNANA
pürüzsüz forsepsRWD Life ScienceF13019-12
Sodyum pentobarbitalGuangdong İl Biyomedikal Görüntüleme Anahtar LaboratuvarıNA
Sprague– Dawley sıçanGuangdong Tıbbi Laboratuvar Hayvan MerkeziGDMLAC-035
sütür makasıRWD Life ScienceS15001-11
Teflon kaplı kateter (0,6 mm x 1 mm)DGZF yeni malzemeler şirketiNA
TGF Beta 1 Poliklonal antikorProteintech21898-1-AP
Doku makasıRWD YaşamBilimleri S13029-14
tarafından sağlanan hayvan ameliyat pedi

Kaynaklar

  1. Rourke, K. F., et al. Canadian Urological Association guideline on male urethral stricture. Cuaj-Can Urol Assoc. 14 (10), 305-316 (2020).
  2. Cotter, K. J., et al. Prevalence of post-micturition incontinence before and after anterior urethroplasty. J Urol. 200 (4), 843-847 (2018).
  3. Bertrand, L. A., et al. Lower urinary tract pain and anterior urethral stricture disease: Prevalence and effects of urethral reconstruction. J Urol. 193 (1), 184-189 (2015).
  4. Mondal, S., Bandyopadhyay, A., Mandal, M. M., Pal, D. K. Erectile dysfunction in anterior urethral strictures after urethroplasty with reference to vascular parameters. Med J Armed Forces India. 72 (4), 344-349 (2016).
  5. Campos-Juanatey, F., et al. European association of urology guidelines on urethral stricture disease (part 2): Diagnosis, perioperative management, and follow-up in males. Eur Urol. 80 (2), 201-212 (2021).
  6. Hoy, N. Y., Chapman, D. W., Dean, N., Rourke, K. F. Incidence and predictors of complications due to urethral stricture in patients awaiting urethroplasty. J Urol. 199 (3), 754-759 (2018).
  7. Anger, J. T., Buckley, J. C., Santucci, R. A., Elliott, S. P., Saigal, C. S. Trends in stricture management among male medicare beneficiaries: Underuse of urethroplasty. Urology. 77 (2), 481-485 (2011).
  8. Milenkovic, U., Albersen, M., Castiglione, F. The mechanisms and potential of stem cell therapy for penile fibrosis. Nat Rev Urol. 16 (2), 79-97 (2018).
  9. European Association of Urology. EAU guidelines on urethral-strictures. , Available from: https://uroweb.org/guidelines/urethral-strictures (2023).
  10. Faydacı, G., et al. Comparison of two experimental models for urethral stricture in the anterior urethra of the male rabbit. Urology. 80 (1), 225.e7-225.e11 (2012).
  11. Yang, M., et al. Urine-microenvironment-initiated composite hydrogel patch reconfiguration propels scarless memory repair and reinvigoration of the urethra. Adv Mater. 34 (14), 210952(2022).
  12. Orabi, H., Aboushwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: A preclinical study. Eur Urol. 63 (3), 531-538 (2013).
  13. Sievert, K. -D., et al. Introducing a large animal model to create urethral stricture similar to human stricture disease: A comparative experimental microscopic study. J Urol. 187 (3), 1101-1109 (2012).
  14. Sievert, K. -D., et al. Urethroplasty performed with an autologous urothelium-vegetated collagen fleece to treat urethral stricture in the minipig model. World J Urol. 38 (9), 2123-2131 (2019).
  15. Hu, W. -F., Li, C. -L., Zhang, H. -P., Li, T. -T., Zeng, X. -Y. An experimental model of urethral stricture in rabbits using holmium laser under urethroscopic direct visualization. Urol Int. 93 (1), 108-112 (2014).
  16. Hua, X., et al. An experimental model of anterior urethral stricture in rabbits with local injections of bleomycin. Urology. 116, 230.e9-230.e15 (2018).
  17. Strittmatter, F., et al. Expression of fatty acid amide hydrolase (faah) in human, mouse, and rat urinary bladder and effects of faah inhibition on bladder function in awake rats. Eur Urol. 61 (1), 98-106 (2012).
  18. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  19. Castiglione, F., et al. Adipose-derived stem cells counteract urethral stricture formation in rats. Eur Urol. 70 (6), 1032-1041 (2016).
  20. Cheng, X., et al. The changing trend in clinical characteristics and outcomes of male patients with urethral stricture over the past 10 years in China. Front Public Health. 9 (794451), 1-8 (2021).
  21. Yu, Z., et al. Single-cell transcriptomic map of the human and mouse bladders. J Am Soc Nephrol. 30 (11), 2159-2176 (2019).
  22. Lichtman, M. K., Otero-Vinas, M., Falanga, V. Transforming growth factor beta (tgf-β) isoforms in wound healing and fibrosis. Wound Repair Regen. 24 (2), 215-222 (2016).
  23. Tatler, A. L., Jenkins, G. Tgf-β activation and lung fibrosis. Proc Am Thorac Soc. 9 (3), 130-136 (2012).
  24. Palminteri, E., et al. Contemporary urethral stricture characteristics in the developed world. Urology. 81 (1), 191-197 (2013).
  25. Hedlund, P., Streng, T., Lee, T., Andersson, K. -E. Effects of tolterodine on afferent neurotransmission in normal and resiniferatoxin treated conscious rats. J Urol. 178 (1), 326-331 (2007).
  26. Yao, H. -J., et al. Three new experimental models of anterior urethral stricture in rabbits. Transl Androl Urol. 11 (6), 761-772 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S an Modeliretral YaralanmaY ksek Frekansl Elektrikli B akHistopatolojik Analizretral HasarKollajen Fiber Organizasyon Bozuklu unflamatuar nfiltrasyon
Video yakında

İlgili makaleler