Yöntem makalesi

Mikroakışkan Elektrosprey Teknolojisi Kullanılarak Farklı Metal İyonları ile Çapraz Bağlı Sodyum Aljinat Mikroküreciklerinin Hazırlanması

DOI:

10.3791/66871

⸱

7 Haziran 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Artificial Organs and Computational Medicine in Zhejiang Province, Institute of Translational Medicine, Zhejiang Shuren University, 2The Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, ilaç taşıyıcı tasarımı için bir mikroakışkan cihaz kullanılarak farklı metal iyonları ile çapraz bağlanmış sodyum aljinat mikrokürelerinin hazırlanmasını açıklar. Bu mikrokürelerin antimikrobiyal özellikleri ve yavaş ilaç salınımı da araştırıldı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroküreler, fiziksel kapsülleme veya adsorpsiyon yoluyla ilaçları yüzeye ve polimerlerin içine yükleyebilen ve kademeli olarak serbest bırakabilen mikrometre büyüklüğünde parçacıklardır. Biyotıp alanında, hidrojel mikroküreler, ilaç uygulama sıklığını azaltma, yan etkileri en aza indirme ve hasta uyumunu iyileştirme yetenekleri nedeniyle ilaç taşıyıcıları olarak uygulamaları için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Sodyum aljinat (ALG), üç omurga glikozidik bağına sahip, doğal olarak oluşan doğrusal bir polisakkarittir. Polimerin parçalarının her birinde, bir alkol hidroksil parçasının özelliklerine sahip olan iki yardımcı hidroksil grubu bulunur. Sentetik ALG birimleri, metal iyonları ile kimyasal çapraz bağlama reaksiyonlarına girebilir, polimer yığınlarının çapraz bağlı bir ağ yapısını oluşturur ve sonuçta bir hidrojel oluşturur. Hidrojel mikro küreler, ALG'nin iyonik çapraz bağlama özelliklerini içeren basit bir işlem kullanılarak hazırlanabilir. Bu çalışmada, bir mikroakışkan elektrodepozisyon stratejisi kullanarak ALG tabanlı hidrojel mikroküreler (ALGMS) hazırladık. Hazırlanan hidrojel mikro kürecikler, mikroakışkan elektrosprey akışının doğru kontrolü sayesinde eşit şekilde boyutlandırıldı ve iyi dağıldı. Mikroakışkan ve yüksek elektrik alanını birleştiren bir mikroakışkan elektrosprey tekniği kullanılarak farklı metal iyonları ile çapraz bağlanmış ALGMS, antimikrobiyal özellikleri, yavaş ilaç salınım kabiliyeti ve biyouyumluluğu araştırılmıştır. Bu teknoloji, ileri ilaç geliştirme ve üretiminde uygulama için umut vaat ediyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaç dağıtım sistemleri, biyo-doku mühendisliği alanında, ilaç dağıtım verimliliğini ve etkinliğini artırmayı ve advers reaksiyonları ve yan etkileri azaltmayı amaçlayan bir araştırma noktasıdır1. Bu sistemler arasında, iyi biyouyumluluk, ayarlanabilir mekanik özellikler ve fonksiyonel plastisite ile karakterize edilen hidrojel mikro küreler, ilaç yükleme ve dağıtımı için en yaygın kullanılan araçlardan biridir2. İlaçların hem yavaş hem de kontrollü salınımı için kullanılabilirler, ilaçlar için iyi koruyucu etkiler sağlayabilirler, ilaçların diğer dokulardaki spesifik olmayan etkilerini önleyebilir veya en aza indirebilirler ve belirli doku yapılarına ilaç iletimini hedeflerler3. Bu nedenle, hidrojel mikrokürecikler yeni ve verimli bir ilaç dağıtım sistemi haline gelmiştir ve bu alandaki araştırmalar yavaş yavaş ortaya çıkmaktadır4.

Hidrojel mikroküreler tipik olarak polisakkaritler, proteinler ve doğal polimerler dahil olmak üzere biyolojik olarak parçalanabilen malzemelerden sentezlenir5. Bunlar arasında ALG, deniz kahverengi alglerindenekstrakte edilen biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen bir polisakkarittir 6. Moleküler zinciri, üç boyutlu bir ağa sahip suda çözünmeyen bir hidrojel yapısı oluşturmak için en iki değerlikli veya çok değerlikli katyonlarla çapraz bağlanabilen serbest hidroksil ve karboksil grupları içerir5. ALG tarafından oluşturulan hidrojel mikro küreler, nötr ve alkali çözeltilerde negatif yüklü polielektrolitlere dönüştürülebilir. Negatif yükler arasındaki bu itme, mikro kürelerin şişmesine neden olarak kapsüllenmiş aktif bileşenin veya ilacın salınmasına izin verir. Bu özellikler, ALG mikrokürelerinin ilaç yükleme ve kontrollü salım7 için yaygın olarak kullanılan umut verici ilaç taşıyıcıları olarak değerlendirilmesine yol açmıştır.

Hidrojel mikroküreciklerin hazırlanması için çeşitli yöntemler mevcuttur. Geleneksel ALGMS hazırlama yöntemleri genellikle sol-jel yöntemini veya emülsiyon-sol yöntemini içerir. Bu yöntemler, hedef mikro küreleri elde etmek için çökeltme, birlikte çökeltme ve jelleşme reaksiyonları gibi adımları içerir8. Son yıllarda, mikroakışkan teknolojisinin sürekli gelişmesiyle birlikte, mikroakışkan elektrosprey yöntemi yavaş yavaş verimli ve hassas bir mikroküre hazırlama yöntemi haline gelmiştir9. Bu yöntem, sonraki kürleme veya çapraz bağlama işlemi10 sırasında mikrometre boyutunda damlacıklar ve mikro küreler oluşturmak için bir polimer çözeltisini mikro ince bir nozuldan elektrosprey hale getirmek için mikroakışkan teknolojisini kullanır. Geleneksel yöntemle karşılaştırıldığında, mikroakışkan elektrosprey, çözelti akış hızı, voltaj ve ince nozul boyutu11 gibi parametreleri ayarlayarak mikroküre parçacık boyutunun ve morfolojisinin hassas kontrolünü sunar. Ayrıca, mikro küreciklerin yüksek hızlı sürekli hazırlanmasını sağlayarak hazırlama verimliliğini artırır ve hafif reaksiyon koşullarını korur. Ek olarak, ALGMS, kontrollü salimli ilaçlar ve yüklü katalizörler gibi çeşitli işlevlere sahip olacak şekilde hazırlanabilir ve bu da çeşitli alanlarda kolay uygulanmasını sağlar.

Burada, mikroakışkan elektrosprey yöntemi kullanılarak ALG mikrokürelerinin hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. İşlem, bir ALG çözeltisinin bir mikroakışkan cihazdan geçirilmesini ve elektrospreye tabi tutulmasını içerir. Elde edilen damlacıklar, çapraz bağlama reaksiyonunu başlatmak için farklı metal iyonları (Ca2 +, Cu2 +, Zn2 + ve Fe3 +) içeren çözelti içinde toplandı. Bu reaksiyon, mikro kürelerin stabilitesini ve yapışmasını geliştirir ve onlara farklı işlevler kazandırır. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi kolaydır ve sentezlenen mikro küreler, morfolojilerinde iyi bir boyut homojenliği sergiler. Ek olarak, antimikrobiyal özelliklerini, yavaş ilaç salma yeteneklerini ve biyouyumluluklarını araştırdık. Bu protokol daha fazla ilaç geliştirme ve üretimi için faydalı olacaktır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneylerde kullanılan kan, 20-25 g ağırlığında ve yaklaşık 7 haftalık SPF dereceli BALB/c dişi farelerden elde edildi. Zhejiang Shuren Koleji Hayvan Deneyleri Etik Kurulu, tüm hayvan bakımı ve deney prosedürlerini onayladı.

1. Çözelti hazırlama

  1. ALG'yi tartın ve %2 ALG çözeltisi elde etmek için 50 °C'de bir su banyosunda karıştırarak ultra saf suda çözün.
  2. Ultra saf suda %5 (veya molar kütle konsantrasyonu 0.3 M'dir) CaCl2, FeCl3, ZnS04 ve CuS04 çözeltileri ile ayrı ayrı kütle fraksiyonu hazırlayın. Her çözeltiyi ayrı ayrı bir toplama kabına dökün.

2. Mikroakışkan elektrosprey cihazı

  1. Bir cam kılcal boru alın ve yumuşatmak için bir kaynak makinesi alevinin üzerine yerleştirin, ardından çeşitli çaplara (50 μm-500 μm) gerin. İnce parçaları bir cam kesici ile kesin ve uç portunu yüksek kaliteli silisyum karbür zımpara kağıdı ile nazikçe parlatın. Temizledikten sonra, kılcal borunun kalın ucunu uzun bir boruya ve borunun diğer ucunu bir dağıtım iğnesine ve 5 mL'lik bir şırıngaya bağlayın (Ek Şekil 1).
    NOT: Cam tüp kesiklerinin keskin kenarlarının hortuma yerleştirilmesi zordur; Bu nedenle, kırılma alev kenarında yuvarlanmalıdır.
  2. Şırıngayı mikroakışkan şırınga pompasına ve bir ucundaki kılcal boruyu tutucuya takın. Yüksek voltajlı güç kaynağının kırmızı yüksek voltajlı uç klipsini şırınganın dağıtım iğnesine bağlayın ve gümüş klipsi toplama sıvısına yerleştirin. Bu konfigürasyon, basit bir mikroakışkan elektrosprey cihazı oluşturur (Şekil 1A).
    NOT: Kılcal boruyu masaya dik olarak yerleştirin.

3. ALG mikro küreciklerinin hazırlanması

  1. Farklı metal iyonları içeren ayrı toplama kaplarını doğrudan kılcal borunun altına yerleştirin. Mikroakışkan şırınga pompasını açın ve tüpü ALG ile doldurmak için Hızlı İleri öğesini seçin, ardından uygun akış hızını (2 mL/s) ayarlayın.
  2. Yüksek voltajlı güç anahtarını açın ve uygun voltajı (5-7 kV) ayarlamak için düğmeyi çevirin.
  3. Farklı metal iyonları ile çapraz bağlı ALGM'ler oluşturmak üzere ALG mikrokürelerini toplamak için 90 mm'lik Petri kaplarının her birine 20 mL çözelti ekleyin (Şekil 1B).
  4. ALG, birkaç saniye içinde farklı iyon toplama çözeltilerinde elektrik alanı ve yerçekimi etkisi altında mikro küreler oluşturur. Mikroküreleri sterilize edilmiş bir pipetle aspire edin ve Zn2 +, Ca2 +, Cu2 + ve Fe3 + -ALG hidrojel mikroküreleri elde etmek için bunları ayrı ayrı 1.5 mL santrifüj tüplerine aktarın (Şekil 1C). Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS ve Fe-ALGMS tüplerini etiketleyin.
    NOT: Voltaj, uç çapı, akış hızı ve çözelti konsantrasyonu gibi parametreler ayarlanarak farklı çaplarda mikro küreler elde edilebilir.
  5. Hazırlanan mikro kürelerden küçük bir miktar alın, bunları PBS'de mümkün olduğunca eşit bir şekilde dağıtın ve görselleştirme için mikroskop altına yerleştirin.
  6. Aynı mikro küre partisinde rastgele seçilen 10 gözlem alanı, ölçülecek görüntüleri ImageJ yazılımına aktarın, görüntüleri uygun gri tonlama moduna dönüştürün ve hedef parçacıkların alanını doğru bir şekilde tanımlamak için eşik segmentasyon teknolojisini kullanın ve ImageJ'in hedef parçacıkları tanımlayabilmesi ve ölçebilmesi için parçacıkları analiz etme işlevini başlatın. Mikro küreler hakkında veri elde edin ve ardından verileri analiz ve parçacık boyutu haritalaması için Origin yazılımına aktarın.

4. Antimikrobiyal performans testi

  1. Staphylococcus aureus (S. aureus) ve Escherichia coli'nin (E. coli) 5 mL süspansiyonlarını sıvı bir Luria-Bertani (LB) ortamı kullanarak 0.2 mcF'lik bir başlangıç bakteriyel bulanıklığı ile hazırlayın.
  2. 4 ayrı 15 mL steril santrifüj tüpüne her bakteri çözeltisinden 10 mL ekleyin. Ardından, her tüpe 0,5 mL Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS ve Fe-ALGMS ALG ekleyin ve bunları 12 saat boyunca 37 ° C ve 200 rpm'de sabit sıcaklıklı bir çalkalayıcıya yerleştirin. Kontrol grubuna eşit miktarda salin ekleyin.
  3. Her bakteri çözeltisini steril su ile10 5 kez seyreltin. Bir LB katı ortama 200 μL bakteri çözeltisi yaymak için steril bir cam boncuk kullanın.
  4. Solüsyonu kaplama plakasına hızlı ve eşit bir şekilde yayın, aynı alanda ileri geri kaçının. Ardından, plakaları 12 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Farklı grupların kolonilerini gözlemleyin.
    NOT: Tüm aseptik prosedürler bir alkol lambasının yakınında yapılmalıdır. Mikrobiyal kültür kaplarını, aşılama kaplarını ve kültür ortamlarını sterilize edin.

5. İlaç salım testi

  1. Farklı mikrokürelerin ilaç salma kabiliyetini değerlendirmek için, yüklü bir model ilaç olarak sığır serum albümini (BSA) kullanın. 24 saat boyunca 1 mg / mL BSA süspansiyonuna her mikroküreden (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ve Fe-ALGMS) 500 μL ekleyin.
  2. İlaç salım tahlili için, her doymuş numuneyi 5.0 M fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7.4) içine ekleyin, ardından 80 rpm'de sürekli çalkalama ile 37 ° C'de 15 dakika çalkalayın.
  3. 100 μL çözelti kullanın ve ortamı 1, 3, 6, 12, 24, 36 ve 48 saatte yeni bir tane ile değiştirin.
  4. Üreticinin talimatlarına göre bir BCA kiti kullanarak süpernatan protein konsantrasyonlarını belirli zamanlarda ölçün. Karşılık gelen emiciliği elde etmek için salınan ilacı enzim markörü ile kantitatif olarak ölçün ve ölçülen değeri standart eğriye göre gerçek ilaç konsantrasyonuna dönüştürün. Aşağıdaki formülü kullanarak ilaç salım oranını hesaplayın:
    İlaç salınım yüzdesi = (belirli bir zaman noktasında salınan ilaç konsantrasyonu / ilk ilaç konsantrasyonu) x %100
  5. Düzenli aralıklarla, her bir oyuktan eşit miktarda PBS çıkarın ve eşit hacimde taze ortamla değiştirin.

6. Hemoliz testi

  1. Hazırlanan Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ve Fe-ALGMS'yi PBS'ye yerleştirin ve inkübasyon solüsyonunu formüle etmek için 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
  2. Sodyum sitrat içeren antikoagüle tüplerde toplanan oküler flebotomi ile sağlıklı BALB/c farelerinden tam kan elde edin. Kırmızı kan hücreleri elde etmek için 15 dakika boyunca 1509 x g'da vorteks ve santrifüj edin.
  3. Kırmızı kan hücrelerini PBS ile 2x-3x yıkayın ve PBS ile% 10'luk bir kırmızı kan hücresi çözeltisi hazırlayın.
  4. Çeşitli ALGM'lerin hazırlanması: Deney grubu için her mikroküreden 500 μL, pozitif kontrol grubu için 1 mL ultra saf su (ddH2O) ve negatif kontrol grubu için 1 mL PBS çözeltisi alın ve her birini 20 μL kan hücresi çözeltisi ile karıştırın.
  5. Numuneleri 37 °C'de 4 saat inkübe edin, 1509 x g'da santrifüjleyin, 15 dakika. Süpernatanı bir kenara bırakın ve hemolizden sonra her gruptaki kırmızı kan hücrelerini fotoğraflayın.
  6. Pozitif kontrol grubunun hemoliz oranını %100 ve negatif kontrol grubunun hemoliz oranını %0 olarak alınız. Her gruptaki süpernatanların absorbans değerlerini ölçün ve aşağıdaki formülü kullanarak hemoliz oranını hesaplayın:
    Hemoliz (%) = (Her grubun süpernatantlarının absorbans değerleri-
    Tek başına damıtılmış suyun absorbans değerleri) / (Pozitif kontrol grubunun absorbans değerleri- Sadece distile suyun absorbans değerleri) x 100

7. Sitobiyouyumluluk testi

  1. Farklı ALGMS 2x'i PBS ile yıkayın ve 15 dakika boyunca 5 mL'lik bir Petri kabına koyun ve süpernatanı atın.
  2. % 10 FBS içeren tam kültür ortamında (DMEM) 0.2 mL'de farklı ALGMS'leri ayrı ayrı ekleyin, 37 ° C'de 24 saat inkübe edin ve sızıntı suyunu elde etmek için çözeltiyi süzün.
  3. NIH3T3 hücrelerini 24 oyuklu plakalarda yaklaşık% 70 hücre yoğunluğuna kadar kültürleyin, NIH3T3 hücrelerini mikroküre liç çözeltisi ile muamele edin ve 24 saat daha tam ortamla kültüre devam edin.
  4. Hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın.
  5. Calcein-/PI testini kullanarak hücre canlılığını değerlendirin. 2.5 μL Calcein-çözeltisi (4 mM) ve 12.5 μL PI çözeltisi (2 mM) alın ve bunları 5 mL 1x PBS'ye ekleyin ve 2 μM Calcein-ve 5 μM PI ile çalışan bir çözelti elde etmek için iyice karıştırın.
  6. Çalışma solüsyonunu oyuk başına 500 μL'de önceden ekilmiş hücre kültürü plakalarına ekleyin, ışık koruması altında 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin ve ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve fotoğraflayın. Her grup için üç çoğaltma ayarlayın.
  7. Hücre canlılığını aşağıdaki formüle göre hesaplayın:
    Hücre canlılığı (%) = canlı hücre sayısı / (canlı hücre sayısı + ölü hücre sayısı)

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklı metal iyonları ile çapraz bağlı ALGMS'nin karakterizasyonu
Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ve Fe-ALGMS'nin optik morfolojisi Şekil 2'de gösterilmiştir ve iyi küresellik, pürüzsüz yüzey, düzgün parçacık boyutu dağılımı (Ek Şekil 2) ve mükemmel monodispersite sergiler. Ayrıca taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve enerji dağılımlı spektroskopi (EDS) analizi kullanarak mikroskobik karakterizasyon gerçekleştirdik. Şekil 3'te gösterildiği gibi, mikro küreler genellikle iyi tanımlanmış yuvarlaklık ile küreseldi. Zn-ALGMS'nin yüzeyi eşit olmayan bir şekilde dağılmış ve birçok kırışıklık ile daha pürüzlü görünüyordu. Jeldeki çapraz bağlanma reaksiyonunda yer alan metal iyonlarının içerik dağılımını belirlemek için enerji dağıtıcı spektroskopi gerçekleştirdik. Özellikle, mikroküre boyutu, toplama mesafesi, jel konsantrasyonu ve elektrik alan voltajı12 gibi parametreler değiştirilerek ayarlanabilir. Özetlenen protokolde, mikroakışkan cihazın parametrelerini ve sıvı konsantrasyonunu ayarlayarak, özel gereksinimlere göre farklı boyutlarda parçacıklar kolayca elde edilebilir.

Antimikrobiyal özelliklerin değerlendirilmesi
Şekil 4'te gösterildiği gibi plaka yöntemini kullanarak farklı mikrokürelerin antimikrobiyal kapasitesini değerlendirdik. Farklı mikroküreler, E. coli ve S. aureus'a karşı antibakteriyel aktivite sergiledi ve Cu-ALGMS ve Zn-ALGMS en güçlü antibakteriyel özellikleri gösterdi. Bu yüksek etkinlik, metallerin, yani bakır (Cu) ve çinkonun (Zn) antimikrobiyal aktivitesine bağlanabilir.13. Sukhodub ve ark. Fe3 +, Zn2 +, Ca2 + ve Cu2 + 'nın kitosan ile sinerjik antibakteriyel etkiler sergilediğini, kitosan içermeyen örneklerin ise böyle bir aktivite göstermediğini ve oluşan komplekslerin sinerjik antibakteriyel etkisini doğruladığını göstermiştir14. Elde edilen sonuçlar, bakteriyel bulaşıcı hastalıkların tedavisinde Cu-ALGMS ve Zn-ALGMS'nin diğer hidrojel mikroküreciklerden üstün olmasıyla bu çalışma ile uyumludur.

İlaç salım özelliklerinin değerlendirilmesi
Model ilaç olarak BSA kullanılarak farklı metal bazlı aljinat hidrojel mikroküreciklerinden ilaç salımının değerlendirilmesi, salım profillerinde farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur. (Ek Şekil 3). İyonlar, diğer malzemelerinkinden daha iyi bir yavaş ilaç salma yeteneği sergiledi. Fe2 + 'nın ilaç salım hızı, diğer üç iyonunkinden nispeten daha hızlıydı, oysa Ca2 + ve Zn2 + 'nın ilaç salım oranı nispeten daha yavaştı. Bu sonuçlar, farklı iyonların ilaç salınımı üzerindeki etkilerindeki farklılıkları vurgulamaktadır. Fe2 + 'nın muhtemelen ilaçla etkileşime girdiğini veya salınmasını kolaylaştıracak şekilde bağlandığını, oysa Ca2 + ve Zn2 + 'nın ilaca daha sıkı bağlandığını veya salım oranını sınırlayan başka faktörler olduğunu varsayıyoruz. Hidrojel mikroküreciklerinden bu sürekli ilaç salınımı, metal ve aljinat polisakkarit arasındaki çapraz bağlanma kuvveti ile ilişkili olabilir. Ek olarak, BSA'nınkine kıyasla farklı metallerin adsorpsiyon kapasitesindeki fark, muhtemelen ilaç geciktirme yeteneklerinde gözlenen farklılıklara katkıda bulunmuştur.

Biyouyumluluk değerlendirmesi
İyi biyouyumluluk, klinik uygulamalarda ilaç taşıyıcı taşıyıcılar için bir ön koşuldur. Bu nedenle, in vitro hemoliz testi kullanarak mikrokürelerin hemouyumluluğunu değerlendirdik. Pozitif kontrol olarak saf su ve negatif kontrol olarak PBS solüsyonu kullandık. Deneysel sonuçlar Ek Şekil 4'te gösterilmiştir ve süspansiyondaki kırmızı kan hücrelerinin farklı mikrokürelerle temas ettiğinde bozulmadan kaldığını ve mikroküreler tarafından minimal hemolizi gösterdiğini ortaya koymaktadır. Sitobiyouyumluluk sonuçları, mikrokürelerin hücresel aktiviteyi etkilemediğini gösterdi (Ek Şekil 5). Bu sonuçlar, mikrokürelerin iyi bir kan hücresi uyumluluğuna sahip olduğunu gösterdi.

figure-results-1
Şekil 1: Aljinat hidrojel mikroküreciklerinin hazırlanması. (A) Mikroakışkan elektrosprey teknolojisinin kurulumu. (B) Mikroakışkan elektrosprey işleminin gerçek zamanlı görüntüsü. (C) Hazırlanan Ca2 +, Cu2 +, Zn2 + ve Fe3 + aljinat hidrojel mikroküreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Aljinat hidrojel mikrokürecikleri mikrografı. PBS'de (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS ve (D) Fe-ALGMS mikrografı (pH 7.4). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Resim 3: Taramalı elektron mikroskobu ve enerji dağılım spektroskopisi. Görüntüler, mikroskopi verilerini taramak için i ve ii ve spektroskopi verileri için iii-v ile (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS ve (D) Fe-ALGMS'nin karakterizasyonunu göstermektedir. Görüntüler iii-v, EDS'nin tüm alan üzerinde elementel dağılım bilgisi elde etmek için taramak üzere numune yüzeyinde bir yüz seçtiği bir EDS haritalamasını göstermektedir. Harita tarama modu, gösterildiği gibi her bir elemanın farklı bir renkle temsil edildiği bileşim analizi, faz bölgesi analizi ve malzemelerin parçacık boyutu dağılımı uygulamalarında kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Mikrokürelerin antimikrobiyal özellikleri. (A) Grupların antimikrobiyal özellikleri bakteriyel yayma yöntemi kullanılarak test edilmiştir. (B, C) Her grup için bakteri yayma plakası sayım sonuçlarının niceliksel olarak belirlenmesi. Kontrol numuneleri, herhangi bir ilave yapılmadan LB ortamında yetiştirilen kolonileri göstermektedir. Diğer bakteriler için nispi koloniler, kontrol grubunun klon sayısı 0 olarak alınarak ve temel olarak kullanılarak hesaplandı. Hata çubuğu: standart sapma, n = 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Bir cam tüp, uzun bir kauçuk tüp aracılığıyla şırıngaya bağlanır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Parçacık boyutu. (A) Zn-ALGMS, (B) Ca-ALGMS, (C) Cu-ALGMS, (D) Fe-ALGMS. Tüm numuneler için %5'lik bir molar konsantrasyon kullanıldı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: İlaç salınımı. PBS'de Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ve Fe-ALGMS'nin ilaç salım eğrisi (pH 7.4). Hata çubuğu: standart sapma, n = 3 Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ve Fe-ALGMS'nin hemoliz testi. PC (Pozitif Kontrol): ddH2O; NC (Negatif Kontrol): PBS. Hata çubuğu: standart sapma, n = 3. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Farklı iyonlarla çapraz bağlanmış mikrokürelerin sitotoksisitesi. Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS ve Fe-ALGMS'nin biyouyumluluk değerlendirmesi yapıldı. Testi gerçekleştirmek için Calcein-/PI kullanıldı ve buradaki sonuçlar için 5 görüş alanı rastgele seçildi. ImageJ, nispi hücre canlılığını elde etmek için kırmızı kan hücrelerinin ölü hücrelere oranını analiz etmek için kullanıldı. 1.PC, Pozitif Kontrol, 2.NC, Negatif Kontrol, 3. Zn-ALGMS, 4. Ca-ALGMS, 5. Cu-ALGMS, 6. Fe-ALGMS, Hata çubuğu: standart sapma, n = 3. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, mikroakışkan elektrosprey teknolojisine dayalı ALGMS hazırlamak için bir yöntem sunuyoruz. Yöntemin kullanımı basittir ve düzgün yuvarlaklığa ve kontrol edilebilir çapa sahip çok sayıda mikro küre verir. Bu yaklaşım araştırmacılara kolaylık sağlar ve hidrojel mikroküreciklerin araştırılmasını ve uygulanmasını teşvik edebilir. Ek olarak, farklı metal iyonları ile çapraz bağlanma yoluyla, ALGMS'nin stabilitesi ve biyoaktivitesi iyileştirildi. Antimikrobiyal deneylerde, Cu-ALGMS ve Zn-ALGMS önemli bakteriyel inhibitör etkiler göstermiştir.

Hidrojel mikro kürecikler, mükemmel plastisiteye sahip esnek mikro yapılardır ve özel malzeme seçimi ve yapısal tasarım yoluyla etkili ilaç dağıtımını sağlar. Hafif koşullar altında jelleşen doğal bir polisakkarit olan aljinat, biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilir ve toksik değildir. Mikron ölçekli sodyum aljinat mikrokürecikleri, farmasötik araştırma, ilaç dağıtımı ve doku mühendisliği dahil olmak üzere biyokimya ve biyotıpta yaygın olarak kullanılmaktadır. Sodyum aljinat mikro küreciklerinin ilaç dağıtım uygulamalarında önemli bir avantajı, aktif farmasötik bileşenin yüksek konsantrasyonlarının uzun bir süre boyunca korunmasını sağlayarak, sürekli ilaç salınımı yetenekleridir14. Devam eden ilaç salım deneylerimiz, farklı iyonik çapraz bağlamaya sahip ALGMS'nin ilaç salımını sürdürme yeteneğine sahip olduğunu ve ilaç dağıtım uygulamaları için kullanılabileceğini ortaya koydu.

Hidrojel mikroküreler için yaygın üretim yöntemleri arasında toplu emülsifikasyon, mekanik ufalama, litografi, mikroakışkan emülsiyon ve elektrosprey 8,15 bulunur. Kesikli emülsifikasyon ve mekanik kırma yöntemlerinin avantajları, imalat yönteminin basitliğinde ve yüksek çıktı verimliliğinde yatmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemleri kullanarak tek tek hidrojel mikro kürelerin şeklini kontrol etmek zordur. Fotolitografi, çapraz bağlanmayı iyileştirmek ve hidrojel mikro küreler oluşturmak için ışığı bir maske plakasına veya kalıba odaklamayı içerir. Bununla birlikte, bu yöntemin üretim verimliliği maske plakası, ışık kaynağı ve kalıptan kolayca etkilenir. Ayrıca, mikroakışkan emülsiyon yöntemi, hidrojel mikro kürelerin kalıplama sürecini daha iyi kontrol edebilir ve belirtilen şekillere sahip hidrojel mikro küreler üretebilir; Bununla birlikte, üretim verimliliği düşüktür16. Bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, mikroakışkan elektrosprey yöntemi, tek tip boyuta, düzenli şekle ve ayarlanabilir parçacık boyutu17'ye sahip hidrojel mikro küreler üretebilir. Bu protokoldeki en önemli adım, mikro kürelerin hazırlanmasıdır. Mikro küreciklerin boyutu ve şekli, cam tüpün düzlüğüne, voltaj değerine ve akış hızına18 bağlı olarak değişebilir. Mikroküreleri hazırlamak için mikroakışkan elektrosprey teknolojisinin kullanılmasında, mikrokanalların tıkanma eğilimi ve sınırlı verim, malzemelerin sınırlı uyumluluğu ve proses ölçek büyütmenin zorluğu ve proses kontrolü ve izlemenin zorluğu gibi bazı sınırlamalar da vardır. Bu, yaygın uygulamalarını bir dereceye kadar sınırlar19.

Özetle, mikroakışkan elektrosprey teknolojisi, tek adımlı sentez avantajı sunan olgun bir mikroküre hazırlama yöntemidir. Akış kanalı boyut parametrelerini optimize ederek ve malzeme konsantrasyonunu ve akış hızını kontrol ederek, çeşitli morfolojiler ve boyutlarda mikro küreler kolayca elde edilebilir. Özellikle, işlem yalnızca sulu fazı içerir ve ek yüzey aktif madde içermez, bu da onu çevre dostu ve kullanımı basit hale getirerek karmaşık yıkama işlemlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu yöntem, aljinat jelleştirme işlemine benzer şekilde hidrojel malzemelerden mikro küreler üretmek için bir strateji sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiçbir çıkar çatışması açıklanmayacaktır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Zhejiang Shuren Üniversitesi araştırma projesi (2023R053 ve 2023KJ237) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
120 örgü ekranSolarbio, ÇinYA0946
Alkol brülörüSolarbio, ÇinYA2320
BALB / c farelerWukong Biyoteknoloji, Çin
Bikinkoninik Asit Test reaktifiMeilunbio, ÇinMA0082
Sığır Serumu AlbüminLablead, Çin9048-46-8
CaCl2 & nbsp; tozAladdin, Çin10043-52-4
Calcein-/ PIBiosharp, ÇinBL130A
Santrifüj tüpleriCorning, Amerika430290
CuSO4 ve nbsp; tozJnxinyuehuagong, Çin7758-99-8
DMEMGibicol, ÇinC11995500BT
FeCl3 ve nbsp tozAladdin, Çin7705-08-0
Fetal Sığır SerumuHAKATA, ÇinHN-FBS
Cam tüplerSartorius, AlmanyaCC0028
Işık mikroskobuEvidentscientific, JaponyaBX53 (LED)
Mikroakışkan şırınga pompasıLongerpump, İngiltereLSP01-3A
NIH3T3HyGyte, ÇinTCM-C752
Petri kabıThermofisher, Amerika150464
Fosfat tampon salinThermofisher, Amerika3002
Taramalı elektron mikroskobuThermofisher, AmerikaAxia ChemiSEM
Sodyum aljinat tozu Bjbalb, ÇinY13095
ZnSO4 tozuJnxinyuehuagong, Çin7733-02-0

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gong, J., et al. A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system. Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).
  2. Zhao, Z., et al. Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery. Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).
  3. Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery. Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).
  4. Lei, L., et al. Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing. Mater Design. 215, 110478(2022).
  5. Ju, Y., et al. Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing. Mater Today Bio. 22, 100739(2023).
  6. El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. New antibacterial hydrogels based on sodium alginate. Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).
  7. Olukman Şahin, M., Şanlı, O. In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres. Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).
  8. Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).
  9. Yang, L., et al. Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration. Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).
  10. Zheng, H., et al. Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain. Biomater Adv. 149, 213398(2023).
  11. Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration. Chem Eng J. 476, 146797(2023).
  12. Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment. ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).
  13. Li, S., et al. Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring. Chem Eng J. 482, 149173(2024).
  14. Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite. Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).
  15. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).
  16. Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  17. Yang, L., et al. Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair. Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).
  18. Wu, D., et al. NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy. ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).
  19. Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. Development and future of droplet microfluidics. LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

apraz Ba l Mikrok relerMetal yonu apraz Ba lamaHidrojel Mikrok relerla Sal mAntimikrobiyal zelliklerla Sal n mBiyouyumluluk De erlendirmesiTaramal Elektron Mikroskobu

İlgili makaleler