Yöntem makalesi

Kök Hücre Dağıtımı Kullanılarak Omurilik Yaralanması için Kombinatoryal Terapötiklerin Geliştirilmesi

DOI:

10.3791/66872

⸱

7 Haziran 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, omurilik yaralanması onarımı için adipoz kaynaklı kök hücrelerin pro-rejeneratif davranışını araştırmak ve bunlardan yararlanmak için kullanılabilecek sinir-mimetik kompozit hidrojeller geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Travmatik omurilik yaralanması (SKY), yaralanma bölgesinin altında kalıcı sensorimotor defisite neden olur. ABD'de yaklaşık çeyrek milyon insanı etkiliyor ve ölçülemez bir halk sağlığı sorununu temsil ediyor. Etkili tedavi sağlamak için araştırmalar yapılmıştır; bununla birlikte, yaralanma bölgesinin karmaşık doğası nedeniyle SCI hala tedavi edilemez olarak kabul edilmektedir. İlaç dağıtımı, hücre nakli ve enjekte edilebilir biyomalzemeler dahil olmak üzere çeşitli stratejiler araştırılmıştır, ancak tek başına bir strateji rejenerasyon için etkinliklerini sınırlar. Bu nedenle, son zamanlarda yaralanmanın çok yönlü özelliklerini hedef alabilen kombinatoryal tedaviler dikkat çekmiştir. Hücre dışı matrislerin (ECM) SCI için hücre transplantasyonunun etkinliğini artırabileceği gösterilmiştir. Bu amaçla, hücreden arındırılmış omurilikler (dSC'ler) ve siyatik sinirlerden (dSN'ler) oluşan 3 boyutlu hidrojeller farklı oranlarda geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir. dSC'lerin ve dSN'lerin histolojik analizi, hücresel ve nükleer bileşenlerin çıkarıldığını doğruladı ve hücresellikten çıkarmadan sonra doğal doku mimarileri korundu. Daha sonra, farklı hacimsel oranlarda kompozit hidrojeller oluşturuldu ve bulanıklık jelleşme kinetiği, mekanik özellikler ve gömülü insan yağ kaynaklı kök hücre (hASC) canlılığı analizlerine tabi tutuldu. Hidrojellerin ve hücresellikten arındırılmış omurilik matrislerinin farklı oranları arasında mekanik özelliklerde önemli bir fark bulunmadı. Jellere gömülü insan ASC'leri, 14 günlük kültür boyunca canlı kaldı. Bu çalışma, sinire özgü ECM ve pro-rejeneratif mezenkimal kök hücreler sunan doku mühendisliği kombinatoryal hidrojellerin üretilmesi için bir araç sağlar. Bu platform, gelecekteki araştırmalarla SCI'den sonra nöro-rejeneratif stratejiler hakkında yeni bilgiler sağlayabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaklaşık 296.000 kişi travmatik SCI'den muzdariptir ve her yıl ABD'de yaklaşık 18.000 yeni SCI vakası meydana gelmektedir1. Travmatik SCI genellikle düşmeler, ateşli silah yaralanmaları, araç kazaları ve spor aktivitelerinden kaynaklanır ve sıklıkla yaralanma bölgesinin altında kalıcı sensorimotor fonksiyon kaybına neden olur. SCI tedavisi için tahmini yaşam boyu masraflar, önemli ölçüde daha düşük yaşam beklentileri ile kişi başına bir ila beş milyon dolar arasında değişmektedir1. Yine de, SKY hala tam olarak anlaşılamamıştır ve esas olarak yaralanma sonrası karmaşık patofizyolojik sonuçlar nedeniyle büyük ölçüde tedavi edilemez2. Hücre nakli ve biyomalzeme bazlı iskeleler dahil olmak üzere çeşitli stratejiler araştırılmıştır. Hücrelerin ve biyomateryallerin transplantasyonu potansiyel göstermiş olsa da, SCI'nin çok yönlü doğası kombinatoryal yaklaşımların daha faydalı olabileceğini düşündürmektedir3. Sonuç olarak, birçok kombinatoryal strateji araştırılmış ve tek tek bileşenlerden daha iyi terapötik etkinlik gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücrelerin ve ilaçların verilmesi için yeni biyomateryaller sağlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır3.

Doğal hidrojellerin üretilmesi için umut verici bir yaklaşım, doku hücreden arındırmadır. Hücreden arındırma işlemi, ECM bileşenlerini korurken hücresel ve nükleik materyallerin tümünü veya çoğunu çıkarmak için iyonik, iyonik olmayan, fiziksel ve kombinatoryal yöntemler kullanır. Hücresel bileşenlerin tamamını veya çoğunu çıkararak, ECM'den türetilen hidrojeller, implantasyon/enjeksiyondan sonra konakçıya karşı daha az immünoreaktiftir4. Hücreden arındırılmış dokuların kalitesini değerlendirmek için ölçülmesi gereken birkaç parametre vardır: hücresel/nükleik içeriğin çıkarılması, mekanik özellikler ve ECM'nin korunması. Olumsuz bağışıklık tepkilerini önlemek için aşağıdaki kriterler belirlenmiştir: 1) mg ECM kuru ağırlığı başına 50 ng'den az çift sarmallı DNA (dsDNA), 2) 200 bp'den az DNA fragmanı uzunluğu ve 3) 4'6-diamidino-2-fenuylindol (DAPI) ile boyanmış neredeyse hiç görünür nükleer materyal yoktur5. Mekanik özellikler çekme, kompresyon ve/veya reoloji testleri ile ölçülebilir ve orijinal dokuyabenzer olmalıdır 6. Ek olarak, protein koruması, örneğin laminin, glikozaminoglikan (GAG) ve omurilikiçin kondroitin sülfat proteoglikan (CSPG) gibi hücreden arındırılmış dokuların ana bileşenlerine odaklanan proteomik veya kantitatif deneylerle değerlendirilebilir 7,8. Doğrulanmış ECM'den türetilmiş hidrojeller, hücre bazlı tedaviye yardımcı olmak için farklı hücre türleri ile yeniden hücreselleştirilebilir9.

SCI onarımı için Schwann hücreleri, koku alma kılıf hücreleri, kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) ve nöral kök / progenitör hücreler gibi çeşitli hücre tipleri incelenmiştir 10,11,12. Ancak etik kaygılar, komşu hücre/dokularla seyrek entegrasyon, yüksek verim için doku kaynaklarının eksikliği, kendini yenileyememe ve/veya sınırlı proliferatif kapasite nedeniyle bu hücrelerin klinik kullanımı sınırlıdır 13,14,15. Bu hücre tiplerinden farklı olarak, insan adipoz kaynaklı MSC'ler (hASC'ler), lipoaspiratlar kullanılarak minimal invaziv bir şekilde kolayca izole edildikleri ve çok sayıda hücre elde edilebildikleri için çekici bir adaydır16. Ek olarak, hASC'ler nöroprotektif, anjiyogenistik, yara iyileşmesi, doku rejenerasyonu ve immünosupresyon potansiyeline sahip büyüme faktörleri ve sitokinleri salgılama yeteneğine sahiptir 17,18,19,20,21.

Tanımlandığı gibi, çok sayıda çalışma yapılmıştır 22,23,24 ve bunlardan çok şey öğrenilmiştir, ancak SCI'nin heterojen özellikleri fonksiyonel iyileşmeyi teşvik etmedeki etkinliklerini sınırlamıştır. Bu nedenle, SKY için tedavi etkinliğini artırmak için kombinatoryal yaklaşımlar önerilmiştir. Bu çalışmada, üç boyutlu (3D) bir hASC kültürü için hücreden arındırılmış omurilikler ve siyatik sinirler birleştirilerek kompozit hidrojeller geliştirilmiştir. Başarılı decellularizasyon, histolojik ve DNA analizleri ile doğrulandı ve farklı oranlarda sinir kompozit hidrojelleri, jelleşme kinetiği ve kompresyon testleri ile karakterize edildi. Sinir kompozit hidrojellerdeki hASC'lerin canlılığı, bu hidrojelin bir 3D hücre kültürü platformu olarak kullanılabileceğini kanıtlamak için araştırıldı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Domuz dokuları ticari olarak elde edildi, bu nedenle hayvan etik komitesi tarafından onay gerekmedi.

1. Domuz omuriliklerinin hücreden arındırılması (Tahmini süre: 5 gün)

NOT:25,26 değişiklikleriyle önceden oluşturulmuş protokolleri kullanarak hücre gidermeyi gerçekleştirin. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler oda sıcaklığında steril bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Tüm çözeltiler, bir şişe üstü filtre (0.2 μm gözenek boyutu) kullanılarak otoklavlanmış şişelere steril olarak filtrelenmelidir. 37 °C'de yapılacak işlemler bir inkübatör veya 37 °C'ye ayarlanmış temiz bir fırın içinde yapılabilir.

  1. Hücre giderme solüsyonlarının hazırlanması
    NOT: Tüm çözeltiler 1 L için hesaplanmıştır. Kullanıcıların deneysel ihtiyaçlarına göre gerekli nihai hacmi ayarlamaları gerekebilir.
    1. % 0.025 tripsin / EDTA yapmak için 500 mL %0.05 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
    2. % 3 Triton X-100 yapmak için 300 mL %10 Triton X-100'ü 700 mL PBS ile seyreltin. 100 mM Na/50 mM fos tamponu yapmak için 0.56 g NaCl, 1.31 g NaH2PO4H2O ve 10.85 gHNa 2O4P·7H2O'yu 1 L deiyonize suda karıştırın.
    3. 1 M sükroz yapmak için 32.4 g sakarozu 1 L deiyonize suda karıştırın. % 4 SD çözeltisi elde etmek için 40 g sodyum deoksikolat (SD) 1 L deiyonize su içinde karıştırın. 6.7 mL %15 perasetik asidi 993.3 mL %4 etanol ile seyreltin.
  2. Domuz omuriliğinin hazırlanması
    NOT: Omurilikler herhangi bir çözelti olmadan donmuş olarak sevk edildi ve kullanıma kadar -80 ° C'de tutuldu.
    1. Hücreden arındırmadan önce omuriliği buzdolabında 4 °C'de 18-24 saat çözdürün. Dura mater'i dikkatlice çıkarmak için steril makas kullanın.
    2. Omuriliği küçük parçalar halinde kesin (yaklaşık 1 cm uzunluğunda). Bir parçayı 15 mL'lik bir tüpe veya en fazla üç parçayı 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  3. Omuriliğin hücreden çıkarılması
    NOT: Her adımdan sonra, hücre giderme çözeltileri atılmak üzere büyük bir behere manuel olarak dökülür. Küçük otoklavlanabilir paslanmaz çelik süzgeç, her adım için gereken dokuları kaybetmeden hücre giderme solüsyonlarının atılmasına yardımcı olmak için kullanılabilir. Aksi belirtilmedikçe omurilik 83 rpm'de ajite edildi.
    1. Omuriliği deiyonize su ile 4 ° C ve 60 rpm'de 18-24 saat durulayın.
    2. Omuriliği %0.025 tripsin/EDTA ile 37 °C ve 40 rpm'de 1 saat durulayın. Ardından, omuriliği PBS ile 15 dakika, 2 kez durulayın.
    3. Omuriliği 2 saat% 3 Triton X-100 ile durulayın. Omuriliği 100 mM Na / 50 mM fos tamponu ile 15 dakika, 2x durulayın.
    4. Omuriliği 1 saat boyunca 1 M sükroz ile durulayın. Daha sonra omuriliği 1 saat deiyonize su ile durulayın.
    5. Omuriliği 2 saat boyunca% 4 SD ile durulayın. Daha sonra omuriliği 100 mM Na/50 mM fos tamponu ile 15 dakika, 2x durulayın.
    6. Omuriliği 4 saat boyunca% 4 etanol içinde% 0.1 perasetik asit ile durulayın. Ardından, omuriliği 1 saat boyunca PBS ile durulayın.
    7. Omuriliği deiyonize su ile 1 saat, 2 kez durulayın. Ardından, omuriliği 1 saat boyunca PBS ile durulayın.
    8. Omuriliği 0.01 mbar ve -56 °C'de 3 gün boyunca liyofilize edin ve kullanana kadar kuru olarak saklayın.

2. Domuz siyatik sinirinin hücreden arındırılması (Tahmini süre: 5 gün)

NOT: Önceden oluşturulmuş bir protokol27 kullanarak hücre hücreden arındırma işlemini gerçekleştirin. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler oda sıcaklığında steril bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Tüm çözeltiler, bir şişe üstü filtre (0.2 μm gözenek boyutu) kullanılarak otoklavlanmış şişelere steril olarak filtrelenmelidir. 37 °C'de yapılacak işlemler bir inkübatör veya 37 °C'ye ayarlanmış temiz bir fırın içinde yapılabilir.

  1. Hücre giderme solüsyonlarının hazırlanması
    NOT: Tüm çözeltiler 1 L için hesaplanmıştır. Kullanıcıların deneysel ihtiyaçlarına göre gerekli nihai hacmi ayarlamaları gerekebilir.
    1. 1.86 g NaCl, 0.262 g d NaH2PO4H2O ve 2.17 gHNa 2O4P 7H2O 1 L deiyonize su içinde karıştırarak 50 mM Na / 10 mM fos tamponu hazırlayın.
    2. 38.4 g SB-10'u 1 L 50 mM Na/10 mM fos tamponunda karıştırarak 125 mM sülfobetain-10 (SB-10) çözeltisi hazırlayın.
    3. 1 L 50 mM Na/10 mM fos tamponunda 30 g SD ve 0.24 g SB-16'yı karıştırarak% 3 SD / 0.6 mM sülfobetain-16 (SB-16) çözeltisi hazırlayın.
  2. Domuz siyatik sinirinin hazırlanması
    NOT: Siyatik sinirler PBS ile donmuş olarak sevk edildi ve kullanıma kadar -80 ° C'de tutuldu.
    1. Siyatik siniri, hücreden arındırmadan 18-24 saat önce buzdolabında 4 °C'de çözdürün.
    2. Siyatik siniri küçük parçalar halinde kesin (yaklaşık 1 cm uzunluğunda). Bir parçayı 15 mL'lik bir tüpe veya en fazla üç parçayı 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  3. Siyatik sinirin hücrelerden arındırılması
    NOT: Her adımdan sonra, hücre giderme solüsyonları atılmak üzere büyük bir behere manuel olarak dökülür ve her adım için gereken dokuları kaybetmeden hücre giderme solüsyonlarının atılmasına yardımcı olmak için küçük bir otoklavlanabilir paslanmaz çelik süzgeç kullanılabilir. Aksi belirtilmedikçe siyatik sinir 15 rpm'de ajite edildi.
    1. Siyatik siniri 7 saat boyunca deiyonize su ile durulayın. Daha sonra siyatik siniri 125 mM sülfobetain-10 (SB-10) ile 50 mM Na / 10 mM fos tamponunda 18 saat durulayın.
    2. Siyatik siniri 100 mM Na / 50 mM fos tamponu ile 15 dakika durulayın. Daha sonra siyatik siniri 2 saat boyunca 50 mM Na / 10 mM fos tamponunda% 3 SD / 0.6 mM sülfobetain-16 (SB-16) ile durulayın.
    3. Siyatik siniri 100 mM Na / 50 mM fos tamponu ile 15 dakika, 3 kez durulayın. Daha sonra siyatik siniri 50 mM Na/10 mM fos tamponunda 125 mM SB-10 ile 7 saat durulayın.
    4. Siyatik siniri 100 mM Na / 50 mM fos tamponu ile 15 dakika durulayın. Daha sonra siyatik siniri 1.5 saat boyunca 50 mM Na / 10 mM fos tamponunda% 3 SD / 0.6 mM SB-16 ile durulayın.
    5. Siyatik siniri 50 mM Na / 10 mM fos tamponu ile 15 dakika, 3 kez durulayın. Daha sonra siyatik siniri 75 U / mL deoksiribonükleaz (DNaz) ile 3 saat çalkalama olmadan durulayın.
    6. Siyatik siniri 50 mM Na / 10 mM fos tamponu ile 1 saat, 3 kez durulayın. Daha sonra siyatik siniri 0.2 U/mL Kondroitinaz ABC ile 37 ° C'de çalkalamadan 16 saat boyunca durulayın.
    7. Siyatik siniri PBS ile 3 saat, 3 kez durulayın. Siyatik siniri 0.01 mbar ve -56 °C'de 3 gün boyunca liyofilize edin ve kullanana kadar kuru tutun.

3. Decellularized dokuların sindirimi ve kompozit hidrojellerin üretimi (Tahmini süre: 4 gün)

  1. Hücrelerden arındırılmış dokuları makas veya homojenizatör kullanarak toz haline getirin veya öğütün. Dokuları doğramak veya öğütmek için aletleri 121 °C'de 45 dakika boyunca bir otoklav kullanarak sterilize edin. Etilen oksit yöntemi de uygulanabilir.
  2. Dokuları, 15 mg / mL konsantrasyonda 1 mg / mL pepsin içeren 0.01 N hidroklorik asit (HCl) çözeltisinde ayrı ayrı sindirin. Decellularized omurilik ve siyatik sinirin tahmini ağırlıkları parça başına sırasıyla 50-100 mg ve 100-150 mg'dır.
  3. Manyetik çubuğu yerleştirin ve prejel çözeltileri oluşturmak için en az 500 gün boyunca 4 rpm ve 4 °C'de karıştırın.
  4. Siyatik sinir ve omurilik prejelini aşağıdaki hacimsel oranlarda karıştırın: 2: 1, 1: 1 ve 1: 2. 1 N sodyum hidroksit (NaOH) ve HCl kullanarak pH 7.4'ü ayarlayın ve M199 ortamı ve 1x PBS kullanarak istenen konsantrasyona seyreltin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Bir seferde 1 μL NaOH ekleyin. M199 ortamı, pH 7.4 olduğunda açık pembeye döndüğü için bir pH indikatörü olarak kullanılabilir, ancak pH seviyesini doğrulamak için pH şeritleri kullanılmalıdır.

4. Hücresellikten çıkarmanın doğrulanması

  1. Hematoksilen ve Eozin boyaması (H&E; Tahmini süre: 8 gün)
    NOT: Her durulama adımından sonra, çözeltiler atılmak üzere manuel olarak büyük bir behere dökülür.
    1. Taze ve hücresizleştirilmiş omurilik ve siyatik siniri% 3.7 formaldehit içinde 4 ° C'de 18 saat sabitleyin. Bir parçayı 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    2. Formaldehiti çıkarın ve dokuları 1 gün boyunca% 10 sükroz içine yerleştirin. % 10 sükrozu çıkarın ve dokuları 6 gün boyunca% 30 sükroz içine yerleştirin.
    3. Uygun boyutta bir kriyokalıbı optimum kesme sıcaklığı (OCT) ile yarıya kadar doldurun. Hücreden arındırılmış dokuları yerleştirin, üzerlerini OCT ile örtün ve 1 gün boyunca OCT'yi emmelerine izin verin.
    4. 1 gün sonra dokuları gece boyunca -80 °C'de dondurun. Bir kriyostat kullanarak dokuları 10 μm kalınlığında kriyoseksiyon yapın.
    5. 1x PBS ile 5 dakika, 2x durulayın. Ardından musluk suyu ile 5 dakika durulayın.
    6. 1 dakika hematoksilen çözeltisi ile boyayın. Musluk suyu ile 1 dakika, 3 kez durulayın.
    7. 1 dakika boyunca eozin çözeltisi ile lekeleyin. %95 etanol ile 1 dakika, 2x ve %100 etanol ile 1 dakika, 3 kez durulayın.
    8. Ksilen ile 1 dakika, 2 dakika ve ardından 1 dakika durulayın. Slaytları 5 dakika kurumaya bırakın.
    9. Slaytların üzerine 3-4 damla dibutilftalat polistiren ksilen (DPX) montaj solüsyonu damlatmak için pamuklu çubuk kullanın. Lamelleri DPX kaplı slaytların üzerine yerleştirin. Slaytları gece boyunca kurumaya bırakın.
  2. DNA analizi (Tahmini süre: 1 saat)
    1. Decellularized ve liyofilize dokuları tartın. Üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak DNA'yı izole edin ve miktarını belirleyin.

5. Kompozit hidrojellerin karakterizasyonu

  1. Jelleşme bulanıklık testi (Tahmini süre: 1 saat)
    1. Buz üzerindeki 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 μL prejel çözeltisi yerleştirin. Bir plaka okuyucu kullanarak 45 dakika boyunca her 2 dakikada bir 405 nm'de absorbansı okuyun.
    2. Aşağıdaki denklemi kullanarak normalleştirilmiş absorbansı hesaplayın:
      (Absorbans - AbsorbansBaşlangıcı) / (AbsorbansMaksimum - AbsorbansBaşlangıcı)
    3. Eğrinin eğimini ve sırasıyla %50 ve %95 jelleşme, t1/2 ve t95 elde etme süresini hesaplayın.
  2. Sıkıştırma testi (Tahmini süre: hidrojel başına 1 dakika)
    1. 8 mm çapında ve 2 mm yüksekliğinde 12 mg / mL konsantrasyonda kompozit hidrojeller üretin.
    2. Numuneleri, paslanmaz çelik paralel plakalar arasında 250 N'luk bir yük ile numune yüksekliğinin/dk'nın %10'u kadar bir gerinim hızında sıkıştırmak için bir reometre kullanın. Reometre okumaları sağlayan yazılım, kuvveti uygulayarak ve hidrojeller kırılana kadar gerinim ölçerek bir gerilim-gerinim eğrisi sağlayacaktır.
    3. Gerilim-gerinim eğrilerinin doğrusal bölgesinin eğiminden Young modülünü hesaplayın.

6. Sinir kompozit hidrojellerde insan ASC'lerinin üç boyutlu kültürü

  1. Üç boyutlu (3D) platformun hazırlanması (Tahmini süre: 3 saat)
    1. 200 μm derinliğinde ve 4 mm çapında dairesel desenler oluşturmak için SU-8 fotorezist ile silikon gofret aşındırın.
    2. Polidimetilsiloksan (PDMS) bazını ve kürleme maddesini 10:1 oranında karıştırın. Karışımı silikon gofret üzerine dökün ve PDMS tabanı ile kürleme maddesinin karıştırılmasından kaynaklanan tüm kabarcıkları çıkarmak için 20 dakika bekletin.
    3. Fırına koyun ve 70 °C'de 2 saat kürleyin. Kürlenmiş PDMS tabakasını kalıptan çıkarın ve PDMS mikro kuyuları yapmak için 8 mm çapında bir biyopsi zımbası kullanarak delin.
    4. Mikro kuyuları 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve PDMS mikro kuyularını sterilize etmek için kuyu plakasını bir hava-plazma temizleyicisine koyun.
    5. PDMS mikro kuyularını sırasıyla 10 dakika ve 20 dakika boyunca %1 polietilenimin (PEI) ve %0.1 glutaraldehit (GA) ile işlevselleştirin. Mikro kuyuları 2 kez damıtılmış suyla yıkayın.
  2. hASC'lerin hazırlanması (Tahmini süre: 7 gün)
    1. Birleşene kadar hASC'lerin büyüme ortamında (fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (Pen-strep) ile desteklenmiş hASC'lerin bazal ortamı) 2-5 geçiş için kültür geçiş hücreleri. Bir hematitometre veya hücre sayacı kullanarak hücre sayısını geçin ve hesaplayın.
  3. ASC yüklü sinir kompozit hidrojeller (Tahmini süre: 2 saat)
    1. Siyatik sinir ve omurilik prejelini 2:1, 1:1, 1:2 hacimsel oranda karıştırın ve herhangi bir siyatik sinir prejeli karıştırmadan sadece omurilik hidrojeli hazırlayın.
    2. M199 ortamı ekleyin ve 1 N, NaOH ve HCl kullanarak pH 7.4'ü ayarlayın. hASC'leri prejelde 1 x 106 hücre / mL yoğunlukta büyüme ortamı ile yeniden askıya alın.
      NOT: M199 ve hücre süspansiyonu miktarı, pregelin% 10'u olmalıdır.
    3. Prejeli 1x PBS kullanarak 12 mg / mL'ye seyreltin. Prejeli mikro kuyucuklara yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin. hASC'lerin büyüme ortamlarında ASC yüklü hidrojellerin kültürü.
  4. Hücre canlılık testi (Tahmini süre: günde 4 saat)
    1. Üreticinin talimatlarına göre piyasada bulunan reaktifleri kullanarak canlılık testi çözümleri hazırlayın.
    2. 1., 4., 7. ve 14. günlerde ortamı aspire edin. Kuyucuklara reaktif ekleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
    3. Bir plaka okuyucu kullanarak 560/590 nm uyarma/emisyonda floresan okuyun. Aşağıdaki denklemi kullanarak yüzde farkını hesaplayın:
      [(floresannumunesi- floresanboş) / floresanboş] x 100

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deselüler dokular, daha önce belirlenmiş protokoller kullanılarak hafif değişikliklerlehazırlandı 26,27. Decellularizasyon, liyofilizasyon ve sindirimden sonra, SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 oranlarında sinir kompozit hidrojeller ve sadece omurilik hidrojelleri üretildi (Şekil 1). Nükleer bileşenlerin çıkarılması H&E boyama ile doğrulandı (Şekil 2A). Decellularizasyonu kantitatif olarak değerlendirmek için, ECM içinde artık DNA ölçüldü. Taze dermater içindeki dsDNA içeriği 132.6 ± 21.3 ng dsDNA/mg kuru doku iken, taze ve hücresizleştirilmiş omurilik parankimi sırasıyla 22.6 ± 8.3 ng dsDNA/mg kuru doku ve 23.74 ± 6.69 ng dsDNA/mg kuru doku içeriyordu (Şekil 2B). Dura mater'in hücreden arındırmadan önce çıkarılması gerektiğini belirtti. Taze ve hücresi bozulmuş siyatik sinirin dsDNA miktarı sırasıyla 222.5 ± 42.65 ve 0.63 ng dsDNA/mg kuru doku idi (Şekil 2C).

Sinir kompozit hidrojellerin jelleşme kinetiği, jelleşme hızını (S) ve nihai bulanıklığın %50 ve %95'ine ulaşma sürelerini belirlemek için değerlendirildi (t1/2 ve t95). Jelleşme kinetiği, tüm hidrojel grupları için sigmoidal bir şekil gösterdi (Şekil 3A). Tüm hidrojel gruplarında jelleşme hızı (S) birbirinden önemli ölçüde farklı değildi. Son bulanıklığın yarısına ulaşmak için gereken süre olan t1/2, SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 ± sadece omurilik hidrojelleri için sırasıyla 11.32 0.57 dk, 13.33 ± 0.6 dk ve 15.7 ± 0.92 dk ve 17.23 ± 1.13 dk idi. Nihai bulanıklığın %95'ine ulaşmak için gereken süre t95, SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 ve omurilik sadece hidrojeller için sırasıyla 13.8 ± 0.83 dk, 15.53 ± 0.83 dk, 18.38 ± 0.79 dk ve 19.62 ± 1.27 idi. Bu sonuçlar, daha fazla siyatik sinir içeriğine sahip hidrojellerin kararlı duruma daha hızlı ulaştığını ve siyatik sinir ECM'sinin hidrojel montajını teşvik edebileceğini göstermektedir. Kompresyon testi sonucu, daha fazla omurilik içeriğine sahip hidrojellerin daha fazla sertlik sağladığına dair bir eğilim gösterdi; bununla birlikte, kompozit hidrojellerin tüm farklı oranlarında önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 3B).

Son olarak, tüm hidrojel gruplarındaki hASC'lerin hücre canlılığını belirlemek için, Şekil 4'te gösterildiği gibi mikrofabrikasyon PDMS mikro kuyuları kullanılarak 3D kültürler kuruldu. 14 günlük kültür boyunca, ASC canlılığı, ticari olarak temin edilebilen bir hücre kültürü ortamı bazlı kolorimetrik ve floresan metabolik tahlil kullanılarak ölçüldü, burada okumalardan yüzde farklar dört farklı zaman noktasında hesaplandı: 1. gün, 4. gün, 7. gün ve 14. gün (Şekil 5). Zaman noktaları arttıkça yüzde farkının değeri arttı ve sadece omurilik hidrojelinin değeri 1, 4 ve 14. günlerde diğer gruplardan daha düşüktü. Birlikte ele alındığında, bu veriler, hücre proliferasyonu ve hücre metabolik aktivitesindeki artış nedeniyle kültür periyodu boyunca hASC canlılığının arttığını göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Sinir kompozit hidrojellerinin üretimi. Domuz omurilikleri ve siyatik sinirleri hücrelerden arındırıldı, liyofilize edildi ve prejel çözeltileri elde etmek için sindirildi. Siyatik sinir ve omurilik pregel solüsyonları 2:1, 1:1 ve 1:2 oranında karıştırıldı ve sadece omurilik prejeli de hazırlandı. Tüm prejel çözeltileri, sinir kompozit hidrojelleri oluşturmak için 37 ° C'de inkübe edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Hücresizleştirmenin doğrulanması. (A) Taze ve hücresi bozulmuş domuz omuriliklerinin ve siyatik sinirlerinin H&E boyaması. Oklar, dokulardaki hücrelerin varlığını gösterir. Ölçek çubukları = geniş açılı görüntüler için 1 mm ve yakınlaştırılmış görüntüler için 500 μm (yalnızca yakınlaştırılmış hücresellikten arındırılmış siyatik sinir görüntüleri için 200 μm). (B) Taze dura materyal, parankim ve hücreden arındırılmış omuriliklerin DNA analizi (sırasıyla n = 10, 16 ve 6). (C) Taze ve hücresizleştirilmiş siyatik sinirlerin DNA analizi (sırasıyla n = 8 ve 3). Hata çubukları standart sapmaları temsil eder. İstatistiksel analiz tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile, (B) için Tukey's post-hoc testi ve (C) için t-testi ile yapıldı. Kısaltmalar: ns = önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Sinir kompozit hidrojellerinin karakterizasyonları. (A) Sinir kompozit hidrojellerinin normalleştirilmiş absorbansı (n = 5). (B) Young'ın hücreden arındırılmış omurilik ve sinir kompozit hidrojel modülü (sırasıyla hücresellikten arındırılmış omurilik için n = 4 ve her kompozit hidrojel grubu için 3). Hata çubukları standart sapmaları temsil eder. İstatistiksel analizler tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Tukey'in post-hoc testi ile yapıldı. Kısaltmalar: ns = önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: 3D kültürün şematik görüntüsü. (A) PDMS mikro kuyuları, SU-8 kaplı bir silikon gofret üzerinde üretildi. Her bir mikrokuyu 8 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanılarak delindi. (B) Farklı oranlarda hücreden arındırılmış omurilik ve siyatik sinir, pH'ı 7.4'e ayarlayın, hASC'lerle yeniden süspanse edin, prejeli mikrokuyu üzerine yerleştirin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Hücre canlılığı testi. 1, 4, 7 ve 14. günlerde sinir kompozit hidrojellerde kültürlenen hASC'lerin yüzde farkı (n = 3). Hata çubukları standart sapmaları temsil eder. İstatistiksel analizler tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Tukey'in post-hoc testi ile yapıldı. * sayfa <0.05; ** sayfa <0.01; sayfa <0.005; sayfa <0.001; NS: Önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SKY patofizyolojisinin karmaşık ve çok yönlü olduğuna inanılmaktadır. Hücre nakli, ilaç dağıtımı ve biyomateryaller gibi tek tedavilerin her biri SKY hakkında değerli bilgiler sağlamış olsa da, SCI'nin karmaşık doğası bireysel etkinliklerini sınırlayabilir 28,29,30,31. Bu nedenle, etkili kombinatoryal terapötikler geliştirme çabaları artmıştır. Bu çalışmada tarif edilen sinir kompozit hidrojelleri, hücreler veya ilaçlar için etkili bir dağıtım aracı olarak hizmet edebilir. Hücrelerle ilgili olarak, ASC'ler hücre nakli için umut verici adaylardan biridir. ASC'ler, interlökin-10 (IL-10) ve transforme edici büyüme faktörü beta (TGF-β) gibi immünomodülatör faktörlerin yanı sıra sinir büyüme faktörü (NGF), beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), glial kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) ve nörotrofin-3 (NT-3) gibi nörotrofik faktörleri salgılar ve bu da dorsal kök gangliyonlarının nörit büyümesine in vitro olarak artar ve in vivo fonksiyon iyileşmesine yol açar 17,19,32,33, 34. Sulu çözeltilerde verilen ASC'ler, sıçanlarda ve insanlarda SCI'den sonra fonksiyonel geri kazanımı destekledi; bununla birlikte, göçe aracılık etme, farklılaşma, hayatta kalma ve ASC'lerin farklılaşması ile ilgili zorluklar kaydedildi 35,36,37. Ek olarak, nakledilen ASC'lerin tümörjenik potansiyeli hakkında çelişkili raporlar vardır; Bazı çalışmalar ASC'lerin farklı kanser türlerinin proliferasyonuna ve metastazına katkıda bulunabileceğini gösterirken, diğer çalışmalar da anti-tümörijenik potansiyeller göstermiştir 38,39,40,41 Bu nedenle, sinir kompozit hidrojellerdeki ASC'lerin uzun vadeli bir güvenlik profilinin gelecekte araştırılması gerekmektedir. Burada, hücreden arındırılmış omurilikler ve siyatik sinirler SKY onarımı için ayrı ayrı incelenmiştir.

Deselüler spinal kordlar, bir sıçan SCI modeline enjekte edildi ve lezyona aksonal inbüyümeyi uyardı ve fonksiyonel iyileşmeyi artırdı; Bununla birlikte, hızlı bozulma nedeniyle, bir kist oluşmuş ve 4-8 haftalık tedaviden sonra iyileşme azalmıştır4, 42. Aselüler hücreden arındırılmış siyatik sinir hidrojeli, SCI sıçanlarına enjekte edildi ve nöral rejenerasyonu destekledi, ancak hidrojelin etkinliği hızlı bozunma nedeniyle sınırlıydı24. Bu nedenle, hücreden arındırılmış dokuların kullanıldığı kombinatoryal yaklaşımlar son zamanlarda dikkat çekmektedir. Decellularize omurilik hidrojellerinin nöral kök hücre/progenitör hücre proliferasyonunu, göçünü ve nöronlarafarklılaşmasını teşvik ettiği bildirilmiştir 4. Aynı zamanda N1E-115 nöroblastom hücrelerinden 3D nörit büyümesini kolaylaştırdı, bu da hücreden arındırılmış omurilik hidrojellerinin aksonal rejenerasyonu teşvik etmek için çekici bir iskele olabileceğini düşündürdü26. Decellularize siyatik sinirler Schwann enkapsülasyonu ile çalışılmış ve SCI43 sonrası sinir grefti olarak potansiyel göstermiştir. Birlikte ele alındığında, hücreden arındırılmış omurilik ve siyatik sinirlerin bir kombinasyonunun hem aksonal rejenerasyonu hem de doku restorasyonunu desteklemesi beklenmektedir. Bu çalışma ayrıca ASC yüklü sinir hidrojellerinin terapötik etkilerinin değerlendirilmesini de içermemektedir. Bu nedenle, platformun pro-anjiyojenik ve nörotrofik etkiler gibi rejeneratif potansiyellerinin in vitro ve in vivo çalışmalar yoluyla değerlendirilmesi önemlidir. Ek olarak, sinir kompozit hidrojelleri, hücre transplantasyonunun terapötik etkinliğini artırmak için Schwann hücreleri, koku alma kök hücreleri ve nöral kök hücreler gibi diğer hücre tiplerini kapsüllemek için kolayca uygulanabilir. SCI'nin farklı aşamalarında sinir kompozit hidrojel içindeki çeşitli hücre tiplerinin güvenliğini ve etkinliğini araştırmak ilgi çekici olacaktır.

Kompozit hidrojellerin oluşturulmasındaki kritik adımlardan biri, başta omurilikler olmak üzere yeterli miktarda doku hazırlamaktır. Hücreden arındırılmış omuriliklerin verimi, protokolde belirtildiği gibi önemli ölçüde düşüktür (50-100 mg omurilik parçası ve 100-150 mg siyatik sinir parçası); Bu nedenle, fareler ve sıçanlar gibi küçük hayvanlardan omuriliklerin toplanması veya elde edilmesi önerilmez. En azından tavşanlar gibi orta büyüklükteki hayvanların önemli miktarda omurilik matrisi kazandığı öne sürülmektedir. Ayrıca, hücre dışı dokuları sindirirken pH'ı kontrol etmek önemlidir, çünkü doku ilavesi pH'ı 1.5-2 civarında olan gerekli pepsin aktivasyon aralığının ötesine kaydırabilir. Omurilik hücresizleştirilmesi için ajitasyon süreleri, daha önce belirlenen yöntem26'dan daha uzundur, çünkü mevcut protokolde ajitasyon hızı daha yavaştır. Bu protokolde kullanılan döndürücü 83 rpm'ye kadar hız sunarken, daha önce kurulan yöntemlerde maksimum 200 rpm kullanılmıştır. Bu nedenle, tüm hücresel kalıntıları iyice yıkamak için çalkalama süreleri iki kez arttırıldı. Tüm hücre giderme solüsyonlarının dokulara nüfuz edebilmesini ve tüm hücresel ve nükleer içerikleri yıkayabilmesini sağlamak için, kullanıcı tarafında histoloji veya DNA analizi kullanılarak ajitasyon sürelerinin ve hızının optimize edilmesi gerekir. Dokular ve decellularizasyon çözeltisi arasındaki oranın en az 1:15 [a/h] olması önerilmektedir. Daha önce kurulan protokol26'daki hücrelerden arındırılmış dokular oda sıcaklığında sindirildi/karıştırıldı; ancak bu protokolde 4 gün boyunca 4 °C ve 500 rpm'de bir karıştırma plakası üzerinde manyetik bir çubuk ile sindirilmişlerdir. Karıştırma plakası motoru ısı üretebilir ve bunu pregel çözeltisine sokabilir. Bu nedenle, düşük sıcaklıklarda sindirilmesi veya sıcaklık kontrollü bir karıştırma plakası kullanılması önerilir.

DNA analizinde belirtildiği gibi (Şekil 2B), omuriliğin dura materini çıkarmak kritiktir, çünkü dura mater içinde önemli miktarda DNA bulunabilir. Dura mater, omurilik parankiminden farklı olarak fibröz dokudan oluşur; bu nedenle, daha önce belgelendiği gibi farklı hücresizleştirme yöntemleri kullanılmalıdır44,45. Hücreden arındırma işleminin etkinliğini doğrulamak için hücreden arındırılmış dokuların H&E boyama ve DNA analizi kullanılmıştır. Başarılı bir hücreden arındırma hedeflerinin yerine getirilmesi için aşağıdaki kriterlerin karşılanması gerekir: 1. 50 ng dsDNA / mg ECM kuru ağırlığından az, 2. 200 bp'den az DNA fragmanı uzunluğu, 3. Doku kesitlerinde veya H&E'de nükleer materyal eksikliği5. Hücreden arındırma sonrası H&E boyamanın kalitatif analizi, hücrelerin başarılı bir şekilde çıkarıldığını düşündüren çekirdek boyama eksikliği gösterdi. Ek olarak, kollajen ve diğer matris proteinleri gibi ECM bileşenleri korundu ve hücresel materyalin uzaklaştırılmasını yansıtacak şekilde hücre dışı bırakma işleminden sonra boyama yoğunluğu azaltıldı. Decellularizasyonu takiben, mg ECM kuru ağırlığı başına DNA içeriği siyatik sinirde 0.63 ng ve omurilikte 23.74 ± 6.69 ng idi, bu da in vivo uygulama için kabul edilebilir eşiğin altındaydı.

Bu çalışmada oluşturulan sinir kompozit hidrojeller gibi yumuşak malzemelerin mekanik özelliklerini analiz etmek için yüksek sıkıştırma kuvvetine sahip reometreler veya çekme test cihazları kullanılamadığından, kompozit hidrojellerin reolojik ölçümlerinin dikkatli bir şekilde tasarlanması gerekir. Numuneler, çekme test cihazında tutulduklarında yırtılacak/parçalanacak ve yüksek kuvvetle sıkıştırma, analiz edilecek kadar hassas veriler sağlamayacaktır. Bu çalışmada, 250 N sıkıştırma kuvvetine sahip bir reometre kullanılmış olup, kullanıcıların amaçlarına uygun veya benzer kuvvete sahip bir aparat bulunması tavsiye edilmiştir. Alternatif olarak, salınımlı kesme ölçümü gibi farklı reolojik ölçümler, depolama ve kayıp modüllerinin belirlenmesine yardımcı olabilir. Decellularizasyondan sonra azalan mekanik özellikler bu çalışmada bir sınırlamadır. Young'ın tüm hidrojel gruplarının modülü, hücreden arındırılmış omuriliğinkine benzer olsa da, taze omuriliklerden önemli ölçüde farklıdır (veriler gösterilmemiştir). Nispeten yumuşak materyaller üzerinde kültürlenen nöral kök hücreler ve MSC'ler, sırasıyla artmış nöronal farklılaşma ve β-III tübülin ekspresyonu gösterdi46,47. Bununla birlikte, hücrelerden arındırılmış malzemeleri aljinat, poli (etilen glikol), genipin ve glutaraldehit 48,49,50,51 gibi diğer malzemelerle güçlendirmek veya çapraz bağlamak mümkündür. Hidrojellerin mekanik özelliklerini geliştirmeye yönelik bu stratejilerin hücresel davranışı veya canlılığı etkilememesini sağlamak için optimizasyon gerekli olacaktır.

Sinir kompozit hidrojellerinin partiden partiye değişkenliği, kısmen hayvanların yaşı, cinsiyeti, ağırlığı ve türündeki farklılıklar nedeniyle gözlenebilir. Aynı tür hayvanların kontrollü ve tutarlı kullanımı, değişkenliği azaltmaya yardımcı olabilir. Farklı hayvanlardan alınan doku örneklerinin bir araya getirilmesi, partiler arasındaki değişkenliği azaltmaya da yardımcı olabilir52. Bu çalışmayı klinik uygulamalara çevirmenin potansiyel zorluklarından biri ölçeklenebilirliktir. Omurilik hücreden arındırma veriminin düşük olması, büyük miktarda hücreden arındırılmış dokunun üretimini engelleyecektir. Daha fazla doku oluşturmak için yeni yöntemlerin geliştirilmesi/optimize edilmesi gerekecektir veya decellularizasyondan sonra verimi artırmak için dura mater birlikte decellularize edilebilir. Diğer bir potansiyel zorluk, düzenleyici izindir. ABD'de FDA, hücre bazlı tedavilerin düzenleyici onayından sorumludur53. Kore Cumhuriyeti düzenleyici otoritesi, diz kıkırdak defekti tedavisi için allojenik göbek kordonu kanı türevi MSC'ler ve %4 hyaluronat hidrojelden oluşan MSC bazlı bir ürün olan CARTISTEM'in pazara girişini onayladı54. Bunun gibi emsal durumlar, güvenlik ve verimlilik verileri sağlayarak düzenleyici inceleme sürecini kolaylaştırmaya yardımcı olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, PhRMA Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından YS'ye verilen P20GM139768 ve R15NS121884 numaralı ödülle desteklenmiştir. Arkansas Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nden Dr. Kartik Balachandran ve Dr. Raj Rao'ya ekipmanlarını kullanmamıza izin verdikleri için teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca, Arkansas Üniversitesi Biyoloji ve Ziraat Mühendisliği Bölümü'nden Dr. Jin-Woo Kim ve Bay Patrick Kuczwara'ya reometre konusunda eğitim verdikleri için teşekkür etmek istiyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-(Desildimetilamonio)propan sülfonat iç tuzuSigma-AldrichD4266Siyatik sinir desellularizasyonu sırasında kullanılan, SB-10
3-(N,N-Dimetilpalmitylammonio)propan sülfonatSigma-AldrichH6883Siyatik sinir desellülerizasyonu sırasında kullanılan, SB-16
AlamarBlue reaktifiFisher ScientificDAL1100AlamaBlue hücre viabilitlik testi sırasında kullanıldı
Kondroitinaz ABCSigma-AldrichC3667Siyatik sinir decellularizasyonu sırasında kullanılır
KriyostatLeicaCM1860
DeoksiribonuklazSigma-AldrichD4263Siyatik sinir decellularizasyonu sırasında kullanılır
Disodiyum hidrojen fosfat heptahidratVWRBDH9296100 mM Na/50 mM phos ve 50 mM Na/10 mM phos tamponu için kimyasal
DNeasy Kan & Doku kitiQiagen69506DNA analizi sırasında kullanılır
Histoloji, sürgü montaj ortamı için Dpx MountantSigma-Aldrich6522H& sırasında kullanıldı E boyama
EozinSigma-AldrichHT110216H& sırasında kullanıldı E boyama
EtanolVWR89125-172
FormaldehitSigma-Aldrich252549H& sırasında kullanıldı E boyama
Glutaraldehit (GA)Sigma-AldrichG6257PDMS yüzey işlevselleştirmesi sırasında kullanılan
hASC büyüme medyasıLonzaPT-4505Fetal sığır serumu ve penisilin/streptomisin içeren hASC'lerin kültürlenmesinde kullanılır
HematoksilenVWR26041-06H& sırasında kullanıldı E boyama
İnsan yağından türetilen kök hücreLonzaPT-5006
Hidroklorik asit (HCl)Sigma-Aldrich320331Deselülarizaze dokuları sindirmek ve pregel çözeltilerini ayarlamak için kullanılır
M199 medyasıSigma-AldrichM0650Prejelleri istenen konsantrasyona kadar seyreltmek için kullanılır
Optimal kesme temperatue bileşiğiTissue-Tek4583
PepsinSigma-AldrichP7000Decellularize dokuları sindirmek için kullanılır
Perasetik asitLaboratuvar SokağıPAA1001Omurilik desellülerizasyonu sırasında kullanılır
Fosfat tamponlu tuzlu (PBS)VWR97062-948
Plaka okuyucuBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polietilenemin (PEI)Sigma-Aldrich181978PDMS yüzey işlevselleştirmesi sırasında kullanılan
Domuz siyatik siniriTissue Source LLCCanlı domuzlar, tanımlanabilir bilgi ve izlenebilirlik detayları olmadan
Domuz omuriliğiTissue Source LLCCanlı domuzlar, tanımlanabilir bilgi ve izlenebilirlik detayları olmadan
QuantiFluor dsDNA sistemiPromegaE2670DNA içeriğini analiz etmek için kullanılır
ReometreTA InstrumentsDHR 2
Dayanıklı rotatorGlas-co099A RD4512Omurilik desellülerizasyonu sırasında kullanılır
Sodyum klorür (NaCl)VWRBDH9286100 mM Na/50 mM phos ve 50 mM Na/10 mM phos tamponu için kimyasal
Sodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750
Sodyum dihidrojen fosfat monohidratVWRBDH9298100 mM Na/50 mM phos ve 50 mM Na/10 mM phos tamponu için kimyasal
Sodyum hidroksit çözeltisi (NaOH)Sigma-Aldrich415443Pregel çözeltilerini ayarlamak için kullanılır
SU-8Kayaku ile desteklenen malzemelerSU8-100Silikon waferi kaplamak için kullanılır
SakarozSigma-AldrichS8501Omurilik desellülerizasyonu sırasında kullanılır
Sylgard 184 silikon elastomer kitiDOW1317318Polidimetilxiloksan (PDMS) baz ve kürleyici madde
Triton X-100Sigma-AldrichX100Omurilik desellülerizasyonu sırasında kullanılır
Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızıThermo Fisher25300062hASC çalışmaları ve omurilik desellülerizasyonu sırasında kullanılır
Tüplü revolver rotatörüThermo Fisher88881001Siyatik sinir decellularizasyonu sırasında kullanılır
KsilenVWRMK866816H& sırasında kullanıldı E boyama

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , Univ. of Alabama at Birmingham. Birmingham, AL. (2017).
  2. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
  3. Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
  4. Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, November 2020 120596(2021).
  5. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  6. Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
  7. Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
  8. Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
  9. Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117(2018).
  10. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  11. Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
  12. Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
  13. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  14. Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
  15. Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692(2022).
  16. Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
  17. Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
  18. Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
  19. Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18(2012).
  20. Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
  21. Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
  22. Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  23. Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
  24. Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110(2018).
  25. Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
  26. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  27. McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
  28. Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
  29. Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
  30. Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101(2022).
  31. Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269(2014).
  32. Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
  33. Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
  34. Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762(2023).
  35. Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
  36. Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
  37. Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
  38. Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
  39. Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
  40. Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
  41. Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
  42. Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
  43. Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
  44. Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
  45. Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
  46. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  47. Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
  48. Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
  49. Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
  50. Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
  51. Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
  52. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
  53. Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
  54. Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cresizle tirilmi HidrojellerH cre D MatrisH cre Transplantasyonunsan Adipoz K k H creleriDoku M hendisli iN ro RejenerasyonHidrojel Karakterizasyonu

İlgili makaleler