Bu protokol, embriyo implantasyon sürecini etkileyen ilgili molekülleri değerlendirmek için in vitro model olarak basit ve verimli embriyo implantasyonu oluşturmak için metodolojileri açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması
Bu makalede
Özet
Özet
Embriyo implantasyonu, başarılı bir gebeliğin kurulmasında ilk adımdır. Embriyo implantasyonu için bir in vitro model, temel biyolojik araştırma, ilaç geliştirme ve tarama için kritik öneme sahiptir. Bu makale, embriyo implantasyonu için basit, hızlı ve oldukça verimli bir in vitro model sunmaktadır. Bu protokolde ilk olarak fare blastokisti edinimi ve insan endometriyal adenokarsinom hücrelerinin (Ishikawa) implantasyon için hazırlığı tanıtıldı, ardından fare embriyoları ve Ishikawa hücreleri için ko-kültür yöntemi uygulandı. Son olarak, bu modele dayalı olarak değişen 17-β-estradiol (E2) ve progesteron (P4) konsantrasyonlarının embriyo adezyon oranları üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir çalışma yaptık. Bulgularımız, yüksekE2 konsantrasyonlarının embriyo adezyonunu önemli ölçüde azalttığını, progesteron ilavesinin ise adezyon oranını geri getirebileceğini ortaya koydu. Bu model, implantasyonu ve endometriyal alıcılığı kontrol eden sitokinler, ilaçlar ve transkripsiyon faktörleri gibi adezyon sürecinde yer alan molekülleri değerlendirmek ve taramak için basit ve hızlı bir platform sunar.
Giriş
Başarılı bir gebeliğin ilk adımı olan embriyo implantasyonu, biyolojik temelini anlamak ve kısırlığın zorluklarını ele almak için çok önemlidir. Bununla birlikte, etik kısıtlamalar, insan klinik embriyo örneklerinin toplanmasında önemli sınırlamalar getirmekte ve hamileliğin erken döneminde insan embriyoları ile endometriyum arasındaki karmaşık etkileşimlere ilişkin araştırmaları engellemektedir1. Bu karmaşık mekanizmaların derinlemesine anlaşılması, temel biyolojik araştırmaları, ilaç keşfini ve üreme sağlığını ilerletmek için hayati önem taşır.
Önceki in vitro modeller, tek katmanlı insan endometriyal epitel hücrelerinin (RL95-2)2 BeWo, JAr veya Jeg-33 koryokarsinom hücreleri gibi embriyonik ikamelerle birlikte kültürlendiği adezyon modellerini kullandı. Bununla birlikte, 70-100 μm arasında değişen sferoidlerin boyutunun seçimi, daha büyük veya daha küçük hücre agregatları deneyin doğruluğunu tehlikeye atabileceğinden çok önemliydi. Özellikle, her preparattaki sferoidlerin sadece% 25'i uygunboyut 4 standardını karşıladı ve blastosistlerin fizyolojik koşullarına kıyasla önemli farklılıklar vardı.
Ayrıca, endometriyum ve blastosist için üç boyutlu (3D) kültür sistemleri fizyolojik olarak daha ilgili bir ortam sunar5, ancak yüksek teknik uzmanlık, yavaş hücre büyümesi, yüksek kaynak ve bakım maliyetleri, standardizasyon zorluğu ve düşük tekrarlanabilirlikgerektirir 6.
Bu protokolde, çoğu laboratuvarda geliştirilebilecek ve kullanılabilecek uygun maliyetli ve hızlı bir in vitro embriyo implantasyon modeli sunuyoruz. Bu yöntemin genel amacı, kontrollü bir ortamda embriyolar ve endometriyum arasındaki etkileşimleri incelemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir platform sağlamaktır. Bu model, in vitro embriyo implantasyonunun temel olaylarını simüle ederek, hayvan modelleri ile klinik ortamlar arasındaki boşluğu doldurmayı ve daha kesin ve hedefli araştırmaları mümkün kılmayı amaçlamaktadır.
Embriyonik ikamelerle karşılaştırıldığında, fare blastosistlerinin kullanımı, in vivo embriyo implantasyon sürecinin fizyolojik olarak daha ilgili bir temsilini sunar7. Ek olarak, insan endometriyal adenokarsinomundan türetilen Ishikawa hücre hattı, glandüler epitel ve uterus lümen epitel1'in karışık özelliklerine sahiptir, bu da normal endometriyumda bulunanlara benzer enzimleri, yapısal proteinleri ve fonksiyonel steroid reseptörlerini eksprese etmesini sağlar, böylece embriyo implantasyonu için fizyolojik olarak ilgili bir substrat sağlar. Ko-kültür sisteminin basitliği ve hızlılığı, yüksek verimli tarama ve uyuşturucu testi yapılmasını mümkün kılar 8,9,10. Bu yöntem, sağlam ve tekrarlanabilir bir platform sağlayarak, embriyo implantasyonu ve bunun insan sağlığı üzerindeki etkisi hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için bir fırsat sunar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Fare işleme ve deneysel çalışmalar, Şanghay Biyomedikal ve Farmasötik Teknolojiler Enstitüsü Hayvan Komitesi tarafından onaylanan protokoller altında gerçekleştirildi. Güvenlik Prosedürlerini Sağlayın: Kimyasalları veya biyolojik malzemeleri kullanırken daima uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın.
1. Fare embriyolarının elde edilmesi
NOT: Bu bölümde fare embriyolarının elde edilme süreci açıklanmaktadır. Yetişkin dişi fareler (6-8 haftalık, hibrit C57BL / 6 ve DBA / 2), 20-25 ° C'de ve% 40-60 nemde 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık standart çevre koşulları altında tutuldu.
- Dişi farelere intraperitoneal olarak 10 IU hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG) enjekte edin ve daha sonra 42-48 saat aralıklarla 10 IU insan koryonik gonadotropin (HCG) enjekte edin.
- Her dişi fareyi benzer yaştaki bir erkekle eşleştirin ve ertesi sabah vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Vajinal tıkaç, meni vajinal açıklıkta katılaştıktan sonra oluşan açık sarı bir fitil yumrudur. - Dişi fareleri CO2 inhalasyonu ile vajinal tıkaçlarla ötenazi yapın.
- Karnı açın ve kadın cinsel organını bulun; yumurta kanalı, yumurtalık ve yağ yastıkçıklarını forseps ile gerin; yumurta kanalını ve yumurtalığı makasla kesin; ve sonra yumurta kanalını ve uterusu kesin (Şekil 1).
- Elde edilen yumurta kanalını M2 ortamı ile önceden doldurulmuş 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
NOT: M2 ortamı bir inkübatörde (37 °C, %5 CO2) 30 dakika önceden ısıtılmalıdır. - Kümülüs-zigot kompleksini serbest bırakmak veya sıkıştırmak için yumurta kanalının genişlemiş ampullasını 25 G'lik bir iğne ile delin (Şekil 2).
- Kümülüs-zigot kompleksini 0.5 mg / mL hyaluronidaz içeren M2 çözeltisine aktarmak için forseps kullanın ve kümülüs hücreleri ayrışana kadar birkaç dakika inkübe edin (Şekil 3).
- Zigotları bir yumurta transfer pipeti kullanarak toplayın ve kalıntı hyaluronidaz, kümülüs hücreleri ve safsızlıkları gidermek için 2 mg / mL BSA içeren M4 ortamında yıkayın.
2. Fare embriyosunun in vitro kültürü
NOT: Bu bölüm, fare embriyolarının zigotlardan blastosistlere kadar in vitro kültürleme sürecini detaylandırmaktadır. Sıcaklık ve gaz dengesini sağlamak için KSOM kültürü mikro damlaları 24 saat önceden hazırlanmalıdır.
- 35 mm'lik bir Petri kabının dibinde, her biri 20 μL hacme sahip 12 mikro damlacık KSOM ortamı hazırlayın. Mikro damlacıkları 3-5 mL mineral yağ ile örtün (Şekil 4) ve Petri kaplarını dengeleme için %5 CO2 ile 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.
- Fare embriyolarını kapsamlı yıkama için bir transfer pipeti kullanarak M2 ortamından KSOM ortamına aktarın.
NOT: Bu adım, 37 °C ısıtma aşamasına sahip bir stereomikroskop gerektirir. Kuluçka makinesinin dışındaki embriyo işleme süresini en aza indirin. - Yıkanmış embriyoları hazırlanan KSOM mikro damlacıklarına yerleştirin ve 4 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Yeterli beslenmeyi sağlamak için, 20 μL mikro damla başına 5-10 embriyo kültürleyin. - Avantajlı blastokistleri büyüklüklerine (100-130 μm), iç hücre kütlesine (iç hücre kütlesi hepsi sıkıştırılmış birçok hücreden oluşur), trofoblast hücrelerinin sayısına (trofektodermis birbirine bağlı ve birlikte paketlenmiş birçok hücreden oluşur) ve genişleme derecesine (blastocoel embriyonun %80-100'ünü kaplar) göre seçin.
3. Endometrial hücrelerin hazırlanması
- Bir biyogüvenlik kabininin içinde, bir pipet kullanarak 1 mL %2 jelatini aspire edin ve 12 oyuklu bir kültür plakasına dağıtın. Alt kısmın jelatin ile tamamen kaplanmasını sağlamak için plakayı yavaşça döndürün. Plakayı 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca yerleştirin. Daha sonra fazla jelatini aspire edin ve plakanın tabanının tamamen kurumasını bekleyin.
- Kaplama işlemi tamamlandıktan sonra, insan endometriyal adenokarsinom hücrelerini (Ishikawa) DMEM/F12 (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız), 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 100 μg/mL streptomisin ve 100 IU/mL penisilin ile kültürleyin, bunları jelatin kaplı 12 oyuklu plakalara (2 × 105hücre/oyuk) tohumlayın ve 24 saat inkübe edin.
4. Embriyo bağlantısı
- Ko-kültür için önceki adımda hazırlanan Ishikawa hücrelerini içeren 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 5-15 taze blastosisti nazikçe yerleştirin (Şekil 5).
- 48 saatlik inkübasyondan sonra, bağlanma durumlarını değerlendirmek için embriyoları mikroskop altında gözlemleyin. Embriyo tutunmasını gözlemlemek için, plakayı üç kez hızlı bir şekilde hareket ettirin. Bağlanmamış embriyolar, Ishikawa hücrelerinin yüzeyi üzerinde yüzer veya yuvarlanma hareketi sergileyecektir.
- Denklem (1) kullanarak embriyo implantasyon oranını hesaplayın; İmplantasyon etkisini temsil etmek için embriyo yapışma oranını kullanın.
Embriyo İmplantasyon Oranı = (Bağlı Embriyo / Toplam İmplante Edilen Embriyo Sayısı) × %100 (1)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yardımcı üreme teknikleri sürecinde, kontrollü yumurtalık hiperstimülasyonu (COH) çok önemli bir adımdır ve hastalarda östrojen seviyelerinin doğal döngülere kıyasla 10-20 kattan fazla önemli ölçüde artmasına neden olur11. Bu bağlamda, yüksek serum östrojen konsantrasyonlarının taze embriyo transferi sırasında embriyo implantasyonunu etkileyip etkilemediğini sorduk. Bu embriyo implantasyon modeline dayanarak,çeşitli E2 ve P4 konsantrasyonlarının embriyo implantasyon oranları üzerindeki ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Embriyo implantasyonu için önerilen in vitro modelin basitliği ve hızlılığı, erken evre ilaç taraması ve diğer araştırma uygulamaları için dikkate değer avantajlar sunmaktadır. Basit protokol, Ishikawa hücre hatlarının yüksek verimli doğası ile birleştiğinde, özellikle ilaç keşfinin erken aşamalarında büyük ölçekli ekranlar için ideal bir aday haline getirir. Liang13, TAGLN2 yıkımının trofoblast hücrelerinin istila kabiliyetini azalttığını buldu. Green14, İnsülin b...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan etmeleri gereken herhangi bir mali veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Çalışmalarımız Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82171603), Şanghay Belediye Sağlık Komisyonu Vakfı (202140341), Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (23JC1403803) ve NHC ve Shanghai Key Labs, SIBPT İnovasyon Teşvik Programı (RC2023-02) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 17-β-estradiol | SIGMA | 3301 | En güçlü memeli östrojenik hormonu |
| BD Falcon | BD | 353001 | Bakteriyolojik Petri Kapları 35 x 10 mm stil, sıkı kapaklı, kristal dereceli saf polistiren, steril |
| Biyogüvenlik Kabini | ESCO | sınıfı  BSC | Aseptik işlemler, kültür yemekleri yapma, reaktifleri alikot etme vb |
| . CO2 İnkübatör | Thermo | 8000DH | Embriyo kültürü |
| Kültür plakası | Corning | 3506 | Hücre kültürü |
| DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), sıvı 1:1, L-glutamin ve 15 mM HEPES tamponu içerir |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 10099141 | Fetal Sığır Serumu, Nitelikli, Avustralya Menşeli |
| Jelatin | SIGMA | G9391 | Tip B, toz, BioReagent, hücre kültürü için uygun |
| HCG | Nanjing Aibei | M2520 | Sterilizasyon reaktifi, intraperitoneal enjeksiyon, 50 IU / mL |
| Hyaluronidaz | SIGMA | V900833 | Reaktif sınıfı, toz ve nbsp; |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x), Toz, Fenol Kırmızısı olmadan, 5 x 10 mL |
| L-glutamin | Gibco | 25030081 | L-glutamin-200 mM (100x), sıvı |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 Orta (1x), Sıvı, Fenol Kırmızısı Mineral |
| yağ ile | SIGMA | M8410 | Mineral yağ, çeşitli moleküler biyoloji uygulamalarında buharlaşma ve çapraz kontaminasyonu kontrol etmek için bir örtü tabakası olarak kullanıma uygundur |
| Penisilin-Streptomisin, sıvı | Gibco | 15140122 | 10.000 Birim penisilin (baz) ve 10.000 birim streptomisin (baz), %0.85 tuzlu su PMSG içinde penisilin G (sodyum tuzu) ve streptomisin sülfat kullanarak |
| Nanjing Aibei | M2620 | Sterilizasyon reaktifi, intraperitoneal enjeksiyon, 50 IU / mL | |
| Progesteron | SIGMA | 5341 | Adet döngüsünün ikinci yarısında korpus luteum tarafından salgılanan steroid hormonu |
| Sodyum piruvat | Gibco | 11360070 | Sodyum piruvat, glikoza ek olarak bir karbon kaynağı olarak hücre kültürü ortamına yaygın olarak eklenir |
| Stereomikroskop | Olympus | SZX7 | Embriyo toplama ve embriyo gelişiminin gözlemlenmesi |
Kaynaklar
- Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines. Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).
- Li, H. Y., et al. Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).
- Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines. Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).
- Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. A high-throughput in vitro model of human embryo attachment. Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).
- Karvas, R. M., et al. Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens. Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques. Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).
- Berneau, S. C., et al. Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation. Cells. 8 (5), 432(2019).
- Jiang, R., et al. Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure. Cell Death Discov. 3, 17057(2017).
- Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models. Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).
- Duan, C. C., et al. Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study. J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).
- Chen, G., et al. Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer. J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).
- Liang, X., et al. Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization. FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).
- Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro. Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).
- Kang, Y. J., et al. MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R. J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).
- Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
- Ahn, J., et al. Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip. Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).
- Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation. Cells. 10 (8), 2008(2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
