Culex tarsalis sivrisineklerinin insan elleri üzerindeki sondalama ve yutma davranışlarını AC-DC elektropenetrografi kullanarak incelemek için prosedürler açıklanmıştır.
Yöntem makalesi
Culex tarsalis sivrisineklerinin insan ellerinde sondalama ve yutma davranışlarının incelenmesi için AC-DC elektropenetrografi
Bu makalede
Özet
Özet
Sivrisinekler, insan ve hayvan sağlığını olumsuz yönde etkileyen patojenleri bulaştırır. Kanla besleme biyolojilerinin ve konakçılar ve patojenlerle etkileşimlerinin daha iyi anlaşılması, sivrisinek kaynaklı hastalıkları kontrol etmek için yeni hedefler geliştirmek için kullanılabilir. Ne yazık ki, sivrisineklerin sondalama (yani ısırma) davranışları, konakçı dokuların içinde meydana geldikleri için tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, insan elinde sondalama ve yutma sırasında üretilen elektrik sinyallerindeki değişiklikleri kaydederek sivrisinek beslenme davranışlarını dolaylı olarak görselleştirmek ve ölçmek için AC-DC elektropenetrografinin (EPG) kullanılması için invaziv olmayan bir prosedür açıklanmaktadır. İnce altın teller, iletken gümüş yapıştırıcı kullanılarak sivrisineklere tutturulur ve EPG cihazına bağlanır. İnsan konakçı elinde bir substrat voltaj probu tutar. Konakçının kablolu sivrisinek tarafından sondalanması, elektrik devresini tamamlar ve elektrik sinyalleri, daha sonra analiz için ölçülebilen ve numaralandırılabilen "dalga formları" olarak bir bilgisayara kaydedilir. Bu metodoloji, Aedes aegypti ve Culex tarsalis sivrisineklerinin sondalama ve yutma davranışlarını karakterize etmek için kullanılmıştır ve diğer sivrisinek türlerine uygulanabilir. EPG, patojenlerin, böcek ilaçlarının ve diğer faktörlerin sivrisinek besleme davranışları üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Giriş
Sivrisinekler, hastalık vektörleri ve rahatsız edici zararlılar olarak rolleri nedeniyle dünya çapında acı ve ekonomik kayba neden olur1. Anofel sivrisinekleri, dünya çapında yılda tahmini 219 milyon vakaya, 400.000'den fazla ölüme neden olan sıtmayı bulaştırır2 ve 12 milyar ABD doları doğrudan maliyet3. Aedes sivrisinekleri, halk sağlığı açısından önemli olan en dikkate değer vektörlerdir, çünkü neredeyse küresel bir varlığa sahiptirler ve Chikungunya, dang humması, lenfatik filaryazis, Rift Vadisi Ateşi, sarı humma ve Zika ajanlarını iletirler, bu da can talep eder, sağlık sistemlerini bunaltır ve kronik ıstırap, yaşam boyu morbidite ve sakatlık ile sonuçlanır4,5. Ek olarak, Culex sivrisinekleri hem insan hem de hayvan sağlığını etkileyen at ensefaliti, Japon ensefaliti, lenfatik filaryazis, Saint Louis ensefaliti ve Batı Nil ateşi ajanlarını iletir3,4.
İnsektisit tabanlı yaklaşımlarla vektör kontrolü, vektör kaynaklı hastalıkların küresel olarak kontrol edilmesinde önde gelen yöntemdir6,7. Bununla birlikte, sivrisinek kontrolü için mevcut böcek ilaçlarının sayısı sınırlıdır. Buna ek olarak, insektisit direnci birçok türde, özellikle Aedes sivrisineklerinde gelişmekte, vektör kaynaklı hastalıklarla mücadele yeteneğimizi etkilemekte ve yeni kontrol stratejilerine olan ihtiyacı artırmaktadır6,8. Sivrisinek biyolojisinin, sivrisinek-konak-patojen etkileşimlerinin ve patojen iletimini düzenleyen süreçlerin daha iyi anlaşılması, vektör kontrolü için yeni araçların geliştirilmesini kolaylaştırabilir6.
Konak dokulardaki sondalama ve yutma davranışları patojen iletimini ve hastalık patolojisini etkileyebilir9,10,11,12. Örneğin, Aedes aegypti yırtılmış damarların dışında toplanan kan yerine doğrudan kılcal damarlardan beslendiğinde daha fazla mikrofilarya yutuldu13. Bu nedenle, bu konuyla ilgili temel ve uygulamalı araştırmalar, sivrisinek kontrol stratejilerinin ve patojen bulaşması için diğer karşı önlemlerin geliştirilmesine, iyileştirilmesine ve değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Bununla birlikte, konakçının derisinin yüzeyinin altında meydana gelen kriptik kan besleme davranışlarının ayrıntılarında önemli bilgi boşlukları vardır, çünkü bu davranışlar genellikle canlı hayvan modellerinde invaziv prosedürler gerektirir veya şeffaf yapay substratlar veya sıvı diyetler kullanır9,11,14,15. Non-invaziv elektropenetrografi (EPG; elektriksel penetrasyon grafiği olarak da adlandırılır) teknikleri, bitki patojen iletimi, konukçu bitki direnci ve böcek ilacı etki modları ile ilgili bitki besleyen böceklerin beslenme davranışlarını incelemek için kullanılmıştır, çünkü araştırmacıların konakçı dokular içinde meydana gelen ağız parçası hareketlerini ve davranışlarını dolaylı olarak gözlemlemelerine, kaydetmelerine ve ölçmelerine olanak tanır10,12.
1950'lerden beri, sivrisinekler de dahil olmak üzere kanla beslenen eklembacaklılara elektronik penetrasyon izleme teknikleri uygulanmıştır16,17,18,19,20. Bununla birlikte, EPG hiçbir zaman kanla beslenen eklembacaklılar için yaygın olarak benimsenmedi çünkü dalga formlarına karşılık gelen biyolojik aktiviteler hiçbir zaman doğrulanmadı21. Ek olarak, ilk aletlerin tasarımları ve elektronikleri, bazı elektrik sinyallerinin aşırı vurgulanmasına, yüksek gürültü-sinyal oranlarına, düşük çözünürlüğe ve dalga biçimlerinin bozulmasına ve omurgalı konakçıların tahrişine neden oldu12,22. Daha yeni bir cihaz olan AC-DC EPG monitör23, değişken ayarlara ve geliştirilmiş sinyal işlemeye sahiptir, bu da onu kanla beslenen eklembacaklıları kaydetmek ve deneysel korelasyon çalışmalarında dalga formlarının biyolojik kökenlerini deşifre etmek için daha uygun hale getirir10<,sup class="xref">12.
EPG için, bir substrat voltaj probu (yani referans elektrodu) aracılığıyla ana bilgisayara bir elektrik sinyali uygulanır. Eklembacaklı bir kayıt elektroduna bağlanır ve konakçıya yerleştirilir. Eklembacaklı ağız kısımlarını (yani stiletleri) konakçıya soktuğunda, elektrik sinyali, sinyal işleme için AC-DC EPG monitörüne iletilir. Elektrik sinyalleri daha sonra bir bilgisayarda, ağız parçası hareketleri, yutma, tükürük salgısı ve patojen edinimi/aşılaması10,12 gibi belirli davranışlara karşılık gelen "dalga formları" olarak görüntülenir. Farklı hiyerarşik düzeylerde (aileler, türler ve alt tipler) dalga formları24,25 dalga formlarının süresi ve sayısı ile ilgili sıralı ve sıralı olmayan yanıt değişkenleri daha sonra türler içinde ve türler arasında meydana gelen beslenme davranışları hakkında fikir edinmek için dalga formlarının sıklığına ve süresine dayalı olarak ve biyotik ve abiyotik faktörlere yanıt olarak hesaplanabilir, konakçılar, patojenler, pestisitler ve çevresel koşullar gibi10,12.
Şimdiye kadar, AC-DC EPG monitörü, Ae'nin yoklama ve yutma davranışlarını karakterize etmek için kullanılmıştır. aegypti26 ve Culex tarsalis<sup class="xref">27 insan eliyle beslenen sivrisinekler ve sığır buzağılarıyla beslenen Dermacentor variabilis ve Amblyomma americanum keneleri28. Ek olarak, bu cihazı kullanarak patojen çalışmalarını kolaylaştırmak için yakın zamanda EPG29 için bir fare modeli geliştirilmiştir. İnsan eli, ilk sivrisinek dalga formu karakterizasyonu için idealdir, çünkü insan konakçılar, sivrisinek sondalamasının yanı sıra diğer davranışları ne zaman hissettiklerini rapor edebilir, bu da dalga formlarının davranışlarla korelasyonunu kolaylaştırır (Tablo 1). Ek olarak, farklı insan popülasyonlarındaki sivrisinekler arasındaki beslenme davranışlarındaki plastisitenin daha iyi anlaşılması, sivrisinekler ve ilettikleri patojenler için daha özel yönetim müdahalelerinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.
Tablo 1: AC-DC EPG kullanılarak insan eli üzerinde Culex tarsalis'ten kaydedilen elektrik sinyallerini sınıflandırmak için kullanılan dalga formu ailelerinin tanımı. Her bir dalga formu ailesine karşılık gelen sondalama aşaması ve biyolojik aktiviteler. Daha fazla bilgi için Cooper et al.27'ye bakın. Kısaltma: AC = alternatif akım, DC = doğru akım, EPG = elektropenetrograf. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Sivrisinek biyolojisi ve konak-vektör etkileşimlerini incelemek için EPG kullanımını kolaylaştırmak için, Cx. tarsalis sivrisineklerinin AC-DC EPG monitörünü kullanarak insan elindeki beslenme davranışlarını ölçmek için metodoloji burada sunulmaktadır. Bu protokoller, çevrimiçi kaynaklar30 bölümünde açıklanan temel AC-DC EPG prosedürleri üzerine kuruludur ve kullanıcıların AC-DC EPG ve ilgili yazılım31 hakkında temel bir çalışma bilgisine sahip olduğunu varsayar. Belirtilen prosedürler, diğer sivrisinek ve konakçı türler için değiştirilebilir ve sivrisinek besleme davranışlarının hipoteze dayalı araştırmasını kolaylaştırmak için bir temel sağlar.
Tablo 2: Ortak AC-DC EPG terminolojisinin tanımları. Tanımlar, çevrimiçi kaynaklarda verilenlere dayanmaktadır30,31 ve bilimsel literatür32. Kısaltma: AC = alternatif akım, DC = doğru akım, EPG = elektropenetrograf. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Protokol
Bu protokol (IRB-10729), Kansas State Üniversitesi İnsan Araştırmaları Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır27 ve yalnızca patojen içermeyen sivrisineklerle kullanım için tasarlanmıştır. İnsan gönüllüler, çalışmaya katılmak ve verilerinin yayınlanması için bilgilendirilmiş onam vermişlerdir. Hayvanlar, insanlar veya biyotehlikelerle herhangi bir çalışmaya başlamadan önce, tüm prosedürlerin ilgili kurumsal düzenleyici komiteler veya denetim sorumluları tarafından incelendiğinden ve onaylandığından emin olun. Bu protokolde kullanılan tüm ekipman ve malzemeler hakkında ayrıntılar için Malzemeler Tablosu'na bakınız.
1. İlk hazırlık ve kurulum
- AC-DC EPG monitörünü (Şekil 1A), Faraday kafesini (Şekil 1B,C) ve yazılımı, aşağıda açıklanan modifikasyonları (adımlar 1.1.1-1.1.5) kullanarak daha önce tanımlandığı şekilde kurun30,31. Ekipmanın ve yazılımın kurulumu ve kullanımıyla ilgili adım adım eğitimler için çevrimiçi kaynaklara30 başvurun. İstenen kurulumu, donanım yönetimi ve dalga formu inceleme yazılımında varsayılan olarak kaydedin. Yaygın AC-DC EPG terminolojisi ve tanımları için Tablo 2'ye bakın.
- Bir kafa aşaması amplifikatörünü (kafa amp) ve bir substrat voltaj probunu kontrol kutusunun Kanal 1'ine bağlayın.
NOT: AC-DC monitörü aynı anda dört böcek ve konakçıyı destekleyebilse de, kayıt işlemi tek bir kanal üzerinden sunulmuştur. - Kontrol kutusundaki Kanal 1'in açık olduğundan ve anahtarlama arayüz kutusundaki ilgili Pre-1 ve Post-1 kanallarının açık olduğundan emin olun.
NOT: Kullanılmayan kanallar kapalı kalmalıdır. - Doğrultulmuş öncesi (pre) ve sonrası (post) sinyalleri kaydetmek için donanım yönetimi yazılımını kullanarak DI-710 A/D Kartı üzerindeki Kanal 1 ve 3'ü etkinleştirin (diğerlerini değil).
- Doğrultulmuş öncesi ve sonrası dalga formlarını görüntülemek/üst üste bindirmek için donanım yönetimi yazılımını biçimlendirin (örneğin, pre-sinyal için 1 = 1 ve post-sinyal için 2 = 3).
- Donanım yönetimi yazılımındaki örnekleme hızını kanal başına saniyede 100 örnek olarak ayarlayın (yani, S/s/CHAN: 100).
- Bir kafa aşaması amplifikatörünü (kafa amp) ve bir substrat voltaj probunu kontrol kutusunun Kanal 1'ine bağlayın.
- Böcek uçları (insect stubs) hazırlayın26,27,29,30:
- Havya, kullanılan özel reçine çekirdekli lehim için önerilen sıcaklığa kadar önceden ısıtın.
- Bir kablo kesici-soyucu araç kullanarak, 20 AWG bakır tel rulosunun ucundan yaklaşık 6 cm'lik plastik kaplamayı soyun, ancak içerideki bakır tel demetini kesmemeye veya işaretlememeye dikkat edin (Şekil 2A). Ardından, açığa çıkan bakır tel demetini kesin ve tekil tellere ayırın (Şekil 2B).
- Bir bakır telye şeridini, uygun bir yüksük piminin başlığının (yani düz üst kısmın) altındaki gövdesine, bakır telin büyük bir kısmı pimin başlığının ötesine uzanacak şekilde kargaburun ile sarın. Teli sabitlemek için telin kuyruğunu pimin başlığının üzerine katlayın (Şekil 2C).
NOT: Kafa amp portuna (kapalı, fişi çekilmiş ve 106 Ohms (Ω) değerine ayarlanmışken) sıkıca oturanları belirlemek için yüksük pimlerini deneyerek test edin. - Bakır tel yukarı bakacak şekilde, yüksük piminin gövdesini yardımcı eller lehimleme aparatıyla tutun. Ardından, yüksük pimi ve bakır telin birleşme noktasına küçük bir damla (~0,2 cm top şeklinde) suda çözünür dekapan (flux) uygulayın (Şekil 2D).
DİKKAT: Dekapan toksiktir ve dikkatle taşınmalıdır. - Yaklaşık 10 cm lehim açın ve düzleştirin. Dekapan eriyene ve metal ısınana kadar sıcak havyayı birkaç saniye boyunca pimin başlığına tutun. Ardından, lehim eriyip birleşme noktasını tamamen kaplayana ve pimi tel ile birleştirip bir böcek ucu oluşturana kadar lehimin ucunu havyanın yanındaki pimin başlığına bastırın.
- Böcek ucu soğurken, havyanın ucunu çelik yünü ve nemli bir süngerle temizleyin.
- Soğuduğunda, böcek ucunu yardımcı ellerden çıkarın. Kalan dekapanı temizlemek için böcek ucunu önce %70'lik etanol ve ardından su ile durulayın. Bakır teli istenen uzunluğa (~3 cm, Şekil 2E) göre kısaltın.
- 20-30 adet böcek ucu hazırlanana kadar 1.2.3-1.2.7 adımlarını tekrarlayın.
- Bir böcek aspiratörü monte edin26,27:
- Cam bir Pasteur pipeti ucunu, pipeti hafifçe döndürerek alevden geçirin. Pipetin ucu, böceğin abdomenini sıkıca saracak uygun boyuta gelene kadar işlemi tekrarlayın.
- Modifiye edilmiş Pasteur pipetinin geniş ucunu sinek teliyle kapatın, ardından doğrudan bir laboratuvar aspiratörüne bağlı silikon tüpe yerleştirin ve bir böcek aspiratörü oluşturmak için bağlantı noktasını elektrik bandıyla sabitleyin (Şekil 2H).
NOT: Farklı boyutlar arasında kolayca geçiş yapmak için Pasteur pipeti ve tül, hızlı ayırıcı takılmış kısa bir plastik tüp parçasına yerleştirilebilir (Şekil 2H).
Şekil 1: İnsan ellerinde kayıt yapmak için AC-DC EPG monitör ekipman kurulumu. (A) (1) kontrol kutusu, (2) anahtar arayüz kutusu, (3) güç kaynağı, (4) DI-710 A/D Kartı, (5) bilgisayar, (6) güç regülatörü dahil olmak üzere EPG bileşenleri ve (B) (C) kuğu boyunlu stand üzerinde bir dijital mikroskop (7), (8) balonlu naylon ve hava yastıkları, (9) substrat voltaj probu ve (10) laboratuvar standı üzerindeki kafa katı amplifikatörünü içeren Faraday kafesi. Kısaltmalar: AC = alternatif akım, DC = doğru akım, EPG = elektropenetrograf. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sivrisineklerin kablolanması için kayıt elektrotları ve kablolama sırasında sivrisinekleri yönlendirmek için kullanılan bir böcek aspiratörü. (A) İçindeki bakır tel demetini açığa çıkarmak için 6 cm'lik plastik kaplaması çıkarılmış 20 AWG bakır tel. (B) Bakır tel demetinin tekil telleri. (C) Bir pirinç raptiye başı etrafına sarılmış, tel kuyruğu raptiye başının üzerine katlanmış tek bir bakır tel teli. (D) Lehimleme hazırlığı için yardımcı lehimleme tutucu ile sabitlenmiş, pirinç raptiye ve bakır tel birleşim yerindeki bir miktar dekapan (flux). (E) Bakır tele lehimlenmiş pirinç bir çiviyle oluşturulmuş tamamlanmış bir böcek sapı (stub). (F) Bir böcek sapının bakır tel ucuna sarılmış altın telden yapılmış ve gümüş yapıştırıcı ile sabitlenmiş bir kayıt elektrodu. (G) Kayıt elektrodu ucundaki altın halkanın yakın çekimi. (H) Modifiye edilmiş Pasteur pipetleri, sivrisinek ağı, plastik tüp, elektrik bandı ve erkek hızlı bağlantı aparatlarından yapılmış, monte edilmiş (üstte) ve demonte edilmiş (altta) bir böcek aspiratörü; yanında dişi hızlı bağlantı aparatıyla donatılmış laboratuvar aspiratör tüpü (sağ üst). Ölçek çubukları = 1 cm (A-F), 200 µm (G). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Sivrisineklerin kablolanması
- Sivrisineklerin ve gümüş tutkalın hazırlanması (EPG'den önceki öğleden sonra/akşam):
- Cx. tarsalis KNWR suşuna ait sivrisinekler, daha önce açıklanan şekilde yetiştirilir ve korunur27.
- Sondaj oranlarını artırmak için eclosion sonrası 5-17 günlük yetişkin dişi sivrisinekler 8-12 saat boyunca aç bırakılır; ancak mortaliteyi önlemek için suya erişim sağlanır.
- Taze gümüş tutkal hazırlanır26,27,28,29,30:
- 20 mL'lik bir behere 510 mg 4-8 µm gümüş pul ekleyin. Terazi darası alın ve gümüş pulun üzerine behere 1.100 mg toksik olmayan okul tutkalı ekleyin.
- Terazi darası alın, tutkalın üzerine behere 510 mg 8-10 µm gümüş pul ekleyin ve ardından bir pipet kullanarak 1.000 µL su ekleyin.
- Behere nazikçe bir manyetik karıştırıcı çubuk ekleyin ve karıştırıcı plakaya yerleştirin. Yavaşça karıştırmaya başlayın, kademeli olarak 'hızlı' ayarına getirin ve 4 dk boyunca karıştırın. Tüm içeriğin karıştığından emin olun.
- Gümüş tutkalı 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarmak için (ucu kesilmiş) bir transfer pipeti kullanın.
- Gümüş tutkal tüplerinin üst kısımlarını Parafilm ile sarın ve kullanıma kadar tezgah üzerinde saklayın.
NOT: Gümüş tutkal 2 güne kadar doğru kıvamda kalır, ancak kullanımdan önceki akşam taze tutkal hazırlanması önerilir30.
- Kayıt elektrotlarının hazırlanması26,27,29,30:
- Gümüş tutkalı kullanmadan önce güçlü bir şekilde vorteksleyin.
- Hazırlanan böcek desteklerini ve kablolu sivrisinekleri tutmak için bir köpük bloğu taze streç film ile sarın.
NOT: Köpük, kablolu sivrisineklerin birbirine değmeden yüzeyde durmasına izin verecek kadar büyük, ancak bir saklama kutusuna sığacak kadar küçük olmalıdır. UYARI: Kan beslemesi sonrası salınan ekskresyon damlacıkları patojenler içerebilir. Streç filmi/köpük bloğunu kullanımdan sonra uygun şekilde atın. - Bakır telin üst 1 cm'sini, her tarafı parlak hale gelene kadar bir jiletle kazıyarak bakır telin ucundaki kararmaları (ve böcek destekleri yeniden kullanılıyorsa eski gümüş tutkalı) temizleyin. Her sivrisinek için bir böcek desteği ve birkaç tane de yedek hazırlayın.
- 0,025 mm çapındaki altın teli 4-5 cm uzunluğunda parçalar halinde kesin. Telde ezilme oluşmasını önlemek için teli her zaman bantla maskelenmiş kendinden kapanan penslerle tutun.
NOT: Altın tel, siyah bir arka planda çok daha kolay görülür. - Altın telin ucunu, böcek desteğinin bakır telinin temiz ucuna yerleştirin ve altın teli bakır telin etrafına nazikçe 3 kez sarın.
- Altın teli sabit tutmak için bir diseksiyon probu ile gümüş tutkal uygulayın. Boşta uç veya gevşek kısım kalmadığından emin olun. Tutkal kuruyana kadar böcek desteğini köpüğe yerleştirin.
- Böcek desteğine bağlı olan altın teli düzeltmek ve uzun, nazik bir yay şekline getirmek için nazikçe okşayın (Şekil 2F). Teli istenen uzunluğa (~2,5-3 cm) göre kesin.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, ince uçlu pensler kullanarak altın telin ucunda bir altın halka oluşturun ve halkayı aşağıda açıklanan şekilde 90° açıyla bükün (adımlar 2.2.8.1-2.2.8.4; Şekil 2E,F). Altın halkanın tamamen kapalı olduğundan emin olun. Böcek desteğini köpük bloğuna geri yerleştirin.
- Baskın olmayan el ile, altın telin ucu mikroskop tablasına değecek şekilde böcek desteğini pirinç çiviyle tutun. Baskın el ile altın telin en ucunu ince uçlu penslerle kavrayın.
- İnce uçlu pensleri kullanarak, altın telin ucunu, altın telin yapıştırıldığı yerin yakınından böcek desteğinin bakır teli üzerinden geçirin. İnce uçlu pensin ucunu ve altın teli mikroskop tablasına bastırın.
- Altın tel, ince uçlu pensin ucu etrafında küçük bir altın halka oluşturana kadar böcek desteğini nazikçe çekin (çok sıkı çekmeyin). Altın teli serbest bırakın ve pensleri dikkatlice çıkarın.
- Böcek desteğini hala baskın olmayan elle tutarken, pensler telin boynuna dik bir açıda olacak ve pensin ucu altın halkanın ortasını kapsayacak, böylece halkanın her iki yanını kavrayacak şekilde altın halkayı ince uçlu penslerle tutun. Halka, telin boynuna 90° açıyla bükülene kadar pensleri nazikçe böcek desteğinden uzağa doğru döndürerek böcek desteğini hafifçe çekin (Şekil 2G).
- Kayıt elektrotlarının sivrisineklere takılması26,27,29,30 (EPG sabahı):
- Aç bırakılmış sivrisinekleri, tüm hareketler durana kadar CO2 gazı ile anestezi yapın. Sivrisinekleri, abdomenleri araştırmacıya bakacak şekilde anestezi pedi üzerinde sırt üstü yerleştirin.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, yapışkan tarafı aşağı bakacak şekilde ~2 cm'lik bir laboratuvar bandı parçası yerleştirin. Bandın üzerine 0,5 cm'lik bir damla (~ 10 µL) gümüş tutkal koyun.
- Anestezi altındaki bir sivrisineğin abdomenini, sadece abdomenin yerine oturmasına yetecek kadar vakum kullanarak modifiye edilmiş Pasteur pipetine çekin. Aspiratörü kullanarak sivrisineği, diseksiyon mikroskobu altında gümüş tutkalın üzerinde tutun.
NOT: Kanatlar modifiye edilmiş Pasteur pipetinin ucunun içinde veya dışında olabilir, ancak içeride olmaları sivrisineğin düşmesini önlemeye yardımcı olacaktır. Kanatları bükmekten veya onlara zarar vermekten kaçının. - Hızlıca çalışarak, bir minutien pinini gümüş tutkala batırın ve sivrisineğin pronotumuna (yani toraksın dorsal yüzeyine) ince bir tabaka uygulayın. Mümkünse hemen bir sonraki adıma geçin (veya gerekirse sivrisineği tekrar anestezi yapın).
NOT: Tutkalın kütiküldeki gözeneklere nüfuz etmesini sağlamak için pini ileri geri sürterek pronotum üzerindeki pulların temizlenmesi önerilir. Tutkalın sivrisineğin başka herhangi bir kısmına bulaşmamasına dikkat edin. - Kayıt elektrodunun ucundaki altın halkayı hızlıca gümüş tutkala batırın ve sivrisineğin pronotumundaki gümüş tutkal noktasına yerleştirin. Halkanın pronotuma tam olarak oturduğundan emin olmak için halkayı ileri geri hareket ettirin. Tutkal kuruyana kadar teli tutun (~20-25 s).
- Böcek desteğini, kablolu sivrisineğin uyandığında rahatça durabileceği bir açıyla köpüğe yerleştirin. Bir sonraki sivrisineğin kablolanmasına geçin.
NOT: Her bir kablolama işleminin kalitesi hakkında notlar alınması tavsiye edilir. - İstenilen sayıda sivrisinek kablolandıktan sonra köpük bloğunu bir saklama kutusuna yerleştirin. Sivrisinekleri kullanıma kadar normal yetiştirme koşullarında tutun.
3. EPG kurulumu ve hazırlığı (EPG'den önceki sabah)
- Aletin dengelenmesi ve olası sorunların giderilmesi için, kayıt işleminden en az 30 dakika önce AC-DC EPG monitörünü (güç kaynağındaki anahtarı çevirerek) açın.
NOT: Kontrol kutusunda ve anahtarlama arayüz kutusunda kullanılan kanallar açık bırakılabilir. - Bilgisayarı açın ve donanım yönetim yazılımını başlatın.
NOT: Sinyaller düz ince çizgiler şeklinde görünmüyorsa, sorun giderme işlemi gereklidir (tartışma bölümüne bakınız). - Dokunma testini gerçekleştirin27,30 ekipman işlevselliğini doğrulamak için:
- Topraklanmış durumdayken (yani çıplak tenle Faraday kafesine dokunurken), şuradaki çevirme düğmesini çevirin kafa amplifikatörü -e / -a 106 Ω ve bir böcek güdüsünün şaftını porta yerleştirin.
NOT: Dokunma testinin daha yüksek bir giriş direnci (Ri) seviyesinde gerçekleştirilmesi kafa amplifikatörüne zarar verebilir. - Topraklama yapılmışken, kafa amplifikatörünü açın ve böcek çıkıntısındaki bakır teli işaret parmağınız ve başparmağınız arasında üç kez sıkıca kavrayın. EPG doğru çalışıyorsa, ekrandaki hem ön hem de sonraki sinyallerde üç büyük pik belirecektir. Eğer durum böyle değilse, sorun giderme işlemi gereklidir (tartışma bölümüne bakınız).
- Topraklanmış durumdayken (yani çıplak tenle Faraday kafesine dokunurken), şuradaki çevirme düğmesini çevirin kafa amplifikatörü -e / -a 106 Ω ve bir böcek güdüsünün şaftını porta yerleştirin.
- Cihaz ayarlarını şu şekilde düzenleyin: 150 mV alternatif akım (AC) ile bir 10'luk Ri7 Ω, a 20-40 kat donanım kazancı, a negatif ofset, a doğal bazal seviyeve bir yazılımsal kazanç -in/-ın/-un/-ün 8-16x27,30aşağıda açıklandığı üzere (adım 3.4.1-3.4.3).
- Kontrol kutusunun 1. Kanalındaki anahtarları ve kadranları kullanarak voltajı, akım tipini, donanım kazancını (aralık, kazanç ve çarpan), ofseti ve baz çizgiyi (sıfır) ayarlayın.
NOT: Uygun donanım kazanç ayarı, kablolama işleminin ve gümüş yapıştırıcının kalitesine bağlıdır; bu nedenle, optimal kazanç ayarlarının sivrisinekten sivrisineğe ve günden güne farklılık göstermesi beklenir. Sinyal tepe noktasına ulaştığında (tanımlandığı üzere), kayıt sırasında donanım kazancının ayarlanması gerekebilir. Tablo 2 ve şurada gösterilmiştir Şekil 3A,C) veya görselleştirilemeyecek kadar küçüktür. Herhangi bir donanım kazanç değişikliği, kaydı kalıcı olarak etkileyecektir (şurada gösterilmiştir: Şekil 3A,C). - Kafa amplifikatörü üzerindeki kadranı kullanarak Ri seviyesini ayarlayın.
- Donanım yönetim yazılımını kullanarak yazılım kazancını ayarlayın ve düzenleyin (örneğin, ön veya son sinyali seçin ve ardından yazılım kazancını artırmak için sol tıklayın veya azaltmak için sağ tıklayın).
NOT: Yazılımda yapılan herhangi bir kazanç (gain) değişikliği, kaydı kalıcı olarak ETKİLEMEZ.
- Kontrol kutusunun 1. Kanalındaki anahtarları ve kadranları kullanarak voltajı, akım tipini, donanım kazancını (aralık, kazanç ve çarpan), ofseti ve baz çizgiyi (sıfır) ayarlayın.
- Donanım yönetim yazılımında yeni bir kayıt kurulumu yapın, ancak bir sonraki bölümdeki 4.3. adıma kadar kaydı başlatmayın.
4. İnsan ellerinde EPG26,27 :
- Bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra (ev kurumun IRB'si tarafından belirtildiği şekilde), denek Faraday kafesinin yanına oturtulmalı, bir kolu içerideyken substrat voltaj probunu kavramalı ve probu kafa amplifikatörünün altında tutmalıdır.
NOT: Kol, balonlu naylon veya benzeri iletken olmayan bir yüzey üzerinde rahatça durmalıdır. Kayıt sırasında el ve alt yüzey voltaj probu, Faraday kafesine veya kafa amplifikatörüne temas etmemelidir. Hasarı önlemek için, gönüllünün kafa amplifikatörü açıldıktan sonra ona dokunmaması kritik önem taşır. Kafa amplifikatörüne yanlışlıkla dokunulursa, işlevselliğini değerlendirmek için yukarıda açıklanan dokunma testini gerçekleştirin. - Konakçı konumlandırıldıktan sonra, baş amplifikatörünü yana çevirin. Saklama kutusundan kablolu bir sivrisineği çıkarın ve böcek çıkıntısının pirinç pimini baş amplifikatöründeki porta takarak cihazla bağlayın. Sivrisineği asılı halde bırakın.
NOT: Telden ayrılan sivrisinekleri kontrol altında tutmak için yakınınızda %70'lik etanol içeren bir sprey şişesi bulundurun. - Donanım yönetim yazılımını kullanarak kaydı başlatın. Sivrisineğin rahatça durabilmesi ve prob yapabilmesi için kafa amplifikatörünü elin üzerine konumlandırın.
- Topraklama yapılmışken kafa amplifikatörünü açın. 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. Prob işleminin başarısını artırmak için konakçının el pozisyonunu gerektiği gibi ayarlayın.
NOT: Hemen sondalama eğilimi gösteren sivrisinekler kullanılırken, sivrisinek ele yerleştirilmeden önce kafa amplifikatörü açılmalıdır. Sivrisineğin konumunu daha fazla ayarlamak için böcek çıkıntısındaki bakır teli bükmek amacıyla ince bir tahta çubuk veya iletken olmayan bir resim fırçası sapı kullanılabilir. EPG sırasında, özellikle davranışsal korelasyon çalışmaları için, sivrisineği gözlemlemede bir büyüteç veya kuğu boynu standlı dijital mikroskop yardımcı olabilir. - Kayıt sırasında konak yanıtları, sivrisinek davranışları, kazanç değişiklikleri vb. ile ilgili zaman damgalı gözlemler (örneğin, olay işaretleyicileri) yapmak için donanım yönetim yazılımını kullanın. Şunu ayarlayın: sinyallerin konumu ekran üzerinde ve yazılımsal kazanç her iki sinyal de ekranda net bir şekilde görünür kalacak şekilde gerektiği kadar. Şunları ayarlayın: donanım kazancı sinyaller doyuma ulaşırsa (Şekil 3A,C ve Tablo 2) veya yazılım kazancı maksimuma çıkarıldığında dalgalar çok küçük görünüyorsa. Şunu ayarlayın: ofset doğrultucu katlanması (foldover) gözlemlenirse (Şekil 3C,C' ve Tablo 2). Yazılım kılavuzuna başvurun31 ve çevrimiçi kaynaklar30 bu ayarlamaların nasıl yapılacağına dair ayrıntılı talimatlar için.
- Ayarlamak için sinyallerin konumu ekranda, ... seçin pre veya post sinyali (örneğin, ile) tıklayarak
1 = 1 veya 2 = 3) ve ardından sinyali sürükleyin ekrandaki istenen konuma (ideal olarak ekranın ortasına yakın ancak üst üste binmeyecek şekilde). - ayarlamak için yazılım kazancı, 3.4.3 numaralı adımda açıklanan donanım yönetim yazılımını kullanın.
- Ayarlamak için donanım kazancı, şu işlemle başlayın: Kanal 1 için Kazanç Ayar Düğmesi kazancı sırasıyla artırmak veya azaltmak için sağa veya sola çevirin. Bu ayar, sinyal kırpılmasını (kazancın çok yüksek olması) önlemek için yeterli değilse; Şekil 3A,C) veya sinyal detaylarının net bir şekilde görselleştirilmesine izin vermezse (kazanç çok düşükse), ...'yı ters çevirin Kanal 1 Aralık ve Çarpan Anahtarları kazancı daha fazla ayarlamak için.
NOT: Dalga formu verilerinin yorumlanmasına yardımcı olmak amacıyla, donanım kazancının (gain) ne zaman ayarlandığını kaydetmek için olay işaretleyicilerin kullanılması önerilir. - Ayarlamak için ofsetters çevirin Kanal 1 Ofset Anahtarı kontrol kutusu üzerinden negatif, ardından ...'yı çevirin Kanal 1 Ofset Kadranı bilgisayar ekranındaki ön ve son sinyallerdeki pikler aynı yönde gerçekleşene kadar. Offset Kadranı çok fazla çevrilirse, son sinyal tekrar ters dönecektir.
- Ayarlamak için sinyallerin konumu ekranda, ... seçin pre veya post sinyali (örneğin, ile) tıklayarak
- Sivrisinek 10 dakika içinde (veya tanımlanmış diğer zaman noktasında) sondaj yapmazsa, baş amplifikatörünü kapatın. Sivrisinek zaman işaretlemesi sırasında sondaj aşamasındaysa, baş amplifikatörünü kapatmadan önce sondaj işlemini tamamlamasına izin verin. Konakçının elini dikkatlice çekmesini sağlayın, ardından sivrisineği beraberindeki böcek tutucusuyla birlikte alın. Sivrisineği saklama kutusuna geri yerleştirin.
- Donanım yönetim yazılımını kullanarak kaydı durdurun/kapatın. Bir sonraki sivrisinekle EPG işlemine geçin (Adım 4.2).
NOT: Her sivrisinekten sonra dosya adını değiştirmeyi unutmayın. - Oturum sonunda kafa amplifikatörünü ve güç kaynağını kapatın ve yazılımdan çıkış yapın.
- Onaylanmış IRB'de belirtildiği üzere, Katılımcı Bilgilendirme Formunu veya benzeri bir belgeyi gönüllü ile birlikte gözden geçirin.
- Sivrisinekleri protokol gerekliliklerine uygun olarak imha edin. Plastik sarmalı köpük bloktan çıkarın ve uygun şekilde atın.
- Tüm veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, dalga formlarını gözden geçirip ölçün ve verileri daha önce açıklanan şekilde analiz edin.24,25,26,27,29,30Çevrimiçi kaynaklara başvurun30 dalga formu inceleme yazılımının kullanımı, dalga formlarını tasvir eden şekillerin oluşturulması, dalga formlarının ölçülmesi, verilerin analiz için dışa aktarılması, istatistiksel analizin gerçekleştirilmesi ve yaygın dalga formu yanıt değişkenlerinin ayrıntılı açıklamasıyla ilgili adım adım öğreticiler için.
Şekil 3: Doyuma ulaşma (peaking out), kontrol kutusu kazanç değişiklikleri, yetersiz kablolamadan kaynaklanan belirsiz voltaj değişiklikleri, doğrultucu katlanması (rectifier foldover) ve gürültü nedeniyle ortaya çıkan suboptimal kayıt örnekleri. İnsan ellerinden doyuncaya kadar beslenen Culex tarsalis sivrisineklerinden alınan dalga formları; (A) doyuma ulaşma (mavi yatay ok) ve ardından kontrol kutusu kazançlarının 100x'den 80x'e, 40x'e, 60x'e, 40x'e ve 20x'e değişmesi (turuncu dikey oklar), (B) belirsiz voltaj değişiklikleri ve (C) ön- (kırmızı) sinyale kıyasla sonrasında (siyah) sinyalde görülen doğrultucu katlanması (dalga formu J'ye bakınız, yakın çekimi panel C' içinde gösterilmiştir), hat gürültüsü (yalnızca doğrultma öncesi (kırmızı) sinyalde görülen 11 Hz sinüs dalgası, yakın çekimi panel C' içinde gösterilmiştir), doyuma ulaşma (mavi yatay ok) ve kontrol kutusu kazancının 500x'ten 200x'e değişmesi (turuncu dikey ok). Dalga formu isimleri her panelin üst kısmında gösterilmiştir. Panel C'nin sağ alt köşesindeki mor oklar, prob işlemi tamamlandıktan sonra baş amplifikatörünün ne zaman kapatıldığını belirtir ve doğrultucu katlanmasına başka bir örnek sunar. Panel C'de doğrultma öncesi sinyalle ilişkili kırmızı yatay çizgiler, zaman damgalı notlar kaydetmek için Olay İşaretleyicilerinin (Event Markers) ne zaman kullanıldığını gösterir. Ri seviyeleri, uygulanan sinyaller, zaman ölçekleri ve yazılım kazançları sırasıyla (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13.2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4.4 s/div, 128x; ve (C) 107 Ω, 150 mV AC, 7.4 s/div, 2x; (C') 0.2 s/div, 8x'dir. Kısaltmalar: AC = alternatif akım, DC = doğru akım, Ri = giriş direnci, mV = milivolt, Ω = Ohm, s/div = bölme başına saniye. Bu şekil Cooper ve ark.27 verileri kullanılarak hazırlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Sonuçlar
Cx. tarsalis sivrisineklerinin insan ellerinden kan beslemesine yönelik AC-DC EPG kayıtları (Şekil 4), analiz ve yayın için uygun, yorumlanabilir dalga formları oluşturmuştur27. Yorumlanabilir dalga formları, dalga formu inceleme yazılımında sıkıştırma (Tablo 2'de tanımlanmıştır) ve yazılım kazancı ayarlandığında, dalga formu ailelerine (Tablo 1 ve Şekil 4), türlere ve alt türlere sınıflandırılabilecek belirgin, ayırt edilebilir tekrarlayan modeller içeriyordu27,31. İnsan ellerinden beslenen Ae. aegypti türünde daha önce tanımlanan tüm dalga formu aileleri (J, K, L, M, N) ve türleri (L1, L2, M1, M2)26, insan ellerinden beslenen Cx. tarsalis tarafından oluşturulan dalga formlarında da tanımlanmış ve burada açıklanan yöntemlerin geçerliliği doğrulanmıştır. Ayrıca, üç yeni dalga formu türü (M3, N1, N2) ve L1, L2, M1 ve M2'nin çok sayıda alt türü belirlenmiştir27. Ek olarak, ağız parçaları konakçıdan geri çekildiğinde voltajın temel seviyeye düşüşü, W dalga formu ailesi olarak adlandırılmıştır27.
Burada belirtilen prosedürler takip edilerek cihaz ayarlarının (akım tipi ve Ri seviyeleri) sistematik olarak değiştirilmesi; Cx. tarsalis türünün insan elleriyle beslenmesinin kaydedilmesi için optimal ayarların, her bir dalga formunun elektriksel kaynaklarının, sivrisinek başına tam ve eksik probların saniye cinsinden ortalama sürelerinin belirlenmesine ve farklı ayarlar arasında böcek başına saniye cinsinden dalga formu süresinin (WDI), böcek başına dalga formu olay sayısının (NWEI) ve böcek başına olay başına saniye cinsinden dalga formu süresinin (WDEI) istatistiksel olarak karşılaştırılmasına olanak sağlamıştır27. Sivrisinekler ayrıca farklı dalga formları sırasında durdurulmuş ve hangi dalga formunun kan alımıyla ilişkili olduğunu belirlemek için diseke edilmiştir27. Benzer bir inceleme, karşılaştırılabilir bir metodoloji kullanılarak Ae. aegypti için de gerçekleştirilmiştir26.
EPG'nin hassas ve karmaşık doğası nedeniyle, tüm kayıtlar Şekil 4'te gösterilenler kadar kusursuz değildi. Sinyal doruk noktasına ulaşma (Şekil 3A,C), donanım kazanç değişiklikleri (Şekil 3A,C), yetersiz kablolama işlemleri (Şekil 3B), J dalga formundaki doğrultucu katlanması (Şekil 3C,C') ve elektriksel gürültü (Şekil 3C,C'), zaman zaman dalga formlarını bozarak maskeledi; bu durum onları yayın kalitesindeki şekillerde kullanıma uygunsuz hale getirdi ve puanlamayı ve analizi zorlaştırdı. Bu nedenle; kablolama becerilerini geliştirmek, kazanç ve voltaj ayarlarını optimize etmek, ofset değerini ayarlamak ve elektriksel gürültüyü kontrol altına almak için ön hazırlık yapılması önerilir. İlginç bir şekilde, doğrultucu katlanması yalnızca Cx. tarsalis türü için J dalga formu ailesinde gözlemlendi (Şekil 3C,C') ve ofset başlangıçta ayarlandıktan sonra, diğer sivrisinek türleri (Ae. aegypti ve Culex quinquefasciatus) kullanıldığında bile tekrarlamadı (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, sorun giderme çalışmaları, Şekil 3'te (paneller C ve C') gösterilen kontrolsüz elektriksel gürültünün hatalı bir Faraday kafesinden kaynaklandığını ortaya çıkardı. Hatalı Faraday kafesinde yapılan kayıtlar hala kullanılabilir durumdaydı, ancak geliştirilmiş bir Faraday kafesi inşa edildiğinde gürültü sorunları çözüldü (Şekil 1B).
Tüm önlemler alındığında ve ön uç optimizasyonları yapıldığında bile, elektrotların sivrisineğe tutunma kalitesindeki hafif farklılıklar ve sinyali bozan ve sinyal-gürültü oranını değiştiren diğer bilinmeyen faktörler, sinyalin görünür aralıkta kalmasını ve her dalga formundaki piklerin çözünürlüğünün dalga formu tanımlama ve karakterizasyonu için yeterli olmasını sağlamak amacıyla kayıt sırasında donanım kazancının (gain) periyodik olarak ayarlanmasını gerekli kılmıştır. Ne yazık ki, kayıt sırasında donanım kazancının ayarlanması ani voltaj kaymalarıyla sonuçlanabilir (Şekil 3A, C); bu durum dalga formlarını yayın için uygunsuz hale getirse de ölçüm ve analiz için (tamamı veya bir kısmı ile) hala kullanılabilir kılar.
Şekil 4: 250 mV AC uygulanan bir sinyal kullanılarak, 107 Ω'luk bir Ri ile insan elindeki bir Culex tarsalis probundan kaydedilen temsili dalga formları.Aile düzeyindeki (NP, J, K, L, M, W) dalga formu isimleri her panelin üst kısmında gösterilmiştir. Alt paneller, panel A'daki seçili bölgelerin büyütülmiş hallerini göstermektedir. Ekli paneller, belirtilen bölgelerin büyütülmüş hallerini göstermektedir. Zaman ölçekleri ve yazılım kazançları sırasıyla (A) 7.0 s/div, 16x; (B) 1.0 s/div, 64x; (B') 0.2 s/div, 64x; (C) 1.0 s/div, 64x; (C') 0.2 s/div, 32x; (D) 1.0 s/div, 64x; (D') 0.2 s/div, 64x'tir. Kısaltmalar: AC = alternatif akım, Ri = giriş direnci, mV = milivolt, Ω = Ohm, s/div = bölme başına saniye. Bu şekil, Cooper ve ark.27 verileriyle hazırlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
AC-DC EPG'yi kullanırken, donanıma zarar vermemek için donanım ve yazılım çalışması30 hakkında temel bir anlayışa sahip olmak ve burada açıklanan protokolleri dikkatlice takip etmek çok önemlidir. En önemlisi, Faraday kafesine topraklanmadıkça, açıldığında kafa amplifikatörüne dokunmaktan kaçının. Faraday kafesinde mümkün olduğunca geriye kayıt yapılması önerilir30. Aşırı ortam elektrik gürültüsü olan bir ortamda kayıt yapılmadıkça, yorumlanabilir dalga formları elde etmek için kafes kapılarının mutlaka kapatılması gerekmez. Faraday kafesinde motorlu hiçbir şey olamaz. Faraday kafesinin düzgün çalışması için yalnızca kafa amplifikatörü aracılığıyla elektriksel olarak topraklanması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Bu, Faraday kafesi tarafından yakalanan elektriğin laboratuvar standına, kafa amplifikatörünün metal kasasına, kablodan kontrol kutusuna akması için iletken bir yol sağlamak üzere standın bir ayağından zımparalanmış boya ile kafa amplifikatörünü metal bir laboratuvar standına bağlayarak gerçekleştirilir. güç kaynağından uygun şekilde topraklanmış bir duvar prizine ve bina topraklamasıyoluyla toprağa 30. Çeşitli noktalar arasındaki direnci (iletkenliğin tersi olan) ölçerek kafes içindeki bileşenler arasındaki bağlantının kalitesini kontrol etmek için bir multimetre kullanılabilir. Kapılar kapatıldığında sesin önemli ölçüde azaldığını (veya ideal olarak ortadan kaldırıldığını) doğrulamak için Faraday kafesinin içine kablosuz bir radyo da yerleştirilebilir, bu da Faraday kafesinin havadaki elektrik sinyallerini yeterince yakaladığını doğrular (E. Backus per. Comm.).
Gümüş tutkalın uygun ve standartlaştırılmış olarak hazırlanması ve kayıt elektrotlarının böceklere bağlanması, kullanılabilir kayıtlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Böcek kütikülü bir yalıtkandır ve gümüş tutkal, elektriğin böceğin içinden pronotum30'un yüzeyindeki altın tele gitmesi için bir yol oluşturmak üzere kütikülün gözeneklerine yeterince nüfuz etmezse bir kapasitör görevi görür. Gümüş yapıştırıcıyı her EPG seansından önce aynı anda hazırlayın, tüpten taze gümüş yapıştırıcı ile çalışın ve kablolama işlemi sırasında sık sık kuvvetli vorteksli gümüş yapıştırıcı ile değiştirin. Altın halkanın göğüs kafesine doğru konumlandırıldığından emin olun, böylece tüm halka kütikül ile temas halinde olur ve güçlü bir elektrik bağlantısı oluşturmaya yardımcı olmak ve ayrıca sivrisineğin telden ayrılmasını ve kaçmasını önlemek için bir tarafa eğilmez veya kalın bir gümüş tutkal ve pul tabakasıyla ayrılmaz.
Burada açıklanan protokoller, farklı sivrisinek türleriyle çalışırken optimize edilmelidir. Belirli bir eklembacaklıya kayıt yapmak için en uygun EPG ayarları (Ri seviyesi, voltaj, akım tipi ve donanım kazancı) deneysel olarak belirlenmelidir12,30. Ancak ofset ayarlandıktan sonra benzer sivrisineklerle çalışırken yeniden ayarlanmasına gerek kalmayacaktır. Ae. aegypti26 ve Cx. tarsalis27 ile AC-DC EPG için en uygun ayarlar belirlenmiştir. Ek türler için dalga biçimi kitaplıkları (Tablo 2'de tanımlanmıştır), sivrisinekler için EPG'nin benimsenmesini kolaylaştıracaktır. Kanla beslenme davranışı sivrisinek türüne ve anestezi seçimine bağlı olarak farklı şekilde etkilenebileceğinden, ilgili sivrisinek için anesteziyi optimize etmek de gereklidir. Örneğin, Cx. tarsalis CO2 ile 15 dakikalık anesteziden sonra 4 saatlik bir iyileşme süresi gerektirirken, Ae. aegypti için buzla 15 dakikalık bir anestezi süresinden sonra 15 dakikalık bir iyileşme süresi yeterlidir. Bununla birlikte, Culex tarsalis'in soğuğa maruz kalma ile yıkılması zordur, bu nedenle uzun iyileşme süresine rağmen ağırlıklı olarak CO2 kullanılır.
AC-DC EPG monitörünün çevrimiçi kaynakları30,31 inceledikten veya deneyimli bir kullanıcıyla eğitim aldıktan sonra kullanımı kolay olsa da, bazı sorun giderme işlemleri gereklidir. Başlangıçta, yazarın sivrisinek sondalarının EPG kayıtları, ön sinyalde Wayadande ve meslektaşları 26 tarafından gözlemlenmeyen veya rapor edilmeyen beklenmedik bir11 Hz işaret dalgasına sahipti. E. Backus ile yapılan istişare, Faraday kafesinin muhtemelen müdahale eden zemin döngüleri nedeniyle sorun olduğunu gösterdi. Aşağıdaki tablodan izole etmek için lastik ayaklarla desteklenen büyük bir alüminyum zemin plakasına cıvatalanmış bir alüminyum çerçeveye bağlı oldukça iletken bir bakır ekrandan yapılmış yeni bir Faraday kafesi (Şekil 1B), 11 Hz gürültü sinyalini çözdü (Şekil 3C,C'). Ek olarak, bazen, EPG güç kaynağı ilk açıldığında, düzeltme öncesi ve sonrası sinyaller düz, pürüzsüz, ince çizgiler yerine kalın, bulanık çizgiler olarak görünürdü. Bu genellikle cihazı kapatarak ve tüm kablo bağlantılarını kontrol ederek düzeltildi. Bu başarısız olursa, cihazın fişini 1-3 dakika çekmek genellikle yardımcı oldu. Çok nadiren, çalışma sırasında ön ve son sinyaller kalınlaşır ve bulanıklaşır, bu durum cihazı kapatıp farklı bir prize takarak veya EPG'yi duvara bağlamadan önce takmak için bir voltaj regülatörü ve güç düzenleyici kullanarak ele alınır. İdeal olarak, EPG monitörü için özel bir hat, EPG30 ile aynı elektrik devresine takılı buzdolaplarından ve diğer ekipmanlardan kaynaklanan hat gürültüsünü ortadan kaldıracaktır.
Şu anda, sivrisinekleri incelemek için EPG kullanmanın iki ana sınırlaması vardır. İlk olarak, hangi problama davranışlarının dalga formlarına karşılık geldiğini doğrulamak için birkaç korelasyon çalışması yapılmıştır. Her dalga formu ailesi (Tablo 1) ve bazı dalga formu tipleri (M1 ve M2) sırasında neler olduğuna dair güçlü hipotezler olsa da, kan alımının dalga formu ailesi M26,27 ile ilişkili olması dışında, bu hipotezlerin çok azı deneysel olarak doğrulanmıştır. En önemlisi, tükürük salgısı olaylarına karşılık gelen dalga biçimleri tanımlanmalıdır çünkü tükürükte birçok patojen bulaşır. Tedavi grupları arasındaki dalga formu süresi ve sayılarındaki önemli farklılıkları anlamlı bir şekilde yorumlamak için EPG dalga formlarının sivrisineklerdeki biyolojik aktivitelerle korelasyonu gerekecektir. İkincisi, EPG sırasında sondalama ve yutma oranları beklenenden çok daha düşük olabilir27. Sivrisinekleri tek tek kısa kablolara bağlamak ve onları doğrudan konakçının üzerine yerleştirmek, uzun mesafeli konakçı arama ve sosyal beslenme davranışlarını önleyebilir, bu da araştırma ve yutma davranışlarını etkileyebilir. Doğru şekilde bağlanmış böcekler normal şekilde yürüyebilir ve uçabilir. Yine de sivrisinekler sıklıkla telleri çekerler ve bazen birbirine dolanırlar veya kendilerini doğal olmayan açılarda tutarlar, bu da kablolu olmanın davranışlarını bir dereceye kadar etkilediğini gösterir. Yazarlar, EPG sırasında sondalama oranlarını artırmak için birçok stratejiyi test ettiler ve sivrisinekleri gece boyunca aç bırakmak, yaşlı bireyleri kullanmak, onları ele yerleştirmeden hemen önce insan nefesine maruz bırakmak ve ele insan tükürüğü uygulamak en etkili olanıydı ve ayrıca sivrisineğin sondalama için ideal konumda olduğundan emin olmak için ellerinin pozisyonunda sürekli olarak ince ölçekli ayarlamalar yapan konakçıları kullanmak27.
Bu sınırlamalara rağmen, AC-DC EPG, araştırma ve yutma davranışlarını incelemek için diğer yaklaşımlara göre çok sayıda avantaja sahiptir. Kan beslemesi sırasında sondalama ve yutma davranışlarını ve tükürük salgılarını ölçmek için tasarlanan BiteOScope11, flyPAD15 ve Otomatik Biyomateryal Platformu14 gibi sistemler, normal konakçı doku sistemleri ve konakçı ipuçlarından yoksun şeffaf yapay substratlar ve sıvı diyetler kullanır. Bu sentetik platformlar birçok deneysel amaç için faydalı olsa da, AC-DC EPG'nin açık bir avantajı, bu eklembacaklı davranışlarını ve doğal konakçı sistemleri içindeki ilgi çekici değişkenleri inceleme yeteneğidir. Ayrıca, AC-DC EPG sisteminin kullanıcı tanımlı uyarlanabilirliği, maksimum miktarda bilgi ile dalga formları elde etmek ve geniş bir konakçı ve eklembacaklıyelpazesi üzerindeki olumsuz etkileri en aza indirmek için gerekli olan ayarlanabilir Ri seviyelerine, akım tiplerine ve voltaj seviyelerine sahip olmayan diğer EPG cihazlarına22,33 ve EPG benzeri elektronik izleme cihazlarına16,21 göre ek bir avantaj sunar. 23. Elektromiyografi (EMG) teknikleri de kanla beslenmeyi incelemek için kullanılır. Bununla birlikte, elektrik devresi genellikle sadece eklembacaklıları içerir ve sadece kayıt elektroduna en yakın kas potansiyelleri kaydedilir, bu nedenle dalga formları, hücre yırtılmaları, stile konumları ve aktiviteleri ve ağız parçalarından akış potansiyelleri gibi konakçı-böcek arayüzünde meydana gelen ayrıntılı aktiviteler hakkında bilgi sağlamaz28,34. İntravital mikroskopi teknikleri, canlı konakçı dokulardaki ayrıntılı ağız parçası hareketlerini ve aktivitelerini doğrudan görselleştirmek için kullanılabilir, ancak bu teknikler canlı hayvan modellerinde invaziv prosedürleri içerir9. Yalnızca AC-DC EPG monitörü, invaziv prosedürlere ihtiyaç duymadan canlı opak konakçı dokularda meydana gelen sondalama, yutma ve tükürük salgılama davranışları hakkında gerçek zamanlı olarak son derece ayrıntılı bilgi sağlayabilir ve çok çeşitli eklembacaklılarda kullanım için uyarlanabilir10,12.
Bu, sivrisinekleri kablolamak, bir böcek aspiratörü inşa etmek ve insan konakçılar üzerinde EPG gerçekleştirmek için ilk ayrıntılı adım adım prosedürdür. Bu protokollerin, insan konakçılarla beslenen sivrisinekler üzerinde AC-DC EPG'nin benimsenmesini kolaylaştırması bekleniyor. AC-DC EPG'yi kullanan gelecekteki araştırma çabalarına örnek olarak, kan alımından önceki stereotipik araştırma davranışları dizilerinin tanımlanması, ağız parçalarından kan akışının araştırılması ve eklembacaklı türleri/gelişim aşamaları26 içinde ve arasında beslenme plastisitesinin karşılaştırılması dahil olmak üzere, kan beslemenin temel mekanizmaları ve konakçı doku hasarı10 üzerine çalışmalar yer alabilir. EPG ayrıca insektisitlerin, antifeedantların ve kovucuların etkilerini ölçmek için de kullanılabilir12. Sivrisinekleri insan ellerinde incelemek için AC-DC EPG'yi kullanmak için burada sunulan prosedürler, bu çalışmaları hızlandıracak ve sivrisinek kanı besleyici biyolojisine yeni bakış açıları sağlayacaktır.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Bu yayında ticari isimlerden veya ticari ürünlerden bahsedilmesi yalnızca belirli bilgiler sağlama amaçlıdır ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onay anlamına gelmez. Bu rapordaki sonuçlar yazarlara aittir ve USDA'nın görüşlerini temsil etmeyebilir.
Teşekkürler
Oklahoma Eyalet Üniversitesi'nden Prof. Astri Wayadande'ye, sivrisinekler için kablolama prosedürüne öncülük ettiği için, Parlier, CA'daki USDA-ARS'den Dr. Elaine Backus'a ve Gainesville, FL'deki EPG Technologies Inc.'den Bay Andrew Dowell'a EPG ekipmanında sorun giderme konusunda yardım için minnettarız. Ayrıca Manhattan, KS'deki USDA-ARS Insectary'den Dr. Dustin Swanson ve Bay William Yarnell'e sivrisinek sağladıkları için ve Manhattan, KS'deki Kansas Eyalet Üniversitesi'nden Bayan Miriam Ruhinda'ya prosedürel videoların çekilmesine yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kansas Eyalet Üniversitesi'ndeki Entegre Moleküler Entomoloji Çekirdeğine (IEMC) erişim ile mümkün olmuştur. Bu araştırma USDA Araştırma, Eğitim ve Ekonomi İşgücü Geliştirme Anlaşması (#58-3022-0-002) ve Hatch Çok Devletli Projesi (NE1943) tarafından desteklenmiştir. Bu el yazması, Kansas Tarımsal Deney İstasyonu, Kansas Eyalet Üniversitesi, Manhattan, KS, ABD'den 24-194-J numaralı katkıdır.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Instrumentation | |||
| AC-DC 4 kanallı elektropenetrograf | EPG Teknolojileri, Inc. | EPG için, güç kaynağı, kontrol kutusu, anahtar arayüz kutusu, dört kafa aşaması amplifikatörü, dört alt tabaka voltaj probu ve ilgili kabloları içerir | |
| EPG sırasında insan konağın elini/kolunu dayaması için | hava yastıkları | Amazon.com | |
| DI-710 Veri toplama donanımı (AD Kartı) | DATAQ Instruments Inc. | analog EPG sinyallerini bir bilgisayarda görselleştirilebilecek şekilde sayısallaştırmak için | |
| Kısılabilir Led Büyüteç Lambası, Büyük 5X Işıklı Eller Serbest Büyüteç ve Okuma Standı Hobiler El Sanatları Dikiş Tezgahı | EPG | sırasında davranışsal gözlem için Amazon.com; EPG sırasında yalnızca fişe takılı olmayan kullanın, aksi takdirde gürültü oluşabilir | |
| EPG sırasında davranışsal gözlem için | |||
| Dino-Lite Esnek kollu Masaüstü Standı | Dino-Lite | MS22B | kamerayı tutmak ve manipüle etmek için |
| Eisco Çelik İmbik Taban Standı ve Çubuk Seti | Fisher Scientific | S41740 | baş sahnesini tutmak için amplifikatör ve Faraday kafesini topraklamak için (metalden yapılmalıdır) |
| EPG Çevrimiçi Atölye | UF IFAS Uzantısı | https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 | AKA, EPG öğrenmek için "çevrimiçi kaynaklar" (cihaz kurulumu, veri toplama ve analizi, Faraday yapımı, gümüş tutkal hazırlama, böcek saplama yapımı, vb.) |
| Furman P-1800 AR Güç Regülatörü/Güç Düzenleyici | Amazon.com | hat gürültüsünü azaltmak için | |
| sahibi ile Faraday kafesi arasında bariyer olarak kullanım için | Küçük Kabarcık Yastıklama Sargısı | Amazon.com | |
| Troemner Talboys Labjaws Normal Kelepçe Tutucu | Fisher Scientific | 02-217-121 | baş stage amplifikatörünü tutmak ve Faraday kafesini topraklamak için (metalden yapılmalı ve plastikle kaplanmamalıdır) |
| EPG | ve istatistiksel analiz için | Windows bilgisayar Best Buy | |
| Software | |||
| Backus 2.0 Veri Analizi SAS programı | UF IFAS Uzantısı | https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/ | dalga formu verilerinin istatistiksel analizi için |
| Ebert 1.0 Dosya Manipülatörü ve Hata Denetleyicisi SAS programları | UF IFAS Uzantısı | https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/ | dalga formu verilerinin istatistiksel analizi için dosyaların hazırlanması için |
| SAS sürüm 9.4 | SAS Institute Inc. | dalga formu verilerinin istatistiksel analizi için | |
| WinDaq Lite | DATAQ Instruments Inc. | EPG verilerinin kaydedilmesi ve gözden geçirilmesi için. WinDaq Hardware Manager yazılımını (AKA, "donanım yönetim yazılımı") ve WinDaq Waveform Browser yazılımını (AKA, "dalga formu inceleme yazılımı") içerir. Yalnızca Windows bilgisayarlarda kullanım içindir. | |
| < güçlü >Faraday Kafesi< / güçlü >< / em>< / u > | |||
| Alüminyum ekran çerçevesi | Ev Deposu | MSCF5167 | Faraday kafesinin duvarları |
| için Alüminyum Levha, 0.125 (1/8) kalınlığında 3003-H14 | Metal Deposu | S318 | Faraday kafesinin tabanı için |
| Köşe destekleri, 1 " | Faraday kafesinin duvarları için Home | Depot | 339547 |
| Düz başlı Phillips makine vidaları, # 6-32 x 1 " | Faraday kafesi yapımı için | Home Depot | 459999 |
| Düz rondelalar, # 6 | Faraday kafesi yapımı için | Home Depot | 638977 |
| Fluke 15B+ Dijital Multimetre, Elektrik Uygulamaları için, 1000V ve 10A'ya kadar AC/DC Gerilim ve Akım Ölçümlerinin yanı sıra Faraday Kafesini | |||
| Taşınabilir Radyo FM, Hoparlörlü Goodes Transistörlü Radyo, Kulaklık Jakı, Uzun Menzilli Alım için 2AA Pille Çalışan Radyo, | Faraday Kafesini test etmek için | Amazon.com | |
| Saf bakır ekran, 0.11 tel çapı ile 16 x 16 ağ, Faraday kafesinin duvarları için 36 "x 12'Metro | Ekran Işleri | ||
| Yuvarlak başlı birleşik makine vidaları, # 6-32 x 3/4 " | Faraday kafesi yapımı için | Home Depot | 528466 |
| Zımpara kağıdı, 1/2" x 1", 150 Grit | Home Depot | 19036-20-CC | laboratuvar standının altından boyayı çıkarmak için |
| Ekran çerçevesi köşeleri, 5/16" | Home Depot | WCORN516 | Faraday kafesinin duvarları için |
| Ekran spline, 0.14 " | Faraday kafesinin duvarları için | Depot | 3034719 |
| Böcek Saplamaları | |||
| Pirinç Rozet Pimleri | Home Depot | 801294 | |
| Bakır tel, böcek | Amazon.com | ||
| Harris suda çözünür grip | Böcek saplama telini lehimlemeye, kaplamaya ve güçlü bir bağlantı oluşturmaya yardımcı olmak için | Home Depot | 355398 |
| İğne burunlu pense | Böcek saplamaları oluştururken tel bükmek için | Home Depot | |
| Pro's Kit 900-015 | Lehimleme sırasında rozet pimlerini tutmak için | Amazon.com | |
| Lehim (reçine çekirdekli) | Home Depot | 296497 | böcek saplamaları oluşturmak için |
| Tel kesici sıyırıcı aracı | Böcek saplamaları oluştururken bakır teli sıyırmak ve kesmek için | Home Depot | |
| YIHUA 928D-III Havya, 110W Yüksek Güçlü, tamamen Dijital Ekranlı Havya | Amazon.com | böcek saplamaları oluşturmak için; temizlik için bir stand, sünger ve çelik yünü ile birlikte gelir | |
| Böcek Aspiratörü | |||
| Accuris ASPIRE Laboratuvar Aspiratörü | Accuris aletleri | V0020 | ; el tipi vakum kontrol cihazı, ince uçlu (40 mm) paslanmaz çelik adaptör ve pipet ucu adaptörü |
| Chemglass Life Sciences Pasteur pipetleri, | sivrisinekleri kablolarken böcek aspiratörü olarak kullanım için | Fisher Scientific NC0230004 | |
| içerirModifiye | Pasteur pipetini vakum hattına takmak için | Home Depot | |
| Cibinlik yardımcı kumaş, 10 x 10 cm kare | Joann Kumaşlar | 16651622 | sivrisineklerin vakum pompasına aspire edilmesini önlemek için |
| Saint Gobain Performans Plastik Tüp Tygon 1/4 x 7/16 | Fisher Scientific | 50-206-8914 | Farklı modifiye Pasteur pipetleri arasında hızlı ve kolay geçiş için |
| Thermo Scientific Nalgene HDPE Hızlı Bağlantı Kesme (3/8 ila 7/16 inç. Kimlik) | Farklı modifiye edilmiş Pasteur pipetleri arasında hızlı ve kolay geçiş için | Fisher Scientific | 15-315B |
| Silver Glue < / strong>< / em>< / u > | |||
| Elmer'in Glue-All Çok Amaçlı Beyaz Tutkal | Amazon.com | gümüş tutkal hazırlama için | |
| Gümüş Pul% 99,9 saf, 4-8 &mikro; m | ThermoFisher | 786.09 | gümüş tutkal hazırlama için |
| Silver Flake %99,95 saf, 8-10 & Gümüş | tutkal hazırlama için | Inframat Advanced Materials | 47MR-12F |
| Böcek Anestezisi | |||
| CO2 fıskiye kiti, 1000 mL, #9 Flypad | kullanırken böceklerin kurumasını önlemek için | FlyStuff | 59-181 |
| Kauçuk Tıpa Flypad çerçeve, standart ölçü | FlyStuff | 59-118 | sivrisineklerin flypad'den düşmesini önlemek için |
| Flystation Fırçası | FlyStuff | 59-205 | bir sineklik üzerinde çalışırken statik elektriği azaltmak için |
| Flystuff Flypad standart ölçü | FlyStuff | 59-114 | AKA sivrisinekleri uyuşturmak için "anestezi pedi" |
| Sinekliğe aktarmadan önce sivrisinek bardaklarını gazlamak için | huni (4 inç çapında) | Amazon.com | |
| Pleksi cam veya düz plastik kapak (boyuta göre kesilmiş) | Sivrisinekler uyanmaya | ||
| başlarsa sinekliği örtmek için Home Depot MC-27Plastik Boru Hortum Kelepçelerini Kapatın Tek Konumlu ve Ayarlanabilir Açık (çeşitli 1/8 "ila 1/2") | Amazon.com | Flypad ve huni arasındaki gazı yönlendirmek için | |
| CO<2 <> | tank" gaz akışını düzenlemek için tek kademeli COsub>2 /subtank | ||
| T” Hem | flypad'i hem de huniyi CO2 tankına bağlamak için | FlyStuff | 59-123 |
| , şeffaf ve nbsp; | FlyStuff | 59-124C | huni ve flypad'i CO2 tankı |
| Insect Wiring | |||
| Black kart stoğu, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11" | Michael's Stores Inc. | Altın telin görselleştirilmesi 327826 daha kolay hale getirilir | |
| Siyah inşaat kağıdı kare 3.5 "x 4.0" | telin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için | 956221 | zımbalar |
| Oruç tutan sivrisinekler için | Amazon.com | pamuk topları | |
| Craft köpük # 12 blok (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm) | Joann Kumaş ve El Sanatları Mağazası | Kablolu sivrisinekleri tutmak için | 1941079 |
| Deflecto Kurdele Dağıtıcı, | Altın tel depolamak için | Amazon.com | |
| Tüy ağırlığı entomoloji forseps | Böcek manipülasyonu için | Fisher Scientific | S72110 |
| İnce forseps (Dumont tarafından FST: #5 91150-20, Inox-Electronic) | Sivrisinekleri kablolarken altın bir halka yapmak için | Güzel Bilim Araçları | 91150-20 |
| İnce uçlu boya fırçası | Amazon.com | kablolama ve EPG sırasında sivrisinekleri manipüle etmek için; EPG için kullanılıyorsa plastik veya ahşap bir sapa sahip olmalıdır | |
| İnce uçlu standart transfer pipetleri, dar, 5,8 mL | Gümüş tutkal hazırlama için | Thomas Scientific | 7761D21 |
| Altın tel, %99,99 saf, 0,025 mm kalınlık | Sivrisinekleri kablolamak için | Goodfellow | AU005121 |
| Minutien pimleri, uç 0,2 mm, 1 cm | Sivrisineklere yapıştırıcı uygulamak için | Fisher Scientific | NC9681411 |
| Kağıt bardaklar | Sert Kağıt Tüp | ||
| Böcek kablolaması sırasında minutien pimini tutmak için | yardımcısı | Fisher Scientific | 50-996-811 |
| Kapaklı plastik saklama kutusu (7 inç x 9 inç x 14 inç) | Amazon.com | kablolu sivrisinekleri taşımak için | |
| Pleksi cam veya düz plastik kapak (boyuta göre kesilmiş) | Home Depot | MC-27 | sivrisinekler uyanmaya başlarsa sinekliği örtmek için |
| Kendiliğinden kapanan forseps | Fisher Scientific | 08-906 | altın tel tutmak ve manipüle etmek için |
| Sıkıştırılmış Gaz | |||
| CO2 gaz tankı | Matheson Sineklikleri | sineklik ile uyuşturmak için | |
| Ortak Laboratuvar Öğeleri | |||
| Biohazard tek kullanımlık otoklav torbaları, 8 1/2" x 11" Kanla | beslenen sivrisineklerin atılması için | Fisher Scientific | 03-410-591 |
| Pasteur pipetlerinin modifikasyonu için | Amazon.com | Bunsen brülörü veya propan meşale | |
| Renkli laboratuvar bandı | Daigger Malzemeleri | Etiketleme, gümüş yapıştırıcı hazırlama ve maskeleme forsepsleri için | EF9763R |
| sarf malzemeleri Tek kullanımlık pipet uçları, 1000 & L | Fisher Bilimsel | gümüş tutkal yaparken suyu kesmek için | |
| Diseksiyon mikroskobu | Leica Microsystems | sivrisinekleri kablolamak için | |
| Diseksiyon probu | Fisher Scientific | NC9109673 | karıştırmak ve gümüş tutkal uygulamak için |
| Erlenmeyer şişesi, 1000 mL | Fisher Scientific | flypad Ethanol kullanırken böceklerin kurumasını önlemek için | |
| ,% 70 & | Kaçan sivrisinekleri kurtarmak için | Fisher Scientific | 04-355-122 |
| Cam petri kapları | Fisher Scientific | 08-747B | sivrisinekleri buzla uyuşturmak için |
| Eldivenler | koruma için | Fisher Scientific | |
| Kimwipes KimTech Science marka hassas görev silecekleri | Fisher Scientific | 06-666 | sivrisinekleri ezmek için |
| Laboratuvar önlükleri | Kişisel koruma için | Fisher Scientific | |
| LiBa Sprey Şişeleri, Doldurulabilir Boş Sprey Şişeleri (sürtünme alkolü güvenli) | Amazon.com | kaçan sivrisinekleri kurtarmak için | |
| Manyetik karıştırma çubuğu, 2 cm uzunluğunda | Fisher Scientific | gümüş tutkalı karıştırmak için | |
| Mekanik Tek Kanallı pipet, 1000 & L | Fisher Bilimsel | 13-690-032 | gümüş tutkal yaparken suyu ayırmak için |
| Mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mL | Fisher Scientific | 780420 | gümüş tutkal Parafilm |
| M | Fisher Scientific | 50-998-944 | gümüş tutkal tüplerinin sızdırmazlığı için |
| Köpük bloğu kaplamak için | plastik sargı | Amazon.com | |
| Pyrex 20 mL beher | Fisher Scientific | 07-250-051 | gümüş tutkalı karıştırmak için |
| Semi-Micro Balance | Fisher Scientific | 10-919-370 | tutkal ve gümüş pul tartmak için |
| Sharpie kalem, | etiketleme için | Amazon.com | |
| Tek kenarlı tıraş bıçağı | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 71980 | saplarını temizlemek için |
| Standart Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri | Fisher Scientific | Gümüş yapıştırıcıyı bir saklama tüpüne aktarmak için | 133-711-7mL |
| Karıştırma plakası | Fisher Scientific | Gümüş yapıştırıcıyı karıştırmak için | |
| Zamanlayıcı/kronometre izle | sahibinin her bir böceğe ne kadar süre maruz kalacağını zamanlamak için | Fisher Scientific | |
| Ultrapure (18 MΩ) su | Fisher Scientific | gümüş tutkal hazırlama için | |
| Yardımcı makas | Fisher Scientific | 08-945 | altın tel kesmek için |
| Vorteks karıştırıcı | Fisher Scientific | gümüş tutkalı karıştırmak için | |
| Çalışma Organizmaları | |||
| Culex tarsalis sivrisinekler | USDA ARS Manhattan'daki Tahıl ve Hayvan Sağlığı Araştırma Merkezi, KS | çalışma konusu olarak kullanılmak üzere |
Kaynaklar
- Becker, N., et al. Medical importance of mosquitoes in Mosquitoes and their control. , 2nd ed, Springer. Los Angeles, CA. 25-42 (2010).
- World Health Organization. Vector-borne diseases. , (2024).
- Woodstream Corporation, Inc. The economic cost of mosquito-borne diseases. AMosquito Magnet. , (2022).
- Bartlow, A. W., et al. Forecasting zoonotic infectious disease response to climate change: Mosquito vectors and a changing environment. Vet Sci. 6 (2), 40(2019).
- Naslund, J., et al. Emerging mosquito-borne viruses linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global status and preventive strategies. Vector Borne Zoonotic Dis. 21 (10), 731-746 (2021).
- Shaw, W. R., Catteruccia, F. Vector biology meets disease control: Using basic research to fight vector-borne diseases. Nat Microbiol. 4 (1), 20-34 (2019).
- Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Negl Trop Dis. 14 (1), e0007831(2020).
- Dusfour, I., et al. Management of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses: Advances and challenges. PLoS Negl Trop Dis. 13 (10), e0007615(2019).
- Choumet, V., et al. Visualizing non infectious and infectious Anopheles gambiae blood feedings in naïve and saliva-immunized mice. PLoS ONE. 7 (12), e50464(2012).
- Backus, E. A., Cervantes, F. A., Guedes, R. N. C., Li, A. Y., Wayadande, A. C. AC-DC electropenetrography for in-depth studies of feeding and oviposition behaviors. Ann Entomol Soc Am. 112 (3), 236-248 (2019).
- Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. Elife. 9, e56829(2020).
- Backus, E. A., Guedes, R. N., Reif, K. E. AC-DC electropenetrography: Fundamentals, controversies, and perspectives for arthropod pest management. Pest Manag Sci. 77 (3), 1132-1149 (2021).
- Gordon, R. M., Lumsden, W. H. R. A study of the behavior of the mouthparts of mosquitoes when taking up blood from living tissue; together with some observations on the ingestion of microfilariae. Ann Trop Med Parasitol. 33, 259-278 (1939).
- Janson, K. D., et al. Development of an automated biomaterial platform to study mosquito feeding behavior. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1103748(2023).
- Henriques-Santos, B. M., Xiong, C., Pietrantonio, P. V. Automated analysis of feeding behaviors of females of the mosquito Aedes aegypti using a modified flyPAD system. Sci Rep. 13, 20188(2023).
- Kashin, P., Wakeley, H. G. An insect 'Bitometer. Nature. 208 (5009), 462-464 (1965).
- Kashin, P. Electronic recording of the mosquito bite. J Insect Physiol. 12, 281-286 (1966).
- Kashin, P. Development of an orally effective insect repellent. IIT Research Institute. , (1967).
- Kashin, P., Arneson, B. E. An automated repellency assay system. II. a new electronic "Bitometer-timer.". J Econ Entomol. 62 (1), 200-205 (1969).
- Shieh, J. -N. Salivation and engorgement parameters of sucking insect vectors: Implications in pathogen transmission. , Oregon State University. (1994).
- Kimsey, R. B. Measuring and recording arthropod blood feeding. History, Development, and Applications of AC Electronic Insect Feeding Monitors. , Entomological Society of America. 122-128 (1994).
- Backus, E. A., Devaney, M. J., Bennett, W. H. Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
- Backus, E. A., Bennett, W. H. The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol. 55 (10), 869-884 (2009).
- Backus, E. A., Cline, A. R., Ellerseick, M. R., Serrano, M. S. Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding on cotton: New methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data. Annals of the Entomological Society of America. 100, 296-310 (2007).
- Ebert, T. A., Backus, E. A., Cid, M., Fereres, A., Rogers, M. E. A new SAS program for behavioral analysis of electrical penetration graph data. Comput Electron Agr. 116, 80-87 (2015).
- Wayadande, A. C., et al. Waveforms from stylet probing of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) measured by AC-DC electropenetrography. J Med Entomol. 57 (2), 353-368 (2020).
- Cooper, A. M. W., et al. An electropenetrography waveform library for the probing and ingestion behaviors of Culex tarsalis on human hands. Insect Sci. 31 (4), 1165-1186 (2024).
- Reif, K. E., Backus, E. A. AC-DC electropenetrography unmasks fine temporal details of feeding behaviors for two tick species on unsedated hosts. Sci Rep. 11 (1), 2040(2021).
- Vaughan, L. D., et al. Electropenetrography as a tool to quantify probing and injection behaviors of mosquitoes (Aedes aegypti) in mice under biocontainment housing. Comp Med. 73 (6), 25(2023).
- Backus, E. A., Shugart, H. Electropenetrography (EPG) Online Workshop. Hosted by L. Diepenbrock at the University of Florida. Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 (2022).
- Dataq Instruments Inc. WinDaq recording and playback software. , (2024).
- Backus, E. A. Our own jabberwocky: clarifying the terminology of certain piercing-sucking behaviors of homopterans. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
- Tjallingii, W. F. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America. 41-69 (2000).
- Mizrahi, J. Advances in Applied Electromyography. , IntechOpen. Rijeka, Croatia. (2011).
Yeniden basım ve izinler
