Yöntem makalesi

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

DOI:

10.3791/66881

⸱

24 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artan kanıtlar, mRNA çevirisinin bir hücre içinde son derece bölmelenmiş bir süreç olduğunu ve belirli mRNA'ların hücre altı taşığı ve lokalizasyonunun, kompartman-spesifik işlevlere sahip proteinlerin ideal ortamda ve uygun miktarlarda üretilmesini sağlamak için anahtar olduğunu göstermektedir. Ancak, bu mRNA'ları çeviren ribozomların hücrealtı izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılan teknikler bugüne kadar sınırlı olduğundan, translasyon mekanizmalarının bileşiminin lokal mRNA çevirisinin düzenlenmesine nasıl katkıda bulunduğu konusunda çok şey bilinmemektedir.

Burada, AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma ile Güçlendirilmiş Biyotinilasyon (ALIBi) yöntemini gösteriyoruz; bu, epitop etiketleme, yeni geliştirilmiş optogenetik olarak aktive edilmiş bölünmüş biotin ligaz ve affinite saflatmasını birleştirerek ilgili herhangi bir subhücresel bölmede lokalize olan ribozomları hızlı ve spesifik olarak etiketleyip izole eden bir yöntemdir. İlk olarak, CRISPR/Cas9 düzenlemesi kullanılarak bir AviTag peptidi, bir tütün etch virüsü (TEV) proteaz bölünme noktası ve bir FLAG epitop etiketi ribozomal proteine birleştirilir. Bölünmüş biotin ligaz, organel-hedefleyici bir domaine birleşmiş, bu hücre hattında ekspresyona ulaşır ve normal biotin konsantrasyonları altında inaktivdir. Ek biotin ve mavi ışık aydınlatmasıyla aktive edildiğinde, ligaz biotinilat hemen çevredeki ribozomları AviTagged ile işaretler; bu da streptavidin kaplı boncuklarda biotinile ribozomların ve ilişkili proteinler ile mRNA'ların affinity saflaştırılmasına olanak tanır. TEV proteaz bölünmesi yoluyla denatüre olmayan elyutasyon, çekirdek ribozomal proteinlerin, ribozom ilişkili proteinlerin ve ribozom bağlı mRNA'ların aşağı akış karakterizasyonu için RNA dizileme veya kütle spektrometrisi proteomiği yoluyla uygun örnekler elde eder.

Bu protokolde, AviTag'in ribozomal proteine birleşmesi ve bölünmüş biotin ligaz enzimini ilgilenilen organellere hedefleme tasarım prensiplerini gözden geçiriyoruz. ALIBi sisteminin aktivasyonunu, hücre lizisini, afinite arındırmasını ve örnek elülasyonunu gösteriyoruz. Son olarak, tipik sonuçlar ve sorun giderme konularını tartışıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre altı organizasyonu ve taşımanın hücresel süreçlere nasıl dahil olduğunu daha iyi incelemek için belirli subhücre bölmelerinden biyolojik örnekleri izole edebilen araçlara önemli ihtiyaç vardır. mRNA çevirisi bu sürecin önemli bir örneğidir: artan kanıtlar çevirinin oldukça bölümlenmiş olduğunu ve özellikle birçok mRNA'nın kodlanmış proteinlerinin bulunduğu organellerdelokalize olduğunu göstermektedir 1,2. Ancak, translasyon makinelerinin hücrealtı lokalizasyonu hakkında daha az bilgi vardır. Ribozomlar, ribozomal proteinlerden (RP'ler) ve ribozomal RNA'lardan (rRNA'lar) oluşan montajın başladığı çekirdek ve çekirdekte varlığına başlar. Daha sonra montajın son aşamaları için sitoplazmaya ihraç edilirler ve ardındanmRNA'lar 3,4'ü çevirmeye başlarlar. Kanonik çeviri siteleri arasında sitoplazma ve endoplazmik retikülüm bulunur; ikincisi, integral membran proteinleri ve zarla bağlı organeller veya ekstrahücre salgısı için tasarlanmış proteinlerinsentezlendiği yerdir 5. Daha yakın zamanda belirlenen lokal translasyon noktaları arasında mitokondri, peroksisom ve nöronalsüreçler 6,7,8,9,10,11,12 bulunmaktadır. İlginç bir şekilde, ribozom ile ilişkili proteinler, translasyon sonrası modifikasyonlar, rRNA modifikasyonları ve çekirdek ribozomal proteinlerin kanonik olmayan stoichiometrysi gibi translasyonel makine özelliklerinin, belirli mRNA'ların ve parametrelerin çevirisini yöneten düzenleyici mekanizmalarda rol aldığına dair kanıtlar ortaya çıkmaktadır; örneğin translasyon sadıklığı vehızı 13,14,15,16,17, 18,19,20. Örneğin, ribozomla etkileşime giren yüzlerce protein tespit edilmiştir ve bu proteinler subhücre ribozom bileşiminde farklılıklara yol açabilir13. Ancak, subhücresel ribozom popülasyonlarını izole etme teknikleri bugüne kadar sınırlı kalmıştır; Bu nedenle, çeviri makinelerinin bileşiminin lokalize mRNA çevirisini düzenlemeye nasıl katkıda bulunduğu hakkında çok şey bilinmemektedir. Özellikle memeli model sistemleriyle uyumlu olanlar, subhücresel ribozom popülasyonlarını izole etmek için çok yönlü yöntemlerin ortaya çıkışı, bu çeviri mekanizması özelliklerinin hücrealtı düzeyde keşfedilmesini mümkün kılacaktır.

Ribozom içeren subhücre fraksiyonlarının izole edilmesinin en erken yöntemleri, ardışık lizis ve santrifüjlemeprensiplerine dayanıyordu 21,22. Genellikle, bu yöntemler belirli organellerle sınırlıdır ve genellikle uzun işlem süreleri gerektirir. Daha yeni bir yöntem, özellikle AviTag peptidsubstratı 10,23,24'ü biyotinile eden biotin ligazı BirA'ya dayanmaktadır. BirA, ribozomların AviTag ile etiketlendiği hücrelerde ilgilenilen organelde genetik olarak lokalize edilebilir. Ancak, BirA, fizyolojik biotin konsantrasyonlarında aktif olduğundan, AviTag içerenribozomların (10,24) oluşturucu ve spesifik olmayan biyotinilasyonunu önlemek için hücrelerin biotin azalma koşullarında kültürlenmesi gereklidir. Bu, biotin tükenmesine duyarlı hücretiplerinde BirA kullanımını sınırlar. Son olarak, BioID, TurboID ve APEX26,27,28 gibi mühendislik enzimleri kullanan promiscuite biotinylasyon yöntemleri geliştirilmiştir. İndüksiyonda, bu enzimler enzimin yarıçapındaki lizin kalıntılarını kovalent olarak değiştiren reaktif bir biotin ara maddesi üretir. Promisküit biyotinilasyon yöntemleri, subhücre proteomlarını haritalamak için son derece faydalıdır, ancak lokalize ribozomların genel çevresindeki proteinleri onlara daha yakın proteinlerden ayırt etmek için daha az bilgilendiricidir.

Burada, subhücre ribozom popülasyonlarını etiketlemek ve izole etmek için geliştirdiğimiz AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma-Güçlendirilmiş Biyotinilasyon (ALIBi) yöntemimizi gösteriyoruz. Bu yöntem, mavi ışık aydınlatması altında heterodimerize olan optogenetik geliştirilmiş Mıknatıs (eMag) anahtarlarına (Şekil 1A) entegre edilmiş mühendislik yapımı bölünmüş BirA'yıkullanır 29; ve FLAG epitopu, tütün etch virüsü (TEV) proteaz bölünme bölgesi ve AviTag (FTA) ile Rpl31 ribozomal proteinine birleşen bir peptid etiketi (Şekil 1B). Bölünmüş enzim, genetik olarak seçilmiş organellere hedeflenebilir, fizyolojik biotin konsantrasyonlarında inaktif olur ve mavi ışık ışığı ile ek biotin eklenmesiyle dakikalar içinde yeniden oluşturulabilir (Şekil 1C-E). Sonraki hücre lizisi, afinite arındırması ve TEV proteaz parçalanması yoluyla denatüre etmeyecek enzimatik elülasyonu, ribozomlar ve mRNA'lar ve ribozom ile ilişkili proteinler gibi ortak arındırıcı moleküller elde eder; bunlar RNA dizileme ve kütle spektrometrisi proteomikleri gibi sonraki analitik yöntemler için uygundur (Şekil 1A). Bu nedenle, bu yöntem sadece ribozom bileşimini değil, ribozomların bağlı olduğu mRNA'ları da ortaya koyar. ALIBi'nin subhücresel ribozom popülasyonlarını karakterize etmek için temel uygulamasını anlatan yakın tarihli bir makalede, bölünmüş enzimi sitoplazma, nükleolus, çekirdek, endoplazmik retikulum, plazma zarı ve mitokondrilere başarıyla hedefledik (Tablo 1)30. Bu subhücresel bölümler arasındaki translasyon mekanizmalarının karşılaştırılması, endoplazmik retikulum ve mitokondride translasyonla ilgili yeni ve beklenmedik bulgulara yol açtı ve çekirdekteki ribozom biyogenezi faktörlerinin gelecekteki araştırmaları için potansiyel ipuçları sağladı.

Bu protokol, ALIBi sisteminin transfeksiyonu ve aktivasyonu, hücre lizisi, affinite arındırması ve örnek elütsiyonunun ayrıntılı bir gösterimini içerir. Ayrıca, western blot ile başarılı affinite arındırmasının nasıl doğrulanacağını tartışıyor ve aşağı akış RNA dizileme veya kütle spektrometrisi (MS) proteomik analizi için önerilerde bulunuyoruz ( bkz. Ek Dosya 1). Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC) eksprese edildiği deneyler için tasarlanmıştır; bu hücreler endogen Rpl31 lokusundan FTA (L31-FTA) ile homozij olarak birleşmiştir; Bu hücre hattı yazarlardan talep üzerine temin edilebilir. Bu hücre hattının oluşturulması stratejisi, Ek Dosya 1'de ve Ek Şekil S1 ile Ek Şekil S2'de açıklanmıştır. Birkaç organele yönelik bölünmüş enzimleri kodlayan plazmidler Addgene'de mevcuttur (katalog numaraları #235608 235643'a kadar). Bu organellere bölünmüş enzimleri hedefleme tasarım prensipleri Ek Dosya 1'de açıklanmıştır. Protokol, her örneğin 10 cm bir plakada yetiştirilen mESC'lerden geldiğini varsayar. 10 cm ölçeğinin kütle spektrometrisi proteomiği için yeterli materyal sağladığını, 6 kuyu ölçeğinin ise western blotlar veya RNA dizileme için yeterli olduğunu bulduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. mESC hücre kültürü

NOT: ALIBi aktivasyonu ve hücre lizisinden önce, mESC'ler hücre kültürü için standart steril teknikle işlenmelidir. Sağlam mESC'lerin santrifüjlenmesi, aksi belirtilmedikçe 200 × g boyunca oda sıcaklığında 3 dakika boyunca yapılmalıdır. Başka belirtilmedikçe kullanımdan önce su banyosunda ortamı 37 °C'ye kadar ısıtın. mESC'ler, gece boyunca jelatinize edilmiş yeni bir doku kültür plakasına geçirilmelidir (bkz. adım 1.1).

  1. Çözülmeden bir gün önce, 10 cm'lik bir plakanın altını %0,1 jelatin 5 mL ile kaplayın. Gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
  2. mESC medya bileşenlerini birleştirin (Tablo 2) ve 0.2 μm filtreden geçirin. 4 °C'de 1 aya kadar saklayabilirsiniz.
  3. Erime gününde, erimiş hücreleri seyreltmek için 5 mL alikot ve kaplama için 10 mL aliquot ısıtın.
  4. Sıvı azot depolamasından ~5 × 106 L31-FTA mESC içeren bir kriyovial alın. Hemen şişenin tabanını 37 °C'lik su banyosunda döndürerek çözebilirsiniz.
  5. 5 mL aliquot'tan 0,5–1 mL medya sıvısını şişe kapasitesinin izin verdiği ölçüde kriyovial içerikle nazikçe karıştırın, ardından kriyovial içeriği 5 mL medya aliquot'a geri aktarın.
  6. Hücreleri santrifüjle pellet edin. Üst natantı aspire edin.
  7. Hücre pelletini 10 mL media aliquot ile yeniden askıya alın.
  8. 10 cm plakadan jelatini aspire edin ve hücre süspansiyonunu hemen plakaya aktarın. 37 °C'de kuluçka yapın.
  9. Her 24 saatte bir (geçiş günleri hariç) plakadan eski ortamı aspire edin ve yerine 10 ml yeni ortam verin.
  10. Koloniler %70–%80 birleştiğinde (genellikle kaplamadan 48 saat sonra), eski ortamı aspire edin ve 10 mL Dulbecco'nun fosfatla tamponlanmış tuzlu sonu (DPBS) ile iki kez durulayın.
  11. DPBS aspirasyonundan sonra plakayı %0,05 tripsin içeren 2 mL ile kaplayın (Tablo 2). 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
  12. Tripsini 4 mL soğuk mESC ortamı ekleyerek nötralize edin. Hemen 5 veya 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak plakada 15 kez yukarı ve aşağı pipet ile kolonileri tek hücreli bir süspansiyona ayırın.
  13. Süspansiyonu konik bir tüpe aktarın. İstek üzerine olarak, hücreleri saymak için bir aliquot çıkarabilirsiniz ve hemositometre kullanabilirsiniz.
  14. Hücreleri santrifüjle pellet edin. Üst natantı aspire edin.
  15. Hücre pelletini taze ortamda yeniden askıya alın. Plaka 5 × 106hücre (genellikle 1:6 geçiş oranı) taze jelatinize 10 cm bir plakada 37 °C'de kuluçka yapın. Transfeksiyona hazır olana kadar 1.9–1.15 numaralı adımları gerektiği gibi tekrarlayın.
  16. Donmuş hücre stokları yapmak için, mESC plakasını tripsine edin (1.10–1.14. adımlarda olduğu gibi). Hücre pelletini dondurma ortamında (5 × 10-6 hücre başına 250–500 μL) yeniden askıya alın, kriyoviallere alın ve hücre dondurma kabında -80 °C'de gece boyunca yavaşça dondurulmadan sonra sıvı azot deposuna aktarılır.

2. Transfeksiyon

NOT: transfeksiyonu mESC'lerin geçişe hazır olduğu bir günde yapın. Plazmidler, transfeksiyondan 3-5 saat sonra ekspresyona başlayabilir. İfade edildikten sonra, hücreleri karanlıkta tutmayı ve erken aktivasyonu önlemek için 37 °C'nin altındaki sıcaklıklara maruz kalmayı en aza indirmeyi öneririz; çünkü önceki çalışmalar Magnet optogenetik domainlerinin sadece mavi ışık altında değil, soğuk31'e maruz kaldığında da dimerleştiğini göstermiştir. Plakaları özel bir kuluçka makinesinde tutun veya ortak kuluçka makinesinde bir rafı alüminyum folyo ile ışıktan koruyun. İnkübatör dışındaki hücrelerle çalışırken, önceden tüm oda ışıklarını ve pencerelerini kapatın veya kapatın, kırmızı ışıklı bir farı kullanarak görebilirsiniz. İnkubator kapısını gereğinden fazla açık bırakmayın. Bir seferde inkubatörden sadece küçük parti plaka çıkarın ve işlem sırasında oda sıcaklığındaki çalışma yüzeyleriyle teması en aza indirmek için plakaları yalıtımlı bir yüzeye (örneğin, temiz bir strafor kutu kapağına) dinlendirin. Kullanımdan önce ortamı tamamen ısıtın. Plakaları ışık yayan bir mikroskop altında incelemeyin.

  1. Transfeksiyondan bir gün önce, 10 cm bir plakayı jelatinleştirin.
  2. Transfeksiyon gününde, plakadan jelatin aspirasyonu yapın ve 37 °C'de önceden ısıtmak için 7,5 mL madde ekleyin. Hücreleri yeniden süspansiyon için 37 °C'de azaltılmış serum ortamını önceden ısıtın.
  3. Transfeksiyon reaktifinden 18,75 μL indirgenişlemli serum ortamında 250 μL seyreltin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırmak için hafifçe dokunun.
  4. N- ve C-fragmentlerini kodlayan iki plazmid birlikte eksprese edilirse, her plazmidi 3,75 μg indirgenişlemli serum ortamına 250 μL ekleyin. Sadece bir plazmid (örneğin, GFP negatif kontrol veya tam uzunlukta BirA pozitif kontrol) ifade ediliyorsa, tek plazmid 7,5 μg eklenir.
  5. Plazmid/indirgenmiş serum ortam karışımını transfeksiyon reaktiv/indirgenmiş serum ortam karışımına ekleyin ve karıştırmak için musluk/ters çevirin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın.
  6. Bu arada, tripsinasyon ve pellet mESC'ler (adımlar 1.10–1.14) alın. Pelleti ısıtılmış indirgenmiş serum ortamında 10 ×10 6 hücre/mL konsantrasyonuna yeniden süzülür.
  7. Plazmid/transfeksiyon reaktifi/indirgenceli serum ortamı karışımına 7,5 × 106 (750 μL) yeniden süzülmüş hücre ekleyin. Tüpü karıştırmak için ters çevirin. RT'de 10 dakika kuluçka yapın, tüpleri ara sıra ters çevirerek hücreleri askıda tutun.
  8. Tüpleri tekrar kısa bir süreliğine ters çevirin ve ısıtılmış ortam içeren plakaya mESC/plazmid/transfeksiyon reaktifi/indirgenmiş serum ortamı karışımını ekleyin. Hücrelerin eşit şekilde dağıtılması için plakayı hafifçe sallayın.
  9. Plakayı 37 °C'de 3–5 saat boyunca kuluçka edin, böylece hücreler bu süre içinde yapışabilir.
    NOT: Bu noktadan itibaren, ışığa maruz kalmaya ve 37 °C'nin altındaki sıcaklıklara karşı yukarıdaki önlemleri gözlemlemenizi öneririz.
  10. Eski medyayı nazikçe aspire edin. Taze ısıtılmış ortam ekleyin, hücrelerin yerinden çıkmasını önlemek için plakanın kenarından pipet yapın. 37 °C'de kuluçkaya devam edin.
  11. Transfeksiyondan 24 saat sonra aktive oluyor/lizleştiriyorsa, 3. bölüme geçin. Transfeksiyondan 48 saat sonra aktive etmeyi/liz yapmayı planlıyorsanız, transfeksiyon edilen hücreleri kaplamadan sonra ~24 saat içinde ortamı değiştirin.

3. ALIBi aktivasyonu ve hücre lizisi

NOT: Hücre/örnekleri karanlıkta işlemeye devam edin (adım 5.4) elüsyonun başlangıcına kadar. Hücreler buz üzerinde soğutulduktan sonra (adım 3.15), örnekleri soğuk tutun ve elülasyon başlayana kadar sadece soğutma reaktifleri kullanın. Çalışma yüzeylerinin, ekipmanlarının, reaktiflerin ve plastiklerin RNAse içermediğinden emin olun; yeni açılmış ürünler kullanarak sert yüzeyleri RNA dezinasyon çözeltisi ve %70 etanol ile silip durulayın. Numune veya ekipman ele alırken eldiven takın. MS proteomik için hazırlanan örneklerde, çalışma alanını tozsuz tutarak keratin kontaminasyonunu da en aza indirmek; Çıplak cildi kapat ve uzun saçları geriye bağla.

  1. Santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun.
  2. Işıklar kapalıyken, transfekte edilen plakaları geçici 37 °C kuluçka makinesine taşıyın ki transilaydınatör yerleştirildikten sonra ana kuluçka makinesinde sıcaklık dalgalanmasına maruz kalmasınlar.
  3. Mavi ışık geçiricisini %70 etanol ile silin ve elektriğe bağlayın. Transilluminatörü ana kuluçka makinesine yerleştirin ve kuruluma devam ederken kuluçka koşullarının yeniden dengelenmesine izin verin.
  4. Biotin ve sikloheksimid (CHX) ile dozlanacak bir madde aliquotunu 37 °C'ye ısıtın. Kontrol örnekleri takviye biotin içermeyen bir alkot da ısıtın; ayrıca sadece CHX ile dozlanacak ayrı bir aliquot da ısıtın.
    NOT: Bazı tampon bileşenleri kullanımdan bir gün önce karıştırılabilir ve gece boyunca 4 °C'de saklanabilir ( bkz. Tablo 2). Western blot veya MS proteomikleri için ve RNA dizileme için deneyler için farklı lizis ve yıkama tampon tarifleri kullanılmıştır.
  5. Bir aliquot DPBS ile CHX (10 cm plaka başına 20 mL) doz verilmesini soğutun.
  6. RNA çıkarma tamponu, tuz yıkama, lizis tamponu ve yıkama tamponlarını hazırlayın ( bkz. Tablo 2). Gliserol ve Triton X-100 gibi yoğun/viskoz bileşenlere sahip tamponlar için, eşit karışmayı sağlamak için tamamlanmış tamponu pipet edin. Kullanmadan önce tamponları buz üzerinde soğutun.
    NOT: Boncuk yıkama adımları için, mevcut tamponunda boncukların bulunduğu tüpü kısa bir süreliğine bir cep santrifüjünde döndürerek içeriği alt kısımdan toplayın. Tüpü manyetik bir rafa 1 dakika veya boncuklar tamamen hareket edene kadar koyun. Boncuk pelletine dokunmadan süpernatantı aspire edin. Boncuk pelleti kurumadan bir sonraki tamponu ekleyin. Boncuk pelletini yeniden askıya almak için, ya nazikçe pipet yapın ya da kapalı tüpü manyetik rafa karşı tutarken parmaklarınız arasında yuvarlanın; böylece boncuklar mıknatıs tarafından hızla birden fazla yöne çekilir. Son olarak, tüpün iç duvarlarının yıkandığından emin olmak için yeniden askılanan boncukları birkaç kez ters çevirin.
  7. Streptavidin boncuklarının stok şişesini nazikçe pipetleme veya sallayarak tekrar askıya alın. Her 10 cm mESC plakası için 450 μL boncuk, protein düşük bağlanma tüpüne aktarın.
  8. Yukarıdaki boncuk yıkama notunu takip ederek, boncuk depolama tamponunu atın ve boncukları 2 kez 900 μL RNA çıkarma tamponuyla yıkın.
    NOT: Gecikmeden bir sonraki adıma geçin; RNA çıkarma tamponunda uzun süre süre bacakların bağlanma kapasitesini azaltabilir.
  9. Boncukları 900 μL tuz yıkama ile 1 kez yıkayın.
  10. Boncukları 2 kez 900 μL Wash I Buffer ile yıkamak. Wash I tamponunun ikinci turunda boncukları tekrar askıya alındıktan sonra, boncukları Wash I tamponunda 4 °C'de saklayıp aktivasyon ve hücre lizisi yapılın.
  11. Isıtılmış alikot(lar)a uygun şekilde biotin (50 μM nihai konsantrasyon; 50 mM stokun 1:1.000 seyreltilmesi) ve CHX (100 μg/mL nihai konsantrasyon; 100 mg/mL stokunun 1:1.000 seyreltilmesi) eklenir. Kullanıma kadar 37 °C'de kalın.
  12. DPBS'nin soğuk aliquotuna CHX (100 μg/mL nihai konsantrasyon; 100 mg/mL stokun 1:1.000 seyreltilmesi) ekleyin ve kullanıma kadar soğutulmuş tutun.
    NOT: Aşağıdaki iki adım, ek biotin ve mavi ışık aydınlatması ile ALIBi'nin aktivasyonunu tanımlar. İdeal aktivasyon süresi, aşağı akış testleri için yeterli miktarda ribozom biyotinilasyonu elde edecek kadar uzundur, ancak uzaylı-zamansal çözünürlüğü koruyacak kadar kısadır. İdeal aktivasyon süresi, hücre tipi, deneyin ölçeği, bölünmüş enzimlerin ifade seviyesi, ilgilenilen organel yakınındaki ribozom bolluğu ve analiz tekniğinin hassasiyeti gibi parametrelere bağlı olarak değişebilir. Başlangıç noktası olarak 15 dakikayı öneriyoruz; bu, temsilci sonuçlarımızda (Şekil 2) ve eşlik edençalışmamızda kullanılan aktivasyon süresi 30.
  13. Transfeksiyon edilen plakalardan aspirasyon ortamı kullanın. Hemen her plaka başına CHX ± biotin içeren sıcak ortamdan 10 mL ekleyin.
  14. Negatif kontrol plakalarının aydınlanmaması için, onları koyu bir kuluçka makinesine yerleştirin. Plakaların aydınlatılması için onları doğrudan transilluminatörün üzerine yerleştirin, transilütülatörü açın ve 15 dakika kuluçka yapın.
  15. Aydınlatma tamamlandığında, plakaları hemen 2 kez 10 mL soğuk DPBS + CHX ile her plaka için yıkayın. Tabakları yıkama arasına ve sonrasına buzun üzerine koyun. İkinci yıkamayı aspire ettikten sonra, plakayı eğin ve kalan DPBS'yi aspire edin.
  16. Her plakayı buzun üzerinde mümkün olduğunca düz tutarak, 2 mL buz soğuğu lizis tamponu ekleyerek lizise işlemi gerçekleştirin. Plakayı buz üzerinde 5 dakika kuluçka edin, bu süre içinde hücreleri 2–3 kez çıkarmak için plakaya dokunun.
    NOT: Folyo altında ve buz üzerinde koyu tutulursa, plakalar hücre kültürü alanından başka bir karanlık alana taşınabilir.
  17. Kalan hücreleri mikropipet kullanarak lizatı plaka yüzeyinde yukarı aşağı ve yukarı pipet ederek kabarcık oluşumunu önleyerek yerinden çıkarın, ardından lizat soğutulmuş ve etiketlenmiş protein düşük bağlanma tüpüne aktarılır.
    NOT: ISTEĞE BAĞLI: Çekirdek ve nükleolus gibi zor lizlesi zor organeller için sonikasyon yardımcı olabilir.
  18. Zor lizize edilen organeller durumunda, deneydeki tüm örnekler 45 saniye boyunca 4 °C'de (güç ayarı 3 watt) soniklenin. Sonikatör tasarımı açık bir örnek tüpüne bir probun yerleştirilmesini gerektiriyorsa, lizat ilk olarak plakadan daha büyük bir tüpe aktarılır ki sonikasyon sırasında taşması önlenir; sonra 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
  19. Lizatı buzda 15 dakika kuluçka yapın.
  20. Lizat 17.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı (arındırılmış lizat) hücre kalıntısının peletini bozmadan soğutulan, düşük bağlanan bir protein tüpüne aktarın.
    NOT: Eğer RNA-dizili analizi amaçlanıyorsa, açıklanmış lizatın bir aliquotu artık toplam RNA fraksiyonu olarak toplanabilir ( ayrıntılar için Ek Dosya 1, "RNA dizileme için öneriler" adım 1.1'e bakınız).
    NOT: Eğer hücre miktarları, transfeksiyon/kültür koşulları ve lizin koşulları tüm örnekler için birer ise, genellikle lizat konsantrasyonlarının örnekler arasında karşılaştırılabilir olduğunu varsayır ve toplam protein konsantrasyonunu niceliklendirmeden devam ederiz. Bu, aktivasyon ile affinite arındırması arasındaki geçen süreyi en aza indirir.

4. Affinite arındırması

  1. Yıkanmış streptavidin boncuklarını manyetik raf kullanarak pellet yapın. Wash I tamponu aspire edin.
  2. 1.200 μL arındırılmış lizat yıkanmış boncukları içeren tüpe aktarın. Boncukları nazikçe tekrar asmak için pipet yapın. Geriye kalan lizat -80 °C'de saklanmalıdır.
  3. Lizatı boncuklarla 4 °C sıcaklıkta, karanlıkta tüp rotatorunda 1 saat boyunca inkubka edin.
  4. Bu kuluçka sırasında TEV ülüsyon tamponunu hazırlayın (Tablo 2).

5. Elution

  1. Boncuk yıkama notları 3'teki uyarınca, boncukları manyetik bir rafa pellet edin ve süpernatantı soğutulmuş protein düşük bağlayıcı tüpe aktarın. Süpernatantı -80 °C'de sakla.
  2. Boncukları 2 kez 900 μL Wash I tampon ile kullanın.
  3. Wash boncukları 1 kez 900 μL Wash II tampon ile kullanın.
    NOT: Bu adım tamamlandıktan sonra, örneklerin karanlıkta işlenmesine gerek kalmaz.
  4. Boncuklara 450 μL TEV elusyon tamponu ekleyin.
  5. Boncukları TEV elution tamponunda tüp rotatorunda oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edin. Düşük hacimli TEV elusyon tamponu kullanılarak yapılan daha küçük ölçekli deneyler için, tüpler 1.000–2.000 rpm'de bir shaker üzerinde inkubasyon edilir.
  6. Boncukları manyetik rafa pellet et. Elüatı protein düşük bağlanma tüpüne aktarın. Proteomik analizi veya western blot amaçlıysa, eluatı -80 °C'de sakla. Eğer RNA-dizili analizi amaçlanıyorsa, depolama talimatları için Ek Dosya 1 "RNA dizileme için öneriler" adımı 1.2'ye bakınız.
  7. ISTEĞE BAĞLI: Afinite saflaştırmasının kayda değer rRNA/mRNA verip vermediğini önceden belirlemek için (ribozomların izole edildiğini gösterir), TEV elution tamponu boşluk olarak kullanılan mikrohacimli spektrofotometrede elüatları analiz edin.
    NOT: Aktive sistemi içeren hücrelerden çıkan elyutlar, bölünmüş enzimler, mavi ışık/biotin veya L31-FTA içermeyen hücrelerden gelen elyutlara göre 260 nm'de daha fazla elübat sahibi olmalıdır.

6. Western Blot

NOT: Laemmli tamponu içinde lizat ve akış örnekleri denatüre olunana kadar, ışığa maruz kalmaktan kaçınmaya devam etmemizi öneririz. Precast jeller, ticari olarak mevcut transfer tamponu ve çalışan tampon ile yarı kuru transfer sistemi kullanıyoruz (bkz. Malzemeler Tablosu). SDS-PAGE ve western blot, aşağıda aksi belirtilmedikçe, üreticilerin bu bileşenler için verdiği talimatlara göre yapılır.

  1. Lizata 6x Laemmli tamponu ekleyin, akış ve/veya 1x Laemmli tamponu nihai konsantrasyona örnekler için elüat yapın. 95 °C'de bir ısı bloğunda veya termosiklinde 10 dakika ısıtın. Tüp kapağı/duvarlarında yoğuşma oluşursa, tüpleri kısa süreliğine aşağı döndürün.
  2. Tank üreticisinin talimatlarına göre jel tankında koşan tamponlu bir jel kur. Örnekleri ve merdiveni yükleyin.
  3. Jeli 125 V'da 45–75 dakika boyunca çalıştırın, ta ki boya ön kısmı jelin altına yaklaşana kadar. Bu arada, PBST ve bloklama tamponlarını hazırlayın (Tablo 2).
  4. Transfer sistemi üreticisinin talimatlarına göre yarı kuru transfer yapın.
    NOT: Tüm zar yıkama/kuluçka aşamalarında, zarın tamamen suya battığından emin olun ve membran tepsisini orbital veya eğik bir sallayıcıya yerleştirin. 10 x 15 cm bir tepsi için bu 25–50 mL tampon gerektirir.
  5. Membranı transfer yığınından çıkarın ve zarın kurumamasını sağlamak için hemen bir sonraki adıma geçin.
    NOT: İSTEĞE BAĞLI: Zardaki kuru noktalar, özellikle streptavidin-yaban peroksidaz gibi kısa kuluçka aşamalı problarda düzensiz tıkama veya sonda bağlanmasına yol açabilir. Bu sorunu önlemek için, nakil sonrası membranları %100 metanolde 30 saniye tekrar ıslatıyoruz, ardından 5 dakika suda koyuyoruz. Bu ölçüm, transferden sonra kurumuş PVDF zarlarının yeniden ıslanması için genelönerilere benzer; 32,33.
  6. Zarı oda sıcaklığında 3 x 10 dakika boyunca PBST'de yıkayın.
  7. Her western blot probu için Tablo 3'te belirtilen koşullara uygun olarak, bloklama, yıkama, prob kuluçka ve ikincil antikor kuluçkalarını gerçekleştirin.
  8. 6.7. adımdaki son yıkamadan sonra, üreticinin talimatlarına göre ECL substrat bileşenlerini karıştırın ve zarı eşit şekilde kaplayın. Görüntüyü kemilyünesans jel görüntüleme sistemiyle yakalayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western Blot (protokol bölüm 6), bir deneyin başarısını ön değerlendirmenin en uygun yoludur. Zarlar streptavidin-HRP ile prodentlendiğinde, sistemin tüm bileşenlerinin bulunduğu hücrelerden alınan lizat, biyotinillenmiş L31-FTA'ya karşılık gelen bir bant içermelidir (Şekil 2A, şerit 20). Hücreler tam uzunlukta BirA ile pozitif kontrol olarak transfekte edilmişse, aynı bant genellikle daha yüksek yoğunlukta bulunmalıdır (Şekil 2A

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALIBi, subhücre çevirisi çalışmak için mevcut tekniklere kıyasla çeşitli avantajlar sunar ve ribozom biyolojisi ile ötesinde potansiyel gelecekteki uygulamalara sahiptir. Bu protokol, ardışık lizis ve santrifüjleme21,22 ile karşılaştırıldığında benzer veya daha az zaman gerektirir ve yerel peptid dizisiyle genetik olarak hedeflenebilen herhangi bir subhücre bölmesine potansiyel olarak uygulanabilir. Aktif olarak aktif

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Barna Laboratuvarı üyelerine faydalı tartışmalar için teşekkür ediyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
-80 °C depolamaHücre kültürü için
Su içindeki %0,1 jelatinMilliporeSigmaES-006-BHücre kültürü için
0,2 µm filtre üniteleriFisher04-977-158Hücre kültürü için
%0,5 tripsin-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054Hücre kültürü için
1 M MgCl2ThermoFisherAM9010Lizis ve afinite saflaştırması için
1 M Tris pH 7.5ThermoFisher15567027Lizis ve afinite saflaştırması için
1 M Tris pH 8ThermoFisherAM9855GOpsiyonel: FTA'yı endojen ribozomal protein lokusuna eklemek için
1,5 ve 2 mL mikroksantrifüj tüpleri, otoklavlanmışTransfeksiyon için
1,5, 2 mL ve 5 mL protein düşük bağlanma mikroksantrifüj tüpleriEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		Lizis ve afinite saflaştırması için
10 cm doku kültürü plakalarıHücre kültürü için
10 M NaOHMilliporeSigma72068-100MLLizis ve afinite saflaştırması için
10x Tris/glisin/SDS çalışma tamponu konsantresiBio-Rad1610772Western blot için
37 °C doku kültürü inkübatörü x 2Hücre kültürü için. Bunlardan biri, hücre kültürü için ana inkübatör ve transfekte edilmiş hücrelerin aydınlatılması için kullanılır. ALIBi aktivasyonu günü, transilüminatörü ana inkübatörde kurarken, ikinci inkübatörde transfekte edilmiş hücrelerin konaklanması için geçici alan gerekir.
37 °C su banyosuHücre kültürü için
5 M NaClThermoFisherAM9010Lizis ve afinite saflaştırması için
50 mM biotinThermoFisherB20656Lizis ve afinite saflaştırması için
6x Laemmli tamponuFIsher50-196-784Western blot için
70% etanolDezenfeksiyon için
AsetonitrilFisherA955Opsiyonel: kütle spektrometrisi numune hazırlığı için
AcTEV proteaz kitiThermoFisher12575015Lizis ve afinite saflaştırması için
ALIBi C-parçacık plazmitiAddgene#235615, 235636 – 235641Transfeksiyon için midi-prep ölçeği gereklidir
ALIBi N-parçacık plazmitiAddgene#235614, 235635, 235642, 235643Transfeksiyon için midi-prep ölçeği gereklidir
Alüminyum folyoLizis ve afinite saflaştırması için
amonyum bikarbonatMilliporeSigma5.3305Opsiyonel: kütle spektrometrisi numune hazırlığı için
anti-FLAG antikoruMilliporeSigmaF3165Western blot için
anti-GAPDH antikoruCell Signaling5174Western blot için
anti-fare ikincil antikoruGE HealthcareNA931VWestern blot için
anti-tavşan ikincil antikoruGE HealthcareNA934VWestern blot için
anti-Rpl12 antikoruAbcamab175219Western blot için
anti-Rpl31 antikoruAbcamab103991Western blot için
anti-Rpl5 antikoruProteinTech15430-1-APWestern blot için
anti-V5 antikoruThermoFisherR960-25Western blot için
ApyraseNEBM0398LLizis ve afinite saflaştırması için
Beta-merkaptoetanol (55 mM)ThermoFisher21985-023Hücre kültürü için
Mavi ışık transilüminatörClare Research ChemicalDR46B (küçük) veya DR196 (büyük)Lizis ve afinite saflaştırması için
Bovin serum albümini (BSA)FisherBP1600-100Western blot için
C18 uçları (OMIX C18 uçları)AgilentA57003100Opsiyonel: kütle spektrometrisi numune hazırlığı için
Hücre dondurma kabıHücre kültürü için
15 mL ve/veya 50 mL konik tüpler için uygun santrifüjHücre kültürü için
1,5-2 mL mikroksantrifüj tüpleri için santrifüjLizis ve afinite saflaştırması için. 4 C'ye kadar soğutma ve 17.000 g'ye kadar hızlara sahip olmalıdır. Tercihen, tüpleri içeri ve dışarı taşırken geçici olarak karartılabilen bir odada bulunmalıdır.
Clarity ECL kitiBio-Rad170-5061Western blot için
Criterion jel tankıBio-Rad1656001Western blot için
Criterion TGX ön şekilli jeller, %4-20Bio-Rad5671095Western blot için. Ekstra kuyu boyutları ve düzenleri mevcuttur
SikloheksimidMilliporeSigmaC7698-5GLizis ve afinite saflaştırması için
DeoksikolatMilliporeSigmaS1827Lizis ve afinite saflaştırması için
DitiotreitolThermoFisherPIA392

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.
  2. Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.
  3. Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.
  4. Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.
  5. Aviram N, Schuldiner M. Targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum at a glance. J Cell Sci. 2017;130(24):4079-85.
  6. Dahan N, et al. Peroxisome function relies on organelle-associated mRNA translation. Sci Adv. 2022;8(2):eabk2141.
  7. Koppers M, et al. Receptor-specific interactome as a hub for rapid cue-induced selective translation in axons. Elife. 2019;8:e48718.
  8. Hafner AS, et al. Local protein synthesis is a ubiquitous feature of neuronal pre- and postsynaptic compartments. Science. 2019;364(6441):eaau3644.
  9. Biever A, et al. Monosomes actively translate synaptic mRNAs in neuronal processes. Science. 2020;367(6477):eaay4991.
  10. Williams CC, Jan CH, Weissman JS. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):748-51.
  11. Lesnik C, et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria. Nat Commun. 2014;5:5711.
  12. Gold VA, Chroscicki P, Bragoszewski P, Chacinska A. Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep. 2017;18(10):1786-800.
  13. Simsek D, et al. The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell. 2017;169(6):1051-65.e18.
  14. Kondrashov N, et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 2011;145(3):383-97.
  15. Shi Z, et al. Heterogeneous ribosomes preferentially translate distinct subpools of mRNAs genome-wide. Mol Cell. 2017;67(1):71-83.e7.
  16. Genuth NR, et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.
  17. Li H, et al. A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility. Nature. 2022;612(7941):725-31.
  18. Milenkovic I, et al. Dynamic interplay between RPL3- and RPL3L-containing ribosomes modulates mitochondrial activity in the mammalian heart. Nucleic Acids Res. 2023;51(11):5301-24.
  19. Sloan KE, et al. Tuning the ribosome: the influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017;14(9):1138-52.
  20. Simsek D, Barna M. An emerging role for the ribosome as a nexus for post-translational modifications. Curr Opin Cell Biol. 2017;45:92-101.
  21. Baghirova S, Hughes BG, Hendzel MJ, Schulz R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2015;2:440-5.
  22. Jagannathan S, Nwosu C, Nicchitta CV. Analyzing mRNA localization to the endoplasmic reticulum via cell fractionation. Methods Mol Biol. 2011;714:301-21.
  23. Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171-84.
  24. Jan CH, Williams CC, Weissman JS. Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):1257521.
  25. Dakshinamurti K, Chalifour L, Bhullar RP. Requirement for biotin and the function of biotin in cells in culture. Ann N Y Acad Sci. 1985;447:38-55.
  26. Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012;196(6):801-10.
  27. Branon TC, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-7.
  28. Rhee HW, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 2013;339(6125):1328-31.
  29. Benedetti L, et al. Optimized Vivid-derived Magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife. 2020;9:e63230.
  30. Zhang Z, et al. A subcellular map of translational machinery composition and regulation at the single-molecule level. Science. 2025;387(6738):eadn2623.
  31. Weinberg BH, et al. High-performance chemical- and light-inducible recombinases in mammalian cells and mice. Nat Commun. 2019;10(1):4845.
  32. Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1-10.8.11.
  33. Gravel P. Protein blotting by the semidry method. In: Walker JM, editor. The protein protocols handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 321-34.
  34. Kirkeby S, Moe D, Bog-Hansen TC, Van Noorden CJ. Biotin carboxylases in mitochondria and the cytosol from skeletal and cardiac muscle as detected by avidin binding. Histochemistry. 1993;100(6):415-21.
  35. Chandler CS, Ballard FJ. Multiple biotin-containing proteins in 3T3-L1 cells. Biochem J. 1986;237(1):123-30.
  36. Jaaro H, Rubinfeld H, Hanoch T, Seger R. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3742-7.
  37. Dang CV, Lee WM. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol. 1988;8(10):4048-54.
  38. Snaar S, et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol. 2000;151(3):653-62.
  39. Shibata Y, et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2008;283(27):18892-904.
  40. Palmer AE, et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 2006;13(5):521-30.
  41. Seth RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF3. Cell. 2005;122(5):669-82.
  42. Collins JC, et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2. J Biol Chem. 1988;263(23):11280-3.
  43. Moskowitz M, Cheng DK, Moscatello DK, Otsuka H. Growth stimulation of BHK cells in culture by free biotin in serum. J Natl Cancer Inst. 1980;64(3):539-44.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BiyolojiSay 233Say 233Bu Ay JoVE deSay

İlgili makaleler