Yöntem makalesi

Keçi Bağırsağı Ters Çevrilmiş Kesecikler Kullanılarak Histidinin Membran Taşınımının Gösterilmesi: Lisans Öğrencileri İçin Deneyimsel Bir Pedagojik Araç

DOI:

10.3791/66882

⸱

4 Ekim 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Sri Venkateswara College, University of Delhi

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir keçi bağırsağında histidinin membran taşınmasını gösteren ucuz ve tekrarlanabilir bir yöntem sunulmaktadır. Bu işlem, enterosit zarı boyunca sodyum gradyanı tarafından sağlanan histidin ve sodyum iyonlarının birlikte taşınmasıyla gerçekleşir. Bu yöntem, biyolojik zarlar boyunca çözünen madde hareketini daha iyi anlamak için deneyimsel öğrenme pedagojisinden yararlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histidin, aynı zamanda bağışıklık sistemi, pulmoner ventilasyon ve vasküler dolaşımda rol oynayan metabolitlerin öncüsü olan esansiyel bir amino asittir. Diyetteki histidinin emilimi, büyük ölçüde, enterositin apikal zarında bulunan Geniş nötr amino asit taşıyıcısı(B0AT) tarafından sodyuma bağlı nötr amino asit taşınmasına dayanır. Burada, histidinin bağırsak villus enterositleri tarafından lümenden emilimini keçi jejunal inverted keseleri kullanarak gösteriyoruz. Değişen konsantrasyonlarda sodyum ve histidine maruz kalan jejunal keseler, zamanın bir fonksiyonu olarak keselerin içindeki histidin konsantrasyonunu belirlemek için test edildi. Sonuçlar aktif histidin emilimini göstermektedir. Tuz konsantrasyonunun arttırılması, histidinin daha yüksek emilimine neden oldu, bu da keçi bağırsağı ters çevrilmiş keselerinde sodyum ve histidin emiliminin bir sempatik olduğunu düşündürdü. Bu protokol, amino asitlerin veya diğer metabolitlerin bağırsak hareketliliğini uygun modifikasyonlarla görselleştirmek için uygulanabilir. Bu deneyi, lisans öğrencilerinin membran taşınımı kavramını anlamalarına yardımcı olabilecek deneyimsel bir pedagojik araç olarak öneriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik hücreler, hücre içi sitosollü hücre dışı içerikten ayıran bir zar lipid çift tabakası ile çevrilidir. Membran, çözünen maddelerin1 hareketini düzenleyen yarı geçirgen bir bariyer görevi görür. Biyolojik zarlar boyunca taşıma, bir çözünen maddenin konsantrasyonu ve yükü dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olan bir çözünen maddenin geçirgenlik katsayısından etkilenir. Genel olarak, çözünen maddeler üç mekanizma kullanarak zar boyunca hareket eder (Şekil 1): Pasif difüzyon, kolaylaştırılmış difüzyon ve aktif taşıma2. Basit difüzyon, çözünür, yüksüz ve polar olmayan çözünen maddelerin konsantrasyon gradyanlarını yarı geçirgen bir zardan aşağı indirdiği süreçtir (Şekil 1A). Membran proteinleri, çözünen maddelerin daha yüksek konsantrasyonlu bir bölgeden daha düşük konsantrasyonlu bir bölgeye hareketini içerdiğinden bu sürece yardımcı olmaz. Difüzyon hızı Fick Yasası3'e dayanmaktadır. Öte yandan, kolaylaştırılmış difüzyon, zarın enerji harcaması olmadan yalnızca seçici çözünen maddelerin bir konsantrasyon gradyanı boyunca geçmesine izin verdiği proteine bağlı bir taşımadır (Şekil 1B). Bu tür bir taşıma spesifiktir ve doygunluk kinetiği sergilemede basit difüzyondan farklıdır.

Aktif taşıma, moleküllerin konsantrasyon gradyanlarına karşı, yani ATP veya iyon gradyanları kullanılarak daha düşük konsantrasyon bölgesinden daha yüksek konsantrasyonlu bir bölgeye proteine bağlı bir taşınmasıdır (Şekil 1C). Taşıyıcı ATP'yi hidrolize ettiğinde, taşıma birincil aktif taşıma olarak adlandırılır (Şekil 1C; sol panel). Aktif taşımanın başka bir şekli ikincil aktif taşımadır (Şekil 1C; sağ panel). İkincil aktif taşımada, çözünen maddeler bir elektrokimyasal gradyana dayalı olarak hareket ettirilir. Bir taşıyıcı protein, bir iyonun (tipik olarak Na+) konsantrasyon gradyanından aşağı hareketini başka bir molekülün veya bir iyonun konsantrasyon gradyanına karşı hareketi ile birleştirdiğinde gerçekleşir. Bu tür bir çözünen madde hareketi, hem çözünen hem de iyonun aynı yönde hareket ettiği bir ortak taşıma (Symport) veya bir değişim (Antiport) olabilir, bu durumda çözünen ve iyon zıt yönlerde hareket eder.

Gıda kaynaklarından alınan diyet amino asitleri ve monosakkaritler ince bağırsakta emilir. İnce barsak fonksiyonel olarak Duodenum, Jejunum ve İleum olmak üzere üç segmente ayrılabilir (Şekil 2). Çözünen maddenin emilimi ince bağırsak boyunca gerçekleşir ve maksimum emilim jejunumda ve ileumun proksimal ucunda meydana gelir. Bağırsak enterositleri polarize hücrelerdir ve iki bitişik hücreyi birbirine bağlayan sıkı bağlantılar, bazolateral ve apikal membran bölgesi olmak üzere iki ayrı zar bölgesi oluşturur (Şekil 2). Sindirim tarafından üretilen luminal çözünen maddelerin emilimi, apikal membran bölgesinde4 meydana gelir.

Apikal membrandaki bağırsak enterositlerinde histidin taşınması, sodyuma bağımlı ikincil bir aktif semptom örneğidir. Bazolateral uçta, enterosit içine giren histidin, konsantrasyon gradyanından hepatik portal dolaşımına doğru hareket eder. Enterosit içindeki hücre içi sodyum konsantrasyonları, bazolateral membran üzerinde bulunan Na+ K+ATPaz tarafından sodyumun hücre dışına aktif olarak pompalanması nedeniyle hücre dışı/luminal konsantrasyonlardan daha düşük olan 12 mmole/L1'de tutulur (Şekil 3). Enterositlerin apikal zarında, B0AT ve sodyum nötr amino asit taşıyıcı (SNAT) 5, sadece histidini değil, aynı zamanda asparagin ve glutamin gibi amino asitleri de sodyuma bağımlı bir birlikte taşımada taşıyan ana taşıyıcılardır 5,6. Enterositlerin bazolateral zarında bulunan Büyük Amino asit Taşıyıcı (LAT)1 adı verilen başka bir taşıma proteini, lösin, triptofan, tirozin ve fenilalanin gibi büyük nötr amino asitleri zar7 boyunca taşır.

Deneyimsel öğrenme pedagojisi yoluyla spektrofotometri ve rutin biyokimyasal tahliller gibi tekniklerle entegre edilmiş membran taşınımı kavramının öğretilmesi amacıyla, kavramı sadece anlaşılması kolay terimlerle göstermekle kalmayıp aynı zamanda lisans öğrencileri için katılımcı öğrenmeyi de mümkün kılan metodolojilerin geliştirilmesi zorunludur. Şu anda, öğrencilerin bu tür biyokimya kavramlarını öğrenmek için uygulamalı katılım için sınırlı kaynaklar bulunmaktadır. Burada, lisans laboratuvarlarında çoğaltılması kolay olan ve diğer metabolitlerin taşınmasını değerlendirmek için de uyarlanabilen, keçi bağırsak zarı boyunca Histidin taşınmasını göstermek için basit bir protokol sunuyoruz. Daha da önemlisi, yöntem bir lisans laboratuvarında ucuz materyaller kullanır ve böylece en basit laboratuvar ortamlarında bile deneyimsel öğrenmeyi mümkün kılar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm adımlarla birlikte protokolün tamamı, Şekil 4'te şematik bir diyagram olarak gösterilmiştir. Yöntem, sıçan bağırsakları8 kullanılarak yapılan önceki bir çalışmadan uyarlanmıştır. Deney, kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan örnekler ticari bir satıcıdan temin edilmiştir.

DİKKAT: Bu deney sırasında eldiven giyin.

1. Ters Jejunum keselerinin hazırlanması

  1. Keçi jejunumunu ön işlemden geçirin ve temizleyin.
    1. Taze kurban edilmiş sağlıklı bir keçinin bağırsaklarını lisanslı bir satıcıdan temin edin.
    2. Bağırsakları, temizlik için tamamen daldırılacak şekilde yeterli miktarda 1x fosfat tampon tuzlu suya (PBS) yerleştirin.
    3. İnce bağırsağı kalın bağırsaktan ayırın ve dış bağ dokusunun makas kullanılarak çıkarıldığından emin olun.
    4. İnce bağırsağı 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 1x PBS ile nazikçe yıkayın ve içi boş bir ince bağırsak torbası elde etmek için sindirilmemiş gıda maddesinin çıkarılmasını sağlayın. Etkili temizlik için bu işlemi en az üç kez tekrarlayın.
      NOT: Yıkama sırasında aşırı güç veya iğne kullanmaktan kaçının. Kuvvet kullanımı bağırsak duvarlarının delinmesine neden olabilir ve böylece bağırsak enterositlerine zarar verebilir.
    5. Üç parçayı elde etmek için bir cetvel kullanarak ince bağırsağın tam uzunluğunu ölçün: Duodenum (ince bağırsağın 1/4'ü) ve geri kalanı Jejunum ve Ileum'a eşit olarak bölünür.
    6. Jejunum bölümünü kullanarak deneye devam edin.
  2. Ters Jejunum hazırlayın.
    1. Bir bıçak kullanarak tüm bağ dokusunu çıkararak jejunum kısmını temizleyin.
    2. Jejunumu 12-15 cm uzunluğunda porsiyonlar halinde kesin, 1x PBS ile yıkayın ve PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
    3. Villus kısmının dışarıdan açığa çıkmasını sağlamak için bir cam çubuk kullanarak jejunum kısımlarını ters çevirin.
      DİKKAT: Keskin kenarlı bir cam çubuk kullanmaktan kaçının. Ayrıca, cam çubuğun çapı kesenin çapından daha büyük olmamalıdır.
      NOT: Bu noktada, villus ışık mikroskobu altında görüntülenebilir (Şekil 4).
    4. Ters çevrilmiş jejunum kısımlarını 1x PBS ile nazikçe yıkayın.
    5. Ters çevrilmiş jejunumun yanlarından herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
    6. Ters jejunum kısımlarını 5 cm uzunluğunda keseler halinde kesin.
    7. Bir ucunu sicim ile bağlayın ve keseleri PBS ile doldurarak bağlı uçta görsel sızıntı olup olmadığını tekrar kontrol edin.
    8. Dış yüzeyinde villus bulunan boş bir ters çevrilmiş kese oluşturmak için diğer ucunu bağlayın.
    9. Ters çevrilmiş keseyi filtre kağıdına vurarak harici sızıntıları tekrar kontrol edin.
  3. Ters çevrilmiş keseleri 1x PBS'de dengeleyin.
    1. Deneye aynı gün devam edin veya keseleri gece boyunca 4 °C'de 1x PBS'de saklayın.

2. Histidin taşınımı için deney düzeneği

  1. Tablo 1'de verildiği gibi farklı sodyum klorür konsantrasyonlarına göre üç adet 50 mL'lik tüpten oluşan iki seti birleştirin.
  2. Hazırlanan bağırsak keselerini setlerin her biri için 30 dakika ve 60 dakika boyunca belirtilen tüplere batırın.
  3. Belirlenen süreden sonra, kese içindeki çözeltiyi ayrı bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde boşaltın ve hacmi belirleyin.
  4. 2 mL'lik bir şırınga kullanarak kese içindeki sıvıyı aspire edin. Alternatif olarak, kesenin bir ucunu çözün ve içeriği 1,5 mL'lik yeni bir tüpte toplayın.
  5. Histidin tahmini için toplanan örneklerin 0.1 mL'sini analiz edin ve standart grafiği kullanarak konsantrasyonu hesaplayın.

3. Pauly'nin reaksiyonunu kullanarak histidin tahmini

  1. Histidin için standart bir eğri hazırlayın.
    1. Tablo 2'de belirtildiği gibi, histidin (5 mM) ve su stok çözeltileri kullanarak değişen konsantrasyonlarda histidin içeren çözeltiler hazırlayın.
    2. Her tüpe sülfanilik asit (0,5 mL) ve sodyum nitrat (0,5 mL) ekleyin.
    3. Tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, ardından her tüpe 1 mL sodyum karbonat ve etanol ekleyin.
    4. Tüpleri oda sıcaklığında (~ 20 ° C) 20 dakika inkübe edin ve 490 nm dalga boyunda absorbansa dikkat edin.
    5. Histidin konsantrasyonuna karşı standart bir absorbans eğrisi çizin.
      NOT: Histidin için yapılan bu test, histidinin bir diazo bileşiği oluşturma özelliğine dayanmaktadır (Şekil 5).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histidinin bağırsak villusları tarafından ters çevrilmiş keselerin lümenine emilmesi yoluyla histidinin bağırsak hareketliliğini göstermek için deneysel iş akışı Şekil 4, Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterilmektedir. Üç bağımsız deney düzeneği gerçekleştirildi ve temsili veriler Şekil 6'da sunuldu.

Verilen deneysel koşullar altında, Pauly'nin reaksiyonunu kullanan histidin tahmini, 300 μM'ye kadar Lambert Beer yasasını takip etti (Şekil 6A). Histidin için yapılan bu test, amino asitler ile reaktifteki diazonyum iyonu arasındaki eşleşmeye dayanır. Pauly'nin reaktifi, konsantre hidroklorik asit içinde çözünmüş sülfanilik aside sahiptir. Bu asit, sodyum nitrat ve HCl varlığında diazotizasyona uğrar. Diazonyum tuzu p-fenildiazosülfonat, alkali koşullar altında histidin molekülleri ile reaksiyona girerek koyu kırmızı/turuncu ila sarı renkli bir kompleks oluşturur, bu da spektrofotometrik olarak 490 nm'de okunabilir (Şekil 5)9. Bu testin histidin ve tirozin tarafından verildiği not edilebilir. Bu çalışmada kullanılan test, soğutulmuş koşullar altında sodyum nitrit kullanmak yerine doğrudan oda sıcaklığında (~ 20 ° C) sodyum nitratın kullanılması gibi orijinal reaksiyonun biraz değiştirilmiş bir versiyonudur9.

Ters çevrilmiş keselerin içinden elde edilen numune ile gözlemlenen pozitif Pauly reaksiyonu, histidinin bağırsak villusu boyunca emilimini göstermektedir. Şekil 6B , jejunal enterositlerde histidin ve sodyum konsantrasyonlarının alımı arasındaki korelasyonu göstermektedir. İnkübasyon süresi 30 dakikadan 60 dakikaya çıktıkça histidin emilimindeki artış, ikincil aktif taşımanın göstergesidir.

figure-results-1
Şekil 1: Farklı membran taşıma türleri. Çeşitli membran taşıma sistemlerini gösteren şematik. (A) Pasif difüzyon. (B) Kolaylaştırılmış difüzyon. (C) Birincil aktif taşıma (solda) ve ikincil aktif taşıma (sağda). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Bağırsak villusundaki enterositlerin organizasyonu. Bu şekil ince bağırsağa odaklanır ve Duodenum, Jejunum ve Ileum olmak üzere üç farklı bölümü gösterir. İnce bağırsakta ayrıca, yutulan gıdaların emilmesi için yüzey alanını artıran villus adı verilen bazı parmak benzeri çıkıntılar vardır. Mikrovilluslar, amino asit emilimi için spesifik taşıyıcıları içeren enterosit adı verilen hücrelere sahiptir. Sıkı bağlantılar, çözünen maddelerin hücreler arasındaki hareketini önler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Amino asit taşıyıcıları olan bir enterosit. Karikatür, apikal ve bazolateral uçları gösteren bir enterositi temsil eder. Apikal uç, B0AT ve SNAT5 proteinleri gibi taşıyıcılara sahiptir ve bazolateral zar, LAT1 taşıyıcısını içerir. Birlikte, bu proteinler histidinin bağırsak lümeninden portal dolaşımına alınmasından sorumludur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Keçi bağırsağı ters çevrilmiş keseleri kullanılarak histidinin membran taşınmasını gösteren protokolün şematik gösterimi. Keçi bağırsakları tarif edildiği gibi temin edildi, ön işleme tabi tutuldu ve temizlendi. Kısaca jejunum eksize edildi ve ters keseler hazırlandı. Bu keseler, çeşitli tuz konsantrasyonlarında histidin alımını ölçmek için deneyi kurmak için kullanıldı. Villuslar ışık mikroskobu kullanılarak 400x büyütmede görüntülendi. Ayrıntılı prosedür metinde verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Pauly'nin metodu için reaksiyon. Pauly'nin testi, konsantre hidroklorik asit içinde sülfanilik asit içeren bir reaktifte diazonyum iyonlarının oluşumunu içerir. Alkali koşullar altında, histidin diazonyum tuzu ile reaksiyona girer ve absorbansı bir spektrofotometre kullanılarak 490 nm'de ölçülebilen kırmızı renkli bir bileşiğin oluşumuna neden olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Pauly yöntemi ile histidin tahmini. (A) Histidin için standart eğri. 0-300 μM arasında değişen histidin konsantrasyonları Pauly reaksiyonuna tabi tutuldu ve oluşan kompleks 490 nm dalga boyunda ölçüldü. (B) Bağırsak keselerinde histidin nakli, 150 mM (katı siyah) ve 200 mM NaCl (katı gri) tuz çözeltisi varlığında 30 dakika ve 60 dakika takip edildi. Ters keseler içindeki histidin konsantrasyonu standart eğri kullanılarak tahmin edildi (Şekil 6A). Değerler kontrole göre rapor edilir (0 mM NaCl). Üç teknik kopya gerçekleştirildi ve temsili veriler sunuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Histidin'in bağırsak hareketliliği için deney düzeneği. Bu tablo, bağırsak keselerinin iki zaman noktası boyunca farklı sodyum klorür konsantrasyonlarında inkübe edilmesini göstermektedir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Histidin için standart eğrinin hazırlanması. Bu tablo, Pauly'nin 0-300 μM arasında değişen bilinen histidin konsantrasyonları ile reaksiyonu için farklı adımları ve bileşenleri göstermektedir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran taşınımı, temel veya uygulamalı tüm büyük biyolojik bilim disiplinlerinin lisans öğrencilerine öğretilen en temel kavramlardan biridir. Geleneksel olarak, zarlar arasındaki hareket, radyoaktif izotoplarla etiketlenmiş metabolitler kullanılarak görselleştirilmiştir. Ancak, bu yöntemler son derece tehlikelidir ve öğretme veya öğrenme için uygun değildir. Deneyimsel öğrenme, bu tür karmaşık kavramları anlamak için en iyi pedagojik teknik olsa da, altyapı eksikliği, pahalı floresan bazlı boyalar/metabolitler ve en önemlisi hayvan diseksiyon deneylerinin yasaklanması ile daha da artan bir zorluktur. Bu nedenle, lisans laboratuvar ortamında sadece güvenli değil, aynı zamanda ucuz ve uygulanabilir araçlar ve alternatif yöntemler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Burada, lisans öğrencileri için membran taşınmasını öğretmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Agar ve ark. 19548, histidinin keçi bağırsağı hücreleri boyunca tek yönlü aktif membran taşınmasını göstermektedir. Bu çalışma, bağırsak zarları boyunca histidin emilimini görselleştirmek için kolorimetri tabanlı bir testin kullanımını göstermek için yapılmıştır. Öğrenciler için basit, tekrarlanabilir ve anlaşılırdır ve herhangi bir laboratuvar ortamında yapılabilir.

Ters bağırsak kesesi modeli ilk olarak Wilson ve Wiseman10 tarafından geliştirildi ve daha sonra dokuların canlılığını artırmak için geliştirildi. İlaç emiliminin mekanizmaları ve kinetiği, bağırsak ters çevrilmiş keseler11 kullanılarak aydınlatılmıştır. Bu modelin avantajları arasında emilim için geniş bir alan; Bununla birlikte, doku canlılığı sınırlayıcı parametrelerden biridir. Bağırsak dokusunun fizyolojik koşullar altında ~ 2 saat boyunca canlı ve metabolik olarak aktif kaldığı bildirilmiştir11. Bu yaklaşımın dikkate alınması gereken bir başka potansiyel uyarısı, muskularis mukozası ve serozanın ters kese preparatlarından çıkarılamamasıdır. Bazı bileşiklerin muskularis tabakasına bağlanması, bu bileşiklerin taşınmasını sınırlayabilir veya hafife alabilir. Ters bağırsak kesesi modeli hem hassas hem de spesifik olsa da, sonuçları çeşitli faktörler etkileyebilir. Bu faktörlerden bazıları, hayvanın yaşı, cinsiyeti, türü, diyeti ve hastalık durumunun yanı sıra analiz için kullanılan bağırsak segmentini (Ileum, Jejunum, Duodenum ve Colon) içerir. PH, havalandırma ve sıcaklık gibi çevresel faktörler de sonuçları etkileyecektir12.

Bağırsağın ve hayvan durumunun (canlı/ölü) alınmasındaki gecikmenin, sıçan bağırsağının duodenal segmentlerinde aktif taşımayı etkilediği gösterilmiştir. Anestezi uygulanmış hayvanlardan yapılan hasat, taşıyıcının bozulmasını önleyerek minimum zaman gecikmesi sağlar13. Ancak üniversitelerde hayvan diseksiyonu yasağı ışığında deney düzeneğimizde yeni kurban edilmiş hayvanlardan alınan bağırsaklar kullanılmıştır. Bu protokol, enterositler boyunca bir metabolitin kalitatif bir alımını sağlamak için başarılı bir şekilde kullanılabilirken, membran taşıma kinetiğini içeren çalışmalarda kullanımı sınırlayıcıdır. Bu protokolün en kritik basamağı, canlı enterositlere sahip, sızdırmaz ters invert barsak keselerinin başarılı bir şekilde hazırlanmasıdır. Villus ve enterositlerin hassas doğası ve yaşayabilirliği, pratikle üstesinden gelinebilecek bir zorluk teşkil etmektedir. Ayrıca, başlangıç materyalinin herhangi bir akraba içi singenik hayvan popülasyonundan olmadığı göz önüne alındığında, deneyler arasındaki sonuçlardaki değişkenlik önemli bir dezavantajdır. Bu, aynı hayvandan birden fazla kopyanın kullanılmasıyla aşılabilir. Bu düşünceleri akılda tutarak, bu çalışmada sunulan yöntem kesinlikle lisans uygulamalı eğitiminde pedagojik bir araç olarak kullanılacaktır.

Ana hatlarıyla belirtilen protokol, histidin taşınmasını göstermek için başarıyla kullanıldı. Hem sodyum hem de histidinin ters keselere tek yönlü alımı, ikincil aktif taşımanın simetrik bir tipini gösterir. Nötr amino asitlerin bağırsaktan emilimi, Na + K + ATPaz tarafından oluşturulan konsantrasyon gradyanına bağlı olan vektörel kinetiği takip eder. Benzer bir kurulum, hücre içi negatif membran potansiyelini ve 150 mM'lik hücre dışı sodyum konsantrasyonunu korur. Bunların her ikisi de nötr amino asitlerin apikal uçta B0AT ile aktif taşınmasını ve ardından bazolateral uçta enterositin LAT1 ile dışarı çıkmasını sağlar. İlginç bir şekilde, daha yüksek tuz konsantrasyonlarında (200 mM), zamanın bir fonksiyonu olarak absorpsiyonda önemli bir fark yoktu. Bu noktada böyle bir gözlemin nedeni hakkında yorum yapamayız; bununla birlikte, aynı deney düzeneği, sodyuma bağlı taşımayı ve doygunluğa bağlı olası katkıyı göstermek için değişken zaman noktalarına ve 150 mM kolin klorür içeren kontrollere sahip çoklu sodyum konsantrasyonlarını içerecek şekilde genişletilebilir.

Prensip olarak, keçi / domuz / sıçan / fareden alınan ters jejunum keseleri, tahmin için biyokimyasal bir test olması koşuluyla, çeşitli diyet metabolitlerinin bağırsak emilimini göstermek için kullanılabilir. Ek olarak, bağırsak emilimini veya membran taşıma inhibitörlerini potansiyel olarak müdahale edebilecek diğer bileşenlerin etkisi de analiz edilebilir. Ters çevrilmiş keseler, in vitro ilaç emilimini, ilaçların bağırsak metabolizmasını ve taşıyıcının ilaç emilimindeki rolünü incelemek için farmasötik araştırmalarda bir araç olarak verimli bir şekilde kullanılmıştır. Son olarak, bu teknik, membran taşınmasının ex vivo gösterimine bir örnektir ve hücresiz ekstrakta (in vitro) değil, bir doku örneğine dayanır. Bununla birlikte, bu avantaj, sınırlayıcı bir faktör olabilen enfekte olmamış keçi / domuz / sıçan bağırsaklarının mevcudiyeti ile dengelenir.

Öğrenme sürecini geliştirmek için bir öğretmenin kullanabileceği birçok pedagojik araç arasında, deneyimsel öğrenme veya 'yaparak öğrenme', öğrencilere ders konularını bütünsel bir şekilde anlama fırsatı sağlayan en ilerici ve etkili öğretim yöntemi olan bir öğretim felsefesi ve metodolojisidir. Deneyimsel öğrenme, bu aktif öğrenme sürecinde destek ve mentorluk sağlayan eğitmenin yanı sıra öğrencilerin de uygulamalı katılımını sağlar14. Geleneksel teorik sınıf eğitimine, özellikle öğrencilerin genellikle tasavvur etmekte zorlandıkları zar taşımacılığı gibi bazı ağır ve bütünleştirici kavramlarda mükemmel bir alternatif olarak hizmet eder. Bu tür alıştırmalar aynı zamanda hem akranlardan hem de mentorlardan etkileşimli ve işbirlikçi öğrenmeyi teşvik edecektir. Mevcut girişim, yalnızca bilgilendirici değil, aynı zamanda akılda kalıcı ve bir öğrenci için dönüştürücü olabilecek ve genel öğrenme deneyimini önemli ölçüde etkileyebilecek bir öğrenme deneyimi yaratma ve etkinleştirme yönünde ileriye doğru atılmış bir adımdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Delhi Üniversitesi, Sri Venkateswara Koleji, Biyokimya Bölümü tarafından desteklenmiştir. Yazarlar laboratuvar personeline destekleri için teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL Mikrosantrifüj TüpleriTARSONS500020
10 mL Test TüpleriBOROSIL9800U04
50 mL Steril Falcon TüpleriTARSONS546041
500 mL BeherBOROSIL10044977
500 mL Konik ŞişeBOROSIL691467
D-GlikozSRL42738
Dijital SpektrofotometreSYSTRONICS2710
EtanolEMSURE1009831000
FinpipetlerTHERMOFISHER4642090
Cam Karıştırma ÇubuğuBOROSIL9850107
L-Histidin SRL17849
NaClSRL41721
Nitril EldivenKIMTECH112-4847
Petri kabı TARSONS460090
Fosfat Tamponlu Salin (ph 7.4)SRL95131
Pipet UçlarıABDOSP10102
Sodyum KarbonatSRL89382
Sodyum Nitrat SRL44618
Sodyum Fosfat Dibazik (susuz)SRL53046
Sodyum Fosfat Monobazik (susuz)SRL22249
Sülfanilik Asit SRL15354
Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. 7th Edition. , W.H. Freeman and Company. (2017).
  2. Stillwell, W. Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes. , Elsevier Science. (2013).
  3. Fick, A. V. On liquid diffusion. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).
  4. Sherwood, L. Introduction to Human Physiology. , Brooks/Cole Cengage Learning. (2013).
  5. Bröer, S. Intestinal amino acid transport and metabolic health. Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).
  6. Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).
  7. Bröer, S. Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia. Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).
  8. Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. The uptake of amino acids by the intestine. BBA - Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).
  9. Pauly, H. Über die Konstitution des Histidins. I. Mitteilung. Biological Chemistry. 42 (5-6), 508-518 (1904).
  10. Wilson, T. H., Wiseman, G. The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface. J Physiol. 123 (1), 116-125 (1954).
  11. Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 23 (2), 313-323 (1998).
  12. Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: Limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
  13. Pento, J. T., Mousissian, G. K. Time-dependent deterioration of active transport in duodenal segments of rat intestine. J Pharmacol Methods. 20 (1), 9-14 (1988).
  14. Williams, L., Sembiante, S. F. Experiential learning in U.S. undergraduate teacher preparation programs: A review of the literature. Teach Teach Educ. 112, 103630(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Histidin EmilimiEvirtilmi ntestinal KeselerKe i JejunumuAmino Asit Ta n mSodyum SimportuEnterosit MembranLisans LaboratuvarAbsorbans l m

İlgili makaleler