Yöntem makalesi

MCF-7 Hücrelerinde Oksidatif DNA Hasarını Değerlendirmek için ELISA Testi Kullanılarak 8-okso-dG Seviyesinin Ölçülmesi

DOI:

10.3791/66888

⸱

24 Mayıs 2024

 ,  ,  , 
1Suzhou Key Laboratory of Medical Biotechnology, Suzhou Vocational Health College, 2Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People’s Hospital of Suzhou City

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, ELISA teknolojisi ile MCF-7 hücrelerinde DNA oksidatif hasarını kantitatif olarak tespit etmek için etkili bir yöntemi tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

8-Okso-7,8-dihidro-2'-deoksiguanozin (8-okso-dG) bazı, yaygın olarak gözlenen DNA oksidatif hasarının baskın şeklidir. DNA bozukluğu, gen ekspresyonunu derinden etkiler ve nörodejeneratif bozuklukları, kanseri ve yaşlanmayı uyarmada çok önemli bir faktör olarak hizmet eder. Bu nedenle, 8-oksoG'nin kesin miktar tayini, DNA hasar tespit metodolojilerinin araştırılmasında klinik öneme sahiptir. Bununla birlikte, şu anda, 8-oxoG tespiti için mevcut yaklaşımlar, kolaylık, uygunluk, satın alınabilirlik ve yüksek hassasiyet açısından zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Farklı konsantrasyonlarda hidrojen peroksit(H2O2) ile uyarılan MCF-7 hücre örneklerinde 8-okso-dG içeriğindeki varyasyonları tespit etmek için oldukça verimli ve hızlı bir kolorimetrik yöntem olan sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tekniğini kullandık. MCF-7 hücrelerinde oksidatif hasara neden olanH2O2 konsantrasyonunu, MCF-7 hücrelerinde IC50 değerini tespit ederek belirledik. Daha sonra, MCF-7 hücrelerini 12 saat boyunca 0, 0.25 ve 0.75 mM H2O2 ile tedavi ettik ve hücrelerden 8-okso-dG çıkardık. Son olarak numuneler ELISA'ya tabi tutulmuştur. Plaka yayma, yıkama, inkübasyon, renk geliştirme, reaksiyonun sonlandırılması ve veri toplama dahil olmak üzere bir dizi adımın ardından,H2O2tarafından indüklenen MCF-7 hücrelerindeki 8-okso-dG içeriğindeki değişiklikleri başarıyla tespit ettik. Bu tür çabalar sayesinde, hücre örneklerinde DNA oksidatif hasarının derecesini değerlendirmek için bir yöntem oluşturmayı ve bunu yaparken DNA hasarının tespiti için daha uygun ve uygun yaklaşımların geliştirilmesini ilerletmeyi amaçlıyoruz. Bu çaba, DNA oksidatif hasarı ile hastalıklar üzerine klinik araştırmalar ve toksik maddelerin tespiti de dahil olmak üzere çeşitli alanlar arasındaki ilişkisel analizlerin araştırılmasına anlamlı bir katkı sağlamaya hazırdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA oksidatif hasarı, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumu ile hücresel antioksidan savunma sistemi arasındaki dengesizliğin bir sonucudur1. Esas olarak DNA pürin ve pirimidin bazlarınınoksidasyonunu içerir 2,3. DNA bazlarının bu oksidatif modifikasyonu sadece genomun bütünlüğünü tehlikeye atmakla kalmaz, aynı zamanda kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve kardiyovasküler hastalıklar dahil olmak üzere çok çeşitli patolojik sorunları da kapsar 4,5. DNA'daki guanin bazı en düşük indirgeme potansiyeline sahiptir ve oksidasyona en duyarlıolanıdır 6. Bu nedenle, 8-okso-7,8-dihidro-2'-deoksiguanozin (8-okso-dG), DNA oksidatif hasarının derecesini değerlendirmek için birincil belirteçgörevi görür 7,8. 8-okso-dG'nin doğru miktar tayini, hastalık oluşumunun, ilerlemesinin ve multifaktöriyel oksidatif yükün9 değerlendirilmesinin çeşitli yönlerinin ele alınmasında kritik bir konu haline gelmiştir.

Elektrokimyasal algılamalı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC-ECD), kütle spektrometresi ve ilgili tireli teknikler gibi 8-okso-dG'yi tespit etmek için geleneksel yöntemler, yüksek hassasiyet ve özgüllük sergiler 10,11,12. Bununla birlikte, bu teknikler genellikle karmaşık operasyonel gereksinimlere ve yüksek maliyetlere sahiptir, bu da yüksek verimli numune analizinde yaygın olarak uygulanabilirliklerini ve pratikliklerini engeller. Bilim ve teknolojinin sürekli ilerlemesiyle birlikte çeşitli yeni, verimli ve doğru yöntemler ortaya çıkmıştır. Bu yeni teknolojilerin uygulanması, 8-okso-dG seviyesini daha doğru bir şekilde ölçmemizi sağlar ve oksidatif stres ile hastalık arasındaki ilişkinin derinlemesine incelenmesi için daha güçlü araçlar sağlar. Örneğin, araştırmacılar DNA13'ü kantitatif olarak tespit etmek ve sıralamak, tek tıklamalı kod dizileme stratejisi14 kullanarak DNA hasar türlerini belirlemek, yüksek verimli dizileme yöntemleri geliştirmek ve biyotin-streptavidin ile entegre ederek 8-oksoG tabanlı biyosensörler oluşturmak için nanopor teknolojisini uyguladılar. Bunlar arasında, özgüllük, yüksek verimli tarama ve maliyet açısından tanınan avantajları ile ELISA, 8-okso-dG tespiti için ideal çözümlerden biridir. Bu nedenle, 8-oxo-dG'yi tespit etmek için yüksek verimli, son derece hassas, kullanışlı ve hızlı bir yöntem geliştirmek çok önemlidir.

1971'degeliştirilen enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tekniği 16, son 50 yılda hızla ilerlemiş ve şu anda biyoloji ve tıp alanlarında en yaygın kullanılan tespit yöntemlerinden biri haline gelmiştir 17,18,19. ELISA teknolojisi, yüksek hassasiyet ve özgüllük sergiler, kısa bir reaksiyon süresine sahiptir ve kullanımı kolaydır, bu da onu büyük ölçekli numune testi ve yüksek verimli analiz için yaygın olarak tanınan bir seçim haline getirir20. Sonuç olarak, ELISA, hücreler 21,22,23 içindeki bileşiklerin, proteinlerin, antikorların veya moleküllerin kantitatif veya yarı kantitatif analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, çeşitli hastalıklar, ilaç kalıntıları ve biyomoleküller ile ilişkili biyobelirteçlerin tespitinde kullanılmıştır24. ELISA'lar deney tasarımı ve ilkelerine dayalı olarak dört ana türe ayrılabilir25. Bu yöntemler arasında doğrudan ELISA, dolaylı ELISA, sandviç ELISA ve rekabetçi ELISA26,27 bulunur. Bunlar arasında, biri hedef molekülü yakalamak ve diğeri tespit etmek için olmak üzere iki spesifik antikor kullanan sandviç ELISA, bu makaledeki çalışma için seçildi. Sandviç ELISA'nın deneysel prensibi şu şekildedir: İlk olarak, ilgilenilen analiti yakalamak için bir mikroplakanın kuyucuklarında spesifik bir antikor hareketsiz hale getirilir. Standart veya numune eklendikten sonra, hedef analit immobilize edilmiş antikora bağlanır. Daha sonra, antijen üzerinde farklı bir epitopu tanıyan etiketli bir antikor eklenir ve bir sandviç yapı oluşturulur. Bağlanmamış antikorların uzaklaştırılmasını takiben, bir substrat eklenir. İkincil antikorun katalitik etkisi altında, bir renk reaksiyonu meydana gelir ve rengin yoğunluğu, numunedeki hedef analitin konsantrasyonu ile pozitif olarak ilişkilidir. Son olarak, numunenin konsantrasyonunu belirlemek için optik yoğunluk (OD) ölçüldü. Sandviç ELISA, hedef numuneler için artan hassasiyet ve özgüllük avantajlarına sahiptir, bu da onu düşük konsantrasyonlarda hedef analitlerin ve karmaşık numunelerin28 tespit edilmesi için uygun hale getirir. Ek olarak, elde edilen sonuçlar daha fazla analiz için nicelleştirilebilir. Bu faktörler, sandviç ELISA'yı hem bilimsel araştırmalarda hem de klinik laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir tespit yöntemi haline getirmektedir29.

Bu çalışma, hücrelerdeki DNA oksidatif hasarının derecesini belirlemek için MCF-7 hücrelerinde 8-okso-dG'yi kantitatif olarak tespit etmeyi amaçladı. Bu çalışma iki ana bölümden oluşmaktadır: bir MCF-7 hücre DNA oksidatif hasar modelinin oluşturulması ve ELISA kullanılarak 8-okso-dG'nin saptanması. İlk olarak, MCF-7 hücreleri in vitro olarak kültürlendi ve farklı süreler boyunca farklı konsantrasyonlardaH2O2ile muamele edildi. Hücre canlılığı, MCF-7 hücrelerinde H2O2'nin yarı maksimal inhibitör konsantrasyonunu (IC50) belirlemek için birCCK-8 testi kullanılarak değerlendirildi. IC50 değerlerine dayanarak, uygun bir H2O2 tedavi süresi ve indüksiyon konsantrasyonu seçildi. Oksidasyon ile hasar gören MCF-7 hücrelerinin örneklerini çıkarmak için, hücre örnekleri ve süpernatanlar elde edildi ve daha önce 8-okso-dG antikorları ile kaplanmış enzim bağlantılı kuyucuklara eklendi. Numunede bulunan 8-okso-dG, katı faz taşıyıcısına bağlı antikorlara bağlanacaktır. Daha sonra yaban turpu peroksidaz ile işaretlenmiş 8-okso-dG antikorları ilave edildi. Reaksiyon karışımı, numunenin ve antikorun tam olarak bağlanmasını sağlamak için sabit bir sıcaklıkta inkübe edildi. Bağlanmamış enzim yıkanarak uzaklaştırıldı ve daha sonra mavi bir renk üreten kolorimetrik substrat eklendi. Asidin etkisi altında, çözelti sararır. Son olarak, reaksiyon kuyusu numunelerinin OD değeri 450 nm'de ölçüldü ve numunedeki 8-okso-dG konsantrasyonu OD değeri ile orantılıydı. Standart bir eğri oluşturarak, numunedeki 8-okso-dG konsantrasyonu hesaplanabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.MCF-7 hücrelerindeH2O2ile indüklenen DNA oksidatif hasar modelinin oluşturulması

  1. MCF-7 hücre geri kazanımı
    1. 3.5 x 106 MCF-7 hücresi içeren ve -80°C buzdolabında saklanan hücre kültürü kriyojenik tüpünü hızlı bir şekilde sıvı azot içeren köpük kutuya aktarın. Tüpü forseps ile alın ve korunan hücreleri çözmek için yaklaşık 1 dakika boyunca 37 °C sabit sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin.
      NOT: Bir su banyosunda çözdürme işlemi sırasında, kriyoviyalin eşit şekilde ısınmasını sağlamak için hücreleri aralıklı olarak sallayın.
    2. Kriyoviali bir santrifüje yerleştirin ve oda sıcaklığında 150 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı kriyojenik depolama tüpünden atmak için bir pipet kullanın ve 1 mL tam kültür ortamı ekleyin. İyice karıştırın ve 10 mm'lik bir kültür kabına aktarın, 7 mL daha tam kültür ortamı ekleyin.
    4. Homojen bir karışım sağlamak için kültür kabını çapraz bir şekilde çalkalayın ve %5 CO2 ile 37 ° C'de bir CO2 inkübatöründe kültürleyin.
      NOT: Tam kültür ortamı, %10 fetal sığır serumu, %1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş DMEM kültür ortamından oluşur.
  2. Hücre canlılığı değerlendirmesi
    1. Deney için iyi hücresel duruma sahip logaritmik büyüme fazındaki MCF-7 hücrelerini seçin. Logaritmik büyüme fazı sırasında, hücreler tipik olarak daha kısa bir bölünme döngüsü ve yüksek bir hücre bölünmesi sıklığı sergiler.
      1. Bir elektron mikroskobu kullanarak MCF hücrelerinin morfolojisini ve büyüme hızını gözlemleyin. Hücreler tekdüze ve yoğun bir şekilde paketlenmiş tek tabakalı bir morfoloji sunduğunda ve hücre çoğalması belirgin olduğunda, hücrelerin esasen logaritmik büyüme aşamasında olduğu belirlenebilir.
    2. Hücre yıkama: Kültür ortamını kültür kabından çıkarmak için bir pipet kullanın, hücreleri yıkamak için 1 mL PBS tamponu ekleyin, ardından PBS'yi atın.
    3. Hücre ayrılması: Hücreleri yıkamak için 1 mL tripsin ekleyin, tripsinin hücreleri kültür kabından tamamen ayırması için yaklaşık 1 dakika bekleyin. Kültür kabına hafifçe vurun; Hücre hareketinin gözlemlenmesi
      Sayfalarda tam hücre ayrılmasını gösterir.
    4. Hücre ayrılmasının sonlandırılması ve hücre sayımı: Ayrılmayı sonlandırmak için 8 mL tam kültür ortamı ekleyin, hücreleri nazikçe pipetleyin ve bir hücre sayma cihazı kullanarak hücre süspansiyon konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Saymadan önce hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre süspansiyonunun homojen olduğundan emin olun.
    5. Hücre tohumlama: 100 μL'de 5.000 hücrelik bir hücre yoğunluğu elde etmek için seyreltilmiş hücre süspansiyonunu ayarlayın. Hücre süspansiyonunu bir pipet tabancası kullanarak 96 oyuklu bir plakanın 21 oyuğuna aşılayın ve her bir oyuğa 100 μL dağıtın. Kültür ortamının aşırı buharlaşmasını önlemek için tohumlanan kuyucukların çevresindeki kuyucuklara 100 μL PBS tamponu ekleyin.
    6. H2O2 içeren ortamın hazırlanması: 12 oyuklu hücre kültürü plakasında 9 kuyucuk seçin ve H2O2 konsantrasyonlarının gradyanına (0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 mM) göre etiketler atayın. 2.0 mM ve 1.5 mM olarak etiketlenmiş kuyucuklara 720 μL tam ortam ekleyin ve kalan kuyucuklara 360 μL tam ortam ekleyin.
      1. Bir pipet kullanarak, sırasıyla 2.0 mM ve 1.5 mM olarak etiketlenmiş kuyucuklara 1.63 μL ve 1.22 μL% 3 H2O2 reaktifi dağıtın. Çözeltiyi iyice karıştırın. Bir pipet kullanarak, 360 μL 2.0 mM H2O2'yi iyi etiketlenmiş 1.0 mM'ye aktarın ve karıştırın; daha sonra 360 μL 1.0 mM H2O2'yi iyi işaretlenmiş 0.5 mM'ye aktarın ve karıştırın; ve son olarak 360 μL 0.5 mM H2O2'yi iyi işaretlenmiş 0.25 mM'ye aktarın. Seyreltmek ve istenen konsantrasyonu elde etmek için 360 μL 1.5 mMH 2O2'yi iyi etiketlenmiş 0.75 mM'ye pipetleyin. (Şekil 1).
        NOT: Herhangi bir kalıntı çözeltiyi önlemek için pipetteki H2O2 stok çözeltisinin kuyucuklara tamamen aktarıldığından emin olun. Seyreltmeye devam etmeden önce çözeltilerin iyice karıştırıldığından emin olun.
    7. İnkübasyon: Yaklaşık 24 saat hücre tohumlamasından sonra, hücreler yüzeylere yapıştıktan sonra kültür ortamını 96 oyuklu plakadan çıkarmak için bir pipet kullanın. Konsantrasyon gradyanına göre, her bir oyuğa ilgili H2O2 içeren ortamı ekleyin. Plakayı 12 saat boyunca inkübatöre geri koyun.
    8. CCK-8 reaktifinin eklenmesi: Belirlenen 12 saatlik tedavi periyodunun ardından, kültür ortamını 96 oyuklu plakadan çıkarmak için bir pipet kullanın, her oyuğa 100 μL tam kültür ortamı ve 10 μL CCK-8 reaktifi ekleyin ve üç boş kontrol kuyusu ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
      NOT: Numune ekleme işlemi sırasında, OD değeri okumasına herhangi bir müdahaleyi önlemek için kabarcık oluşumundan kaçının.
    9. Absorbans ölçümü: 96 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın, bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nm dalga boyunda absorbansı ölçün ve sonuçları kaydedin.
    10. IC50 hesaplama formülüne göre,
      inhibisyon oranı (%) = (ilaç deney grubunun OD'si-ilaç kontrol deliğinin ortalama OD'si) / (hücre kontrol deliğinin ortalama OD'si-ilaç kontrol deliğinin ortalama OD'si) x %100
      Sonuçları kontrol kültürlerinde absorbans yüzdesi olarak hesaplayın.
    11. İşlenen deneysel verileri bir istatistiksel analiz yazılımına aktarın, Doğrusal Olmayan Regresyon analiz türünü seçin, dört parametreli lojistik modeli oluşturun ve eğri uydurma için Eğriyi Sığdır düğmesine tıklamaya devam edin. Montaj işleminin ardından, yazılım IC50 değerini otomatik olarak hesaplayacaktır.
  3. H2O2 ile indüklenen MCF-7 hücre oksidasyon deneyi
    1. Deney için iyi hücre durumu ile logaritmik büyüme fazındaki MCF-7 hücrelerini alın.
    2. Yıkayın, hücre ayırma işlemini gerçekleştirin, ayırmayı sonlandırın ve hücreleri sayın (belirli yöntemler için adım 1.2'ye bakın).
    3. Hücre tohumlama: Hücre süspansiyonunun yoğunluğunu, 6 cm çapındaki tabak başına 4 mL süspansiyon ile tabak başına 1 x 106 hücre olarak ayarlayın.
    4. İki adet 5 mL'lik mikrosantrifüj tüpünü 0.25 mM ve 0.75 mM, %3,H2O2olarak etiketleyin. Her tüpe 4 mL tam ortam ekleyin, ardından sırasıyla 1.13 μL ve 3.40 μL% 3 H2O2 ekleyin. İyice karıştırmayı sağlamak için tüpleri hafifçe sallayın. Üç tabaktaki kültür ortamını, 0, 0.25 ve 0.75 mM'likH2O2konsantrasyonları içeren tam bir ortamla değiştirin.
    5. Kültürleri kuluçkaya yatırın: Bulaşıkları 12 saat boyunca kuluçka makinesine geri koyun.

2. Hücresel örneklerin hazırlanması ve ELISA reaktiflerinin hazırlanması

  1. Hücre ekstraktı örneklerinin toplanması
    1. Örnek toplama: MCF-7 hücre kültürü süpernatantını atın, durulayın, hücre ayrılmasını gerçekleştirin, ayrılmayı sonlandırın ve hücreleri toplayın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    2. Santrifüjleme: Hücre peletini toplamak için 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Her hücre örneğini yeniden süspanse etmek için 200 μL PBS ekleyin ve tekrarlanan donma-çözülme döngüleri ile hücreleri bozun. Hücre lizatını 10 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin ve analiz için süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın.
      NOT: Hücre miktarı düşük olduğunda, yeniden süspansiyon için kullanılan PBS hacmini azaltın. Numuneler, hemen analiz mümkün değilse 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir. Uzun süreli depolama için, numuneleri tek kullanımlık miktarlara göre ayırın ve tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için -80 °C'de saklayın.
  2. ELISA reaktiflerinin hazırlanması
    1. Reaktiflerin çözülmesi: Conta filmleri, önceden kaplanmış plakalar, standartlar, numune seyreltici, tespit antikoru-HRP, kromojen substratı, durdurma çözeltisi, konsantre yıkama tamponu (20x) ve test numuneleri dahil olmak üzere ELISA reaktiflerinin teste başlamadan önce 20 dakika boyunca oda sıcaklığına (18-25 °C) ulaşmasına izin verin. Kullanmadan 15 dakika önce ELISA okuyucuyu önceden açın.
    2. Yıkama tamponunun hazırlanması: Gerekli seyreltilmiş yıkama tamponu hacmini hesaplayın ve ardından 20x konsantre yıkama tamponunu damıtılmış veya deiyonize su ile 1x çalışma çözeltisine seyreltin. Kullanılmayan konsantre yıkama tamponunu 4 °C buzdolabına geri koyun.
      NOT: Yıkama tamponu kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır. Buzdolabında saklanan konsantre yıkama tamponunda kristaller varsa, oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin ve kullanmadan önce kristaller tamamen çözülene kadar hafifçe sallayın.
    3. Standardın hazırlanması
      1. Sırasıyla 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ve 40 ng/mL konsantrasyonlara sahip standart numunelerin çalışma çözeltilerini hazırlayın. Deneysel sonuçların doğruluğunu sağlamak için, çözünme işlemi sırasında kabarcık oluşumunu önlemek için kullanmadan önce standart numuneleri dikkatlice yukarı ve aşağı karıştırın.

3. ELISA deneyi

  1. Plaka kaplama: Standartlar, numuneler ve boş/kontroller için toplam kuyu sayısını önceden tasarlayın ve gerekli plaka şeritlerini çıkarın. Reaksiyon kuyularına 50 μL standart çalışma çözeltisi ve farklı konsantrasyonlara sahip tespit numuneleri ekleyin. Standartları üç nüsha halinde uygulayın ve boş/kontrol kuyularına25 herhangi bir numune eklemekten kaçının.
    NOT: ELISA testinin deneysel adımları Şekil 2'de şematik olarak gösterilmiştir. Numune konsantrasyonu algılama aralığını aşarsa, numune alınmadan önce numune seyreltici ile seyreltilmelidir. Numune eklerken, bunları plakanın dibine ekleyin, kuyu duvarlarına dokunmaktan kaçının, karıştırmak için hafifçe sallayın ve kabarcık oluşumunu önleyin. Deneyin doğruluğunu sağlamak için, her numune ilavesi 10 dakika içinde tamamlanmalıdır.
  2. İnkübasyon: Boş kuyucuklar dışında, her reaksiyon kuyucuğuna 100 μL yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge tespit antikoru ekleyin, kuyucukları bir plaka contası ile kapatın ve sabit sıcaklıktaki bir inkübatörde 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Yıkama: Sıvıyı atın, plaka kuyucuklarındaki sıvıyı silkeleyin, emici kağıt üzerinde kurulayın, her reaksiyon kuyucuğuna 350 μL yıkama tamponu ekleyin, 1-2 dakika bekletin, ardından yıkama tamponunu atın. Yıkama işlemini 5 kez tekrarlayın.
    NOT: Kapsamlı yıkama, deney sonuçlarının doğruluğunu doğrudan etkilediği için çok önemlidir. Her yıkamadan sonra yıkama tamponunun tamamen çalkalandığından emin olun. Emicilik ölçümünü etkilememek için yıkadıktan sonra plakanın altındaki kalıntıları dikkatlice silin.
  4. Renk reaksiyonu: Her reaksiyon kuyucuğuna 50 μL substrat A ve 50 μL substrat B ekleyin, plakayı kapatın ve karanlıkta 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Renk reaktifini ekledikten sonra, reaksiyon kuyucuklarındaki renk değişimini hemen gözlemleyin. Renk çok koyuysa, reaksiyonu daha erken sonlandırmak için durdurma solüsyonunu ekleyin.
  5. Reaksiyonu sonlandırın ve absorbansı ölçün: Her reaksiyon kuyucuğuna 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve OD değerini hemen bir ELISA okuyucu ile 450 nm dalga boyunda (15 dakika içinde) ölçün.
  6. Veri analizi: İşlenen deneysel verileri istatistiksel analiz yazılımına aktarın, Doğrusal Regresyon analiz türünü seçin. X eksenindeki standartların konsantrasyonunu Y eksenindeki optik yoğunluk (OD) değerlerine karşı çizerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Numunelerde bulunan 8-okso-dG konsantrasyonunu belirlemek için yerleşik kalibrasyon eğrisini kullanın. Bir Lojistik matematiksel model oluşturun ve eğri uydurma için Eğriyi Sığdır düğmesine tıklamaya devam edin. Montaj işleminin ardından yazılım, standart eğriyi ve P değerini otomatik olarak hesaplar.
    NOT: Standart eğri tekrar kullanılamaz ve her deney için yeniden belirlenmesi gerekir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 3'te gösterildiği gibi, X ekseni MCF-7 hücrelerine uygulananH2O2konsantrasyonunu gösterirken, Y ekseni hücre canlılığını gösterir. 12 saat boyunca 0.75 mM ile tedavi, MCF-7 hücrelerinin canlılığını% 67'ye düşürdü. Konsantrasyondaki artışla birlikte, MCF-7 hücrelerinin canlılığında, özellikle canlılığın% 3'ün altına düştüğü 1.5 mM'lik bir konsantrasyonda önemli bir azalma olmuştur (Tablo 1). Deneysel sonuçlar, MCF-7 hücreleri için 0.7655 mM'lik bir IC50 önerdi.

Bu deney serisinde, 8-okso-dG seviyelerinin nicelleştirilmesi için gelişmiş bir ELISA tekniği kullandık. Veri analizi yoluyla, standart eğrinin regresyon denklemi şu şekildedir:

Y = 23.66 × X + 0.07038 olur.

Şekil 4A'da gösterildiği gibi, kalibrasyon eğrisi yüksek doğrusallık göstermiştir (R²=0.978) ve Şekil 4B, numunelerde ölçülen 8-okso-dG konsantrasyonları ile bunlara karşılık gelen eklenen miktarlar arasındaki ilişkilerin güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu göstermektedir, bu da iyi bir hassasiyet olduğunu gösterir (varyasyon katsayısı %5'ten azdı). Ayrıca, elde edilen sonuçların çoklu tekrarlar arasındaki tutarlılığı, deneysel yöntemin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini gösterir.

Özetle, deneysel veriler, optimize edilmiş ELISA yöntemimizin, iyi kontrol edilen koşullar altında 8-okso-dG seviyelerindeki dalgalanmaları başarılı bir şekilde tespit edebildiğini göstermektedir. Bunun, oksidatif stresin neden olduğu DNA hasarını izlemek için bu tekniğin daha geniş bir numune türü yelpazesinde gelecekteki uygulamaları için önemli etkileri vardır. Bazı sınırlamalara rağmen, yöntemin uygulama beklentileri, deney koşullarının optimizasyonu üzerine umut verici görünmektedir.

figure-results-1
Şekil 1: H2O2 dilüsyonlarının hazırlanması. Şematik diyagram, çözeltilerin titiz kombinasyonunu ve çeşitli H2O2 konsantrasyonlarının buna uygun olarak 1.0 mM, 0.5 mM ve 0.25 mM olarak etiketlenmiş tüplere hassas bir şekilde aktarılmasını içeren hidrojen peroksit (H2O2) seyreltmelerinin hazırlanması için yöntemi tanımlar. Hedeflenen konsantrasyon, 1.5 mMH2O2'nin0.75 mM olarak belirlenen tüpe aktarılmasıyla elde edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Antijen tespiti için enzime bağlı immünosorbent Testi (ELISA). Bu şematik çizim, antijen tespiti için bir Enzime Bağlı İmmünosorbent Testinin (ELISA) sıralı adımlarını göstermektedir: Numune ekleme ve boş hazırlama; HRP işaretli antijen inkübasyonu; yıkama ve plaka hazırlama; substrat ekleme ve inkübasyon; reaksiyon sonlandırma ve optik yoğunluk (OD) ölçümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: H2O2, MCF-7 hücre proliferasyonunu inhibe etti. Hücre canlılığı, 12 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlardaH2O2 (0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5 veya 2.0 mM) ile muamele edilen CCK-8 testi ile değerlendirildi ve belirtilen durum için IC50 hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4:H2O2tedavisini takiben MCF-7 hücrelerinde 8-okso-dG'nin kantitatif analizi. (A) 8-okso-dG için ELISA standart eğrisi. Bilinen 8-okso-dG konsantrasyonları (1.25, 2.5, 5, 10, 20 ve 40 ng/mL) ile bunların ilgili absorbans değerleri arasındaki ilişkiyi gösterir. Standart eğrinin regresyon denklemi Y = 23.66 × X + 0.07038'dir. (n=3, R2=0.978). (B)H2O2ile muamele edilmiş MCF-7 hücrelerinde 8-okso-dG konsantrasyonu. Grafik, farklıH2O2konsantrasyonlarına (0, 0.25 ve 0.75 mM) maruz kalan MCF-7 hücrelerinde 8-okso-dG seviyelerini göstermektedir. Her veri noktası, oksidatif stresin DNA hasarı üzerindeki etkisini gösteren üç bağımsız deneyden (n = 3) elde edilen ortalama ± SE'yi (standart hata) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Parametre
H2O2 konsantrasyonu, mM00.250.50.7512
MCF-7 hücre canlılığı, %10082.881.3761.0713.42.77

Tablo 1:H2O2ile tedavi edilen MCF-7 hücrelerinin hücre canlılığı.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ELISA yöntemlerinin geliştirilmesi hem mevcut hem de yeni DNA hasar tespit metodolojileri için büyük önem taşımaktadır. Geleneksel HPLC ve kütle spektrometresi teknikleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım yalnızca kullanıcı dostu olmakla kalmaz, aynı zamanda yüksek hassasiyet sergiler ve yüksek verimli taramanıntaleplerini karşılar 30. Bu, büyük ölçekli hastalık tarama çalışmalarında 8-okso-dG'nin izlenmesini sağlayarak, bu biyobelirteç ile çeşitli hastalıklar arasındaki korelasyonun daha derin bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırır.

Deneysel prosedürler sırasında, sonuçların güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için birkaç kritik adım gereklidir. Başlangıçta, deney, MCF-7 hücrelerinin tolerans seviyesini vurgulayarak, 12 saatte 0.7655 mM'lik bir IC50 değeri ileH2O2'yeduyarlılığını yetkin bir şekilde değerlendirdi. Bu sonuç, MCF-7 hücrelerinin antioksidan savunma mekanizmalarını ve oksidatif stres altında hayatta kalmalarını anlamak için büyük bilimsel öneme sahiptir ve aynı zamanda antioksidan ilaçların veya ilgili tedavi mekanizmalarının gelecekteki taraması için önemli bir referans göstergesi sağlar31. Ayrıca, 8-okso-dG antikorlarının seçimi ve eşleştirilmesi, ELISA tespiti için hayati önem taşır ve ELISA tespit sisteminin özgüllüğünü ve duyarlılığını doğrudan etkiler. Ek olarak, sinyal amplifikasyon stratejisinin ve numune işleme adımlarının optimize edilmesi, algılamanın doğruluğunu etkileyen önemli faktörlerdir. Kararlı bir substrat reaksiyon sistemi kullanmanın arka plan hatalarını azaltabileceğini ve algılama hassasiyet aralığını artırabileceğini bulduk.

Deneysel süreç sırasında, kararsız antikorlar, sinyal dalgalanmaları ve reaktanların çapraz reaktivitesi gibi teknik sorunlar ortaya çıkabilir. Bu sorunları ele almak için, antikor stabilitesini iyileştirmek için kararlı antikor çözücülerinin kullanımını ve deneysel koşulların optimizasyonunu ve ayarlanmasını içeren daha kararlı bir deneysel protokol benimsedik. Ek olarak, sinyal dalgalanmalarının neden olduğu hatayı ele almak için, sonuçların tutarlılığını sağlamak için standart 8-okso-dG numuneleri kullanarak deneyi standartlaştırdık.

Deneysel yöntemin sınırlamaları ile ilgili olarak, ELISA yüksek verimli bir yaklaşım sağlasa da, yine de spesifik antikor kapsamı ve kaçınılmaz substrat çapraz reaktivitesi32 ile sınırlı olabilir. Bu nedenle, karmaşık numuneler için ek numune saflaştırma veya ön işleme adımları gerekebilir. Ayrıca, daha düşük konsantrasyonlara sahip numunelerin tespiti, araştırma gereksinimlerini karşılamak için antikor aktivitesinin daha fazla optimizasyonunu gerektirebilir.

Sonuç olarak, 8-okso-dG için ELISA tespit yöntemi, belirli araştırma alanları için önemli çıkarımlara sahiptir. Çevresel izleme, hastalık risk değerlendirmesi ve erken teşhiste potansiyel uygulama değerine sahiptir ve tarım, gıda güvenliği ve ilaç taramasında 8-oxo-dG için yeni bir tespit yaklaşımı sağlar33. Örneğin, çevresel biyoizlemede, organizmalardaki çevresel toksinlerin neden olduğu DNA oksidatif hasar stresinin tespiti, potansiyel risklerin zamanında belirlenmesine yardımcı olabilir34. Gelecekte, algılama teknolojisinin daha da optimizasyonu ve birden fazla disiplinde uygulanmasıyla, bu yöntemin yaşam bilimleri araştırmalarında daha kritik bir rol oynaması bekleniyor.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumu Bilim ve Teknoloji için Yenilikçi Araştırma Ekibi (2021), Jiangsu Meslek Yüksekokulu Mühendislik Teknolojisi Araştırma Merkezi Programı (2023), Suzhou Halkının Geçim Teknolojisi Projeleri Anahtar Teknoloji Programı (SKY2021029), Jiangsu Klinik Kaynaklar Biyobankası Açık Projesi (TC2021B009), Radyasyon Tıbbı ve Koruma Devlet Anahtar Laboratuvarı Projesi, Soochow Üniversitesi (GZK12023013), Suzhou Mesleki Sağlık Koleji Programları (SZWZYTD202201) ve Çin'deki Jiangsu Eyaleti Qing-Lan Projesi (2021, 2022).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTA (1x)Gibco25200-072
Hücre Sayma Kiti-8DojindoCK04
Hücre Sayma PlakasıQiuJingXB-K-25
CO2< / alt> inkübatörTermo51032872
DMEM temel (1X)GibcoC11995500BT
FBSPANST30-3302
GraphPad Prism X9GraphPad Yazılımıistatistiksel analiz yazılımı
yüksek hızlı santrifüjThermo  9AQ2861
İnsan 8-okso-dG ELISA KitiZcibioZC-55410
L-1000XLS+ PipetlerRainin17014382
L-20XLS+ PipetlerRainin17014392
sıvı nitrojen tankıMvecryogeYDS-175-216
MCF-7 HÜCRELIBNCCBNCC100137
Multiskan FC mikroplaka fotometreThermo1410101
PBSSolarbioP1020
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100XBeyotimeC0222
Trinoküler canlı hücre mikroskobuMotic1.1001E+12
Ultra düşük sıcaklıklı dondurucuHaireV118574

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med. 107, 13-34 (2017).
  4. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  5. Jaruga, P., Dizdaroglu, M. Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells. Nucleic Acids Res. 24 (8), 1389-1394 (1996).
  6. Fleming, A. M., Burrows, C. J. Chemistry of ROS-mediated oxidation to the guanine base in DNA and its biological consequences. Int J Radiat Biol. 98 (3), 452-460 (2022).
  7. Delaney, S., Jarem, D. A., Volle, C. B., Yennie, C. J. Chemical and biological consequences of oxidatively damaged guanine in DNA. Free Radic Res. 46 (4), 420-441 (2012).
  8. Wang, B., et al. Cross-sectional and longitudinal associations of acrolein exposure with pulmonary function alteration: Assessing the potential roles of oxidative DNA damage, inflammation, and pulmonary epithelium injury in a general adult population. Environ Int. 167, 107401(2022).
  9. Chiorcea-Paquim, A. M. 8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanosine biomarkers of oxidative DNA damage: A review on HPLC-ECD determination. Molecules. 27 (5), (2022).
  10. He, L., Liu, X. L., Zhang, J. J. Simultaneous quantification of urinary 6-sulfatoxymelatonin and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1095, 119-126 (2018).
  11. Lam, P. M., et al. Rapid measurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in human biological matrices using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Free Radic Biol Med. 52 (10), 2057-2063 (2012).
  12. Machella, N., Regoli, F., Santella, R. M. Immunofluorescent detection of 8-oxo-DG and pah bulky adducts in fish liver and mussel digestive gland. Aquat Toxicol. 71 (4), 335-343 (2005).
  13. An, N., Fleming, A. M., White, H. S., Burrows, C. J. Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence. ACS Nano. 9 (4), 4296-4307 (2015).
  14. Xiao, S., Fleming, A. M., Burrows, C. J. Sequencing for oxidative DNA damage at single-nucleotide resolution with click-code-seq v2.0. Chem Commun (Camb). 59 (58), 8997-9000 (2023).
  15. Kong, W., Ji, Y., Zhu, X., Dai, X., You, C. Development and application of a chemical labeling-based biosensing assay for rapid detection of 8-oxoguanine and its repair in vitro and in human cells. Chinese J Chem. 40 (19), 2329-2334 (2022).
  16. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin g. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  17. Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: Immunoassays in DNA damage and instability detection. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4689-4704 (2019).
  18. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. J Invest Dermatol. 133 (9), e12(2013).
  19. Ahirwar, R., Bhattacharya, A., Kumar, S. Unveiling the underpinnings of various non-conventional ELISA variants: A review article. Expert Rev Mol Diagn. 22 (7), 761-774 (2022).
  20. Li, D., et al. Magnetic nanochains-based dynamic elisa for rapid and ultrasensitive detection of acute myocardial infarction biomarkers. Anal Chim Acta. 1166, 338567(2021).
  21. Tabatabaei, M. S., Islam, R., Ahmed, M. Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-pcr assays: A review. Anal Chim Acta. 1143, 250-266 (2021).
  22. Berlina, A. N., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B. ELISA and lateral flow immunoassay for the detection of food colorants: State of the art. Crit Rev Anal Chem. 49 (3), 209-223 (2019).
  23. Amber, K. T., Bloom, R., Hertl, M. A systematic review with pooled analysis of clinical presentation and immunodiagnostic testing in mucous membrane pemphigoid: Association of anti-laminin-332 IGG with oropharyngeal involvement and the usefulness of ELISA. J Eur Acad Dermatol Venereol. 30 (1), 72-77 (2016).
  24. Gervay, J., Mcreynolds, K. D. Utilization of elisa technology to measure biological activities of carbohydrates relevant in disease status. Curr Med Chem. 6 (2), 129-153 (1999).
  25. Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2508, 115-134 (2022).
  26. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  27. Hayrapetyan, H., Tran, T., Tellez-Corrales, E., Madiraju, C. Enzyme-linked immunosorbent assay: Types and applications. Methods Mol Biol. 2612, 1-17 (2023).
  28. Eldahshoury, M. K., Hurley, I. P. Direct sandwich ELISA to detect the adulteration of human breast milk by cow milk. J Dairy Sci. 106 (9), 5908-5915 (2023).
  29. Tsumuraya, T., Hirama, M. Rationally designed synthetic haptens to generate anti-ciguatoxin monoclonal antibodies, and development of a practical sandwich ELISA to detect ciguatoxins. Toxins (Basel). 11 (9), 533(2019).
  30. Ito, E., Iha, K., Yoshimura, T., Nakaishi, K., Watabe, S. Early diagnosis with ultrasensitive elisa). Adv Clin Chem. 101, 121-133 (2021).
  31. Larsson, P., Parris, T. Z. Optimization of cell viability assays for drug sensitivity screens. Methods Mol Biol. 2644, 287-302 (2023).
  32. Gunawardana, C. G., Diamandis, E. P. High throughput proteomic strategies for identifying tumour-associated antigens. Cancer Lett. 249 (1), 110-119 (2007).
  33. Zhang, S., et al. Development of a das-ELISA for gyrovirus homsa1 prevalence survey in chickens and wild birds in China. Vet Sci. 10 (5), 312(2023).
  34. Li, Y., Sun, J., Shang, H. Effect of hogg1 expression level on oxidative DNA damage among workers exposed to nickel in stainless steel production environment. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 32 (8), 578-581 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

8 Oxo dG NicelendirmesiHidrojen Peroksit UygulamasDNA Hasar TespitiH cre Canl l AnaliziOksidatif Stres BelirteciSandvi ELISADNA Hasar Belirteci

İlgili makaleler