Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sıçanlarda Supra-Çölyak Aort Çapraz Klemplemesi ile Viseral İskemi-Reperfüzyonu Takiben Akut Akciğer Hasarı Modeli

926 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66896

⸱

15 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, sıçanlarda laparotomi ile supra-çölyak aort çapraz klemplemesi sırasında viseral iskemi-reperfüzyonu takiben akut akciğer hasarı modeli anlatılmaktadır. Aort klemplemesinin hem klinik hem de biyolojik etkilerinin yanı sıra iskemi-reperfüzyonun altta yatan organlar ve uzak akciğer yaralanmaları üzerindeki etkisinin araştırılmasını sağlar.

Özet

Abdominal aort anevrizmaları için açık cerrahi, kan dolaşımının geçici olarak kesilmesini gerektirir ve bu da aşağı akış organlarının iskemi-reperfüzyonuna neden olur. Böbrek, mezenterik ve splanknik arterler tutulabilir. Supra-çölyak aort klemplemesi sonrası iskemi-reperfüzyonun neden olduğu uzak akciğer hasarını önlemede etkili olduğu kanıtlanmış bir tedavi yoktur. Akut akciğer hasarının patofizyolojik yolaklarını ve farmakolojik tedavileri incelemek için, sıçanlarda deneysel bir aort klempleme modeli geliştirilmiştir.

İşlem öncesi Buprenorfin ile subkutan analjezi (0.05 mg/kg) uygulanır. Spontan ventilasyon ile genel anestezi, bir maske aracılığıyla halojen gaz (İzofluran% 2.5) kullanılarak indüklenir. Isıtılmış bir masada ksifo-pubik laparotomi yapılır (sıcaklık intrarektal olarak izlenir). Gastrosplenik blok ve bağırsaklar sağ kanada geri çekilir ve karaciğer üst karın bölgesine mobilize edilir. Diyafram ve sütunları, supra-çölyak aortunun intradiyafragma geçişinden adım adım salınmasına izin verecek şekilde tanımlanmıştır. Diseksiyon, diyafram direkleri arasındaki aortun çevresel kontrolünü sağlamak için nazikçe yapılır. Altta yatan çölyak gövdesi ve süperior mezenterik arter dikkatlice tanımlanır. Viseral arterlerin üzerindeki aort tıkanıklığı için bir mikrovasküler klemp kullanılabilir. Uygun klempleme, ince bağırsağın solukluğu ile ilişkili aort pulsatilitesinin olmaması ile doğrulanır. Sıçan, iskemi süresi boyunca anestezi altında kalır. İskemi süresinin sonunda, mikroklemp çıkarılır ve aort pulsatilitesi ve bağırsakların yeniden renklenmesi kontrol edilir. Karın duvarı bir dikişle kapatılır, ardından sıçanın derisi kapatılır. Reperfüzyon süresinin sonunda hayvan aynı şekilde uyuşturulur. Kan örneklemesi sırasında kan kaybı ile ötenazi yapılır ve daha sonra akciğer toplanabilir. Akciğer hasarı kan gazı analizi, akciğer gravimetrisi ve histolojik inceleme ile değerlendirilebilir. Akciğer örnekleri ayrıca RT-PCR ve Western blot analizleri için de kullanılabilir.

Giriş

Aort anevrizması, aortun fokal ve kalıcı bir genişlemesidir1. Bir anevrizmanın evrimi, önemli mortalite taşıyanmasif kanama ile ilişkili yırtılmaya eğilimlidir 2. Bu nedenle, tedavinin odak noktası bu dramatik komplikasyonun önlenmesinde yatmaktadır. Aort anevrizmaları en sık böbrek altıdır ve aort endoprotezi ile tedavi edilebilir. Bir aorto-bi-iliak endogreft, perkütan bir yaklaşım kullanılarak femoral arterlerden minimal invaziv bir şekilde sokulan kapalı çatallı bir stenttir. Bu teknik aort klemplemesi gerektirmez ve viseral iskemiye neden olmaktan kaçınır. Lokal anestezi altında yapılabilir. Buna karşılık, torakoabdominal anevrizmalar ve kompleks abdominal aort anevrizmaları gibi daha geniş aort anevrizmalarının endovasküler teknikler kullanılarak tedavi edilmesi daha zordur. Bunun nedeni renal arterler, superior mezenterik arter ve çölyak gövdesinin anevrizmal segment içinde tutulumudur (Şekil 1). Bu majör viseral arterler, aortun kendisine ek olarak yeniden yapılandırılmalıdır. Bu nedenle endovasküler, minimal invaziv yaklaşım, viseral arter rekonstrüksiyonu için fenestre ve/veya dallı endogreftlerin kullanımını içeren daha karmaşık bir prosedür gerektirir. Bu endogreftlerin ana sınırlaması, uzun üretim süresidir - genellikle birkaç ay - bu da onları acil tedavi için uygun hale getirmez. Bu gibi durumlarda, konvansiyonel açık cerrahi onarım uygulanabilir ve güvenilir bir seçenek olmaya devam etmektedir.

Açık onarım ile tedavi, laparotomi ve supra-viseral klempleme, yani geçici viseral iskemi gerektirir. Bu torakoabdominal anevrizmaların tedavisi sırasında komplikasyon oranı yüksektir. Mortalitesi %5 ile %15 arasında değişmektedir3. Pulmoner komplikasyonların %60'ında, renal komplikasyonların %40'ında görülür4. Sistemik bir inflamatuar yanıtla ilişkili bu komplikasyonlar, multi-viseral yetmezliğeilerleyebilir5. Bu morbimortalite cerrahi agresiflik, anestezi, analjezi, hemodinamik varyasyonlar, hemorajik şok ve iskemi-reperfüzyon fenomenlerini içeren multifaktöriyel bir hastalıktır. Cerrahi saldırganlık, yaklaşımın torakotomi, frenotomi, lumbotomi veya laparotomi içerip içermediği, ventilasyon mekaniğini değiştirerek, özellikle diyafram fonksiyonunun bozulmasıyla birlikte komplikasyonların tezahürüne katkıda bulunur6.

Geçici viseral iskemi reperfüzyonu, sindirim sistemi, splanknik sistem, böbrekler ve alt ekstremiteler dahil olmak üzere aşağı akış organlarını etkiler7. Pulmoner komplikasyonlar torakoabdominal aort cerrahisini takiben en sık görülen advers olaylardır. Kökenleri çok faktörlüdür. Supraselyak aort klemplemesi direkt olarak pulmoner iskemi-reperfüzyona neden olmaz. Bununla birlikte, aşağı akış viseral organların iskemi-reperfüzyonu majör bir sistemik inflamatuar yanıtı tetikler. Viseral iskemi-reperfüzyon ile uzak yaralanma - özellikle akciğer hasarı - arasında nedensel bir bağlantı olduğu hipotezi iyi desteklenmektedir. Alveolar-kılcal zarın kritik bir bileşeni olan pulmoner endotel disfonksiyonu, Akut Akciğer Hasarı (ALI) gelişiminde merkezi görünmektedir. Büyük bir sistemik inflamatuar yanıt ve nötrofillerin aktivasyonu bu süreçte çok önemli bir rol oynar.

ALI genellikle klinik prezentasyondan ziyade histolojik kriterlere göre tanımlanır. ALI, pulmoner endotel ve epitel bariyerlerinin bozulması ile karakterize akut enflamatuar bir bozukluğu ifade eder. Akciğerin fonksiyonel birimi olan alveolar-kılcal zar üç bileşenden oluşur: mikrovasküler endotel, interstisyel boşluk ve alveolar epitel.

ALI'nin ayırt edici özelliği, nötrofil infiltrasyonu ve sitotoksik proinflamatuar mediatörlerin salınması ile yönlendirilen bu bariyerin artan geçirgenliğidir. Alveoler epitel hasarı hem tip I hem de tip II pnömositleri içerir. Alveolar yüzeyin %95'ini kaplayan tip I hücreler, yaralanmaya karşı oldukça hassastır ve gaz değişiminde önemli bir rol oynar. Daha fazla sayıda ancak daha küçük bir alanı kaplayan Tip II hücreler, yüzey aktif madde üretimi, epitel onarımı ve iyon taşınması için gereklidir. Yaralanmayı takiben, tip II hücreler, rejeneratif kapasiteleri ve tip I hücrelere farklılaşmaları yoluyla alveolar bütünlüğün restorasyonuna katkıda bulunur.

ALI sırasında epitel hasarında çoklu hücre ölüm yolları rol oynamıştır ve tip I hücreler özellikle savunmasızdır. ALI yaygın olarak, endotel disfonksiyonunu yansıtmak için mikrovasküler geçirgenlik ölçümleri olsun veya olmasın pulmoner ödemin değerlendirilmesiyle değerlendirilir.

Bu modelin amacı, Şekil 2'de gösterildiği gibi hem metabolik hem de mekanik seviyelerde viseral iskemi-reperfüzyon ile uzak akciğer hasarı gelişimi arasındaki bağlantıyı araştırmaktır. Bu özel bağlantı sadece kısmen anlaşılmıştır. Aort klempleme modelimiz, sıçanlarda abdominal aort anevrizması olmaksızın sağlıklı bir aort üzerinde viseral iskemi-reperfüzyon senaryosunu temsil eder. Çölyak gövdesinin üstünde, ne insanlarda ne de sıçanlarda ana dallar yoktur. Bu seviyenin üzerindeki aort, sadece torasik duvarı besleyen küçük parietal dallara yol açan supra-çölyak aorta karşılık gelir. Bu nedenle, insanlar ve sıçanlar arasında bu seviyedeki ana damarların vasküler anatomisinde önemli bir fark yoktur.

Bu modelin kullanılması, kapsamlı araştırmalara izin verir. Uzak doku yaralanmasının gelişiminde erken biyobelirteçlerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Ek olarak, bu model, dolaşımdaki aracıların inhibitörleri veya belirli uzak organ yaralanmalarının inhibitörleri dahil olmak üzere potansiyel inhibitörlerin incelenmesini sağlar.

Diğer iskemi-reperfüzyon modelleri uzak yaralanmaları incelemek için kullanılır. Serebral, intestinal ve renal iskemi-reperfüzyon modelleri güçlü bir şekilde temsil edilmektedir 8,9,10. Superior mezenterik arterin (SMA) geçici tıkanıklığına bağlı intestinal iskemi-reperfüzyon sonrası pulmoner hasar hakkında kapsamlı araştırmalar vardır11,12,13. İskemi ve reperfüzyon süreleri son derece değişkendir, dakikalar ile birkaç saat arasında değişir14,15. İskemi süresinin mantığı, uzak yaralanmaların ortaya çıkmasına yol açan önemli bir yanıtı tetiklemek için yeterli saldırganlığı indüklemektir. Çok kısa bir iskemi süresi, çalışılan metabolik yolda önemli bir değişikliğe neden olmayabilir. Reperfüzyon süresi ile ilgili olarak, gerekçe, uzak yaralanmaların erken başlangıcında ve patofizyolojik değişikliklerin potansiyel olarak geçici doğasında yatmaktadır. İdeal bir reperfüzyon süresi, metabolik bozukluğu yeterince karakterize etmek için çok erken veya çok geç olmamalıdır.

Modeller esas olarak kemirgenlerdedir. Kemirgenlerin avantajları arasında küçük boyutları, bakım kolaylığı, kısa yaşam döngüsü ve bol genetik kaynakları sayılabilir16. Domuzlar, köpekler veya primatlar gibi büyük hayvanların kullanımı, arıtma ile ilgili hayvan deneylerinin etik kurallarıyla uyumlu olan ek faydaların yokluğunda haklı görünmemektedir. Ayrıca, insanlara anatomik, fizyolojik ve genetik benzerlikleri nedeniyle, kemirgenler translasyonel çalışmalara izin verir16.

SMA klempleme modellerinin temel sınırlamalarından biri, klinik uygulamada, bağırsak iskemi döneminin başlangıcının tanımlanamamasıdır. Bu, insan klinik durumlarına ekstrapolasyonu daha belirsiz hale getirir. Buna karşılık, kompleks aort cerrahisi sırasında, farklı organların iskemi ve reperfüzyon dönemleri açıkça tanımlanır. Ayrıca, supra-çölyak aort klemplemesi sırasında, altta yatan tüm iç organlar iskemik bir dönemdedir (sindirim sistemi, karaciğer, dalak, böbrekler, pelvik organlar ve alt ekstremiteler). Bu organların tümü iskemi-reperfüzyon fenomenine uğrar. Tersine, belirli bir organa (bağırsak, böbrek, karaciğer vb.) odaklanan iskemi-reperfüzyon modelleri, aort klempleme modelleri ve dolayısıyla metabolik patofizyolojiye sahip çoklu organların iskemi-reperfüzyonu modelleri daha az çalışılmıştır. Benzer şekilde, aort klemplemesi sonrası pulmoner lezyonlar gibi uzak yaralanmalar metabolizma açısından zayıf bir şekilde incelenmiştir17,18.

Mevcut aort klempleme modelleri öncelikle abdominal aortun renal arterlerin altına klemplenmesine odaklanmıştır. Bu modelin sınırlaması, viseral iskemi-reperfüzyonu indüklememesidir. Bu nedenle, viseral iskemi-reperfüzyon ile potansiyel uzak yaralanmalar arasında bir bağlantının gösterilmesine izin vermez18,19. Ayrıca, aort klempleme yoluyla iskemi-reperfüzyonun incelenmesine izin veren bir in vitro model yoktur, bu nedenle in vivo modeller kullanılarak analiz gereklidir.

Bu nedenle, sıçanlarda supra-çölyak aort klemplemesinin bu deneysel modeli, uzak akciğer yaralanmalarını hedef alan patofizyolojik mekanizmalar ve farmakolojik müdahaleler hakkında kapsamlı bir araştırmayı kolaylaştırmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu modelin oluşturulması, hayvan bakımı ve deneyleri için yönergelerin yanı sıra Fransız ve Avrupa mevzuatına uygundur. Bu model, Normandiya, Rouen, Fransa'daki Bölgesel Üniversite Etik Komitesi tarafından onaylanan bir deney hayvanı çalışmasında doğrulanmıştır (n°APAFIS: #18974).

1. Hayvan modeli ve iklimlendirme

  1. Hayvan modeli adaptasyon süreci
    NOT: Model, iyileştirme ilkelerine bağlıdır.
    1. Ameliyat öncesi adaptasyona izin vermek için hayvanları bir hafta boyunca aşırı kalabalık olmayan tesislerde barındırın.
    2. Fareleri, deneyimli personel tarafından günlük olarak kontrol edilecek olan su ve yiyeceğe ad libitum erişimi ile kafes başına iki kez barındırın.
    3. Yatak takımlarının (kağıt şeritler) temizliğini günlük olarak kontrol edin ve gerekirse deneyimli personel tarafından haftada iki kez veya daha fazla sistematik olarak değiştirin.
    4. Deneyci ile günlük temas halinde olacakları ve 12 saatlik aydınlatma döngülerine maruz kalacakları bir haftalık bir iklimlendirme döneminden sonra, prosedürler aynı deneyci ile ayrı, sessiz bir odada gerçekleştirilecektir.
  2. Hayvan modeli türleri
    1. Akredite ve sertifikalı bir yetiştirme tesisinden alınan viseral iskemi-reperfüzyon fizyopatolojisinin analizinde östradiol gibi hormonal etkilerden kaçınmak için erkek Wistar veya Sprague Dawley sıçanlarını kullanın11,20.
    2. Deney gruplarını ve grup başına düşen hayvan sayısını önceden belirleyin.
    3. Yaşı seçin, 6-10 haftalık sıçanların (350 g) kullanılması önerilir.

2. Anestezi ve analjezi

  1. Analjezi
    1. İşlem gününde her hayvanı tartın.
    2. İşlemden 1 saat önce sıçanın sırt derisi seviyesinde deri altına buprenorfin (0.05 mg / kg) analjezik amaçlı analjezik amaçlı 25 G iğne ve 2 mL şırınga ile uygulayın.
    3. Lidokain hidroklorür jeli% 1'i karın derisine, gelecekteki cilt kesisi seviyesinde uygulayın. Sıçanlarda ağrının yüz ifadelerini değerlendirmek için bir ölçek kullanarak ameliyat sonrası ağrıyı düzenli olarak (günde en az iki kez) yeniden değerlendirin21.
    4. İlk 24 saat boyunca, her 8 saatte bir sistematik deri altı buprenorfin enjeksiyonları (0.01 ila 0.05 mg / kg) uygulayın.
    5. Daha sonra, Ulusal Araştırmada Hayvanların Değiştirilmesi, İyileştirilmesi ve Azaltılması Merkezi'nin yüz ağrısı ölçeğine dayalı olarak buprenorfin enjeksiyonları (0.01 ila 0.05 mg / kg) uygulayın ve gerekirse her 8 saatte bir tekrarlayın21.
  2. Genel anestezi
    1. Genel anestezi için halojenli gazlar (İzofluran) kullanın22.
    2. İndüksiyon aşaması için 2 dakika boyunca 2 L / dak hava akış hızında izofluran (% 5) içeren havalandırmalı bir oda kullanın.
    3. Anestezinin sürdürülmesi için, sıçanı, ameliyat boyunca 2 L / dk'lık bir hava akış hızında izofluran (% 2-2.5) ile spontan ventilasyon için özel olarak takılmış bir maskeye geçirin.
    4. Maske aracılığıyla ventilasyona izin vermek için dili ağız boşluğundan dışarı çıkararak üst solunum yollarını temizleyin.
    5. İşlem sırasında anestezi derinliğini sürekli olarak izleyin ve İzofluran konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın.

3. İşlem sırasında sıçan yerleştirme

  1. Sıçanın fizyolojik eklem hareket aralıklarına saygı gösterirken, ön ve arka bacakları yapışkan bant kullanılarak hareketsiz hale getirilerek sıçanı sırt yaslığına yerleştirin.
  2. Fareyi, rektal sıcaklığın izlenmesi ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma pedine yerleştirin.
  3. Dacryogel uygulayarak gözleri koruyun. Karın kürkünü tıraş edin ve karnı povidon-iyot çözeltisi ile iyice dezenfekte edin.

4. Cerrahi prosedür

  1. Cerrahi işlemin durumu
    1. Vazgeçilmez olmasa da, hassas manevraları kolaylaştırmak için prosedürü mikrocerrahi bir büyüteç altında gerçekleştirin.
  2. Kesi
    1. İnsizyonun üst sınırında ksifoid sürecin palpasyonunu takiben, karın kaslarının linea alba'sını ortaya çıkaran karnın ortasındaki cildi kesin.
    2. Karın kaslarından kanamayı önlemek için linea alba üzerinde karın kasının merkez kesisi.
  3. Karın içi teşhir
    1. Karın duvarını her iki tarafta kendinden tutucu ekartörlerle koruyun.
    2. Anomalilerin (tümörlerin) olmadığından emin olun, iç organları, mideyi, dalağı ve karaciğeri karnın sağ tarafına mobilize edin ve ardından supra-çölyak aortunu açığa çıkarın.
    3. Küçük bir kompres ile tüm iç organları mümkün olduğunca karın içinde tutun, uzunlamasına katlayın ve ılık (37 ° C) tuzlu su çözeltisine batırın.
    4. Hipotermi ve dehidrasyonu önlemek için tüm iç organları 37 ° C'ye ısıtılmış tuzlu su çözeltisine batırılmış bir kompres ile örtün.
  4. Başlıca karın içi damarların tanımlanması
    1. Supra-çölyak aortunu nabız atışları ve diyafram direkleri arasındaki konumu ile tanımlayın.
    2. Aortu mümkün olduğunca atravmatik olarak serbest bırakmak için pamuk uçlu aplikatörler ve diseksiyon forsepsleri kullanılarak nazik ve dikkatli diseksiyon ile diyafram direkleri arasındaki aortun kontrolü.
    3. Supra-çölyak aortu diseksiyon ve ligatür forseps ile 5-0 monofilament sütür kullanarak çevreleyin.
    4. Çölyak gövdesinin ve altta yatan mezenterik arterin kökenini doğrulayın. Bu cerrahi işlemin süresi sıçan başına 10 ila 15 dakikadır.
    5. Subrenal inferior vena kavanın altta yatan tanımlanması, retroperitonun şeffaflığı nedeniyle kolaydır.
    6. Subrenal inferior vena kava'yı sadece ön yüzeyinde serbest bırakın, bu da herhangi bir farmakolojik ajanın doğrudan intravenöz olarak uygulanmasına izin verir.
  5. İntravenöz enjeksiyon
    1. Bu amaçla, enjeksiyon için 30 G'lik bir iğne kullanın ve hemostaz elde etmek için birkaç milimetre hemostatik kompres yerleştirin.
    2. Farmakolojik ön koşullandırma yapılıyorsa, enjeksiyonu aort klemplemesinden önce uygulayın. Şartlandırma sonrası tedavi için, aort klemplemesi sırasında veya sonrasında uygulayın.
    3. Bu protokol farmakolojik ön koşullandırmayı inceledi, bu nedenle aort klemplemesinden 5 dakika önce uygulayın.
  6. İskemik dönem
    1. Çölyak aortunu 40 dakikalık iskemik dönemin tamamı boyunca atravmatik mikrovasküler klemp ile klempleyin. Altta yatan aort nabızlarının kaybolması ve klempleme sırasında iç organların ve uzuvların renginin birden çok kez değişmesi ile klempin etkinliğini doğrulayın.
    2. Su ve ısı kaybını sınırlamak için üç basit 5-0 örgülü emilebilir sütürle karın bölgesini kısmen kapatın. Cerrahi insizyonu, tüm iskemi süresi boyunca ılık tuzlu su çözeltisine batırılmış steril bir kompres ile örtün.
  7. Reperfüzyon dönemi
    1. İskemik dönemin sonunda, karnı tekrar açın ve aortu daha önce tarif edildiği gibi ortaya çıkarın.
    2. Vasküler kelepçeyi çıkarın ve altta yatan aort pulsatilitesinin yeniden başladığını ve iç organların ve uzuvların yeniden renklendiğini doğrulayın. Reperfüzyon süresi, mikrokelepçenin çıkarılmasından hemen sonra başlar.
  8. Karın kapanışı
    1. İç organları orijinal pozisyonlarına geri getirin ve linea alba üzerinde 5-0 örgülü emilebilir sütür ile karın bölgesini ve 5-0 monofilament emilebilir sütür ile cildi kapatın.
  9. Hayvan uyanışı
    1. İnferior vena kava'yı viseral kitle ve hipovolemi bağlamı tarafından sıkıştırmayı önlemek için fareyi sol lateral dekübit pozisyonuna yerleştirin. Yaklaşık 10 dakika sonra uyanana kadar sıcaklığı korumak için fareyi bir ısı lambası olan ayrı bir kafese yerleştirin.
  10. İkinci genel anestezi
    1. 180 dakikalık reperfüzyon süresinin sonunda, indüksiyon fazı için 2 dakika boyunca 2 L / dk hava akış hızında izofluran (% 5) ile havalandırılan bir odadan aynı gaz anestezisini kullanarak sıçanı anestezi altına alın.
    2. Anestezinin sürdürülmesi için, sıçanı, doku toplama süresi boyunca 2 L / dk'lık bir hava akış hızında izofluran (% 2-2.5) ile spontan ventilasyon için özel olarak takılmış bir maskeye geçirin.

5. Örnekleme

  1. Kan örnekleri
    1. 23 G'lik bir iğne ve 5 mL'lik bir şırınga kullanarak, böbrek damarlarının altındaki inferior vena kavaya doğrudan delme yoluyla kan örnekleri toplayın.
    2. Küçük bir parça hemostatik kompres uygulayarak ponksiyonu takiben hemostaz elde edin.
    3. Gaz için toplam kanın küçük bir kısmını (100 μL) kullanın ve tek bir oda sıcaklığında test kartında standart kan analizi yapın.
    4. Kalan tam kanı 4 mL'lik bir EDTA tüpünde toplayın ve +4 °C'de 10 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
    5. Plazmayı kriyotüplerde sıvı nitrojen içinde dondurun ve analize kadar -80 ° C'de saklayın.
  2. Doku örnekleri
    1. Doku örneklemesi
      1. Hayvanın ötenazisi sırasında doku örneklerini (akciğer, bağırsak, böbrek, karaciğer ve kalp) toplayın. Daha önce belirtildiği gibi aynı protokole göre izofluran ile genel anesteziden sonra kan kaybına yol açan kan örneklemesi ile ötenazi gerçekleştirin.
      2. Açık karın boyunca, her dokudan 50 mg alın: sol böbreğin üst kutbu, sol hepatik lob ve çekumdan 1 cm önce distal ince bağırsak.
      3. Ardından, kalbi ve akciğerleri tanımlamak için hızlı bir şekilde medyan sternotomi yapın.
      4. Sol akciğeri ligamentinden kurtarın ve histolojik analiz için tamamen çıkarın. Sağ multiloblu akciğeri bağlarından kurtarın. Nükleik asit ve protein analizleri için ön lobu ayırın, geri kalanını fizyolojik serum içeren bir kapta 37 ° C'de birkaç dakika saklayın ve daha sonra gravimetri yapın.
      5. Kalbi, aort, pulmoner arter ve her iki vena kava bölümleri ile bütün bir blok olarak çıkarın. Nükleik asit ve protein analizleri için sol ventrikülden bir parça numune alın, geri kalanını daha sonra gravimetri yapmak için birkaç dakika boyunca fizyolojik serum içeren bir kapta 37 ° C'de saklayın.
    2. Nükleik asit analizi
      1. Nükleik asit analizi için hemen 50 g'lık bir doku parçası toplayın. Sıvı nitrojen içinde dondurun ve analize kadar -80 °C'de saklayın.
      2. Üreticinin protokolüne göre yüksek kaliteli toplam RNA'nın izolasyonu için kullanıma hazır reaktif ile toplam RNA'yı çıkarın.
      3. RNA konsantrasyonunu ve saflığını bir spektrofotometre ile belirleyin. RNA konsantrasyonunu, boş referans olarak 2 μL RNaz içermeyen su ile 2 μL numune kullanarak ölçün. RNA konsantrasyonunu belirlemek için 260 nm'de absorbansı kullanın.
        NOT: Kabul edilebilir RNA saflığı, 1.7 ile 2.0 arasında değişen 260/280 ve 260/230 absorbans oranı olarak tanımlanmıştır.
      4. Ters transkripsiyon için her RNA örneğinden 1 μg kullanın.
      5. Proinflamatuar sitokinlerin (IL-1beta, TNF-alfa, IL-6) ve dahili bir referansın (beta2-mikroglobulin) mRNA seviyelerini, kullanıma hazır sıcak başlatma reaksiyonu karışımını kullanarak entegre gerçek zamanlı, çevrimiçi algılama özelliklerine sahip hızlı, plaka tabanlı, termal blok döngüleyicide gerçek zamanlı bir polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile ölçün (Primerler Tablo 1'de listelenmiştir).
      6. 2-ΔΔCT yöntemini kullanarak bağıl mRNA seviyesini hesaplayın.
    3. Protein analizi
      1. Protein analizi için, elli adet 2.8 mm zirkonyum oksit seramik boncuk içeren 2 mL'lik bir parçalama tüpüne 50 mg doku yerleştirin. Bu parçalama tüpü, bir proteaz inhibitör tableti ve bir fosfataz inhibitörü tableti ile 1 mL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu içerir.
      2. Laboratuvar tüp değirmeninde 3 tekrar 5 sn kontrol ve ardından 10 sn dinlenme periyodu ile homojenizasyon yoluyla numunelerden protein ekstrakte edin.
      3. Numuneleri 10.000 g'da +4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanları analize kadar -20 °C'de kriyotüplerde saklayın.
      4. Bradford bazlı bir protein tahlili yöntemi ile protein konsantrasyonlarını belirleyin ve numuneleri -80 °C'de tutun.
      5. SDS-PAGE kullanarak her numuneden eşit miktarda protein ayırın.
      6. Ayrılmış proteinleri 0.2 μm nitroselüloz membranlara aktarın.
      7. % 5 TBS-Tween yağsız kuru süt ile bloke ettikten sonra, tercih edilen spesifik proteine karşı bir primer antikor ile 1 saat boyunca membranı inkübe edin. Örneğin, heparanazı araştırmak için, insan heparanazına karşı bir tavşan poliklonal primer antikoru (seyreltme 1:2000) ve GAPDH olarak bir kontrol proteini kullanın, gece boyunca 4 ° C'de GAPDH'ye karşı bir keçi monoklonal primer antikoru (seyreltme 1:5000) kullanın.
      8. Lekeleri TBST-Tween% 0.1 tampon ile üç kez yıkayın.
      9. Bloke edici çözeltide 1 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) birincil antikora karşı yönlendirilmiş HRP ile konjuge bir ikincil antikor ile inkübe edin. Örneğin, heparanazı araştırmak için keçiyi tavşan ikincil antikoruna karşı kullanın (seyreltme 1:5000) ve GAPDH'yi keşfetmek için tavşanı keçi ikincil antikoruna karşı kullanın (seyreltme 1:10000).
      10. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) tespit sistemini kullanarak bağışıklık komplekslerini tespit edin.
      11. Dahili kontrol olarak GAPDH'yi kullanarak hedef bantların densitometrik değerlerini belirlemek için özel yazılım kullanarak membranları analiz edin. Heparanaza (50 kDa) karşılık gelen bandın dansitometrik analizini yapın ve nispi sinyal yoğunluğunu belirlemek için bunu GAPDH protein bandına (35 kDa) normalleştirin.
    4. Histolojik analiz
      1. Histolojik analiz için, sol unilobar akciğeri hilusta alın, ardından 16 G'lik bir kateter kullanarak sol ana bronştan bir kriyoprezervasyon solüsyonu ile infüze edin. Sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 °C'de saklayın.
    5. Gravimetri analizi
      1. Nükleik asit ve protein analizi için numunelerden sonra, kalbin ve sağ multilobüler akciğerin kalan kısmını gravimetri ile analiz edin, 70 ° C'de fırınlarda kurutma ile ıslak/kuru ağırlık oranının doku ödemi tahmini sağlamasına izin verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün güvenli olduğu, anestezi ve cerrahi sırasında minimum hayvan kaybı (%5'ten az) olduğu ve akut akciğer hasarının indüksiyonu için etkili olduğu bulundu. İzofluran ile anestezi, hızlı uyanma ve daha iyi sıçan iyileşmesi ile (veriler gösterilmemiştir) ksilazin anestezisi (yaklaşık% 15 kayıp) ile kombine edilen ketaminden daha güvenliydi. Anestezi uygulanan tüm hayvanlara bu yöntemle güvenli ve etkili aort klemplemesi yapılabildi. Etkili aort klemplemesi olan tüm hayvanlar (% 100) sırasıyla 40 dakika ve 3 saat ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Aort çapraz klemplemenin bu cerrahi modeli, viseral iskemi-reperfüzyonu takiben akut akciğer hasarının hem doku bazlı hem de plazma bazlı kapsamlı bir analizine izin verme avantajını sunar. Ayrıca, ön veya son koşullandırmada intraperitoneal, enteral veya intravenöz uygulama ile farmakolojik molekülleri test etme fırsatı sağlar.

Kritik adımlardan biri ameliyat sırasında suprakeliak aort klemplemesidir. Ana sayfa oluşturulduğunda, bu adım hızlı bir şekilde gerç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 &mikro; m nitroselüloz membranlar Trans-Blot Turbo Transfer PaketiBiyo-Rad16201500.2 &mikro; m nitroselüloz membranlar önceden kesilmiş
1cc Luer Slip şırınga iğnesizTerumoMDSS01SE1cc Luer Slip şırınga iğnesiz
2cc Luer Slip şırınga iğnesizBecton Dinckinson2cc Luer Slip şırınga iğnesiz
4 mL EDTA tüp BD K3 13 mm x75 mmBD VacutainerBD3688605 mL EDTA tüp BD K3 13 mm x 75 mm
5-0 örgülü sütür / Vicryl 5-0 (Ethicon) veya Novosyn (B. Braun)Ethicon - Johnson ve JohnsonV7970E SerisiVicryl 5-0 İğne Konik Nokta 1/2 daire 13 mm Uzunluk 45 cm
5-0 monofilament emilebilir sütür / Monocryil PoliglecaproneEthicon - Johnson ve JohnsonY493Gİğne 3/8 daire Uzunluğu 18in
5cc Luer Slip şırınga iğnesizTerumoSS-05LE15cc Luer Slip şırınga iğnesiz
Atravmatik mikrovasküler klemp/Damar için tek kullanımlık damar klempleriAROSurjiTKF-1-20gSıçan aortunu klemplemek için damar kullanımı için atravmatik mikrovasküler klemp
BD Mikrolans 3 23 G x 1 0,6 x 25 mmBD Vacutainer300800BD Mikrolans 3 23 G x 1 0,6 x 25 mm
BD Mikrolans 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mmBD Vacutainer300600BD Mikrolans 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mm
BD Mikrolans 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mmBD Vacutainer304000BD Mikrolans 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mm
beta-aktin DavetliCarlsbad, Amerika Birleşik Devletleri15G5A11/E2
Bradford tabanlı yöntem protein tahliliBiorad, Marnes-la-Coquette, Fransa5000201
BuprenorfinBuprenorfin
Santrifüj Sigma 3-30Sigma, Almanya10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014Eppendorf için santrifüj cihazı
cOmplete MiniRoche11836153001Proteaz İnhibitörü Kokteyli 25 tablet
Pamuklu çubuk
Dacryogel /  Oküler jel Lubrithal 10 gDechra Veterinerlik ürünleriKod  ACL7376464Oküler jel Lubrithal 10 g
Tek kullanımlık neşterParamountPDSS11Tek kullanımlık skalpel bıçağı n° 11
ElektrokoterDentRMedEMB/87400Yüksek sıcaklığa sahip hemostatik kalem
Gelişmiş ECL Algılama SistemiBiorad, Herkül, Kaliforniya, ABD1705060S
Fisherbrand Boncuk Değirmeni 24Fisher bilimsel15515799Kullanılan  moleküler ekstraksiyondan önce biyolojik numunelerin öğütülmesi, parçalanması ve homojenleştirilmesi
Gazlı bez swablar Raffin.010106Gazlı bez swablar 
ImageLabTM yazılımıBiorad HakkındaUSB sürücüsünde veya lisansta
İzofluran %5İzofluran %5
Lidokain Prilokain jel %5 Aguettant, Lyon, FransaLidokain Prilokain jel %5 
LightCycler 480 CihazıRoche, Bâ le, İsviçre5015243001termal döngüleyici
Kayganlaştırıcı Jöle Steril K-Y 82 gRECKITT BENCKISERKayganlaştırıcı Jöle Steril K-Y 82 g
Nano Damla 2000TermoScientific, Waltham, Massachusetts, ABDND-2000 SerisiSpektrofotometre
Peha Pince anatomikHartmann991063Anatomik pense
FosSTOPRoche4906837001fosfataz inhibitörü 20 tablet 
Alçı/Yapışkan BantAnapor135320Cerrahi yapışkan bant/alçı
Povione-iyot çözeltisi / Vé té yemek ÇözümüVé TokinolHarici kullanım için antiseptik solüsyon
Precellys Lysing Kit tüp Sert doku homojenleştirici CK28, BertinCK28Precellys Lysing Kit tüp 
Prolè ne Prolipropilen sütürEthicon - Johnson ve Johnson7472HProlè ne 5-0 İğne Konik kesim 3/8 daire 13 mm Uzunluk 75 cm
Safe-Lock tüpler 1,5 mLEppendorf Belediyesi.0030120086Safe-Lock tüpler 1.5cc renksiz Santrifüjleme için 1000 tüp
Safe-Lock tüpler 2 mLEppendorf Belediyesi.0030120094Safe-Lock tüpler 2.0cc renksiz santrifüjleme için 1000 tüp
Güvenli Kilitli Tüpler 5 mLEppendorf Belediyesi.0030119401Safe-Lock tüpler 5.0cc renksiz santrifüjleme için 200 tüp
Tuzlu su çözeltisi NaCl %0,9Aguettant, Lyon, Fransa600502Tuzlu su çözeltisi %0,9 500 mL
SDS-SAYFASigma-Alrich
Surflash IV Kateter 16 GTerumoSR*FF1651 Serisi
SurgicelEthicon - Johnson ve JohnsonHemostatik emilebilir swablar
Dikiş seti n° 12Hartmann4701762Yapışkan şampiyonlu steril sütür seti, sisorlar, Adson pense, iğne tutucu
SYBR Yeşil KIT Işık Döngüsü 480 SYBR Yeşil I MasternRoche4707516001SYBR Yeşil
TBST-Tween 0.1% tampon Sigma-Alrich
Test Kartları Epoc 24 kart 13 parametreSiemens-Sağlık Çalışanları
Doku TEKSakura FinetecKriyoprezervasyon çözeltisi 
TRIzol reaktifi InvitrogenThermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kaliforniya, ABD15596026TRIzol reaktifi

Kaynaklar

  1. Johnston, K. W., Rutherford, R. B., Tilson, M. D., Shah, D. M., Hollier, L., Stanley, J. C. Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Subcommittee on Reporting Standards for Arterial Aneurysms, Ad Hoc Committee on Reporting Standards, Society for Vascular Surgery and North American Chapter, International Society for Cardiovascular Surgery. J Vasc Surg. 13 (3), discussion 245-247 452-458 (1991).
  2. Johansen, K., Kohler, T. R., Nicholls, S. C., Zierler, R. E., Clowes, A. W., Kazmers, A. Ruptured abdominal aortic aneurysm: the Harborview experience. J Vasc Surg. 13 (2), 245-247 (1991).
  3. Cambria, R. P., Clouse, W. D., Davison, J. K., Dunn, P. F., Corey, M., Dorer, D. Thoracoabdominal aneurysm repair: Results with 337 operations performed over a 15-year interval. Ann Surgery. 236 (4), 471-479 (2002).
  4. Feezor, R. J., et al. Genomic and proteomic determinants of outcome in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. J Immunol. 172 (11), 7103-7109 (2004).
  5. Welborn, M. B., et al. The relationship between visceral ischemia, proinflammatory cytokines, and organ injury in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Crit Care Med. 28 (9), 3191-3197 (2000).
  6. Money, S. R., et al. Risk of respiratory failure after repair of thoracoabdominal aortic aneurysms. Am J Surg. 168 (2), 152-155 (1994).
  7. Collange, O., et al. Compartmentalization of inflammatory response following gut ischemia reperfusion. Eur J Vasc Endovasc Surg. 49 (1), 60-65 (2015).
  8. Shi, Y., Han, L., Zhang, X., Xie, L., Pan, P., Chen, F. Selenium alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury by regulating oxidative stress, mitochondrial fusion and ferroptosis. Neurochem Res. 47 (10), 2992-3002 (2022).
  9. Wang, Q., et al. Empagliflozin protects against renal ischemia/reperfusion injury in mice. Sci Rep. 12 (1), 19323(2022).
  10. Wu, M. -B., Ma, B., Zhang, T. -X., Zhao, K., Cui, S. -M., He, S. -C. Propofol improves intestinal ischemia-reperfusion injury in rats through NF-κB pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 24 (11), 6463-6469 (2020).
  11. Breithaupt-Faloppa, A. C., et al. Acute effects of estradiol on lung inflammation due to intestinal ischemic insult in male rats. Shock. 41 (3), 208-213 (2014).
  12. Klausner, J. M., et al. Thromboxane A2 mediates increased pulmonary microvascular permeability following limb ischemia. Circ Res. 64 (6), 1178-1189 (1989).
  13. James, I. A. O., Chen, C. -L., Huang, G., Zhang, H. -Y., Velten, M., Besner, G. E. HB-EGF protects the lungs after intestinal ischemia/reperfusion injury. J Surg Res. 163 (1), 86-95 (2010).
  14. Kannan, K. B., et al. Hypoxia-inducible factor plays a gut-injurious role in intestinal ischemia reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (5), G853-G861 (2011).
  15. Li, Y., et al. Enteral supplementation of alanyl-glutamine attenuates the up-regulation of beta-defensin-2 protein in lung injury induced by intestinal ischemia reperfusion in rats. Int J Surg. 12 (11), 1181-1186 (2014).
  16. Bryda, E. C. The mighty mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  17. Palmier, M., et al. A supraceliac aortic cross clamping model to explore remote lung injury and the endothelial glycocalyx. Ann Vasc Surg. 93, 18-28 (2022).
  18. Ak, E., Ak, K., Ustandag, U. V., Kervancioglu-Demirci, E., Emekli-Alturfan, E., Çetinel, S. Milrinone attenuates heart and lung remote injury after abdominal aortic cross-clamping. Ann Vasc Surg. 69, 391-399 (2020).
  19. Kurt, A., Kalkan, Y., Turut, H., Cure, M. C., Tumkaya, L., Cure, E. Topiramate reduces aortic cross-clamping-induced lung injury in male rats. Acta Medica (Hradec Kralove). 61 (4), 144-149 (2018).
  20. Fantozzi, E. T., et al. Estradiol mediates the long-lasting lung inflammation induced by intestinal ischemia and reperfusion. J Surg Res. 221, 1-7 (2018).
  21. Sotocina, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55(2011).
  22. Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
  23. Annecke, T., et al. Sevoflurane preserves the endothelial glycocalyx against ischaemia-reperfusion injury. Brit J Anaesth. 104 (4), 414-421 (2010).
  24. Pararajasingam, R., Weight, S. C., Bell, P. R. F., Nicholson, M. L., Sayers, R. D. Pulmonary nitric oxide metabolism following infrarenal aortic cross-clamp-induced ischaemia-reperfusion injury. Eur J Vasc Endovasc Surg. 19 (1), 47-51 (2000).
  25. Nielsen, V. G., Baird, M. S., McAdams, M. L., Freeman, B. A. Desflurane increases pulmonary alveolar-capillary membrane permeability after aortic occlusion-reperfusion in rabbits: evidence of oxidant-mediated lung injury. Anesthesiology. 88 (6), 1524-1534 (1998).
  26. Axon, R. N., Baird, M. S., Lang, J. D., Brix, A. E., Nielsen, V. G. PentaLyte decreases lung injury after aortic occlusion-reperfusion. Am J Respir Crit Care Med. 157 (6), 1982-1990 (1998).
  27. Fujimura, N., et al. Neutrophil elastase inhibitor improves survival rate after ischemia reperfusion injury caused by supravisceral aortic clamping in rats. J Surg Res. 180 (1), e31-e36 (2013).
  28. Spanos, K., et al. Transition from open repair to endovascular aneurysm repair for rupture aortic aneurysms throughout a 16-year period of time in a single tertiary center. Ann Vasc Surg. 100, 120-127 (2024).
  29. Hansen, L. W., et al. Sirtuin1 activator SRT1720 protects against organ injury induced by intestinal ischemia-reperfusion. Shock. 45 (4), 359-366 (2016).
  30. Thais Fantozzi, E., et al. Acute lung injury induced by intestinal ischemia and reperfusion is altered in obese female mice. Pulm Pharmacol Ther. 49, 54-59 (2018).
  31. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society Workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  32. Michel, J. -B., et al. Novel aspects of the pathogenesis of aneurysms of the abdominal aorta in humans. Cardiovasc Res. 90 (1), 18-27 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sıçan Cerrahi ModeliSupra-Söyelik AortPulmoner İnflamasyonKan Gazı AnaliziAkciğer HistolojisiPulmoner ÖdemNötrofil İnfiltrasyonu
Sıçanlarda Supra-Çölyak Aort Çapraz Klemplemesi ile Viseral İskemi-Reperfüzyonu Takiben Akut Akciğer Hasarı Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.