Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66899

⸱

19 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  , 
1Ashoka University

Bu makalede

Özet

Burada, düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA oranını artırarak çevresel antimikrobiyal direnci (AMR) değerlendirmek için basit bir teknik sunuyoruz. % 20 -% 30 PEG ve 1.2 M NaCl ile önceki tedavi, hem genomik hem de yatay olarak transfer edilen AMR genlerinin saptanmasına izin verir. Protokol, ek optimizasyon ile kitsiz bir sürece uygundur.

Özet

Çevresel gözetim, pandemi sonrası dönemde halk sağlığını değerlendirmek için önemli bir araç olarak kabul edilmektedir. Su, özellikle atık su, çevredeki patojen yüklerini örneklemek için tercih edilen kaynak olarak ortaya çıkmıştır. Açık kanalizasyonlardan ve topluluk su arıtma tesislerinden gelen atık su, hem patojenlerin hem de antimikrobiyal direnç (AMR) genlerinin bir rezervuarıdır ve sıklıkla insanlarla temas eder. AMR'yi sudan izlemenin birçok yöntemi olsa da, heterojen numunelerden yüksek verimle iyi kaliteli DNA'yı izole etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Telafi etmek için, numune hacimlerinin genellikle yüksek olması gerekir ve bu da pratik kısıtlamalar yaratır. Ek olarak, çevresel DNA sıklıkla parçalanır ve AMR kaynakları (plazmitler, fajlar, doğrusal DNA) düşük moleküler ağırlıklı DNA'dan oluşur. Yine de, az sayıda ekstraksiyon işlemi, doğrusal ve düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın yüksek verimli ekstraksiyonu için yöntemlere odaklanmıştır. Burada, polietilen glikolün (PEG) çökeltme özelliklerini kullanarak küçük hacimli atık sudan yüksek verimli doğrusal DNA ekstraksiyonu için basit bir yöntem rapor edilmiştir. Bu çalışma, doğrusal DNA oranını zenginleştirerek metagenomik analizler için toplanan su örneklerinden elde edilen genel DNA verimini artırmak için bir durum ortaya koymaktadır. Ek olarak, düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın iyileştirilmesi, yüksek moleküler ağırlıklı ve hücre içi DNA'ya odaklanma nedeniyle mevcut yetersiz örnekleme çevresel AMR sorununun üstesinden gelir. Bu yöntemin, hücre dışı DNA mevcut olduğunda, ancak arıtma tesislerinden gelen atık sular gibi düşük konsantrasyonlarda özellikle yararlı olması beklenmektedir. Ayrıca, yatay gen transferi yoluyla yayılan AMR gen parçalarının çevresel örneklemesini de geliştirmelidir.

Giriş

SARS-CoV-2 ve sonrası, bulaşıcı hastalık salgınlarının izlenmesi ve tahmin edilmesinde çevresel sürveyansın öneminin altını çizdi 1,2. Viral pandemiler belirgin olsa da, antimikrobiyal direncin (AMR) yükselişi genellikle sinsi bir pandemi olarak tanımlanır ve dünya çapında önde gelen bir halk sağlığı sorunu oluşturur 3,4. Sonuç olarak, AMR'nin evrimini ve yayılmasını anlamak için koordineli stratejilere acil ihtiyaç vardır. Su kütleleri ve atık su, hem patojenler hem de AMR 5,6,7,8 için rezervuar görevi görebilir. Bu nedenle, paylaşılan su kaynakları, özellikle kötü hijyen ve aşırı nüfusun el ele gittiği düşük ve orta gelirli ülkelerde (LMIC) insanlar arasında güçlü bir hastalık bulaşma kaynağıdır 9,10,11. Su kaynaklarının test edilmesi, toplum sağlığını değerlendirmek için uzun süredir kullanılmaktadır 12,13,14. Son zamanlarda, kentsel atık su arıtma tesislerinden gelen atık su,klinik 1,2,15,16,17,18'deki COVID vakalarının iyi bir ön göstergesi olduğunu kanıtladı.

Belirli hastalıkların izlenmesiyle karşılaştırıldığında, ortamdaki AMR'nin tespit edilmesi ve izlenmesi daha karmaşık bir sorun teşkil eder. Kullanılan çok sayıda antibiyotik, çeşitli direnç genleri, farklı lokal seçim baskıları ve bakteriler arasında yatay gen transferi, gerçek AMR yükünü değerlendirmeyi ve bir kez değerlendirildikten sonra klinik gözlemlerle ilişkilendirmeyi zorlaştırmaktadır 19,20,21,22. Sonuç olarak, klinik AMR'nin uyumlu sürveyansı dünya çapında çeşitli kuruluşlar tarafından yürütülürken 3,23,24, çevresel AMR izlemesi henüz emekleme aşamasındadır ve 19,25,26'da gözden geçirilmiştir.

Son yıllarda, çevresel AMR'nin izlenmesi için farklı yöntemler rapor edilmiştir 5,27, 28,29'da gözden geçirilmiştir. Bunların çoğunun başlangıç noktası, heterojen çevresel örneklerden iyi kalitede DNA'nın çıkarılmasıdır ve bu başlı başına bir zorluktur. Ek olarak, çevresel DNA, düşmanca çevreye maruz kalma nedeniyle tipik olarak parçalanır. Parçalanmış hücre dışı DNA, uzun zamandır AMR genlerinin önemli bir rezervuarı olarak kabul edilmektedir (30,31,32'de gözden geçirilmiştir) ve yatay gen transferi yoluyla bakterilere girme ve bakterilerden ayrılma potansiyeli eklenmiştir. Bu nedenle, ortamdaki AMR yükünü ölçmeyi amaçlayan herhangi bir protokolün, doğrusal ve düşük moleküler ağırlıklı DNA'yı mümkün olan en iyi şekilde örneklemesi önemlidir. Şaşırtıcı bir şekilde, doğrusal ve düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın yüksek verimli ekstraksiyonuna özgü yöntemlerin geliştirilmesine çok az odaklanılmıştır: bu çalışma boşluğu ele almaya odaklanmaktadır.

DNA'yı çökeltmek için yaygın ve basit bir yöntem, polietilen glikol (PEG) ve sodyum klorür (NaCl)33 gibi tuzları birleştirmektir. PEG, DNA fragmanlarının34,35 boyuta özgü çökelmesini sağlamak için kullanılan makromoleküler bir kalabalıklaştırma ajanıdır. PEG konsantrasyonu ne kadar düşükse, verimli bir şekilde çökeltilebilen DNA'nın moleküler ağırlığı o kadar yüksek olur. Birçok çalışma, DNA ve RNA 1,2'nin çevresel ekstraksiyonu sırasında (Tablo 1 17,33,36,37,38,39'da özetlenmiştir) ya son adım 33,36,37'de veya SARS-CoV-2 15,40'ta olduğu gibi viral partiküllerin ekstraksiyonu için büyük su örneklerini konsantre etmek için PEG kullanmıştır. Mevcut çalışmada, daha önce çevresel DNA ekstraksiyonları için kullanılan PEG konsantrasyonlarının (büyük ölçüde viral sürveyans protokolleri tarafından belirlenir) düşük moleküler ağırlıklı doğrusal DNA'yı yakalamadığı bulunmuştur. Bu nedenle, kısa DNA fragmanlarının örneklenmesini kaybederler ve AMR içeriğini doğru bir şekilde değerlendirmek için uygun değildirler. Bu çalışma, polietilen glikol ve sodyum klorürün özelliklerini, düşük moleküler ağırlıklı doğrusal DNA parçalarını, gelecekte uygun maliyetli bir DNA ekstraksiyon yöntemine yol açabilecek yüksek bir verimle etkili bir şekilde çökeltmek için kullanmıştır. Bu yöntem, karmaşık doğal örneklerden parçalanmış ve düşük moleküler ağırlıklı DNA oranını zenginleştirmek ve böylece çevresel AMR'nin daha doğru bir resmini yakalamak için kullanılabilir. Biraz daha ayrıntılandırma ile teknik, yerel belediye şirketleri ve diğer devlet kurumları tarafından minimum teknik eğitimle bir gözetim aracı olarak kullanılmak üzere kolay ve düşük maliyetli bir uygulamaya uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Atık su örneklemesi

  1. 500 mL'lik bir polipropilen kabı açık drenaj veya kanalizasyon arıtma tesisi (STP) rezervuarına batırın ve ~300 mL atık su numunesi toplayın.
  2. Numunenin ~ 250 mL'sini 250 mL'lik otoklavlanmış polipropilen şişeye aktarın.
  3. Şişenin kapağını vidalayın ve plastik bir filmle kapatın. Şişeyi kapalı bir torbada dik tutun.
  4. Numuneyi ortam sıcaklığında kapalı bir kapta dik olarak taşıyın.
  5. Numuneyi, DNA ekstraksiyonu için işlemeden önce 70 °C'de sıcak hava fırınında 4 saat ısıtın.

2. Atık su örneklerinden DNA ekstraksiyonu

  1. Atık su numunesi soğuduktan sonra, numuneleri maksimum hızda vorteksleyin ve döküntü/çamurun çökelmesine izin verin.
  2. 27,5 mL atık suyu 50 mL'lik santrifüj tüplerine boşaltın ve üzerine 13,5 g PEG-8000 (son konsantrasyon %30) ve 3 g NaCl (son konsantrasyon 1,2 M) ekleyin ve tamamen eriyene kadar iyice karıştırın.
  3. Numuneyi gece boyunca (~ 16-18 saat) 4 ° C'de inkübe edin.
  4. Numuneyi 15.500 x g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı atın.
    NOT: %30'luk PEG-8000 oldukça viskozdur ve süpernatan atılırken pelet yerinden çıkabilir. Peletin kaybolmamasını sağlamak için süpernatant yavaş ve dikkatli bir şekilde boşaltılmalıdır. 2.6 ila 2.23 arasındaki adımlar, birkaç değişiklikle kit talimatlarına göre Toprak DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir.
  6. Pelet, kitin lizis çözeltisinin 800 μL'sinde çözün ve çözeltiyi karışık zirkonyum boncuk tüpüne ekleyin.
    NOT: Daha büyük hacimlerde işlem yapıyorsanız, peletleri istenen sayıda tüpten toplayın. Örneğin, 160 mL numune işleniyorsa; PEG ve NaCl içeren atık su içeren dört adet 50 mL'lik tüp olacaktır. Dört tüpün tümünün 30 dakika boyunca 4 ° C'de 15.500 x g'da santrifüjlenmesinden sonra, dört tüpün hepsinden süpernatanı atın. Her birine 200 μL CD1 çözeltisi ekleyin, peletleri yeniden süspanse edin ve bunları bir boncuk tüpünde bir araya getirin.
  7. Boncuk tüpünü bir girdap üzerine yatay olarak sabitleyin. Tüpü 20-30 dakika maksimum hızda vorteksleyin.
    NOT: Uzun süreli girdaplama, numunelerin tamamen parçalanmasını ve homojenizasyonunu sağlar, bu da DNA verimini artırır.
  8. Boncukları dibe oturtmak, köpürmeyi gidermek ve süpernatanı tüpten tamamen 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için tüpleri 15 saniye boyunca 8.000 x g'da döndürün. Bu adım sırasında bazı boncuklar da aktarılabilir.
  9. Süpernatanı 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
  10. Süpernatanı temiz bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Süpernatan hala bazı asılı parçacıklar içerebilir.
  11. 200 μL çökeltici çözelti ekleyin ve 5 saniye boyunca maksimum hızda girdaplayın. 4 °C'de 5 dakika inkübe edin.
    NOT: 4 ° C'de inkübasyon, DNA çözelti içinde kalırken proteinlerin ve hücresel kalıntıların çökelme verimliliğini arttırır. Ekstrakte edilen DNA'nın veriminde ve kalitesinde önemli bir azalma olmadan bu adımda protokolü 2 saate kadar duraklatmak mümkündür.
  12. Oda sıcaklığında (RT) 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin. Peletten kaçının ve berrak süpernatanı temiz bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  13. 700 μL süpernatan başına 600 μL bağlayıcı tampon ekleyin ve 5 saniye boyunca maksimum hızda girdap yapın.
  14. 700 μL lizatı bir silika spin kolonuna yükleyin, 2 dakika inkübe edin ve 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Lizatın silika kolon üzerinde inkübe edilmesi, DNA'nın kolona bağlanmasını artırarak daha iyi DNA verimi sağlar.
  15. Akışı atın ve tüm lizat döndürme kolonundan geçene kadar adım 2.14'ü tekrarlayın.
  16. Döndürme kolonunu dikkatlice 2 mL'lik temiz bir toplama tüpüne yerleştirin. Döndürme kolonuna herhangi bir akış sıçramadığından emin olun.
  17. Sıkma kolonuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin ve sıkma kolonunu 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
  18. Akışı atın ve sıkma kolonunu aynı 2 mL toplama tüpüne geri koyun.
  19. Döndürme kolonuna 500 μL etanol yıkama tamponu ekleyin. 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
  20. Akışı atın ve döndürme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
  21. Artık etanolü çıkarmak için 16.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Döndürme kolonunu 1,5 mL'lik yeni bir tüpe yerleştirin.
  22. Beyaz filtre membranının ortasına 100 μL elüsyon tamponu (önceden 55 °C'ye ısıtılmış) ekleyin ve 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Isıtılmış elüsyon tamponu, zar üzerinde inkübasyon ile birlikte, DNA elüsyonunun, özellikle yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın verimliliğini arttırır.
  23. 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin. Döndürme sütununu atın.
  24. Ayrıştırılmış DNA'ya 10 μL 3 M NaCl (1/10 hacim DNA elüat) ve 250 μL soğutulmuş mutlak etanol (2.5 hacim DNA elüat) ekleyin. İyice karıştırmak için ters çevirin ve içeriği 15 saniye boyunca 8.000 x g'da döndürün.
  25. DNA-etanol karışımını -20 °C'de en az 1 saat inkübe edin.
    NOT: DNA-etanol karışımının inkübasyonu, ekstrakte edilen DNA'nın veriminde veya kalitesinde önemli bir azalma olmaksızın 16 saate çıkarılabilir.
  26. 19.000 x g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dekantasyon ile atın.
  27. Pelete 500 μL soğutulmuş %70 etanol ekleyin.
  28. 15 dakika boyunca 4 ° C'de 19.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dekantasyon ile atın.
  29. Kılcal hareketle kalan etanolü çıkarmak için tüpü kağıt mendil üzerine ters çevirin ve hafifçe vurun.
  30. Tüpleri bir ısıtma bloğunda 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca tüm etanol buharlaşana kadar açık tutarak DNA peletini tamamen kurutun.
  31. DNA peletini 30-50 μL otoklavlanmış çift damıtılmış su (ddH2O) içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
  32. DNA'yı 15 saniye boyunca 8.000 x g'da döndürün.
  33. Bir Nanodrop spektrofotometresinde Nükleik Asitler ayarları altında dsDNA uygulamasını seçin.
    1. Kaideyi tüy bırakmayan kağıt mendil ve suyla temizleyin. Cihazı boşaltmakiçin ddH 2O'yu kullanın ve ardından kaide üzerine 2 μL DNA örneği yükleyin.
    2. Saflığı belirlemek için konsantrasyon ve absorbans oranlarını (A260/280 ve A260/230) ölçün.
  34. DNA örneğini -20 °C'de saklayın.

3. Bir dizi moleküler ağırlıkta DNA geri kazanımını kontrol etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilmiş doğrusal DNA'nın çökeltilmesi

  1. E. coli MG155'ten genomik DNA kullanarak, aşağıdaki genlerden bir doğrusal parça havuzu oluşturmak için gen parçalarını PCR ile çoğaltın: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (primer dizileri ve PCR koşulları için Tablo 2'ye bakınız).
  2. PCR saflaştırma kitini kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın ve PCR ürünlerini bir araya getirin.
  3. Havuzlanmış amplikonları eşit hacimlerde 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine bölün - bir tüpü 'Giriş DNA'sı' olarak etiketleyin.
  4. İstenilen koşullara göre (%9, %20, %30 PEG-8000; 0.3 M, 1.2 M NaCl) 'Input DNA' etiketli olan hariç tüplerin her birine PEG ve NaCl ekleyin ve son hacmi 1 mL'ye tamamlayın.
  5. Tüpleri gece boyunca (~ 16-18 saat) 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: 3.16'ya kadar olan adımların geri kalanı için 'Giriş DNA'sı' buzdolabında değişmeden saklanır.
  6. Tüpleri 4 ° C'de 1 saat boyunca istenen hıza (15.000 x g veya 20.000 x g) göre masa üstü bir mikrosantrifüjde döndürün.
  7. Bir mikropipet kullanarak peletin karşı tarafından 900 μL süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  8. İlk etanol yıkama: Peletlere 900 μL soğutulmuş %70 etanol ekleyin ve tüpleri hafifçe ters çevirerek karıştırın.
  9. Tüpleri adım 3.6'da (15.000 x g veya 20.000 x g) kullanılanla aynı hızda 4 °C'de 30 dakika boyunca döndürün.
  10. Süpernatanı dekantasyon ile çıkarın.
  11. İkinci etanol yıkama: Pelete 500 μL soğutulmuş %70 etanol ekleyin.
  12. Tüpleri 3.6 ° C'de 30 dakika boyunca (15.000 x g veya 20.000 x g) kullanılanla aynı hızda döndürün. Süpernatanı dekantasyon ile atın.
  13. Kılcal hareketle kalan etanolü çıkarmak için tüpü kağıt mendil üzerine ters çevirin ve hafifçe vurun.
  14. Tüm etanol buharlaşana kadar tüpleri bir ısıtma bloğunda 37 ° C'de 5-10 dakika açık tutarak DNA peletini tamamen kurutun.
  15. Peleti 20 μL otoklavlanmış çift damıtılmış suda tekrar süspanse edin.
  16. Bir Nanodrop spektrofotometresi veya florometre kullanarak farklı koşullar tarafından çökeltilen DNA konsantrasyonunu ve 'Giriş DNA'sını' ölçün.
  17. DNA görselleştirmesi için çökeltilmiş DNA'yı %1'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin.

  

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Atık su örneklerinden DNA'nın yüksek verimli ekstraksiyonu için bir protokolün oluşturulması
Su örneklerinden yüksek kaliteli DNA ve RNA'nın çıkarılması için önceden belirlenmiş protokollerin değiştirilmiş bir versiyonu kullanıldı17. Numuneler, Kuzey Hindistan'ın Delhi-NCR bölgesindeki açık kanalizasyonlardan ve atık su arıtma tesislerinden elde edildi. PEG ve NaCl (Şekil 1) kullanılarak ön işlemden sonra, numuneler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

AMR, Dünya Sağlık Örgütü tarafından listelendiği üzere günümüzde en önemli 10 sağlık tehdidinden biridir ve AMR için çevresel gözetim dünya çapında önemli bir araç olarak kabul edilmektedir. Giriş bölümünde belirtildiği gibi, kapsamlı bir çevresel AMR kaydı, düşük moleküler ağırlıklı, parçalanmış ve hücre dışı DNA'yı içerir. Burada tuz (%30 PEG ve 1.2 M NaCl) ile birleştirilmiş yüksek konsantrasyonda PEG kullanılarak rapor edilen ön işleme protokolü, bu sonucu, daha yüksek moleküler ağırlıklı fraksiyonların (büyük ölçüde...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

APSI Hindistan ekibinin (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/) bir parçası olarak Rockefeller Vakfı'ndan (Rockefeller Vakfı Hibe Numarası 2021, HTH 018) finansman desteğini kabul ediyoruz. Ayrıca, bu araştırmayı desteklemek için Axis Bank tarafından sağlanan mali yardımı ve ekipman ve diğer destekler için Ashoka Üniversitesi'ndeki Trivedi Biyolojik Bilimler Okulu'nu da kabul ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 koltuklu mikrosantrifüjEppendorf Santrifüj 5425 REP5406000046
Mutlak Etanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Etanol analiz için mutlak)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Tezgah üstü soğutmalı santrifüjEppendorf Santrifüj 5920 REP5948000131
ChemiDoc Görüntüleme SistemiBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTP'ler (dNTP karışımı her biri 10 mM, 0,2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA polimeraz, 5 U/&mikro; L + 10x DreamTaq Tamponu *ThermofscientificEP0702
E-Jel 1 Kb Plus Express DNA MerdiveniInvitrogen10488091
Maxiamp PCR tüpleri 0.2 mLTarsons510051
PCR HiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Mikro Hacimli UV-Vis SpektrofotometreTermo Bilimsel13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Jel Temizleme KitiQiagen28506
Qubit 4 Florometre (WiFi ile)ThermofisherQ33238
Qubit Test TüpleriThermofisherQ32856
ds DNA için Qubitt reaktif kiti, geniş ürün yelpazesiThermo ScientificQ32853 (500 tahlil)
Sodyum KlorürHiMediaTC046M-500G
SYBR Güvenli DNA Jel LekesiInvitrogenS33102
T100 Termal DöngüleyiciBioRad1861096
Termo Döngüleyici (ProFlex 3 x 32 kuyulu PCR Sistemi)Uygulamalı Biyosistemler4484073
Sihirbazı Genomik DNA Saflaştırma KitiPromegaA1125

Kaynaklar

  1. Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
  2. Amman, F., et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-COV-2 at national scale. Nat Biotechnol. 40 (12), 1814-1822 (2022).
  3. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  4. The L. Antimicrobial resistance. The L. Antimicrobial resistance: Time to repurpose the global fund. Lancet. 399 (10322), 335(2022).
  5. Munk, P., et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance. Nat Commun. 13 (1), 7251(2022).
  6. Parnanen, K. M. M., et al. Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence. Sci Adv. 5 (3), 9124(2019).
  7. Grenni, P. Antimicrobial resistance in rivers: A review of the genes detected and new challenges. Environ Toxicol Chem. 41 (3), 687-714 (2022).
  8. Siri, Y., Precha, N., Sirikanchana, K., Haramoto, E., Makkaew, P. Antimicrobial resistance in southeast Asian water environments: A systematic review of current evidence and future research directions. Sci Total Environ. 896, 165229(2023).
  9. Hunter, P. R., Macdonald, A., Carter, R. C. Water supply and health. PLoS Med. 7 (11), e1000361(2010).
  10. Bain, R., et al. Fecal contamination of drinking-water in low- and middle-income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 11 (5), e1001644(2014).
  11. Collignon, P., Beggs, J. J., Walsh, T. R., Gandra, S., Laxminarayan, R. Anthropological and socioeconomic factors contributing to global antimicrobial resistance: A univariate and multivariable analysis. Lancet Planet Health. 2 (9), e398-e405 (2018).
  12. Asghar, H., et al. Environmental surveillance for polioviruses in the global polio eradication initiative. J Infect Dis. 210, Suppl 1 S294-S303 (2014).
  13. Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Hernandez, F., Zuccato, E., Castiglioni, S. Wastewater-based epidemiology as a novel biomonitoring tool to evaluate human exposure to pollutants. Environ Sci Technol. 52 (18), 10224-10226 (2018).
  14. Choi, P. M., et al. economic correlates of food and chemical consumption measured by wastewater-based epidemiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21864-21873 (2019).
  15. Hemalatha, M., et al. Surveillance of SARS-COV-2 spread using wastewater-based epidemiology: Comprehensive study. Sci Total Environ. 768, 144704(2021).
  16. Westhaus, S., et al. Detection of sars-cov-2 in raw and treated wastewater in Germany - suitability for COVID-19 surveillance and potential transmission risks. Sci Total Environ. 751, 141750(2021).
  17. Lamba, S., et al. SARS-COV-2 infection dynamics and genomic surveillance to detect variants in wastewater - a longitudinal study in Bengaluru, India. Lancet Reg Health Southeast Asia. 11, 100151(2023).
  18. Stockdale, S. R., et al. RNA-seq of untreated wastewater to assess COVID-19 and emerging and endemic viruses for public health surveillance. Lancet Reg Health Southeast Asia. 14, 100205(2023).
  19. Bengtsson-Palme, J., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs. Environ Int. 178, 108089(2023).
  20. Bengtsson-Palme, J., Kristiansson, E., Larsson, D. G. J. Environmental factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 42 (1), 053(2018).
  21. Dunachie, S. J., Day, N. P., Dolecek, C. The challenges of estimating the human global burden of disease of antimicrobial resistant bacteria. Curr Opin Microbiol. 57, 95-101 (2020).
  22. Hughes, D., Andersson, D. I. Evolutionary trajectories to antibiotic resistance. Annu Rev Microbiol. 71, 579-596 (2017).
  23. World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS). World Health Organization. , (2022).
  24. Walia, K., et al. Establishing antimicrobial resistance surveillance & research network in india: Journey so far. Indian J Med Res. 149 (2), 164-179 (2019).
  25. Hart, A., Warren, J., Wilkinson, H., Schmidt, W. Environmental surveillance of antimicrobial resistance (AMR), perspectives from a national environmental regulator in 2023. Euro Surveill. 28 (11), (2023).
  26. Huijbers, P. M. C., Flach, C. F., Larsson, D. G. J. A conceptual framework for the environmental surveillance of antibiotics and antibiotic resistance. Environ Int. 130, 104880(2019).
  27. Liguori, K., et al. Antimicrobial resistance monitoring of water environments: A framework for standardized methods and quality control. Environ Sci Technol. 56 (13), 9149-9160 (2022).
  28. Hayward, C., Ross, K. E., Brown, M. H., Whiley, H. Water as a source of antimicrobial resistance and healthcare-associated infections. Pathogens. 9 (8), 667(2020).
  29. Booton, R. D., et al. One health drivers of antibacterial resistance: Quantifying the relative impacts of human, animal and environmental use and transmission. One Health. 12, 100220(2021).
  30. Sivalingam, P., Pote, J., Prabakar, K. Extracellular DNA (eDNA): Neglected and potential sources of antibiotic resistant genes (ARGs) in the aquatic environments. Pathogens. 9 (11), 874(2020).
  31. Woegerbauer, M., Bellanger, X., Merlin, C. Cell-free DNA: An underestimated source of antibiotic resistance gene dissemination at the interface between human activities and downstream environments in the context of wastewater reuse. Front Microbiol. 11, 671(2020).
  32. Kittredge, H. A., Dougherty, K. M., Evans, S. E. Dead but not forgotten: How extracellular DNA, moisture, and space modulate the horizontal transfer of extracellular antibiotic resistance genes in soil. Appl Environ Microbiol. 88 (7), 0228021(2022).
  33. Lever, M. A., et al. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front Microbiol. 6, 476(2015).
  34. Lis, J. T., Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2 (3), 383-389 (1975).
  35. He, Z., Zhu, Y., Gu, H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (20), 9175-9183 (2013).
  36. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. Biotechniques. 49 (3), 631-640 (2010).
  37. Arbeli, Z., Fuentes, C. L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples. FEMS Microbiol Lett. 272 (2), 269-275 (2007).
  38. Verma, S. K., Singh, H., Sharma, P. C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 7 (3), 171(2017).
  39. Narayan, A., Jain, K., Shah, A. R., Madamwar, D. An efficient and cost-effective method for DNA extraction from athalassohaline soil using a newly formulated cell extraction buffer. 3 Biotech. 6 (1), 62(2016).
  40. Sapula, S. A., Whittall, J. J., Pandopulos, A. J., Gerber, C., Venter, H. An optimized and robust peg precipitation method for detection of sars-cov-2 in wastewater. Sci Total Environ. 785, 147270(2021).
  41. Calderon-Franco, D., Van Loosdrecht, M. C. M., Abeel, T., Weissbrodt, D. G. Free-floating extracellular DNA: Systematic profiling of mobile genetic elements and antibiotic resistance from wastewater. Water Res. 189, 116592(2021).
  42. Sangamnere, R., Misra, T., Al Bherwani, H. E. t A critical review of conventional and emerging wastewater treatment technologies. Sustain Water Resour Manag. 9, 58(2023).
  43. Weiss, N., Heng, S. W., Lim, H. W. Centrifugation at 30,000 x g. in plasmid DNA precipitation allows better recovery rates and shorter centrifugation times. Application note no: 234, Eppendorf. , Available from: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/157398_Application/Eppendorf_Centrifugation_Application-Note_234_Centrifuge-5430-familiy_Safe-Lock-Tubes_Centrifugation-at-30_000-x-g-plasmid-DNA-precipitation-allows-better-recovery-rates-shorter-centrifug.pdf (2017).
  44. Atha, D. H., Ingham, K. C. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume. J Biol Chem. 256 (23), 12108-12117 (1981).
  45. Sivalingam, P., et al. Extracellular DNA includes an important fraction of high-risk antibiotic resistance genes in treated wastewaters. Environ Pollut. 323, 121325(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Atık Su DNA EkstraksiyonuAntimikrobiyal Direnç GenleriÇevresel SürveyansPolietilen Glikol PresipitasyonuYatay Gen TransferiMetagenomik AnalizDNA PurifikasyonuEkstrasellüler DNANanodrop Spektrofotometrisi
Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.