Yöntem makalesi

Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının #946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması

1.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66903

⸱

26 Temmuz 2024

 ,  ,  , 
1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, buğday bitkilerinde başta β-1,3-glukanaz ve peroksidaz olmak üzere hücre duvarı ile ilgili enzimleri incelemek ve karakterize etmek için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. Buğday-RWA etkileşimi sırasında aktivite seviyeleri artar ve yaprak biti beslenmesini caydıran hücre duvarı takviyesi yoluyla bitki savunma tepkisinde yer alır.

Özet

Rus buğday yaprak bitleri (RWA) tarafından istila edilen buğday bitkileri, aşırı duyarlı tepkiler (HR) ve β-1,3-glukanaz ve peroksidaz (POD) gibi patogenezle ilgili (PR) proteinlerin indüksiyonu dahil olmak üzere bir dizi savunma tepkisine neden olur. Bu çalışma, hücre duvarı ile ilişkili POD ve β-1,3-glukanazın fizikokimyasal özelliklerini karakterize etmeyi ve RWASA2-buğday etkileşimi sırasında hücre duvarı modifikasyonu üzerindeki sinerjilerini belirlemeyi amaçlamaktadır. Duyarlı Tugela, orta derecede dayanıklı Tugela-Dn1 ve dayanıklı Tugela-Dn5 çeşitleri sera koşullarında önceden çimlendirilerek ekildi, ekimden 14 gün sonra gübrelendi ve her 3 günde bir sulandı. Bitkiler, 3 yapraklı aşamada aynı RWASA2 klonunun 20 partenogenetik bireyi ile istila edildi ve yapraklar istiladan 1 ila 14 gün sonra hasat edildi. Hücreler arası yıkama sıvısı (IWF), vakum filtrasyonu kullanılarak ekstrakte edildi ve -20 °C'de saklandı. Yaprak kalıntıları toz haline getirildi ve hücre duvarı bileşenleri için kullanıldı. POD aktivitesi ve karakterizasyonu, 5 mM guaiacol substratı ve H2O2 kullanılarak belirlendi ve 470 nm'de absorbanstaki değişiklik izlendi. β-1,3-glukanaz aktivitesi, pH ve sıcaklık optimum koşulları, β-1,3-glukan ve β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak DNS reaktifi ile hidrolizattaki toplam indirgeyici şekerlerin ölçülmesi, 540 nm'de absorbansın ölçülmesi ve glikoz standart eğrisi kullanılarak gösterilmiştir. Optimum pH, pH 4 ila 9 arasında, sıcaklık optimumu 25 ila 50 °C arasında ve termal stabilite 30 °C ile 70 °C arasında belirlendi. β-1,3-glukanaz substrat özgüllüğü, curdlan ve arpa β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak 25 °C ve 40 °C'de belirlendi. Ek olarak, β-1,3-glukanaz etki modu, laminaribiyoz ila laminaripentaoz kullanılarak belirlendi. Oligosakkarit hidroliz ürün paternleri, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile kalitatif olarak analiz edildi ve HPLC ile kantitatif olarak analiz edildi. Bu çalışmada sunulan yöntem, buğdayın RWA ile istila edilmesi, hücre duvarı bölgesinden peroksidaz ve β-1,3-glukanazın ekstrakte edilmesi ve bunların kapsamlı biyokimyasal karakterizasyonu için sağlam bir yaklaşım göstermektedir.

Giriş

Rus buğday yaprak bitleri (RWA) buğday ve arpayı istila ederek önemli verim kaybına veya tahıl kalitesinin düşmesine neden olur. Buğday, dirençli çeşitlerde β-1,3-glukanaz ve peroksidaz aktivite seviyelerinin arttırılması da dahil olmak üzere çeşitli savunma tepkilerini indükleyerek istilaya yanıt verirken, duyarlı çeşitler erken istila döneminde bu enzimlerin aktivitesini azaltır 1,2,3,4. Buğday bitkisindeki β-1,3-glukanaz ve POD'un temel işlevleri, RWA istilası 1,3,5,6,7 sırasında dirençli kültivarda kalloz birikiminin düzenlenmesi ve hücre duvarında ve apoplastik bölgelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) söndürülmesini içeriyordu. Mafa ve ark.6, RWASA2 istilası üzerine dirençli buğday çeşidinde artan POD aktivitesi ile artan lignin içeriği arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Ek olarak, artan lignin içeriği, istila edilmiş dirençli buğday çeşidinin hücre duvarının güçlendirildiğini ve bunun da RWA beslemesinin azalmasına yol açtığını gösterdi.

Çoğu araştırmacı grubu, buğday / arpa-RWA etkileşimi sırasında apoplastik β-1,3-glukanaz ve POD'u çıkardı ve inceledi; Ek olarak, bu çalışmaların çoğu, bu enzimlerin, hücre duvarı bölgesindeki enzim varlığını ölçmeden RWA ile enfekte olmuş buğday bitkisinin hücre duvarını etkilediğini iddia etti. Sadece birkaç çalışma, β-1,3-glukanaz aktivite seviyelerinin kalloz regülasyonu 7,8,9 ile bağlantılı olduğunu veya dirençli 6,10'da POD aktiviteleri ile hücre duvarı modifikasyonu arasındaki korelasyonu göstermek için ekstrakte edilen ana hücre duvarı bileşenlerine bağlı olduğunu göstermek için mikroskobik teknikler kullanmıştır. Hücre duvarına β-1,3-glukanaz ve POD ilişkisinin araştırılmaması, araştırmacıların hücre duvarına bağlı enzimleri doğrudan ölçmelerine izin veren yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.

Mevcut yöntem, hücre duvarına bağlı enzimlerin ekstrakte edilmesinden önce apoplastik sıvının yaprak dokusundan çıkarılmasının gerekli olduğunu önermektedir. Apoplastik sıvının ekstraksiyon prosedürü, hücre duvarına bağlı enzimlerin ekstrakte edilmesi için kullanılan yaprak dokusundan iki kez yapılmalıdır. Bu işlem, apoplastik enzimlerin hücre duvarı bölgelerinde bulunanlarla kirlenmesini ve karışıklığını azaltır. Bu nedenle, bu çalışmada hücre duvarına bağlı POD, β-1,3-glukanaz ve MLG'ye özgü β-glukanaz ekstrakte edildi ve biyokimyasal karakterizasyonları gerçekleştirildi.

Protokol

Çalışma, Free State Üniversitesi Çevre ve Biyogüvenlik Araştırmaları Etik Kurulu'nun (UFS-ESD2022/0131/22) onayı ve izni ile gerçekleştirilmiştir. Buradaki reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bitki büyüme koşulları

  1. Her buğday çeşidinin 250 tohumunu, yani duyarlı Tugela, orta derecede dirençli Tugela-Dn1 ve dayanıklı Tugela-Dn5'i ayrı Petri kaplarında çimlendirin.
  2. Her Petri kabına 5 mL damıtılmış su ekleyin, bir parafin filmi ile kapatın ve 25 ° C'ye ayarlanmış çimlenme odasında 2 gün boyunca inkübe edin.
  3. Her çeşidin çimlenmiş tohumlarını, kontrollü sera koşullarında 1: 1 toprak ve turba yosunu (saksı başına 15 bitki) içeren 15 cm'lik saksılara nakledin.
  4. Sıcaklık rejimlerini gece ve gündüz sırasıyla 18 °C ve 24 °C'ye ayarlayın.
  5. Bitkileri her 3 günde bir musluk suyu kullanarak sulayın ve çimlenmeden 14 gün sonra 2 g/L gübre ile besleyin.
  6. Bitkileri ağlarla kaplı kafeslere yerleştirin ve üçüncü yaprak aşamasına 2,6'ya kadar büyümelerine izin verin (her çeşidin dört biyolojik kopyası ile).

2. Buğday çeşitleri RWASA2 ile istila

  1. Jimoh ve ark.11 ve Mohase ve Taiwe12'ye göre Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5 buğday çeşitlerini RWASA2 ile istila edin.
  2. Bitkileri kafeslerde iki ayrı set halinde tutun; Ağlarla kaplı büyüme odalarındaki her saksıda bitki başına aynı RWASA2 klonunun 20 partenogenetik bireyi ile bir seti istila edin. Başka bir buğday bitkisi setini, büyüme odasının altında, temiz ağlarla ayrı bir odada tutun ve bunları kontrol olarak kabul edin.
    NOT: İki tedaviyi ayrı odalarda saklayın ve bitkileri ağlarla kaplı kafeslerde örtün. Ayrıca, bir çalışmada iki farklı DIT biyotipinin kullanıldığı bir durumda, ikinci biyotipin istila ettiği bitkileri mümkün olduğunca ikinci biyotipin istila ettiği bitkilerden veya RWASA2'nin olası çapraz kontaminasyonunu önlemek için ağlarla kaplı büyüme odalarının altındaki ayrı odalarda tutun.
  3. Hasat için, ikinci ve üçüncü yaprakları kısa süreli besleme periyodu (1, 2 ve 3 gün) ve uzun süreli besleme periyodu (7 ve 14 gün) olmak üzere iki farklı zaman rejiminde seçin ve nemli kağıt havlulara sarın.
  4. Hücreler arası yıkama sıvısı (IWF) ekstraksiyonundan önce yaprak metabolizmasını azaltmak için hasat edilen yaprakları hemen buz içeren bir kutuya aktarın.

3. Apoplasttan hücreler arası yıkama sıvısının (IWF) ekstraksiyonu

  1. Yaklaşık üç buğday çeşidinin hasat edilen yapraklarını 7 cm'lik parçalar halinde kesin.
  2. Kesilen uçlardaki sitozolik kontaminasyonu gidermek için yaprak parçalarını damıtılmış sudaiki kez durulayın 6,13.
  3. Yaprak parçalarını kalın duvarlı bir cam tüpe yerleştirin ve numuneleri ekstraksiyon tamponuna (50 mM Tris-HCl, pH 7.8) daldırın.
  4. Yaprakları ekstraksiyon tamponu ile emprenye etmek için bir su jeti pompası kullanarak 5 dakika boyunca vakum sızması uygulayın.
  5. Daha sonra yaprak parçalarını cam tüpten çıkarın ve bir kağıt havluyla kurulayın.
  6. Kurutulmuş yaprak parçalarını, delikli disklerle donatılmış önceden soğutulmuş santrifüj tüplerine dikey olarak yerleştirin ve 500 °C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine toplamak için 100 μL'lik bir pipet kullanın.
  8. Tüm ekstraksiyon prosedürünü aynı yaprak materyali ile tekrarlayın.
  9. Toplanan süpernatanı birleştirin ve -20 ° C'de saklayın.
    NOT: Süpernatan alikotlar, apoplast içeriğinin veya IWF'nin kaynağı olarak kabul edilir. Bu çalışmada IWF kullanılmadı, ancak hücre duvarına bağlı β-1,3-glukanaz ve Peroksidaz (POD) ekstrakte etmeden önce yaprak dokularından çıkarılması önemliydi.

4. Hücre duvarı ile ilişkili β-1,3-glukanaz ve POD'un ekstraksiyonu

NOT: IWF ekstraksiyonundan sonra kalan yaprak kalıntıları, toplam hücre duvarı proteinini çıkarmak için kullanıldı.

  1. Yaprak kalıntılarını bir havan ve havaneli kullanarak sıvı nitrojen ile ince bir toz haline getirin.
  2. Yaklaşık 200 mg toz haline getirilmiş yaprak dokusunu 4 mL ekstraksiyon tamponu (% 1 (a / h) polivinilpolipirolidon (PVPP) ile 50 mM sodyum fosfat; pH 5.0) içeren bir harca aktarın, ardından bir havaneli ile pürüzsüz bir macun haline getirin, bu daha sonra mikrosantrifüj tüplerine aktarılır.
  3. Karışımı mikrosantrifüj tüplerinde buz üzerinde 3 dakika inkübe edin ve ardından 10.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı (toplam protein ekstraktları) mikrosantrifüj tüplerinde (2 mL'lik alikotlar) toplayın ve tüm çalışma için β-1,3-glukanaz ve POD kaynağı olarak kullanın.

5. Protein standardının belirlenmesi

  1. Bradford yöntemini14 izleyerek ekstraktların toplam protein konsantrasyonunu belirleyin.
  2. Sığır serum albümini (BSA) çözeltilerini 0.0 mg / mL, 0.1 mg / mL, 0.2 mg / mL, 0.3 mg / mL, 0.4 mg / mL, 0.5 mg / mL, 0.6 mg / mL, 0.7 mg / mL, 0.8 mg / mL, 0.9 mg / mL ve 1.0 mg / mL konsantrasyonlarında protein standardını oluşturmak için 50 mM sodyum fosfat tamponunda çözündürün.
  3. 190 μL (% 0.25 v / v) Bradford reaktifi ile 96 oyuklu mikroplakaya her bir BSA çözeltisinden 10 μL ekleyerek standardı hazırlayın (bkz.
  4. 25 ° C'de 20 dakika inkübe edin ve mikroplaka okuyucuyu kullanarak 595 nm'de absorbansı ölçün ve protein konsantrasyonunu ölçmek için standart eğriyi hazırlamak için absorbans değerlerini kullanın.
  5. Protein konsantrasyonunu ölçün
    1. Ekstrakte edilen enzimin 10 μL'sini (adım 4), üçlü kopyalar halinde 190 μL (% 0.25 v / v) Bradford reaktifi ile 96 oyuklu bir mikroplakaya ekleyin.
    2. Oda sıcaklığında (25 °C) 20 dakika inkübe edin.
    3. Bir mikroplaka okuyuculu spektrofotometreyi kullanarak 595 nm'de absorbansı ölçün ve protein standardı olarak BSA'yı kullanarak protein konsantrasyonunu belirlemek için absorbans değerlerini kullanın (adım 5.4'te hazırlanmıştır).

6. β-1,3-glukanaz aktivitesi için glikoz standardı hazırlayın

  1. 0.00 mg / mL ile 1.0 mg / mL (0.0 mg / mL, 0.1 mg / mL, 0.2 mg / mL, 0.3 mg / mL, 0.4 mg / mL, 0.5 mg / mL, 0.6 mg / mL, 0.7 mg / mL, 0.8 mg / mL, 0.9 mg / mL, 1.0 mg / mL) arasında konsantrasyonlarda standart çözeltileri hazırlayın.
  2. Her bir glikoz çözeltisinden 300 μL ve 600 μL 3,5-Dinitrosalisilik asit (DNS) reaktifini 1:2 oranında 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve reaksiyonları 100 °C'de 5 dakika inkübe edin (DNS reaktifleri için Malzeme Tablosuna bakınız) (Miller ve ark.15).
  3. Spektrofotometre kullanarak 540 nm'de absorbansı ölçmeden önce karışımın oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
  4. β-1,3-glukanaz enzim aktivitesini belirlemek için standart eğriyi geliştirmek için ortalama absorbans değerlerini kullanın.

7. β-1,3-glukanaz aktivite testinin belirlenmesi

NOT: Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5'ten ekstrakte edilen hücre duvarına bağlı β-1,3-glukanazın enzim aktivitesi, Miller ve ark.15 tarafından tarif edildiği gibi modifiye edilmiş bir yöntem kullanılarak %0.5 (a/h) karışık bağlı β-1,3-1,4-glukan (MLG) ve %0.4 (a/h) β-1,3-glukan substratlarının hidrolizinden salınan salınan toplam indirgeyici şekerlerin miktarı ile belirlenmiştir.15. Protein alikotlu tüpleri her zaman buzun üzerinde tutun. Numuneler donmuşsa, buz üzerinde çözdürün ve çözüldükten hemen sonra devam edin.

  1. 200 μL enzim ekstraktı ekleyin (aksi belirtilmedikçe tüm reaksiyonlarda protein konsantrasyonunu 20 μg / mL ila 90 μg / mL arasında tutun) ve 50 mM sodyum sitrat tamponunda çözülmüş 300 μL substrat (pH 5.0) 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine.
    NOT: Tüm substratlar için enzim ekstraktı olmadan paralel bir boş reaksiyon çalıştırın (ilk boş) ve boş enzim, substratsız enzim ekstraktından oluşur (ikinci boş). Hem substrat hem de enzim ekstraktı, sırasıyla birinci ve ikinci siyahlarda tampon ile değiştirildi.
  2. Reaksiyonları 37 ° C'de 24 saat inkübe edin ve 100 ° C'de 5 dakika ısıtarak reaksiyonu sonlandırın, ardından 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
  3. 300 μL süpernatanı 600 μL DNS reaktifi (1:2 oranında) ile yeni 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine karıştırın ve 100 °C'de 5 dakika kaynatın.
  4. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve spektrofotometreyi kullanarak absorbansı 540 nm'de ölçün.
    NOT: Karışımdaki toplam indirgeyici şekerlerin konsantrasyonu yüksekse, spektrofotometre kullanılarak okunması zor olan koyu kahverengi bir çözelti ile sonuçlanacaktır. Bu nedenle, absorbansı okumadan önce numunelerin daha fazla seyreltilmesi gereklidir.
  5. Standart eğrinin SI birimlerindeki enzim aktivitesini belirlemek için yukarıdaki adım 6.4'te geliştirilen glikoz standart eğrisini kullanın.
  6. Aktiviteyi μmol glikoz/h/mg protein cinsinden ifade edilen belirli bir aktiviteye dönüştürmek için aşağıdaki denklemi kullanın:
    Spesifik aktivite = [(enzim aktivitesi/180.16)*1000]/zaman/protein konsantrasyonu
    NOT: Enzim aktivitesini mg / mL cinsinden g / mL'ye dönüştürün; 180.16 g/mol, glikozun moleküler ağırlığıdır, 1000, M'yi mikromollere dönüştüren bir faktördür, zaman reaksiyon süresidir ve protein özü konsantrasyonu mg/mL cinsinden temsil edilir. Bir birim β-1,3-glukanaz aktivitesi, 1 saatlik bir reaksiyon periyodu içinde substrattan salınan 1 μmol glikoz olarak tanımlanır.

8. Peroksidaz (POD) aktivitesinin belirlenmesi

NOT: Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5 buğday çeşitlerinin hücre duvarına bağlı peroksidaz aktivitesi, guaiacol16'dan birim zamanda üretilen tetra-guaiacol oluşumunun ölçülmesiyle belirlendi.

  1. 25 ° C'de küvetlere 30 μL enzim ekstraktı, 30 μL% 1 (h / h) H2O2 ve 970 μL 5 mM guaiacol ekleyin.
    NOT: Enzim özütü olmadan boş reaksiyonu yapın (İlk boş) ve substrat içermeyen enzim numuneleri için başka bir boşluk (ikinci boş). Enzim veya substrat numuneleri, sırasıyla birinci ve ikinci boşluklarda 50 mM Sodyum Fosfat tamponu ile değiştirildi.
  2. 470 nm'de absorbanstaki değişikliği izlemek için spektrofotometrenin kinetik modunu kullanın.
  3. Grafiğin doğrusal olduğu eğimi belirleyin ve bunu absorbans değeri olarak kullanın.
  4. Ortalama absorbansı hesaplayın ve bunu POD aktivitesini hesaplamada kullanın.
  5. Guaiacol'ün molar sönme katsayısını (26.6 mM-1 cm-1) kullanarak peroksidaz aktivitesini hesaplayın ve aktiviteyi μmol tetra-guaiacol / min / mg proteini cinsinden ifade edin.
  6. Mafa ve ark.6 tarafından kullanılan denklemi kullanarak POD aktivitesini hesaplayın:
    BAKLA AKTİVİTESİ = [(ΔABS × DF) ÷ Protein konsantrasyonu] × 26.6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    NOT: Burada ΔABS = ortalama absorbans; DF = Seyreltme faktörü; 26.6 mM-1 cm-1 = Guaiacol yok olma katsayısı.

9. POD karakterizasyonu

NOT: POD karakterizasyon deneyleri, Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5'in istiladan 3 gün sonra (dpi) enzim ekstraktları kullanılarak, reaksiyon tamponlarında ve sıcaklıklarda küçük değişikliklerle, adım 8'de açıklanan benzer yöntemler izlenerek gerçekleştirilmiştir. Deneyler yapılırken enzim örnekleri her zaman buz üzerinde tutuldu. Reaksiyonları paralel bir boş reaksiyonla dörtlü olarak çalıştırın.

  1. Optimum pH tahlilleri için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Guaiacol substratını 50 mM tamponlarda (sodyum sitrat, pH 4 ve 5), sodyum fosfat (pH 6 ve 7) ve Tris-HCl'de (pH 8 ve 9) çözün (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Reaksiyonları 25. adımda açıklandığı gibi 8 °C'de çalıştırın.
  2. Optimum sıcaklık tahlilleri için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Reaksiyonları sırasıyla 25 °C, 30 °C, 40 °C ve 50 °C'de çalıştırın.
    2. pH 5 (pH optimum) tamponunda çözünmüş guaiacol substratı kullanın ve reaksiyonları adım 8'de açıklandığı gibi çalıştırın.
  3. Termostabilite deneyleri için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Reaksiyonlara başlamadan önce enzimi 37 °C, 50 °C ve 70 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    2. Reaksiyonları, 50 mM sodyum sitrat tamponu (pH 5) kullanarak ve 40 °C'de (optimum sıcaklık) adım 8'de açıklanan yöntemlere göre çalıştırın.

10. β-1,3-glukanaz karakterizasyonu

NOT: Reaksiyon tamponlarında ve sıcaklıklarda bazı modifikasyonlarla, 3 dpi enzim ekstraktları kullanarak adım 7'de açıklanan yöntemi izleyerek karakterizasyon testlerini gerçekleştirin. Reaksiyonları, her substrat için paralel bir boş reaksiyonla dörtlü olarak çalıştırın.

  1. Optimum pH tahlilleri için aşağıdakileri yapın:
    1. MLG ve β-1,3-glukan substratlarını 50 mM tamponlarda (sodyum sitrat, pH 4 ve 5), sodyum fosfat (pH 6 ve 7) ve Tris-HCl'de (pH 8 ve 9) çözün.
    2. Reaksiyonu 7. adımda açıklandığı gibi çalıştırın.
  2. Optimum sıcaklık tahlilleri için aşağıdakileri yapın:
    1. Reaksiyonları sırasıyla 25 °C, 30 °C, 40 °C ve 50 °C'de çalıştırın.
    2. Optimum β pH ile (adım 1,3'de elde edilen) 50 mM sodyum sitrat tamponunda (pH 5) çözülmüş MLG ve 10.1-glukan substratlarını kullanın ve reaksiyonları adım 7'de açıklandığı gibi çalıştırın.
  3. Termostabilite deneyleri için aşağıdakileri yapın:
    1. Reaksiyonlara başlamadan önce enzimi 37 °C, 50 °C ve 70 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    2. Reaksiyonları 50 mM sodyum sitrat tamponunda (pH 5) çözünmüş substratları kullanarak çalıştırın ve 25 °C ve 40 °C'de 24 saat inkübe edin.

11. Farklı glukan substratları üzerinde β-1,3-glukanaz etki mekanizmasının değerlendirilmesi

NOT: Glukan substratları, omurgalarında aynı glikoz kalıntısını içerir, ancak glukopiranoz birimleri arasındaki glikozidik bağlar çeşitlidir ve α veya β yöneliminialabilir 17. Glikozidik bağlar, glikoz moleküllerinin kimyasal yapılarını tanımlayan birkaç karbon atomu arasında oluşabilir, örneğin β-1,3-glukan, β-1,4-glukan ve karışık bağlı β-1,3-1,4-glukan (MLG)18,19,20. β-1,3-glukanaz etki mekanizması, RWASA2 ile enfekte edilmiş Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn 5 numuneleri (enzim kaynakları) ve aşağıdaki substratlar β-1,3-glukan (CM-curdlan), MLG (arpadan) ve β-1,4-glukan (AZO-CM-Selüloz) kullanılarak belirlendi. Etki mekanizması, optimal tahlil koşulları altında (25 ° C ve 40 ° C, pH 5.0),% 0.1 (a / h) β-1,4-glukan,% 0.4 (a / h) β-1,3-glukan veya% 0.5 (a / h) MLG substratları.

  1. Substratları 50 mM sodyum sitrat tamponunda (pH 5) çözün.
  2. 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine 200 μL enzim ekstraktı ve 300 μL substrat ekleyin.
  3. Reaksiyonları 25 °C ve 40 °C olmak üzere iki ayrı sıcaklıkta 8 saat inkübe edin.
  4. 100 °C'de ısıtılarak reaksiyonların sonlandırılması.
  5. β-1,3-glukan ve MLG reaksiyon karışımını 10.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve adım 7.3'te açıklandığı gibi devam edin.
  6. β-1,4-glukan için, reaksiyonu 100 °C'de sonlandırdıktan sonra, karışımı 800 μL mutlak etanol ile seyreltin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı eğrilere aktarın, spektrofotometre ile 590 nm'de absorbansı ölçün ve üreticinin prosedürünü kullanarak β-1,4-glukan üzerindeki β-1,3-glukanaz aktivitesini hesaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve aktiviteyi Birimler/mg protein cinsinden ifade edin.

12. β-1,3-glukanaz etki şeklinin belirlenmesi

NOT: RWASA2 ile enfekte edilmiş Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5'in neden olduğu β-1,3-glukanaz etki modu, polimerizasyon derecesi (DP) 5 ile 2 arasında olan laminarin-oligosakkaritler (LAM'lar) ile test edildi. Substratı hidrolize etmek için β-1,3-glukanaz için gereken DP'yi belirlemek için İnce tabaka kromatografisi (TLC), sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) ve glikoz oksidaz peroksidaz (GOPOD) kitini kullanın. TLC, kalitatif analiz için kullanıldı ve LC-MS, reaksiyon21'den sonra hidrolizattaki oligosakkaritlerin konsantrasyonunu belirleyen kantitatif analiz için kullanıldı.

  1. β-1,3-glukanaz etki modunun reaksiyonlarını hazırlayın
    NOT: Konsantre protein ekstraktını 10 kDa santrifüj konsantre membran filtresi ile hazırlayın ve böylece deney için konsantre ve konsantre olmayan RWASA2 istilasına uğramış protein ekstraktlarına sahip olun.
    1. Her bir çeşitten ekstrakte edilen enzimleri konsantre etmek için, ekstraktların 5 mL'sini 10 kDa santrifüj konsantre membran filtrelerine aktarın.
    2. Ekstrakt içeren membran filtre tüplerini 15.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
    3. Laminaripentaoz (LAM5), Laminaritetraoze (LAM4), Laminaritrioz (LAM3) ve Laminaribiose (LAM2) (Malzeme Tablosuna bakınız) 50 mM sodyum sitrat (pH 5) içinde 10 mg / mL yapmak için çözün.
    4. Reaksiyonu başlatmak için 20 μL protein özütü ve 40 μL Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraoze (LAM4), Laminaritrioz (LAM3) ve Laminaribiose (LAM2) ekleyin.
    5. Reaksiyonu 40 °C'de 16 saat inkübe edin ve 100 °C'de 5 dakika kaynatarak sonlandırın.
  2. İnce tabaka kromatografisi (TLC) yapın
    1. 4 silika plakayı 10 cm'lik2 parçaya kesin ve bir kenarın altından 1 cm boşluk bırakarak plakanın yüzeyi boyunca bir çizgi çizin.
    2. Çizgilerin üzerindeki noktaları işaretleyin ve bunları Laminarin-oligosakkaritlerin farklı çeşitlerine ve DP'lerine göre 1 cm aralıklarla işaretleyin ve. Konsantre protein özütü için 2 silika plakası ve konsantre olmayan özler için diğer 2 tanesini alın.
    3. Silika plaka üzerindeki karşılık gelen işaretli noktaların üzerine 3 ila 5 kez 3 μL reaksiyon karışımları ekleyin ve işlemi tekrarlamadan önce plaka üzerindeki lekelerin tamamen kurumasını bekleyin.
    4. Silika plakaları, n-butanolün mobil fazını içeren TLC tankına: asetik asit: su (2: 1: 1 v / v / v) altta numunelerin lekelerini içeren tarafı olacak şekilde yavaşça koyun.
    5. Mobil fazın plakanın altından üstüne doğru hareket etmesine izin verin.
      NOT: Bu adım yaklaşık 2 saat sürebilir. Numuneler ayrılırken tankı hareket ettirmeyin veya rahatsız etmeyin.
    6. Plakaları mobil fazdan çıkarın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
    7. Boyama solüsyonunu küçük bir kaba ekleyin, silika plakasını 5 saniye boyunca% 5 (v / h) sülfürik asit kullanarak% 95 (v / h) etanol içinde% 0.3 (a / h) Naftol boyama çözeltisine hafifçe batırın, çıkarın ve ardından oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
      NOT: Bu adımda, ısıtma bloğunu/fırını açın ve sıcaklığı 100 °C'ye ayarlayın.
    8. Kurutulmuş silika plakaları ısıtma bloğuna koyun ve 100 °C'de 7-10 dakika veya mavi-mor lekeler görünene kadar ısıtın. Mavi-mor lekeleri gösteren silika plakaların fotoğraflarını çekin ve belgeleyin.
  3. Laminerin-oligosakkarit hidrolizatlarının konsantrasyonunu ölçmek
    NOT: LAM hidrolizatlarının konsantrasyonu, hem konsantre hem de konsantre olmayan protein ekstraktları21 için ölçülecektir.
    1. Bir C18 (Karbonhidrat 4,6 × 250 mm) kolonuna her numuneden 20 μL ekleyin ve 10 dakika boyunca %100 B'den %60 B'ye kadar bir su (çözücü A) ve asetonitril (çözücü B) gradyanı kullanarak 500 μL/dk'lık bir akış hızında ayrılmaya izin verin ve ardından kolonun yeniden dengelenmesine izin vermek için toplam 20 dakikalık çalışma süresine sahip kolon yeniden dengeleme adımları izleyin.
    2. Fazla çözücüyü, 30 psi nebulizatör gazını, 30 psi ısıtıcı gazını ve 20 psi perde gazını buharlaştırmak için 400 °C ısıtıcı sıcaklığına sahip kütle spektrometresi iyon kaynağında negatif elektrosprey modunda elüting analitlerini iyonize edin.
    3. Küme çözme potansiyelini 350 V olarak ayarlayın.
    4. 150 Da ile 1000 Da arasında değişen bir Q1 tarama modunda ve 3 sn bekleme süresinde kütle spektrometresi üzerindeki eluting analitlerini analiz edin.
    5. Analitlerin konsantrasyonlarını elektronik tabloya kaydedin.
  4. Glikoz konsantrasyonunu ölçün
    1. Üreticinin talimatlarına22,23 uyarak GOPOD reaktifi kullanılarak laminarin hidrolizi ile üretilen glikoz konsantrasyonunu analiz edin.
    2. Spektrofotometrenin sabit modunda 510 nm'de absorbansı ölçün.

13. Veri toplama ve analizi

  1. İstila veya numune toplama sırasında yanlılığı önlemek için tüm deneyleri rastgele hale getirin ve analizi dört nüsha halinde gerçekleştirin.
  2. Aksi belirtilmedikçe, toplanan deneysel verilerden oluşturulan grafik ve tablolardaki değerleri temsil etmek için ortalama ± standart sapmayı kullanın.
  3. Tüm verileri analiz etmek ve grafikler oluşturmak için Microsoft Excel'i kullanın.
  4. Uyumlu yazılım ile istatistiksel analiz yapın.
    NOT: Tedaviler arasındaki anlamlılığı test etmek için Çok Faktörlü Varyans Analizi (ANOVA) ve 0,05 alfa değerinde homojen grupları test etmek için Fisher'ın LSD'sini gerçekleştirin.

Sonuçlar

Buğday çeşitlerinin dört biyolojik kopyası (Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5), 3 yapraklı büyüme aşamasında RWASA2 ile istila edildi. İstiladan sonra yapraklar 1, 2, 3, 7 ve 14 dpi'de hasat edildi. Deney sonuçlarını strese maruz kalmayan buğday bitkileriyle karşılaştırılabilir hale getirmek için kontrol tedavileri RWASA2 ile enfekte edilmedi. Deneyler dörtlü olarak yapıldı ve sonuçlar ortalama değerler olarak sunuldu.

Hem RWASA2 ile enfekte edilmiş hem de kontrol ekstraktlarının protein konsantrasyonları, bir protein standardı olarak BSA kullanılarak ölçüldü. Bu, β-1,3-glukanaz ve POD için enzim aktivitesini belirlerken ve her reaksiyonda kullanılan protein konsantrasyonlarının her numune için bilinmesini sağlarken yararlıdır; Farklılıklar yok denecek kadar azdı. Veriler bir grafik veya tablo biçiminde sunulabilir. İlk grafik formatı, hem enzim aktivitesi hem de karakterizasyon tahlil sonuçları için istiladan sonraki günlere (x ekseni) karşı çizilen enzime özgü aktiviteleri (y ekseni) ifade etmek için kullanıldı. RWASA2 ile enfekte edilmiş dirençli Tugela-Dn5 örneklerinde β-1,3-glukanaz, MLG'ye özgü β-glukanaz ve POD'un artan spesifik aktivitesi, enzimlerin savunma yanıtında rol oynadığını göstermiştir (Şekil 1 ve Şekil 2). Ek olarak, her iki enzim de RWASA2 ile enfekte olmuş duyarlı Tugela'da zamanla aktivitesini önemli ölçüde kaybetti.

Hücre duvarı ile ilişkili β-1,3-glukanaz ve POD'un biyokimyasal karakterizasyonu, aktivitenin sırasıyla çizgi ve çubuk grafiklerle temsil edilen yüzde göreceli aktivite veya spesifik enzim aktivitesi cinsinden ifade edilmesiyle belirlendi (Şekil 3). Sonuç, hem β-1,3-glukanaz hem de POD'un asidik hücre duvarı koşullarına karşılık gelen pH benzeri optimum koşullara (pH 5) sahip olduğunu gösterdi (Şekil 3

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

Tartışma

Buğday ve arpa, Rus buğday yaprak bitleri (Diuraphis noxia) dahil olmak üzere yaprak biti türleri tarafından sıklıkla istila edilen tahıl ürünleridir7,24. Dirençli buğday bitkileri, kalloz ve lignin birikimini düzenleyerek hücre duvarını değiştirmek için istila dönemi boyunca savunma tepkileri olarak POD ve β-1,3-glukanaz aktivitelerinin yukarı regülasyonunu indükler 6,25,26,27. Çoğu çalışmanın POD ve β-1,3-glukanaz enzimlerini apoplast 3,12,28'den çıkardığını ve hücre duvarı işlevlerini oldukça spekülatif hale getirdiğini belirtmek önemlidir. Bu çalışma, hücre duvarına bağlı β-1,3-glukanaz, MLG'ye özgü β-glukanaz ve POD'u toplam proteinin bir parçası olarak ekstrakte eden bir yöntem geliştirdi. Bu enzimler, dirençli buğday çeşitlerinde kontrole göre oldukça aktif iken, duyarlı çeşitlerde aktiviteleri gecikmiştir. Deneylerdeki kontrollerin kullanılması, istilanın duvara bağlı enzimlerin aktivite seviyeleri üzerindeki etkilerini anlamaya yardımcı oldu. İstöle edilmiş veya kontrol örnekleri için üçüncü ve ikinci yaprak dokularından numune alınması, tutarlılık sağladığı için önemlidir. Ayrıca, POD, β-1,3-glukanaz ve MLG'ye özgü β-glukanaz aktivitesi buğday fidelerinin büyümesini artırdığından, istila edilmiş ve kontrolü aynı periyotta örnekleyin.

Bu çalışmada kullanılan kıvrık substrat, buğday-RWA etkileşimi sırasında hücre duvarı bölgesinde biriken bir polimer olan kallosunkine benzer bir kimyasal yapıya sahiptir 7,24. Arpa MLG substratı, çoğu monokotta ksilona kıyasla düşük oranda bulunan hücre duvarı hemiselülozunun bir kısmını temsil eder. Substratlar, bitki hücre duvarı bölgesi29'un asidik durumunu taklit etmek için sodyum sitrat pH 5 tamponu içinde çözüldü. β-1,3-glukanaz ve MLG'ye özgü β-glukanaz IWF ile uzaklaştırılırsa, kalan yaprak dokusundan ekstrakte edilen toplam protein, MLG ve curdlan substratları üzerinde aktiviteye sahip olmayacaktır. Ayrıca, protein ekstraktları sitoplazmik bölgeden elde edilmişse, nötr pH aralığında aktivite gösterirler. İlginç bir şekilde, her iki enzim de toplam protein ekstraktında mevcuttu çünkü MLG ve curdlan substratlarını başarılı bir şekilde hidrolize ettiler. MLG ve curdlan'ın ilgili enzimler tarafından hidrolizi, Mafa ve ark.6 tarafından modifiye edilmiş bir yöntem izlenerek DNS reaktifi tarafından tespit edilen indirgeyici şekerleri üretti. Numuneler daha yüksek toplam indirgeyici şeker konsantrasyonuna sahip olduğunda, azalan şeker konsantrasyonu düşük olduğunda DNS reaktif rengi sarıdan koyu kahverengiye değişir veya renk sarıdan açık kahverengiye (koyu turuncu görünür) değişir.

POD aktivitesini ölçmek için Guaiacol substratı kullanıldı. POD'un yüksek katalitik verimliliği nedeniyle, spektrofotometrenin kinetik modunu kullanarak aktivitesini ölçtük. POD, substratın (Guaiacol) varlığında düşükH2O2konsantrasyonu ile aktive edilir. Bu enzimin aktivitesi, guaiacol'ü kahverengi-turuncu renkli bir bileşik olan tetra-guaiacol oluşturmaya dönüştürür. Tetra-guaiacol üretimi, POD'un oligomerler üretmek için fenolik bileşikleri çapraz bağladığını veya fenolik bileşikleri lignine dahil ettiğini doğrular. POD, RWASA2 ile enfekte olmuş dirençli Tugela-Dn5'te daha yüksek aktivite seviyeleri gösterdi, bunu kontrollere kıyasla orta derecede dirençli Tugela-Dn1 izledi. Bununla birlikte, istila edilmiş duyarlı Tugela'da POD aktivite seviyeleri zamanla önemli ölçüde azalmıştır. Bu çalışmanın bulguları, RWASA2 istilasına uğramış dirençli buğday çeşitlerinin, lignin veya lignin-hemiselüloz bağlantılarını6 çapraz bağlayarak hücre duvarlarını güçlendirmek için POD kullandığı iddiasıyla desteklenmiştir. POD, H2O2'nin çalışmasını gerektirdi, bu da hücre duvarı bölgesindeki H2O2 seviyelerini düzenleyerek hücre duvarı yapısal karbonhidratlarının oksidasyonunu veya ağartılmasını azalttığını gösterir.

Bu hücre duvarına bağlı enzimler için biyokimyasal optimum koşulları belirlemek için farklı pH ve sıcaklık koşulları kullanıldı. Optimum koşullar, enzimlerin asidik pH aralıklarında (pH 5) optimum aktivitelere sahip olduğunu gösterdi, bu da hücre duvarı bölgesi ile ilişkili olduklarını gösteriyor. β-1,3-glukanaz için optimum sıcaklık, β-1,3-1,4-glukan ve β-1,3-glukan substratları hidrolize edilirken sırasıyla 25 °C ve 40 °C'de elde edildi. Bu gözlem, β-1,3-glukanazların ve MLG'ye özgü β-glukanazın, RWASA2 istilası sırasında dirençli buğday çeşitlerinin hücre duvarı bölgesinde indüklenen iki farklı enzim olduğunu doğruladı. Biyokimyasal karakterizasyon, benzer substratlara sahip farklı enzimleri keşfetmek veya tanımlamak için umut verici bir yöntem olsa da, yine de western blotting ve zymogram tahlilleri dahil olmak üzere diğer zahmetli ama doğru yöntemlerin kullanılmasını öneriyoruz. Son olarak, MLG-oligosakkaritlerin eksikliğinden dolayı MLG'ye özgü β-glukanaz için enzim aktivitesi modunu ölçemedik. Bununla birlikte, RWASA2 ile enfekte edilmiş Tugela-Dn5 ve Tugela-Dn1'den ekstrakte edilen β-1,3-glukanazlar, LAM5, LAM4 ve LAM3'te daha yüksek aktivite gösterirken, duyarlı Tugela'dan elde edilen glukanazlar LAM5 ve LAM4'te daha yüksek aktivite gösterdi. Bu, enzim aktivitesi modunun incelenmesinin, RWA ile enfekte edilmiş dirençli ve duyarlı çeşitlerde indüklenen β-1,3-glukanazlar arasındaki ince farklılıkları da yakalayabileceğini doğrular.

Mevcut çalışma, buğday yaprağı dokusundan hücre duvarına bağlı enzimlerin çıkarılması için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Ekstraksiyondan sonra, β-1,3-glukanaz, MLG'ye özgü β-glukanaz ve POD olmak üzere üç hücre duvarına bağlı enzim tanımladık. Bu enzimlerin aktivite seviyeleri, RWASA2 ile enfekte olmuş orta derecede dirençli Tugela-Dn1 ve dirençli Tugela-Dn5 çeşitlerinde kontrollere göre anlamlı derecede daha yüksekti. Bunlar, hücre duvarına bağlı enzimlerin dirençli çeşitlerde savunma tepkisine katkıda bulunduğunu doğruladı. Karakterizasyon bulguları, hücre duvarı POD ve β-1,3-glukanazın aynı koşullar altında işlev gördüğüne dair bir fikir verir, bu da buğday-RWASA2 etkileşimi sırasında hücre duvarını sinerjik olarak güçlendirdiklerini düşündürür.

Tartışılan mevcut protokollere müdahale eden bazı sınırlamalar tespit edilmiştir. Buğday bitkilerinin kıtlığı, enzim örneklerini çıkarmak için mevcut yaprak materyalini sınırlayabilir. Apoplasttan gelen IWF, hücre duvarı enzimleri ekstrakte edilmeden önce yaprak örneklerinden başarılı bir şekilde ekstrakte edilmezse, hem apoplast hem de hücre duvarı enzimlerinin kombinasyonuna yol açabilir. IWF ve hücre duvarı bölgesi enzimlerinin kombinasyonu, hücre duvarına bağlı olan hücre duvarına bağlı enzimlerin incelenmesini zorlaştırır. Mevcut protokolde başka bir sınırlama tanımlanmamıştır.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

M. Mafa NMK-Thuthuka'dan fon aldı (Referans Numarası: TTK2204102938). SN Zondo, yüksek lisans derecesi için Ulusal Araştırma Vakfı Yüksek Lisans Bursunu aldı. Yazarlar, bu çalışmada kullanılan tohumları sağladığı için Tarımsal Araştırma Konseyi - Küçük Tahıl (ARC-SG) Enstitüsü'ne minnettardır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve tavsiye yazar(lar)a aittir ve bu nedenle fon sağlayıcılar bunlarla ilgili herhangi bir sorumluluk kabul etmez.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 kDa Santrifüj konsantre membran cihazıSigma-AldrichR1NB84206Sadece araştırma amaçlıdır. Teşhis prosedürlerinde kullanım için değildir. Biyolojik çözeltilerin konsantrasyonu ve saflaştırılması için.
2 g LaminaribioseMegazyme (Wicklow, İrlanda)O-LAM2Araştırma, biyokimyasal enzim tahlilleri ve in vitro diagnostik analizlerde kullanım için yüksek saflıkta laminaribioz.
3 g LaminaritrioseMegazyme (Wicklow, İrlanda)O-LAM3Araştırma, biyokimyasal enzim tahlilleri ve in vitro diagnostik analizlerde kullanım için yüksek saflıkta laminaritrioz.
3,5 Dinitro salisilik asitSigma-AldrichD0550İndirgeyici şekerlerin kolorimetrik tayininde kullanılır
4 g Laminaritetraoz;Megazyme (Wicklow, İrlanda)O-LAM4Araştırma, biyokimyasal enzim tahlilleri ve in vitro diagnostik analizlerde kullanım için yüksek saflıkta laminaritetraoz.
5 g LaminaripentaoseMegazyme (Wicklow, İrlanda)O-LAM5Araştırma, biyokimyasal enzim tahlilleri ve in vitro diagnostik analizlerde kullanım için yüksek saflıkta laminaripentaoz.
%95 Mutlak etanolSigma-Aldrich107017Analiz için mutlak
etanol asetik asitSigma-AldrichB00063Acetc asit buzul %100 analiz için (asetik asit içerir)
Azo-CM-SelülozMegazyme (Wicklow, İrlanda)S-ACMCPolisakkarit, 20 şeker kalıntısı başına yaklaşık bir boya molekülü olacak şekilde Remazolbrilliant Blue R ile boyanır.
Beta glukan (arpa) Megazyme (Wicklow, İrlanda)G6513Suda daha az çözünür olan toz halinde bir substrat. β-1,3-glukanaz aktivitesinin belirlenmesinde kullanılır.
Bio-Rad Protein Test BoyasıBio-Rad Laboratuvarları, Güney Afrika500-0006Kolorimetrik tahlil boyası, konsantre, Bio-Rad Protein Test Kitleri I ve II ile kullanım için 
Sığır serum albümini (BSA)Gibco Europe810-1018Yalnızca laboratuvar kullanımı için
Sitrat asidiSigma-AldrichC0759Yalnızca Yaşam Bilimleri araştırmaları için. Teşhis prosedürlerinde kullanım için değildir.
CM-curdlan Megazyme (Wicklow, İrlanda)P-CMCURβ-1,3-glukanaz aktivitesini belirlemek için toz haline getirilmiş substrat. Suda çözünmez.
D-GlukozSigma-AldrichG8270Yalnızca Yaşam Bilimleri araştırmaları için. Teşhis prosedürlerinde kullanım için değildir.
GuaiacolSigma-AldrichG5502Oksidasyon göstergesi. Peroksidaz aktivitesini belirlemek için kullanılır.
Hidrojen peroksitBDH Laboratuvar Malzemeleri, İngiltere10366Güçlü oksitleyici ajan.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Estonya)NITurba yosunu bazlı fide substratı.
Çok beslemeli gübre (5.2.4 (43))Multifeed ClassicB1908248Optimum kök gelişimini sağlamak için yüksek fosfor (P) gereksinimi olan genç gelişmekte olan bitkiler ve fideler için suda çözünür bir gübredir.
NaphtholMerck, AlmanyaN2780Bir katalizör varlığında hidrojenasyonlara uğrar.
FenolSigma-Aldrich33517Işığa duyarlı. Ar-Ge için Yalnızca D kullanın. İlaç, ev veya diğer kullanımlar için değil. SDS mevcut
Potasyum sodyum tartrat tetrahidrat (Rochelle tuzu)Sigma-AldrichS2377indirgeyici şekerin belirlenmesinde kullanılan 3,5-dinitrosalisilik asit çözeltisinin hazırlanmasında kullanılır.
Silika plaka (TLC Silika jel 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EASilika jel matrisi, floresan göstergeli 254 nm
Sodyum hidroksitSigma-AldrichS8045Ar-Ge için Yalnızca D kullanın. İlaç, ev veya diğer kullanımlar için değil.
Sodyum metabisülfitSigma-Aldrich314483,5-dinitrosalisilik asit çözeltilerinin hazırlanması sırasında bir antioksidan olarak eklenir.
Sodyum fosfat dibazik heptahidratSigma-AldrichS9390Biyolojik araştırmalarda pH'ı sabit tutmak için tampon çözelti olarak kullanılır.
Sodyum fosfat monobazik heptahidratSigma-Aldrich71500Suda çözünen inorganik bir bileşik. Silikat bazlı harçların geliştirilmesinde reaktif olarak kullanılır.
İstatistiksel analiz yazılımıTIBCO Statisticasürüm 13.1
Sülfürik asitMerck, Darmstadt, Almanya30743Hg, ACS reaktifi analizi için sülfürik asit %95-97.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001İnkübasyon karışımlarında tamponlama maddesi. Ayrıca lizis ve TE (Tris-EDTA) tamponunun bir bileşeni olarak da kullanılmıştır. Yalnızca yaşam bilimleri araştırmaları için. Teşhis prosedürlerinde kullanım için değildir.
UV– Görünür SpektrofotometreGENESYS 120 
  NI = tanımlanmadı.
,

Kaynaklar

  1. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
  2. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
  3. Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
  4. Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
  5. Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
  6. Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
  7. Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review. J Plant Physiol. 269, 153582(2022).
  8. Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
  9. Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
  10. Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
  11. Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
  12. Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
  13. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  16. Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
  17. Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
  18. Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
  19. Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).
  20. Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).
  21. Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
  22. Megazyme. GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
  23. Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress. Plants. 11 (3), 394(2022).
  24. Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
  25. Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
  26. Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358(2014).
  27. Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747(2021).
  28. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
  29. Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Beta 1Peroksidaz AktivitesiRus Bu day AfidiPatogenezle li kili ProteinlerEnzim Karakterizasyonunce Tabaka KromatografisiGlukanaz Substrat zg nlBitki Zararl Etkile imi
Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının #946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.