Yöntem makalesi

Donör Kalp Koruma Stratejilerini Test Etmek için İzole Çalışan Bir Sıçan Kalbi Modeli Kullanma

1.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66910

⸱

4 Ekim 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

Bu makalede

Özet

Donör kalp koruma stratejilerini test etmek için ex vivo izole çalışan bir sıçan kalbi protokolü tanımladık. Bu makale, kemirgen donör kalplerinin statik soğuk depolanmasında kullanım protokolünü açıklamaktadır; Bununla birlikte, protokol dolaşım ölümü ve beyin ölümü sonrası bağış sonrası elde edilen donör kalpler için de kullanılabilir.

Özet

Donör kalp koruma çözümlerinin optimizasyonu, organ alımı, taşınması ve transplantasyon sırasında donör kalplerinde iskemi-reperfüzyon hasarının azaltılmasında önemli bir rol oynamıştır. Laboratuvarımızdaki önceki çalışmalar, donör kalp koruma solüsyonlarına gliseril trinitrat ve eritropoietin ilavesinin, uzun süreli soğuk hava deposundan sonra ve dolaşım ölümü kalplerinden sonra bağışta kardiyak fonksiyonel iyileşmeyi önemli ölçüde iyileştirebileceğini gösterdi. Bu takviye protokolü, Avustralya, Belçika ve Birleşik Krallık'taki nakil ünitelerinde klinik kullanımda uygulanmıştır. Burada, ex vivo izole çalışan sıçan kalbi (IWRH) perfüzyon devresi kullanarak takviye stratejilerini test etmek için bir protokol özetliyoruz. Bu metodolojiyi kullanarak, takviye stratejileri, uzun süreli soğuk statik depolama, beyin ölümünden sonra bağış ve dolaşım ölümünden sonra bağış donörü kalbinin korunması bağlamında test edilebilir. Aort akımı, koroner akım, kardiyak debi, nabız basıncı ve kalp hızı ile ölçülen kardiyak fonksiyonel iyileşme, belirli bir koruma stratejisinin donör kalbin iskemi-reperfüzyon hasarını en aza indirip indiremeyeceğini belirlemek için kullanılabilir.

Giriş

Bir kalp naklinin başarısı, donör kalp için kullanılan koruma yönteminden büyük ölçüde etkilenebilir. Donör kalpler, organ alımı, taşınması ve nakli süreci boyunca iskemik hakaretlere maruz kalır. Donör organdaki iskemik hasarın derecesi, uygun bir donör kalp koruma stratejisi seçilerek azaltılabilir. Soğuk statik depolama (CSS), donör kalbinin korunması için en uygun ve yaygın yöntem olmaya devam etmektedir; bununla birlikte, CSS tüm kalp bağışı yolları için en iyi seçenek olmayabilir. Örneğin, dolaşım ölümü sonrası bağış (DCD) yolu ile temin edilen kalpler, normotermik makine perfüzyonu kullanılarak korunur ve canlılık açısından değerlendirilirken, beyin ölümü sonrası bağış (DBD) yolu ile temin edilen kalpler CSS veya hipotermik makine perfüzyonu kullanılarak korunabilir. Kullanılan koruma stratejisi için bir diğer önemli belirleyici, kalbin organ temini ve nakli sırasında maruz kaldığı sıcak iskemi (DCD için) veya soğuk iskemi (DBD için) miktarıdır.

Birçok merkez, iskemik toleransı artırmak ve nakil sonrası kalp fonksiyonunu iyileştirmek için kalp koruma solüsyonunun ek farmakolojik takviyesini kullanır. Laboratuvarımızdan yapılan kemirgen çalışmaları, kardiyoplejinin eritropoietin ve gliseril trinitrat ile takviyesinin, donör kalbin uzun süreli soğuk depolanmasından sonra kardiyak fonksiyonel iyileşmeyi önemli ölçüde iyileştirebildiğini göstermiştir 1,2. Bu çalışmalar daha sonra donör kalbin korunmasına yönelik domuz çalışmalarına ilerledi ve normotermik makine perfüzyonu 3,4,5 kullanılarak bir DCD yolu yoluyla elde edilen kalplerin kardiyopleji çözeltisine eritropoietin ve gliseril trinitratın dahil edilmesine yol açan klinik öncesi temeli sağladı. Şu anda, eritropoietin ve gliseril trinitrat takviyesi, CSS'yi içeren klinik DBD kalp alımları için Avustralya nakil ünitelerinde de kullanılmaktadır. Aşağıda özetlenen izole çalışan sıçan kalbi (IWRH) perfüzyon protokolünün genel amacı, donör kalp koruma stratejilerini laboratuvar ortamında test etmek ve reperfüzyondan sonra donör kalp fonksiyonunu korumak için etkinliklerini test etmektir. Tarif edilen izole çalışan sıçan kalbi protokolü, laboratuvarımızda yirmi yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır ve donör kalp korumasını iyileştirebilecek potansiyel takviyeler ve / veya stratejilerin taranmasında son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır 2,7,8,9.

Protokol

Tüm hayvanlar, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (Avustralya) yönergelerine uygun olarak insancıl bakım aldı. Tüm hayvan prosedürleri, Garvan Tıbbi Araştırma Enstitüsü (Sidney, Avustralya) Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Krebs-Henseleit (KH) tamponunun hazırlanması

  1. 2.36 M NaCl, 0.094 M KCl, 0.024 M MgSO4, 0.024 M KH2PO4 içeren 20x stok çözeltisinden 2 L hazırlayın. 50 mL'lik tüplere koyun ve -20 °C'de saklayın.
  2. Deneyden önce, 1900 mL deiyonize su, 100 mL 20x stok KH tamponu, 4.20 gNaHCO3 (25 mM) ve 3.96 g glikoz (11 mM) içeren iki adet 2 L Erlenmyer şişesi 1x KH tamponu hazırlayın.
    1. Tampon şişelerini 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve çözeltiyi karbojen (%95 oksijen, %5 karbondioksit, akış hızı 2 L/dk'ya ayarlanmış) ile hava taşları (geçmeli giriş filtresi) aracılığıyla 5 dakika boyunca gazlayın, ardından 2,8 mL 1 M CaCl2 (1,4 mM) ekleyin. Deneyin başlamasından önce çözeltiyi en az 1 saat köpürtmeye devam edin. Bir hava taşının kullanılması, tamponun düzgün bir şekilde havalandırılmasına yardımcı olur.
    2. Soğuması ve bir buzlu tampon tabakası oluşturması için -20 °C'de yuvarlak metal bir tabağa küçük hacimli (~ 50 mL) bir tampon yerleştirin.

2. Perfüzyon devresinin hazırlanması

  1. Tüm boru ve cam eşyaların görünür bir büyüme/kirlenme olmadan temiz olduğundan emin olun.
  2. 1 cm H2O'nun 1,36 mmHg'ye eşdeğer olmasına bağlı olarak gerekli perfüzyon basınçlarına karşılık gelecek şekilde cam odaların yüksekliklerini ayarlayın: Langendorff'tan kalbe 100 cm (yaklaşık 75 mmHg), ön yük yan kalbe çalışma 15 cm (yaklaşık 11 mmHg), kalpten son yüke bölme 100 cm (yaklaşık 75 mmHg).
  3. Kalp perfüzyonundan en az 10 dakika önce devrenin etrafında sıcak su sirkülasyonunu başlatın.
  4. Mikrofiber filtreleri (1.2 μm) filtre tutuculara yerleştirin ve sıkıca sabitleyin.
  5. Devreyi KH tamponu ile doldurun, tüm havanın çıkarıldığından emin olun ve bir akış kontrol tüpü cl kullanınamp Langendorff tarafındaki akışı ayarlamak için (Şekil 1A, B) ~50 mL/dk'ya ayarlayın. Daha yavaş akış, aort kanülasyonunu kolaylaştırır ve bağlamadan önce kalbin yerinden çıkmasını önler. Tamponun sıcaklığını ~37 °C'de izlemek için T şeklinde bir boru konektörü aracılığıyla devrenin içine bir termometre yerleştirin.

3. Lab Chart (veri analizi) yazılımının kurulması

  1. Veri analiz yazılımını açmadan önce Powerlab (veri toplama sistemi) ve akış ölçerin açık ve bilgisayara bağlı olduğundan emin olun.
  2. Yeni bir dosya açın.
  3. Ayarlar açılır menüsünü ve Kanal Ayarları'nı seçerek veri toplamayı ayarlayın. Aort basıncı, aort akışı ve kalp atış hızı için seçin (Şekil 2A).
  4. Her kanalı Şekil 2B'de gösterilen ayarlarla ayarlayın.

4. Sıçan kalbi izolasyonu için hayvanın hazırlanması

NOT: Soğuk statik depolama için DBD olmayan ve DCD olmayan kalpler için sıçan kalbi izolasyonu ve perfüzyonu metodolojisi aşağıda özetlenmiştir. Perfüzyon devresine kalp enstrümantasyonu yöntemleri, hangi bağış yönteminin kullanıldığına bakılmaksızın nispeten benzerdir. DBD ve DCD sıçan kalbi bağışı protokolündeki farklılıklar, esas olarak hayvan anestezisinin yürürlüğe girdiği andan kalbin hayvandan çıkarıldığı zamana kadar ortaya çıkar.

  1. Hayvanı tartın ve ağırlığının >330 g olduğundan emin olun. Erkek sıçanlar için ideal ağırlık aralığı 330-420 g'dır.
  2. İntraperitoneal ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın. Pedal refleksi (ayak parmağını sıkıştırma refleksi) ve göz kırpma refleksinin olmamasına bağlı olarak yeterli cerrahi anestezi düzlemi sağlayın.
  3. Hayvanı sırtüstü pozisyona getirin ve uzuvları bantla sabitleyin. Hayvana bir burun konisi ile oksijen verin.
  4. Diseksiyon istasyonunda KH tampon buzlu rüşvet metal kabını ve buzlu küçük bir metal kabı bulundurun. 7,5 cm x 7,5 cm'lik bir gazlı bezi KH tamponuna batırın ve buzlu kabın üzerine yerleştirin.
  5. Yeterli cerrahi anestezi düzlemi onaylandıktan sonra, cerrahi insizyon bölgesinde cildi tıraş edin ve cildi betadin gibi aseptik veya% 70 alkol ile temizleyin. Karın boyunca yanal bir kesi yapın (laparotomi) ve sol böbrek damarına erişim sağlamak için mide ve bağırsakları yana doğru hareket ettirin. 1500 IU heparin enjekte edin ve kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın. Kalp alımına devam etmeden önce heparinin dolaşması için 1-2 dakika bekleyin.
  6. Her iki taraftaki göğüs kafesini keserek ve diyaframı keserek göğüs boşluğunu açın. İnen aort boyunca keserken kalp-akciğer bloğunu dikkatlice tutun ve kaldırın, aort kemerinin sağlam kalmasını sağlayın. Bu, kanülasyon için yeterli aort uzunluğunun kalmasına izin verecektir.
  7. Sıçan, anestezi altındayken kalbin ve akciğerlerin çıkarılmasıyla ötenazi yapılır. Kalbin durmasına izin vermek için kalp-akciğer bloğunu KH tampon buz çamuruna batırın.

5. Kalbin izole çalışan kalp perfüzyon devresine kanüle edilmesi

  1. Kalp-akciğer bloğunu buz üzerinde bir gazlı beze aktarın. Aort çevresindeki fazla yağı inceleyin, aortu kanülasyon için 3-5 mm uzunlukta kalacak şekilde kesin ve pulmoner arterde ~ 1-2 mm küçük bir kesi yapın. Bu, koroner atık su için bir yol sağlayacaktır.
  2. Kesilmiş kalp-akciğer bloğunu (hala buz üzerindeyken) doğrudan kanüllerin altına yerleştirin. Aort kanülasyonunu kolaylaştırmak için bir akış kontrol tüpü kelepçesi kullanarak Langendorff tarafından akışı ayarlayın. Aortu dikkatlice sol kanül üzerine kanül edin, siyah bir klemp ile tutun ve 2-0 ipek dikiş ile bağlayın.
  3. Akış kontrol hortumu kelepçesini tamamen açarak Langendorff perfüzyonundan gelen akışı artırın. Son yük kelepçesini açın. Langendorff odasından sürekli akış olduğundan emin olun. Yazılımla kalp aktivitesini izlemeye başlayın.
    NOT: Akış ölçer ekranındaki aort akış değeri <10 mL/dk ise, pulmoner arteriyotominin yeterli boyutta olduğundan emin olun. Düşük bir aort akış izi/değeri, aort kanülünün çok uzağa yerleştirildiğini de gösterebilir.
  4. Kalp-akciğer bloğunu, akciğerlerin ön yüzeyi operatöre bakacak şekilde ayarlayın. Sol akciğer lobunu 2-0 ipek dikişle bağlayın ve fazla sol akciğer dokusunu kesin. Kalan akciğer loblarını 2-0 ipek sütür ile tek seferde bağlayın ve dokuyu kesin. Kalbi, bağlı akciğerler arkaya doğru olacak şekilde döndürün.
  5. Küçük Vannas makası kullanarak sol atriyal apendiksin 2-3 mm'lik bir kenarını kesin ve kulakçıklara küçük bir açıklık elde edilmesini sağlayın. Sol atriyal apendiksiyi dikkatlice sol kanüle edin, siyah bir kelepçe ile tutun ve 2-0 ipek dikişle bağlayın. Şekil 3A , her iki kanülün yerleşimini göstermektedir.
  6. Kalp haznesi su ceketini, kalp haznenin ortasına oturacak şekilde ayarlayın.
  7. Basınç dönüştürücüsünü havaya açın ve yazılımdaki Aort Basıncı açılır menüsünü > Bridge Amp > Zero'yu seçerek basınç dönüştürücüyü sıfırlayın. Tamam'a tıklayın.
  8. Kalbi Langendorff modunda 10 dakika boyunca perfüze edin. Langendoff aort akışının 10-20 mL/dk (ideal 20 mL/dk) arasında ölçüldüğünden emin olun.
  9. Çalışma modunu değiştirmeden önce, Langendorff KH tampon haznesinden gelen hava taşının (geçmeli giriş filtresi) çalışan KH tampon haznesine yerleştirildiğinden emin olun.
  10. Aort kanülüne giden büyük kelepçeyi kapatarak ve sol atriyal apendiks'e giden akışı açarak kalbi çalışma moduna geçirin. Çalışma perfüzatöründen çıkan üç musluğu açın. Ortak dönüş borusunu (KH tamponunu rezervuara geri alarak) Langendorff rezervuarından çalışan rezervuara aktarın.
  11. Kalbi 15 dakika boyunca çalışma modunda perfüze edin. Aort akım değerleri ideal olarak 15 dakikalık perfüzyon sonunda >30 mL/dk olmalıdır. Kalp stabilize olduktan sonra, verileri veri analiz yazılımına kaydetmeye başlayın.
  12. Koroner atık suyu (koroner akış) 1 dakika, 5 dakika, 10 dakika ve 15 dakikada ölçün.
    NOT: Koroner akım değerleri 10-20 mL/dk arasında olmalıdır. 22 mL/dk'dan büyük koroner akış genellikle bağlanmamış bir akciğer damarından kaynaklanan bir sızıntıyı gösterir. Kalp atış hızı 200-300 bpm arasında olmalıdır. Koroner atık su, doku hasarı belirteçlerinin (örneğin, troponin-I, laktat dehidrojenaz salınımı) aşağı akış analizi için toplanabilir.

6. Kalbin soğuk statik depolanması için kardiyoplejinin uygulanması

  1. Kardiyopleji odasını (yaklaşık 40 mmHg perfüzyon basıncı elde etmek için 60 cm yüksekliğe yerleştirilmiş) 50 mL belirlenmiş kardiyak koruma solüsyonu (takviyeli veya takviyesiz) ile doldurun.
  2. Su ceketini indirin ve çalışma modu tarafındaki üç musluğu kapatın.
  3. Kelepçeyi kapatarak sol atriyal kanüle doğru akışı durdurun.
  4. Aort kanülüne giden akışı açın.
  5. Kelepçeyi Langendoff tarafından ve art yük üzerinde kapatın.
  6. Kelepçeyi kardiyopleji hattından açın ve 15 mL kardiyoplejiyi basınç hattından dışarı atın. Basınç hattındaki musluğu kapatın.
  7. Kalbin aort kanülü yoluyla kardiyopleji ile yıkanmasına izin verin ve koroner atık suyu toplayın. Kardiyoplejiyi 3 dakika çalıştırın ve uygulanan kardiyopleji hacmini kaydedin.
  8. Yazılımda veri kaydetmeyi durdurun ve dosyayı kaydedin.
  9. 3 dakika sonra, kardiyopleji kelepçesini ve aort kanülüne giden küçük mavi kelepçeyi kapatın.
  10. Aort kanülüne bir bulldog kelepçesi ve sol kanüle ikinci bir bulldog kelepçesi yerleştirin. Kalp kanülü bloğunu devreden ayırın ve bir buz kutusunda kardiyopleji içeren bir behere yerleştirin (Şekil 3B, C).
  11. Kalbi buzdolabında 6 saat (veya istediğiniz soğuk saklama süresi) saklayın.

7. Soğuk statik depolamadan sonra kalp reperfüzyonu

  1. KH tamponunu bölüm 1'e göre hazırlayın.
  2. Perfüzyon devresini bölüm 2'ye göre hazırlayın.
  3. Kaydedilen dosyayı taban çizgisi perfüzyonundan açın.
  4. Kalp kanülü bloğunu buz kutusundan dikkatlice çıkarın ve perfüzyon devresine sabitleyin. Aort kanülünü yeniden bağlamadan önce, kanüldeki havayı çıkarmak için KH tamponu ile doldurulmuş künt uçlu 18 G'lik bir şırınga kullanın. Önce aort kanülünü bağlayın, Langendorff tarafındaki boru kelepçesini açın ve son yük boru kelepçesinin açık olduğundan emin olun.
  5. Perfüzyon devresine bağlanmadan önce kanülden havanın alındığından emin olarak sol atriyal kanülü yeniden bağlayın. Langendorff'tan çalışma moduna geçme zamanı gelene kadar çalışma tarafı kelepçesini kapalı tutun.
  6. Kalbi Langendorff modunda 15 dakika boyunca perfüze edin. Langendorff reperfüzyonunun başlangıcında veri kaydetmeye başladığınızdan emin olun.
  7. Çalışma moduna geçmeden önce, her iki köpüren taşı da KH tamponuna yerleştirin, çalışma tarafındaki 3 musluğu açın ve ortak dönüş borusunu çalışma rezervuarına aktarın.
  8. Beyaz Langendorff kelepçesini kapatın, beyaz çalışma tarafı kelepçesini açın ve kalbi 30 dakika boyunca perfüze edin. Aşağı akış analizi için belirlenen zaman noktalarında koroner atık suyu ölçün ve toplayın (örn., kardiyak hasar belirteçleri). Yeni bir segment başlatmak (veya alternatif olarak bir yorum eklemek) için yazılım kaydını durdurup yeniden başlattığınızdan emin olun.
  9. Yaklaşık 15 dakikalık çalışma modu reperfüzyonunda, üç musluğu kapatın.
  10. Reperfüzyonun sonunda, veri dosyasını kaydedin, devredeki akışı durdurun ve kalp bloğunun bağlantısını kesin. Histolojik işleme için sol ventrikül örneklerini toplayın ve / veya gelecekteki çalışmalar için donduruldu (ör., western blot çalışmaları için protein ekstraksiyonu).
  11. Filtreleri filtre tutucularından çıkarın, tamponu devreden boşaltın ve 5 L damıtılmış su ile iki kez yıkayın.
    NOT: Gerekli olmasa da, damıtılmış suyun su banyosu içindeki büyük bir kapta önceden ısıtılmasına yardımcı olur.

8. Fonksiyonel geri kazanım analizi

  1. LabChart dosyasını açın.
  2. En az 30 saniyelik bir kayıt bölgesini vurgulayın, ardından Veri seçimi ekle VEYA Veriye çoklu ekleme > Komut düğmesini tıklayın. Bu, istenen parametreleri yazılım içindeki bir DataPad dosyasına ekleyecektir.
  3. DataPad'> Pencere açılır menüsünü seçin.
  4. İşlevsel kurtarma analizi için kurtarma değerlerini DataPad'den vurgulayın ve bir elektronik tabloya kopyalayın. İşlevsel kurtarmayı, ilgili temel değeri 1,6,7'nin yüzdesi olarak hesaplayın.

Sonuçlar

Başlangıç perfüzyonundan elde edilen sonuçlar, ilk deneyin (ön depolama) başarılı olup olmadığını belirleyecektir. Langendorff modu sırasında görüntülenen aort akışı 14 - 22 mL/dk arasında olmalıdır. Langendorff akışı, aortun retrograd perfüzyonu nedeniyle akış ölçerde negatif bir değer olarak görüntülenir. Kabul edilebilir bir Langendorff izi örneği Şekil 4A'da gösterilmiştir.

Çalışma moduna geçildikten sonra, kalp yerleştikten sonra aort akışı en az 30 mL / dak olmalıdır. Akışın başlangıçta yaklaşık 50 mL / dk'ya yükselmesi, daha sonra stabil bir başlangıç aort akışına geri dönmeden önce yaklaşık 25 mL / dk'ya düşmesi normaldir. Başlangıç parametreleri tatmin edici olduğunda (AF > 30 mL/dk, CF 10-20 mL/dk, HR 200-300 bpm), kalp saklanabilir. İyi bir temel izleme örneği Şekil 4B'de gösterilmiştir.

Test edilen koruma çözeltisine bağlı olarak, bazı kalpler, mükemmel bir taban çizgisine sahip olmasına rağmen, uzun süreli soğuk statik depolamadan sonra iyi bir iyileşme sağlamayacaktır. Çalışma modunda zayıf iyileşmeyi gösteren bir iz örneği Şekil 4C'de gösterilmiştir.

Aort akışı için nihai fonksiyonel iyileşme, başlangıç değerinin yüzdesi olarak son aort akışı okumasına dayalı olarak hesaplanabilir. Örneğin, kalp başlangıç AF'si 40 mL/dk ve soğuk statik depolamadan sonra reperfüzyonun sonundaki AF 20 mL/dk ise, bu kalp için AF geri kazanımı P idi. Bu veri gösteriminin bir örneği Şekil 5'te gösterilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Çalışan kalp perfüzyon devresi. (A) İzole çalışan sıçan kalp perfüzyon devresinin fotoğrafı. Kırmızı kutu, izole edilmiş kalbin nerede konumlandırıldığını gösterir. (B) Langendorff (noktalı çizgi) ve çalışma modu (düz çizgi) perfüzyonu için devre boyunca KH tamponunun akış yönünü gösteren izole edilmiş çalışma kalbi perfüzyon devresinin şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: LabChart yazılım kurulumu. (a) Aort basıncı, aort akışı ve kalp atış hızı için kanal ayarlarının ayarlanması. (B) Üç kanalla ayarlanmış LabChart şablonu örneği. Sağdaki Windows, ayarlanan her bir kanalı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Kanülasyon ve kardiyopleji. (A) Su ceketi haznesine yerleştirilmeden önce kalp kanülasyonu. Sol kanül aort içine, sağ kanül ise sol atriyal apendiks yoluyla sol ventriküle yerleştirilir. Akciğer damarları bağlandı ve akciğer dokusu diseke edildi. (B) Kardiyopleji uygulandıktan sonra, kalp kardiyopleji solüsyonunu içeren bir behere yerleştirilir. Kanüller, teçhizattan ayrılmadan önce bulldog klipsleri ile kenetlenmiştir. (C) Uzun süreli soğuk hava deposu için bir buz kutusu içine yerleştirilen kalp örneği. Burada, reperfüzyon için iki kalp saklanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: LabChart izleme örnekleri. (A) İyi Langendorff izi, (B) Çalışma modu reperfüzyonu sırasında iyi iyileşme, (C) Çalışma modu reperfüzyonu sırasında zayıf toparlanma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Fonksiyonel iyileşme için temsili grafikler. (A) aort akışı, (B) koroner akış, (C) kalp debisi ve (D) kalp atış hızı. Bu figür Gao ve ark.8'in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Kalbin temel işlevinin hassas doğası göz önüne alındığında, perfüzyon teçhizatını temiz ve uyumlu bileşenlerle tutmak için özen gösterilmelidir. Örneğin, doğru PVC boru kullanılmalıdır. Silikon gibi bazı boru malzemeleri, boru yoluyla oksijen kaybına bağlı olabilecek daha düşük aort akışına ve kasılmasına katkıda bulunabilir. Piyasada izole edilmiş çalışan sıçan kalbi perfüzyon devreleri olsa da, bunların çoğu öncelikle sadece Langendorff perfüzyonu için kullanılır. Genel olarak, sol ventrikül diyastolik basınç (LVDP) ölçümleri elde etmek için sol ventriküle bir balon kateter yerleştirilerek bir Langendoff perfüzyon modelinde fonksiyonel ölçümler elde edilebilir. Bununla birlikte, bir Langendoff perfüzyon sisteminde ham aort akım ölçümlerini ve kardiyak debiyi ölçmek mümkün değildir. IWRH protokolünün ana avantajı, kalbin ek müdahalelerine (yani balon kateter) ihtiyaç duymadan aort akışı ve kardiyak debi fonksiyonel ölçümleri elde etme yeteneğidir. Çalışan bir sıçan kalbi perfüzyon sistemi için ticari seçenekler vardır ve bunlar bireysel çalışma gereksinimleri için özelleştirilebilse de, bu sistemler maliyetli olabilir.

Perfüzyon sırasında kemirgen kalbinin optimal temel fonksiyonunu sağlamak için protokolde kritik adımlar vardır. KHB tampon stok çözeltilerinin hazırlanması 4 haftadan eski olmamalıdır. Hazırlama sırasında perfüzyon devresinde herhangi bir hava kabarcığı bulunmamalıdır. Sol atriyal apendiks kanüle edilirken dikkatli olunmalıdır. Dokunun aşırı kullanımı yırtılma riskini artırabilir ve ayrıca kalbin fonksiyonel sinirliliğine de katkıda bulunabilir.

IWRH perfüzyon devresi performans kalitesi genellikle kalplerde elde edilen temel okumalarla belirlenebilir (AF > 30 mL / dak, CF ~ 20 mL / dak). Bir CSS modelinde daha fazla kalite kontrol testi, kalbin 1 μmol / L zoniporid artı 0.1 mg / mL gliseril trinitrat ile desteklenmiş Celsior koruma solüsyonunda tutuklanması ve saklanmasıyla gerçekleştirilebilir. Gliseril trinitrat artı zoniporid ile takviye edilmiş Celsior ile tutuklanan kalpler, 6 saatlik soğuk hava deposundan sonra anında Langendorff reperfüzyon geri kazanımını ve %40-60 arasında nihai fonksiyonel iyileşmeyi garanti eder. Makinenin iyi performans gösterip göstermediği konusunda şüpheniz varsa, bu kalite kontrol takviyesi test etmek için yararlıdır.

Dolaşım ölümünden sonra bağış yoluyla temin edilen kemirgen kalplerinin kullanım yöntemleri daha önce tarif edilmiştir10,11. Kısaca sıçanlar uyuşturulur, karotis arter kanüle edilir ve basınç ölçümleri elde edilir. Heparin (500 IU) karotis arter kanülü yoluyla enjekte edilir. Trakea, yaşam desteğinin çekilmesini başlatmak için bağlanır. Gerekli sıcak iskemik süreye ulaşıldığında, kalp eksize edilebilir ve perfüzyon devresine kanüle edilebilir. Koruma solüsyonunun DCD kalbine uygulanması için, 60 mL koruma solüsyonu devre üzerindeki basınç hattı üzerinden aorttan (~ 20 mL / dak) akıtılır. Pulmoner damarlar bağlanır, akciğerler diseke edilir, sol kanül yerleştirilir ve daha sonra 40 mL koruma solüsyonu basınç hattı üzerinden yıkanır. Kalp daha sonra yukarıdaki protokole göre perfüze edilir. Fonksiyonel iyileşme, fonksiyonel hemodinamiğin ham bir değeri olarak alınır ve değerler, sahte olarak çalıştırılan kalplerle karşılaştırılarak istatistiksel analiz yapılır (bununla birlikte, teçhizat üzerinde yıkanmış DCD yoktur).

Beyin ölümünden sonra elde edilen kemirgen kalplerinin kullanım yöntemleri daha önce tarif edilmişti12. Kısaca, hayvanlar DCD kemirgen protokolüne göre hemodinamik izleme ile uyuşturulur, entübe edilir ve havalandırılır. Temporoparietal kafatasında bir çapak deliği yapılır ve subdural olarak bir 3F embolektomi kateteri yerleştirilir. Sahte kontrollerde çapak delikleri vardır ancak kateter yerleştirilmez. Balon 2 dakika boyunca 0.3 mL su ile şişirilir ve 1 saat şişirilir. 1 saatlik hemodinamik gözlemden sonra, kalpler ekilir ve izole çalışan kalp perfüzyon devresine yerleştirilir, temel ölçümler kaydedilir, kardiyopleji uygulanır ve kalpler yukarıda tarif edildiği gibi soğuk saklanır.

IWRH perfüzyon devresini kullanmanın ana sınırlaması, sistemde dolaşmak için kan bazlı bir perfüzyon tamponunun kullanılamamasıdır. Perfüzata eklemek için yeterli kemirgen kanı elde etmek imkansız olurdu; Bu nedenle, kan bazlı perfüzyon mümkün değildir. Kemirgen heterotopik kalp nakli veya büyük hayvan ortotopik kalp nakli çalışmaları gibi alternatif modellerin, kan bazlı perfüzyonun etkisini test etmek için muhtemelen yapılması gerekecektir. Bununla birlikte, bu alternatif yöntemler mikrocerrahi beceriler ve / veya büyük hayvan cerrahi tesislerinde uzmanlık ve deneyimli anestezistler, perfüzyonistler ve kardiyotorasik cerrahlar gerektirir.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Burada açıklanan çalışmalar, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, St Vincent's Clinic Foundation ve NSW Sağlık Kardiyovasküler Araştırma Kapasitesi Kıdemli Araştırmacı Hibesi'nden PS Macdonald'a verilen hibelerle finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL renksiz Eppendorff tüp, kutu başına 1000Bio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 mL cent/tüpler (S) Kılıf/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BP Dönüştürücü/Kablo kitiADInstrumentsMLT1199Veri Toplama
Köprüsü AmpADInstrumentsFE221Veri Toplama
Karbogen 555G2BOCBOC002
Checktemp1 termometreHanna AletleriHI98509Teçhizat İnşaat
Kelepçesi Tutam 1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40Teçhizat
İnşaat Kelepçesi W/Uzatma Gövdesi Med.Thomas Scientific8847T08Teçhizat İnşaat
Kelepçesi W/Uzatma Gövdesi Sm.Thomas Scientific8847T02Teçhizat
Klipsleri, Kap, 60 g BasınçTutarlı Scientific14121Cerrahi Ekipman
Kapalı KonnektörThomas Scientific8847E25Teçhizat İnşaatı
Covidien Sofsilk 2-0 siyah önceden kesilmiş 45 cm 24'lü kutuÖzel Tıbbi MalzemelerS195Cerrahi sarf malzemeleri
Özel Yapım 250 mL Ceketli Gaz GidericiÖzel Üflemeli Züccaciye Pty LtdN/ATeçhizat Yapısı
Özel Yapım 750 mL RezervuarÖzel Üflemeli Züccaciye Pty LtdN/ATeçhizat İnşaatı
D-(+)-Glikoz Susuz SigmaUltraSigma-aldrich Pty LtdG7528-1KgKrebs Tamponu
Çift Kanallı KonsolCihazlarıyapmak için TS402Veri Toplama
Erlenmyer şişeleri 2 L 
Filtre Mikrofiber tip GF/C cam elyaf 47 mm, 100Bio-strategy Pty Ltd1822047
Forseps, 15 cm, 0,3 mm, CRVDTutarlı Bilimsel14114Cerrahi Ekipman
2-70 mm çaplı nesneleri tutmak için 9 mm x 115 mm uzunluğunda kollu Dört Çatal Kelepçe. Vinil kaplıMet-App Australia Pty Ltd1352Teçhizat İnşaat
Isıtıcı Sirkülatör. Dijital Katı Hal Kontrolü. (1020 Watt/240 Volt)Thermoline ScientificTU3Teçhizat İnşaatı
Heparin 5000 U / 5 mL kutu 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693İlaçlar
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mLCenvet Australia Pty LtdX5010Anestezik
Johns Hopkins Bulldog KelepçesiTutarlı Bilimsel CS-WPI-14117
Ketamin 100 mg/50 mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1
Anestezik Magnezyum Sülfat heptahidrat AR 500 g ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gKrebs Tamponu yapmak için
Erkek/Dişi Menteşeli AdaptörThomas Scientific8847V08Teçhizat İnşaatı
Masterflex L/S Hassas Boru için Kolay Yükleme Kafası, PPS, CRS RotorJohn Morris1015164Teçhizat İnşaatı
Metzenbaum makas, 11,5 cm kavisliTutarlı BilimselWPI-501748Cerrahi Ekipman
Metzenbaum makas, 14,5 cm düzTutarlı BilimselWPI-501252Cerrahi Ekipman
Montaj Donanımı F/2-HEADS SSJohn Morris1014414Pompa kafaları için montaj vidaları
Açık taraflı konektörThomas Scientific8847E05Teçhizat İnşaatı
ParaformadehitSigma-AldrichP6148-500GNumune işleme
Potasyum Klorür (AnalaR NORMAPUR) 500 gVWR Kimyasalları 26764.26Krebs Tampon
Potasyum fosfat monobazik yapmak için Sigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gKrebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 kanal kaydedici + Labchart yazılımıyapmak için ADInstrumentsML826Bilgisayar Donanımı ve Yazılımı
Hassas XN Satır İçi Akış Sensörü, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXNTeçhizat
İnşaat Neşter saplı tek kullanımlık #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Swinnex için Silikon Conta 47 mm 5/PKMerck MilliporeSX0004701Teçhizat İnşaatı
Silikon O-Ring 5-329 10/PKMerck Millipore XX1104707Teçhizat Yapımı
Tek Büret KelepçesiThomas Scientific8847T32Teçhizat Konstrüksiyonu
Geçmeli giriş Filtre gözenek boyutu 10 ve mikro; m (fıskiye)Sigma-aldrich59277Teçhizat İnşaatı
Sm. 360 Rotasyon KonnektörüThomas Scientific8847E35Teçhizat İnşaatı
Sodyum bikarbonatSigma-Aldrich Pty LtdS6297 - 250gKrebs Tampon yapmak için
Swinnex Filtre Tutucu, 47 mmMerck MilliporeSX0004700Teçhizat İnşaat
şırıngaları 1 mL kutu/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
9 mm çap x 125 mm uzunluğunda kol ve 5-80 mm tutmak için çift vidalı Üç Uçlu KelepçeMet-App Australia Pty Ltd1356Teçhizat İnşaat
Boru Debimetre Modülü TS410ADInstrumentsTS410Veri Toplama
Borusu PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Rulo 15.24m, şeffaf, DEHP ftalat içermez, gıda sınıfı REACThermo FisherNAL 8701-0600Teçhizat İnşaatı
Boru PVC 7,94 mm İç Çap x 11,1 mm OD 50ft Rulo 15,24 m, şeffaf, DEHP ftalat içermez, gıda sınıfı REACThermo FisherNAL 8701-0900Teçhizat İnşaat
Borusu PVC 9,52 mm İç Çap x 12,7 mm OD 100ft RuloTermo BalıkçıNAL 8701-4120Teçhizat İnşaatı
Vannas makas, 8,5 cm, Düz, 7 mm BıçaklarTutarlı BilimselWPI-500-086Cerrahi Ekipman
Su Banyosu 30 Litre Asma TepsiliThermoline ScientificTLWB-30Teçhizat İnşaatı
İnşaat ile buluşur

Kaynaklar

  1. Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
  2. Watson, A. J., et al. Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution. J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).
  3. Chew, H. C., et al. Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia. J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).
  4. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
  5. Joshi, Y., et al. Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases. Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).
  6. Villanueva, J. E., et al. Functional recovery after dantrolene-supplementation of cold stored hearts using an ex vivo isolated working rat heart model. PLoS One. 13 (10), e205850(2018).
  7. Villanueva, J. E., et al. The cardioprotective potential of the sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor empagliflozin in donor heart preservation. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1151-1153 (2020).
  8. Gao, L., et al. Critical role of the STAT3 pathway in the cardioprotective efficacy of zoniporide in a model of myocardial preservation - the rat isolated working heart. Br J Pharmacol. 162 (3), 633-647 (2011).
  9. Cropper, J. R., Hicks, M., Ryan, J. B., Macdonald, P. S. Cardioprotection by cariporide after prolonged hypothermic storage of the isolated working rat heart. J Heart Lung Transplant. 22 (8), 929-936 (2003).
  10. Gao, L., et al. Enhanced functional recovery of the heart donated after circulatory death determination with antemortem heparin. J Heart Lung Transplant. 39 (6), 607-609 (2020).
  11. Villanueva, J. E., et al. The effect of increasing donor age on myocardial ischemic tolerance in a rodent model of donation after circulatory death. Transplant Direct. 7 (6), e699(2021).
  12. Kumarasinghe, G., et al. Improved heart function from older donors using pharmacologic conditioning strategies. J Heart Lung Transplant. 35 (5), 636-646 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

skemi Reperf zyon HasarKardiyak Fonksiyonel yile meSo uk Statik SaklamaLangendorff Perf zyonuKardiyopleji Sol syonuAortik Ak l mKalp Perf zyon Devresi

İlgili makaleler