Yöntem makalesi

Yüzey Suyu ve Çevre Sağlığı Değerlendirmesi için Konvansiyonel Olmayan Bir Biyomonitör Olarak Hellgrammite

718 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66911

⸱

26 Temmuz 2024

 ,  ,  , 
1Posgrado en Hidrociencias, Colegio de Postgraduados, 2Instituto Politécnico Nacional, Laboratorio de Evaluación de la Salud de los Ecosistemas Acuáticos, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, 3Instituto Politécnico Nacional, Coordinación Politécnica para la Sustentabilidad

Bu makalede

Özet

Bu protokol, sucul ekosistemlerdeki zararlı etkilerin erken tespiti için biyobelirteçlerin kullanımını açıklar. Biyobelirteçler, sentinel özellikleriyle yakından ilişkilidir ve değişiklikleri, erken uyarı hasarlarının tespit edilmesine yardımcı olur.

Özet

Yaygın olarak Hellgrammites olarak bilinen Corydalus cinsinden dobsonflies larvaları, kayda değer büyüklükleri, geniş oluşum aralığı ve bir yıla kadar sürebilen uzun olgunlaşmamışlık süreleri ile karakterize edilir. Hellgrammitlerin kirliliğe ve habitat yapısı etkilerine karşı hassasiyet gösterdikleri açıkça bilinmektedir. Bu benzersiz özellikler göz önüne alındığında, Corydalus texanus larvalarının kullanılması, sucul ekosistemlerin ekolojik bütünlüğünü değerlendirmek için güvenilir biyoizleme ajanları olarak son derece uygundur. Bu protokol, C. texanus değerlendirmesi için gerekli araçları sağlamayı ve bir vaka çalışması yoluyla etkinliklerini göstermeyi amaçlamaktadır. Araştırma bulgularının, C. texanus larvalarının madencilik kirliliğine erken uyarı tepkileri gösterdiğini ve Zn, Fe ve Al gibi yüksek miktarda ağır metalleri biyolojik olarak biriktirdiğini gösteren pratik çıkarımları vardır. C. texanus popülasyonlarının varlığı veya yokluğu, ekosistem sağlığı ile ilgili potansiyel sorunları belirlemek için yararlı bir gösterge olarak hizmet edebilir. Alışılmadık yaklaşım, madencilikten etkilenen sahalarda erken kirlilik uyarıları göstererek, çevreyi korumak için zamanında harekete geçme ihtiyacını vurguladı. Eşsiz özellikleri göz önüne alındığında, C. texanus larvalarının güvenilir bir geleneksel olmayan biyoindikatör olarak kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

Giriş

Hellgramitler, Megaloptera (Latreille, 1802) takımından böcek larvalarıdır ve yetişkinlik dönemlerinde dobsonflies veya balık sinekleri olarak adlandırılırlar. Düşük bir çeşitlilik, ancak yaygın, su ekosistemlerinden gelen bu en iyi yırtıcı böcek larvaları grubunu karakterize eder1. Hellgramit türleri iyi tanımlanmış biyocoğrafik bölgelerde görülür; Bu nedenle, yüksek bir taksonomik bilgi olmadan türleri tanımlamak nispeten kolaydır. Özellikle, Corydalidae larvaları, Megaloptera takımından (20-90 mm vücut uzunluğu) en belirgin türe sahiptir.2 ve hellgramiti çıplak gözle görülebilir hale getirir.

Hellgrammites, etkileyici yırtıcı şekillerini ifade eden büyük çiğnemeler nedeniyle güçlü bir varlığa sahip, avcı olarak su ekosistemlerinde çok önemli bir rol oynar. Dorsoventral olarak düzleştirilmiş bir gövde ayrıca vücut boyunca 7-8 çift filament solungaç ile birleşir ve her iki tarafta altı stemmata bulunan bir kafa kapsülü, hellgrammitleri entomologlar ve hayranlar için büyüleyici organizmalar haline getirir3. Corydalidae erginleri, belirgin boyutları nedeniyle insanları şaşırtır ve bir izlenim imajı oluşturur; Ancak, tamamen zararsızdırlar. Hellgrammitlerin larva evrelerinde su ortamlarında önemli bir süre devam etme yeteneğine sahip olmaları dikkat çekicidir.

Hellgrammitlerin fenotipik özellikleri, su ekosistemlerindeki rollerini vurgulamak için özel bir şans verir; Bununla birlikte, gösterge potansiyelleri su ekolojistleri için en çok aranan özelliktir. Sucul ekosistemlerde biyoindikatör potansiyelleri hakkında geniş bilgi vurgulanmaktadır, çünkü bunların oluşumu, yüzey sularındaki organik kirliliğe karşı toleranssızlıkları nedeniyle habitatlarındaki iyi sağlık koşullarıyla ilgilidir 4,5,6,7,8.

Çoğu Corydalidae megalopteranı, Arnavut kaldırımı ve çakıl taşlarının baskın olduğu oluklar ve alt tabakalar olarak yüksek hızlı akan sularda yaşar, ancak hellgrammitler, budaklar ve kum alt tabakaları olan düşük gradyanlı akarsularda ve ayrıca göller 3,9,10 gibi lentik habitatlarda da görülür. Geniş oluşum yelpazesi, en iyi yırtıcının kritik özelliklerini ve etkili yaşam öyküsü stratejilerinin hedeflediği çeşitli habitatları kolonileştirme yeteneklerini yansıtır11. Hellgramitler, özelliklerini su ekosistemlerinin dinamikleriyle ilişkilendirdi; bu nedenle, spiracles tarafından hava solunumuna adaptasyon gibi stratejiler (trakeal solungaçların ventral tutamlarına ek olarak) Corydalidae stratejilerineuygundur 10.

Hellgrammitler belirli ekosistemlerde yaşar ve yerleşik modellerden sapmalara hızlı tepkiler sergiler, böylece bir erken uyarı sistemi olarak hizmet eder7. Bu yaban hayatı organizmalarının reaksiyonları, özellikle hedef olmayan kirletici karışımlar söz konusu olduğunda, kirliliğin su ekosistemleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için değerli bir araç olarak kullanılabilir. Kimyasalların bireysel toksisitesi nedeniyle ekosistemlerde canlı organizmalar üzerindeki bazı zararlı etkiler kabul edilmiştir, ancak kirletici karışımların etkisi tanımlanmalıdır. Hellgrammitlerden gelen erken uyarı yanıtları, bir kirletici karışımının etkilerine referans vererek veya kirleticilerin bireysel etkileri Gözlemlenebilir Etki Konsantrasyonu Yok (NOEC)12 tanıdığında bile zararlı etkilerin belirlenmesini mümkün kılabilir.

Deneysel akut ve kronik testler için çeşitli model organizmalar kullanılmıştır; Bununla birlikte, kontrollü koşullar altında kültürlenir ve korunurlar13. Kontrollü koşullar, maruz kaldıkları çeşitli kirleticilerin hedef olmayan etkilerini belirleyememelerine neden olur. Ayrıca, kirletici karışımının karmaşıklığı nedeniyle NOEC sıklıkla tanınır. Bu nedenle, son on yıllarda, ekotoksikolojik araştırmaların yürütülmesi için gerekli olan tarama sistemlerine, hedef olmayan etkilere sahip model olmayan yerli türlerin tanındığı kabul edilmiştir14. Sonuç olarak, hellgrammitler, su ekosistemlerindeki kirliliğin zararlı etkilerini değerlendirebiliyor gibi görünmektedir. Diğerlerinin yanı sıra biyolojileri, genetikleri ve fizyolojileri gibi özellikler, model olmayan organizmaları ekosistemlerde etki değerlendirmesi için uygun hale getirir14.

Bu protokol, hedef olmayan kirlilik karışımlarına yanıt olarak erken uyarı sinyallerini tespit edebilen model olmayan bir organizma kullanarak yeni bir biyoizleme aracı oluşturmayı amaçlamaktadır. En iyi sonuçları elde etmek için, model tür olan C. texanus'un larvaları tarafından sergilenen özellikler kapsamlı bir şekilde düşünülmüş ve analizedahil edilmiştir 15.

Protokol

figure-protocol-1
Şekil 1: Sucul ekosistemlerde kullanılmak üzere konvansiyonel olmayan biyomonitör Corydalus texanus'un nasıl kullanılacağına dair adım adım hızlı kılavuz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Saha Çalışması

  1. Şüpheli veya belirgin etkilerin tanındığı kirlilik kaynağının yukarı ve aşağı akışında bulunan çalışma alanlarını belirleyin (yani, dakik veya yaygın emisyonlar).
    NOT: Mevcut protokol dört ana nehirde 15 çalışma alanını içeriyordu: 1) Extoraz Nehri (PB, EZ, RQ, BC siteleri); 2) Escanela-Jalpan Nehri (ES, EN, AH, JL, PI, PA); 3) Ayutla Nehri (AY); ve 4) Santa María Nehri (SM, AT).
  2. En az bir referans sitesini arayın ve bulun (küçük veya etkilerin olmadığı bir yer) ve bunu bir çalışma alanı olarak tanımlayın.
    NOT: Mevcut çalışma alanları için BC, ES, SM, AY ve AT referans bölgeleri olarak kabul edilmiştir.
  3. C. texanus bireylerini bulma olasılığını artıran habitatların belirli özelliklerini tanır. Bunlar arasında çakıl substratı, daha dik eğimlere sahip kayalık habitatlar, yüksek hızlı akışlar, iyi oksijenli sular, yüksek gölgelik yoğunluğu ve yaylalar ve ovalardaki habitatlar bulunur.
  4. Biyolojik izleme için uygun habitatları belirlemek için derenin 100 m'lik bir bölümünü kapatın16.
  5. Örnekleri toplamak için akışın içine girin.
  6. En az altı bireyi örnekleyin C. texanus 500 μm ağ boyutuna sahip bir tekme ağı kullanarak oluklar, çakıl taşları, berrak sular ve döküntüler gibi habitatlarda.
  7. Suyun akış yönündeki kayaları çıkarın ve larvaları ağa aktarın.
  8. Tekme ağını örneklenmiş larvalarla tutun ve bunları geçici barınma için belirlenmiş şişelere aktarın. Ağı dikkatli tutun ve larva kaybını önlemek için kenarları iç kısma doğru katlayın.
  9. IX ila XI arasındaki yıldızları (6 mm ila 10 mm aralığında) tanımlamak için bir kumpas kullanarak örneklenen larvaların kafa genişliğini ölçün.
  10. Larvaları 30 dakika boyunca dere suyu içeren bir şişeye batırarak temizleyin.
  11. Numuneleri şeffaf etiketli plastik şişelere koyun ve ardından kriyojenik bir tankta sıvı nitrojene (-75 °C) daldırarak ötenazi yapın.
  12. Numuneleri -45 °C'de laboratuvardaki ultra dondurucuda güvenli bir şekilde taşıyın ve saklayın.
  13. Bir polietilen şişe kullanarak, 200 mL'lik bir akış suyu numunesi alın, 1 mL nitrik asit ekleyin ve numuneyi laboratuvarda daha sonra ağır metal miktar tayini için 4 °C'de saklayın.

2. Örneklenen larvaların diseksiyonu ve doku ayrılması

  1. Plastik diseksiyon tepsisini buzun üzerine koyun ve kontrol etmek için bir termometre kullanarak 4 °C'ye ulaşana kadar bekleyin.
  2. Ultra dondurucudan örnekler alın ve diseksiyona başlamak için diseksiyon tepsisine koyun.
  3. Hedef dokuları seçin: kas, dallar, nöral tüp ve dış iskelet.
  4. Kafayı çıkarmak için seramik bir bıçak kullanın ve dokuları dikkatlice ayırın. Vücudu uzunlamasına açın ve her iki taraftaki solungaçları çıkarın.
  5. Daha küçük bir seramik bıçak kullanarak dış iskeletleri ayırın ve fazla dokuyu temizleyin. Dış iskeletleri bir fırına koyun ve 80 °C'de 48 saat kurutun.
  6. Zaman geçtikten sonra, daha fazla analiz için kuru dış iskeletleri saklayın.
  7. Mikrotahlillerle daha fazla analiz için yumuşak dokuları soğuk koşullar altında temizlemeye devam edin.
  8. Yağdan yumuşak dokuları çıkarmak için küçük bir seramik bıçak kullanın. Her bir hedef dokuyu aynı örnekleme noktasından bireylerden ayırın ve bir araya getirin.
  9. Her doku tipini 2 mL'lik bir mikrotüpte saklayın ve işlem boyunca soğuk koşulları koruyun.
  10. Her bir hedef dokuyu hazırlamak için, 100 mg dokuyu tartın ve pH'ı 7.4 olan 1 mL PBS çözeltisi ekleyin. Her dokuyu homojenize etmek için tek elle doku yırtıcı kullanın. Tipik olarak, yumuşak dokular her biri 10 s'lik üç döngü gerektirir.
  11. Numuneyi 1.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
  12. Biyobelirteç mikro tahlilleri yapın.

3. Ağır metal miktar tayini

  1. Analitik bir terazi kullanarak belirtilen gelişim aşamasında en az altı örnekten 250 mg kurutulmuş dış iskelet tartın.
  2. Dış iskeletleri ince toz haline gelene kadar bir cam havanda öğütün. Toz reaksiyon kaplarına 250 mL ultra saf nitrik asit ekleyin.
  3. Numuneleri sindirmek için, 30-45 dakika boyunca 180 ° C'de bir sindirim mikrodalgasına aktarın.
    NOT: Numuneleri güvenli ve etkili bir şekilde ısıtmak için mikrodalga markası için doğru mikrodalgaya uygun kabı kullanın. Doku örnekleri için sindirim süresi mikrodalga markasına göre değişir ve 30-45 dakika sürer. Bazı markalar standartlaştırılmış yöntemler sunar.
  4. Su numuneleri için EPA3015A yöntemi izleyerek, 45 mL su numunesi kullanarak ve 5 mL nitrik asit ekleyerek bir mikrodalga sindirim yöntemi uygulayın.
  5. Hg, Cu, Pb, Zn, Fe, Cr, Cd, Mn, Ba ve As dahil olmak üzere endüktif olarak eşleştirilmiş plazma optik emisyon spektroskopisi (ICP-OES) kullanarak sindirilmiş numunelerdeki (su ve dokular) ağır metalleri ve metaloidleri ölçün.
    NOT: Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için argon derece 5 ve her metal ve metaloidin standart çözeltilerini kullanın.

4. Oksidatif stres ve biyobelirteçlerin değerlendirilmesi için mikro testler

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. 50 mM Monobazik Fosfat Tamponu yapmak için 6 g NaH2PO4'ü 1000 mL ultra saf su ile karıştırın. Bir şişede 2-8 °C'de süresiz olarak saklayın.
    2. % 8.1 SDS yapmak için 450 mg sodyum dodesil sülfatı (SDS) 5 mL ultra saf suda çözün. Kullanmadan hemen önce hazırlayın.
    3. 2 mL trikloroetanoik asidi (TCA) 8 mL ultra saf su ile seyreltin (gerektiğinde taze reaktif hazırlayın).
    4. 100 mg tetrabütilamonyumu (TBA) 10 mL ultra saf suda çözün (gerektiğinde taze reaktif hazırlayın).
    5. 50 mM PBS pH 7.8 yapmak için, 97mgNa2HPO4 ve 59 mg NaH2PO 4'ü 10 mL ultra saf suda çözün. Ardından, artırmak için NaOH veya azaltmak için HCl kullanarak pH'ı 7.8'e ayarlayın.
    6. 8 mg'ını 40 μL ultra saf suda çözerek 200 μg/mL'lik bir sığır katalaz çözeltisi hazırlayın (gerektiğinde taze reaktif hazırlayın).
    7. 50 mM TRIS / 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi yapmak için, 45 mL ultra saf suya 6.05 g tris (hidroksimetil) aminometan (TRIS) ve 0.073 g EDTA ekleyin. HCl ile pH'ı 7.6'ya ayarlayın ve kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
    8. 0.1 M glutatyonu azaltılmış (GSH) için (45 çoğaltılmış numune için), 0.0184 g GSH'yi tartın ve 600 μL 10 mM HCl'de çözün.
    9. 10 mM HCl hazırlamak için, 599,5 μL ultra saf suya 0,5 μL konsantre HCl ekleyin.
    10. 1.4 mL 0.1 M TRIS / HCl 0.5 mM EDTA pH 8.0'a 28.5 μL glutatyon redüktaz ekleyin.
    11. pH 8.0'da 0.1 M TRIS / HCl ve 0.5 mM EDTA çözeltisi hazırlamak için 1.211 g TRIS ve 0.0146 g EDTA'yı 90 mL ultra saf su ile karıştırın. Gerekirse pH'ı ayarlamak için HCl ekleyin. Çözelti 2-8 ° C'de süresiz olarak saklanabilir.
    12. 0.075 g NADPH ağırlığında ve 2.25 mL% 1 NaHCO3 1 mM EDTA'ya ekleyin.
    13. % 1 NaHCO3 ve 1 mM EDTA çözeltisi hazırlamak için 1 gNaHCO3 ve 0.0282 g EDTA'yı 100 mL ultra saf suda karıştırın. Çözeltiyi belirsiz bir süre boyunca 4-8 ° C'de saklayın.
    14. 7 mM'lik bir çözelti elde etmek için 2 μL t-bütil hidroperoksiti 2 mL ultra saf su ile karıştırın. Kullanmadan hemen önce karıştırın.
    15. 1 μg / μL'lik bir stok çözeltisi oluşturmak için 1 g sığır serum albüminini (BSA) 1 mL ultra saf su ile karıştırın.
  2. Tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) (lipid peroksidasyonu, LPO)17
    1. 1 mL'lik bir mikrotüpe 5 μL doku süpernatanı ekleyin. 45 μL 50 mM PBS (taze ve stok çözeltisi) ekleyin.
    2. 12,5 μL% 8,1 SDS (taze hazırlanmış) ekleyin. 93,5 μL TCA pH 3.5 (taze hazırlanmış) ekleyin.
    3. 93,5 μL% 1 TBA (taze hazırlanmış) ekleyin. 50,5 μL ultra saf su ekleyerek hacmi tamamlayın. Tüpün kapağını kapatın ve 30 saniye boyunca girdaplayın.
    4. Mikrotüp kapağını bir iğne ile delin ve 10 dakika kaynar suda inkübe edin.
    5. Tüpü oda sıcaklığında (RT) soğutun ve ardından 10 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin.
    6. 96 oyuklu bir mikroplakadaki bir kuyuya 150 μL süpernatan ekleyin ve bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak 530 nm'de absorbansı ölçün.
    7. Lipid peroksitlerin miktarını belirlemek için, Tablo 8'de açıklandığı gibi malondialdehit bis (dimetil asetal) kullanarak 160 noktalı bir TBARS kalibrasyon eğrisi (1-1 μM) oluşturun. Malondialdehit (MDA) eğrisini doku tipine veya şüphelenilen hasar seviyesine göre ayarlayın.
    8. Sonuçları nmol MDA eqmg-1 proteini olarak ifade edin.
  3. Süperoksit dismutaz antioksidan enzim mikroassay (SOD)18
    1. 96 oyuklu bir plaka kullanın. 147 μL 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8'i iki kuyucuğa boşluk olarak ekleyin. 144 μL 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8'i diğer kuyucuklara iki katına ekleyin.
    2. Süpernatanttan 3 μL alın ve numune kuyucuklarına ekleyin. Plakadaki içeriği birkaç kez yavaşça karıştırın.
    3. 30 saniye içinde her kuyucuğa 3 μL 10 mM pirogallik asit ekleyin. Hemen yavaşça karıştırın.
    4. T0 (zaman = 0 s) ve T10'da (zaman = 10 s), 420 nm ve 25 °C'de absorbansı ölçün.
    5. Aşağıdaki denklemi kullanarak numunedeki pirogallol inhibisyonu yüzdesini hesaplayarak SOD'yi belirleyin:
      figure-protocol-2
      Nerede
      x% = numunedeki SOD ile pirogallolün oksidasyon yüzdesi; Bu nedenle, pirogallolün oksidasyonu% 100 - X'e eşittir
      NOT: 1 IU dikkate alınarak SOD aktivitesinin hesaplanması, aşağıda açıklandığı gibi pirogallol oksidasyonunun% 50'sini inhibe eden hacimdir:
      figure-protocol-3
      Nerede
      y = mililitre cinsinden numune hacmi (pirogalonun P'sini inhibe eder)
      % 50 = pirogallolün inhibisyon yüzdesi 1U SOD'ye eşittir
      0.003 = numunenin mililitre cinsinden hacmi
      100 - x% = numune tarafından yüzde olarak pirogallolün inhibisyonu
    6. Son olarak, aşağıdaki denklemle SOD aktivitesini belirleyin:
      figure-protocol-4
      SOD = mikrogram protein başına uluslararası birimler cinsinden SOD aktivitesi
      Y = pirogallolün P'sini inhibe eden numune hacmi
      100 = desilitreden mililitreye dönüşüm faktörü.
      protein = Bradford'un miktar tayininden elde edilen protein konsantrasyonu mililitre başına mikrogram olarak ifade edilir; Desilitre başına grama dönüştürmek için 10'a bölmek gerekir
  4. Katalaz antioksidan enzim mikrotesti (CAT)19,20
    1. 96 oyuklu bir mikroplaka kullanın. Kuyucuklara 20 μL numune süpernatanı ekleyin (iki katına çıkarak).
    2. Standart olarak kuyucuklara 20 μL taze katalaz (200 μg/mL) ekleyin (iki katına çıkarak). Numuneye 100 μL 50 mM PBS pH 7.8 ekleyin ve kuyucukları boşaltın.
    3. Reaksiyonu başlatmak için kuyucuklara 100 μL 90 mM (% 30) H2O2 ekleyin. H2O2ekledikten sonra, 240 nm'de 2,5 dakika boyunca her 15 saniyede bir absorbans okuyun.
    4. Denklemi kullanarak etkinliği hesaplayın:
      figure-protocol-5
      figure-protocol-6
      figure-protocol-7
      figure-protocol-8
      figure-protocol-9
  5. Glutatyon peroksidaz enzim mikrodeneyi (GPx)21
    1. 96 oyuklu bir mikroplaka kullanın.
    2. 240 μL 0.1 M GSH çözeltisi, 1 200 μL 10 U / mL GSH-Rd çözeltisi ve 1 200 μL 4 mM NADPH'yi karıştırın. Çözeltiyi buz üzerinde tutun.
    3. 100 μL 50 mM TRIS / HCl 5 mM EDTA pH 7.6 kuyucuklarına ekleyin. İki parça halinde 1 μL süpernatan numune ekleyin. Mikroplakaya hafifçe vurun ve hafifçe karıştırın.
    4. 50 μL karışım çözeltisi ekleyin (adım 4.5.2) ve hafifçe karıştırın.
    5. Reaksiyonu başlatmak için kuyucuklara 20 μL 7 mM t-bütil hidroperoksit çözeltisi ekleyin (16 çoğaltılmış numunede reaksiyonun başlatılması yaklaşık 15 saniye sürer). Mikroplakayı hızlı bir şekilde karıştırın.
    6. 340 nm'de 25 ° C'de 5 dakika boyunca her 1 dakikalık aralıklarla absorbansı izleyin.
    7. GPx aktivitesini aşağıdaki denklemle hesaplayın:
      figure-protocol-10
      Nerede
      GPx = proteinin mikrogramı başına dakikada milimolar cinsinden aktivite
      ΔAbs340/dk= Deltada ortalama absorbans
      103 = molardan milimolara dönüşüm
  6. mg prot = Bradford'un belirlemesinden elde edilen protein konsantrasyonu, mikrolitre başına mikrogram olarak ifade edilir
    1. Bradford'un analizi ile protein miktar tayini22
    2. Tablo 1'de gösterildiği gibi stok çözeltisi 2 μg / μL'den ayarlanan sığır serum albümini (BSA) çözeltilerinden standart bir eğri gerçekleştirin.
    3. 96 oyuklu bir mikroplaka kullanın. Numuneye ve standart kuyucuklara 190 μL Bradford reaktifi ekleyin.
    4. Standart kuyucuklara iki katına 10 μL BSA ekleyin. Numune kuyucuklarına iki katına 10 μL süpernatan ekleyin.
    5. Pipet ucuyla nazikçe karıştırın.
    6. 595 nm'de absorbans okuyun. Protein konsantrasyonunu standart eğri ile ölçün.

Sonuçlar

Çalışmanın sonuçları, Şekil 2'de gösterildiği gibi, ağır metallerin, özellikle Alüminyum (Al), Demir (Fe) ve Çinko'nun (Zn) çevre üzerinde zararlı bir etkiye sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Tüm bölgelerden toplanan hem doku hem de su örneklerinde yüksek düzeyde ağır metallerin tespit edilmesi olumsuz bir sonuca yol açmıştır. Biyoakümülasyon Faktörü (BAF) 600 olan aykırı değerler, özellikle Extoraz Nehri gibi madencilik yoğun alanlarda ( Şekil 3'te gösterilen PB, EP, RQ ve BC bölgeleri) tespit edildi. Dikkat çekici bir şekilde, sudaki çinko konsantrasyonlarının anormal derecede yüksek (PB) olduğu bazı çalışma alanlarında, C. texanus örneklerini bulmak mümkün değildi. Bu, biyoakümülasyon eşiğinin muhtemelen aşıldığını gösterir.

figure-results-1
Şekil 2: 15 çalışma alanı boyunca örneklenen Corydalus texanus bireylerinde değerlendirilen Biyoakümülasyon Faktörünün (BAF) kutu grafiği. Al, Fe ve Zn metalleri için C. texanus bireylerinin su örnekleri ve dış iskeletleri analiz edilerek biyoakümülasyon faktörü (BAF) hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SGBR korunan bir doğal alan olduğundan, nöbetçi organizmayı etkileyebilecek hiçbir çevresel değişikliğin meydana gelmemesini sağlamak esastır. Bununla birlikte, oksidatif stres biyobelirteçlerinin yanıtlarında gradyanlar gözlenmiştir (Şekil 3). Değerlendirmeye göre, LPO seviyeleri ile kanıtlandığı gibi en düşük hücre zarı hasarı seviyelerine sahip bölgeler EN, SM ve CN idi. Aynı bölgeler, vücudun oksidatif strese karşı savunmasında birincil enzim olarak görev yapan düşük bir SOD aktivitesi seviyesi sergiledi. Bu, bu yerlerde meydana gelen minimum oksidatif stres olduğunu ve bu nedenle sentinel organizmaları etkilemeyen müdahalelerin düşünülebileceğini düşündürmektedir. Buna karşılık, GPx'in aktivitesinin, yüksek LPO seviyelerinin kaydedildiği EP, RQ, BC ve ES gibi çeşitli bölgelerde önemli ölçüde daha düşük olduğu gözlendi. Bu gözlem, organizmanın esas olarak madenciliğin neden olduğu stresli koşullara tepki verdiğini göstermektedir. Bu özel organizma içindeki erken uyarı belirteçleri değerlendirildiğinde, belirli bölgelerin düşük ve yüksek düzeyde etkiye sahip olduğu keşfedilmiştir. Bu bulgular, bu türün alışılmadık bir nöbetçi olarak kullanılmasının faydasını etkili bir şekilde göstermektedir.

figure-results-2
Şekil 3: Kurak ve yağışlı mevsimlerde Meksika'daki bir havzaya (Sierra Gorda Biyosfer Rezervi) akan üç ana nehirdeki 15 örnekleme alanında Corydalus texanus örneklerinde değerlendirilen biyobelirteç tepkilerinin kutu çizimi. Yanıtlar üç biyobelirteç kullanılarak ölçüldü: (A) hücresel erken hasarı yansıtan lipid peroksidasyon seviyesi (LPO), (B) birinci basamak hücresel savunma süperoksit dismutazın (SOD) antioksidan yanıtı ve (C) glutatyon peroksidaz (GPx) ile hücresel savunmanın antioksidan yanıtı. Kırmızı oklar, biyomonitör bireylerinin yokluğunu veya yalnızca bir kez meydana gelen çok sınırlı sayıda örneğin olmadığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tüp200 μM MDA bis (μL)Ultra saf su (μL)MDA bis konsantrasyonu (μM)
1010000
212.5987.52.5
3259755
45095010
510090020
620080040
740060080
8800200160

Tablo 1: MDA konsantrasyon eğrisini oluşturmak için gereken MDA konsantrasyonu.

Konsantrasyon (μg/μL)Stok çözeltisi (μL)Ultra saf su (μL)
0050
0.1545
0.21040
0.42030
0.84010
1500

Tablo 2: Protein miktar tayin eğrisi için BSA konsantrasyonu.

Tartışma

Her ne kadar kullanımı C. texanus değerlendirme için en uygun olsa da, kullanımının ve toplanmasının çeşitli yönlerini dikkate almak gerekir. Seçilen bölgelerdeki olumsuz hava koşulları, coğrafi erişilemezlik, yüksek kuraklık seviyeleri veya yetersiz güvenlik protokolleri gibi çeşitli faktörler nedeniyle seçilen çalışma alanları zorlu olmaktadır. Belirtilen kısıtlamalar ve sınırlamalar, saha çalışması yürütülürken genellikle zorluklar ortaya çıkarabilir. Belirli bölgeleri, özellikle tropikal akarsulardaki bölgeleri değerlendirirken, numune almak zor olabilir. Bu amaç için Barbour23 yönergelerine uyulmasına rağmen, belirli özellikleri nedeniyle bazı ekosistemlerde protokollerin uyarlanmasının önünde engeller olabilir. Daha önce de belirtildiği gibi, tropikal lotik ortamlarda numune toplamak, bölgesel ve yerel faktörler nedeniyle çeşitli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu faktörler, yüksek düzeyde çevresel heterojenliği, yüksek varyasyonlu substratları, havzayı, genişliği, derinliği, akışı, nehir kenarı bitki örtüsünü ve çok çeşitli fiziksel-kimyasal koşulları kapsar24. Sonuç olarak, numuneler için tek tip bir boyut elde etmek, özellikle mevsimsel değişikliklere yanıt olarak, belirtilen bir faktör aralığından doğal olarak etkilendikleri için zor olabilir. Sonuç olarak, boyutlarını standartlaştırmak karmaşık bir girişim olabilir. Saha çalışmasının başarılı bir şekilde tamamlanmasının ardından, sonraki laboratuvar prosedürleri kolaylaştırılır ve daha fazla analize izin verilir.

C. texanus'ta erken uyarı değerlendirmesinin uygulanması, sucul ekosistemler bağlamında etkileri yansıtmada uygulanabilirliğini göstermiştir. Bu bağlamda, sucul makro omurgasızları insan etkisinin güvenilir göstergeleri olarak tanımlamanın pratik bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır25,26. Mevcut araştırmalar, C. texanu'nunçevresel koşulları hızlı bir şekilde değerlendirmek için oldukça etkili geleneksel olmayan bir model olarak hizmet ettiğini göstermiştir. Mevcut çalışma söz konusu olduğunda, C. texanus'un madencilikten kaynaklanan ağır metal kirliliği ile karşı karşıya kalınan tepkilerde çeşitlilik gösterdiğini göstermiştir. Habitat değişikliklerinin ek etkileri, C. texanus'ta yüksek hassasiyet derecesinin tanınmasına izin verir. Bölgede madencilik faaliyetine dair kanıtlar mevcut olsa da, Rico-Sanchez ve ark.27'de hesaplanan çeşitlilik indeksi gibi geleneksel kirlilik göstergeleri, çekirdek bölgelerdeki veya koruma alanlarındaki ağır metal kirliliğinin etkisini tanıyamadı. Bununla birlikte, çekirdek bölgelerde yer alan BC veya SM gibi alanlarda değişiklikler gözlenmiştir. Her ne kadar doğal korunan alanlar koruma için etkili olsa da, C. texanus ile ilgili bulgular, hasarın erken uyarı sinyallerinin zaten fark edilmeden gerçekleştiğini göstermektedir. Konvansiyonel olmayan ve yerli faunanın dahil edilmesi, özellikle nehir ekosistemlerinin ılıman bölgelerdekilerden önemli ölçüde farklı olduğu tropikal bölgelerde, kendi ülkelerindeki araştırma protokolleri ve ileriye dönük düzenlemeler için savunulmalıdır28. C. texanus gibi geleneksel olmayan bir biyomonitörün kullanılması, araştırma bulgularının doğruluğunu ve uygunluğunu artırmaya ve bu önemli türler ve yaşam alanları için koruma çabalarını geliştirmeye yardımcı olabilir.

Corydalus sp. kullanımı, Filobobos Nehri'nde (Meksika Körfezi havzasına doğru bir yer) gözlemlendiği gibi, insan faaliyetlerinden kaynaklanan çeşitli etkilere (yani, arazi kullanımı değişikliği ve zirai kimyasalların kullanımı gibi tarımsal etkiler) karşı yüksek hassasiyet göstermiştir.7. Söz konusu çalışma, Filobobos Nehri'ndeki anormal derecede sertleşmiş sular altında LPO seviyelerindeki artan artış nedeniyle Corydalus sp. üzerinde strese neden olmada kalsiyumun önemli rolünü vurgulamaktadır. Bu bulgular, mevcut bulgularla birlikte, Corydalus cinsinin intertropikal enlemlerdeki su ekosistemlerini değerlendirmedeki kullanışlılığını kanıtladı. Bununla birlikte, belirli bir su ekosistemini değerlendirmeden önce, çalışma alanı hakkında önceden bilgi sahibi olmak gerekir. Kapsamlı bir analiz yaparak, en kapsamlı ve eksiksiz verileri toplamak için en uygun araştırma yerleri belirlenmelidir.

Laboratuvar çalışmasının etkinliği büyük ölçüde uygun toplama tekniklerinin kullanılmasına bağlıdır. Daha büyük örneklerin toplanması, analiz için mevcut olan yumuşak doku ve dış iskelet miktarının artması nedeniyle diseksiyon yapılırken faydalı olabilir. Bununla birlikte, mevsimsel değişikliklerin yağ dokusu birikimini etkileyebileceğini ve temporal çalışmalar sırasında yumuşak dokuları ve dış iskeletleri ayırmayı zorlaştırabileceğini unutmamak önemlidir. Bu gibi durumlarda, her bireyin solungaçlarına ve mevcut kaslarına odaklanmak tavsiye edilebilir. Önemli sayıda birey elde etmek kritik bir zorluğu temsil edebilir. Daha önce belirtilen varyasyonlar nedeniyle, ağır metal içeriğini ve biyobelirteçlerin tepkisini değerlendirmek için yeterli doku elde etmek daha zor olabilir. Bu çalışma, SGBR'den alınan örneklerde katalazı değerlendirmek mümkün olmadığı için bu durumun bir örneğini göstermiştir. Mevcut protokolden önce, katalazın değerlendirilmesi yüksek miktarda doku gerektiriyordu; Bununla birlikte, katalaz tayini için mevcut öneri, değerlendirmeleri için minimum bir doku miktarı sunmaktadır.

Mevcut protokol önerisi, sucul ekosistemlerde yaygın hellgrammitleri kullanarak ekolojik bütünlüğün uygulanabilir bir yaklaşımını almak için uygun bir şans sunmaktadır. Dakik kirliliği veya insan etkilerinin dolaylı zararlı etkilerini belirlemek için çok önemli bilgiler sağlayarak paydaşlara, ekolojistlere ve su bilimcilerine uygun bilgiler sağlar. Mevcut protokolün maliyeti önemli ölçüde azalmış olsa da, birkaç reaktifin gerekliliği ve özel ekipman kullanımı nedeniyle hala nispeten pahalı olmaya devam etmektedir. Ayrıca, özel ekipman gereksinimi, tam testin gerçekleştirilebileceği yerlerin sayısını sınırlar.

Açıklamalar

Yazarlar, çalışmalarında herhangi bir çıkar çatışması bulunmadığını açıkladılar.

Teşekkürler

Yazarlar, araştırma çabalarını büyük ölçüde kolaylaştıran FONINS P 1931 hibesini sağladığı için CONAHCyT'ye içten teşekkürlerini sunarlar. Ayrıca, SIP proje hibesi (20200577) aracılığıyla sağlanan paha biçilmez destek için Instituto Politécnico Nacional'daki Secretaría de Investigación y Posgrado'ya teşekkür edeceklerdir. Buna ek olarak, ilk yazar, ekibin saha gezileri düzenlemesine ve önemli verileri toplamasına olanak tanıyan CONAHCyT tarafından verilen cömert lisansüstü bursunu kabul etmek istiyor. Son olarak, yazarlar, María Teresa García Camacho'nun laboratuvardaki paha biçilmez yardımı için takdirlerini ifade etmek isterler, bu proje olmadan bu proje mümkün olmazdı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
220 g analitik teraziOhausPR224/EBu terazi, numunelerden çıkarılan dokuyu tartmak için kullanışlıdır.
Göğüs kuşlarıLaCrosse700152MNumune toplama için kuş kuşları kullanmanızı öneririz. Alternatif olarak, örnekleme için lastik kalça botları ile botları da kullanabilirsiniz.
Kesme tahtasıTrueTRUE915121Beyaz ve plastik tahtaların kullanılması tavsiye edilir.
ForsepsDR Aletleri112Paslanmaz çelikten yapılmış 12 pul forseps kullanılması tavsiye edilir.
Endüktif Eşleşmiş Plazma-Optik Emisyon Spektroskopi SistemiPerkin Elmer7300 DVSpektroskopi kullanarak ağır metallerin miktarını belirlemek için bir cihaz.
Tekme ağıLaMotte0021-PBir tekme ağı yapmak için alternatif bir yöntem, 500 mikrometre kalınlığında bir ağ kullanarak manuel olarak bir ağ oluşturmayı içerir.
Sıvı Azot NANANA
Sıvı Nitrojen Dewar Statik Kriyojenik KonteynerBestEquipDF0504Teneke kutulu bir alüminyum tank kullanılması tavsiye edilir.
Harç ve Havaneli SetCole-ParmerEW-63100-54Bu, kuru dokuların öğütülmesi için kullanılan porselen bir havan ve havan tokmağıdır.
Multiwave GO PlusAnton PaarC93IP001EN-EMultiwave, birden fazla numuneyi sindirmek için kullanışlı bir araçtır.
Kurutma fırınıFisher scientific506GKuru mendil fırını olarak da bilinen bir inkübatör fırını, dokuları en az 80 ° C sıcaklıklarda kurutmak için gereklidir.
Hassas neşterXcelite by Weller037103-48768Alüminyumdan yapılmış bir neşter kullanılması tavsiye edilir.
Doku Homojenizatörü (tearer)KoproK110000Tabanı olan doku yırtıcı kullanılması tavsiye edilir. Bazı şirketler, en uygun seçim olabilecek ultrasonik yırtıcılar sunar.
Ultra Düşük Sıcaklıklı Derin DondurucuREVCOCA89200-384Birçok şirket dondurucu sağlar, ancak depolama sıcaklığı en az -40°C olan birini seçmeniz önerilir.
Geniş ağızlı plastik şişelerUnited Scientific81900Geniş kapaklı ve ağızlı polipropilen şişelerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

Kaynaklar

  1. Rivera-Gasperín, S. L., Ardila-Camacho, A., Contreras-Ramos, A. Bionomics and ecological services of Megaloptera larvae (Dobsonflies, Fishflies, Alderflies). Insects. 10 (4), 86(2019).
  2. Cover, M. R., Seo, J. H., Resh, V. H. Life history, burrowing behavior, and distribution of Neohermes filicornis (Megaloptera: Corydalidae), a long-lived aquatic insect in intermittent streams. Western North Ame. Nat. 75 (4), 474(2016).
  3. Martins, C. C., Ardila-Camacho, A., Rivera-Gasperín, S. L., Oswald, J. D., Liu, X., Contreras-Ramos, A. A world checklist of extant and extinct species of Megaloptera (Insecta: Neuropterida). Euro J of Tax. 812 (1), 1-93 (2022).
  4. Knight, A. W., Siegfried, C. A. The distribution of Corydalus Cornutus (Linnaeus) and Nigronia Serricornis (Say) (Megaloptera: Corydalidae) in Michigan. The Great Lakes Entomol. 10 (2), 1(2017).
  5. Florida, S., Lindsay, H., Patel, M., Lindsay, P. Water quality of Quebrada Cuecha: effects of the effluent from the Monteverde cheese factory. , Available from: https://digitalcommons.usf.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1662&context=tropical_ecology (2018).
  6. Cao, C. -Q., Liu, Z., Chen, S. -Z., Tong, C. The swimming behavior of the aquatic larva of Neoneuromus ignobilis (Megaloptera: Corydalidae: Corydalinae). Acta Entomol Sin. 55 (1), 133-138 (2012).
  7. Rico-Sánchez, A. E., Rodríguez-Romero, A. J., Sedeño-Díaz, J. E., López-López, E. Assessment of seasonal and spatial variations of biochemical markers in Corydalus sp. (Megaloptera: Corydalidae), a non-conventional biomonitor, in a mountain cloud forest in Mexico. Environ Sci Pollut Res Int. 27 (24), 30755-30766 (2020).
  8. Galindo-Pérez, E. J., et al. Cave macroinvertebrates as bioindicators of water quality. Water Sci Technol. 8 (5), 5-17 (2017).
  9. Dolin, P. S. The life history and ecology of Chauliodes Rastricornis Rambur and C. Pectinicornis. (Linnaeus)(Megaloptera: Corydalidae) in Greenbottom swamp, Cabell County, West Virginia. Marshall University. , Doctoral dissertation (1980).
  10. Cover, M. R., Resh, V. H. Global diversity of dobsonflies, fishflies, and alderflies (Megaloptera; Insecta) and spongillaflies, nevrorthids, and osmylids (Neuroptera; Insecta) in freshwater. Hydrobiologia. 595 (1), 409-417 (2008).
  11. Barba-Álvarez, R., De la Lanza-Espino, G., Contreras-Ramos, A., González-Mora, I. Aquatic insects indicators of water quality in Mexico: case studies, Copalita, Zimatán and Coyula rivers, Oaxaca. Mexican Biodiversity Magazine. 84 (1), 381-383 (2013).
  12. Beyer, J., et al. Environmental risk assessment of combined effects in aquatic ecotoxicology: A discussion paper. Mar Env Res. 96, 81-91 (2014).
  13. Tišler, T., Zagorc-Končan, J. Comparative assessment of toxicity of phenol, formaldehyde, and industrial wastewater to aquatic organisms. Water Air Soil Pollut. 97, 315-322 (1997).
  14. Larramendy, M. Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-traditional Aquatic Models. Royal Society of Chemistry. , Cambridge. (2017).
  15. Contreras-Ramos, A., Rosas, M. V. Biodiversity of Megaloptera and Raphidioptera in Mexico. Biodiversity Supplement of Mexico. 85, 257-263 (2014).
  16. Villamarín, C., Rieradevall, M., Paul, M. J., Barbour, M. T., Prat, N. A tool to assess the ecological condition of tropical high Andean streams in Ecuador and Peru: The IMEERA index. Ecol Indic. 29, 79-92 (2013).
  17. Uchiyama, M., Mihara, M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem. 86 (1), 271-278 (1978).
  18. Marklund, S., Marklund, G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 47 (3), 469-474 (1974).
  19. Aebi, H. Catalase. Methods Enzymol. 105, 121-126 (1984).
  20. Li, Y., Schellhorn, H. E. Rapid kinetic microassay for catalase activity. J Biomol Tech. 18 (4), 185-187 (2007).
  21. Kumar, P., Maurya, P. K. L-Cysteine efflux in erythrocytes as a function of human age: Correlation with reduced glutathione and total anti-oxidant potential. Rejuvenation Res. 16 (3), 179-184 (2013).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  23. Barbour, M. T., Stribling, J. B., Verdonschot, P. F. M. The multihabitat approach of USEPA's rapid bioassessment protocols: benthic macroinvertebrates. Limnetica. 25 (3), 839-850 (2006).
  24. Allan, J. D. Stream Ecology: Structure and Function of Running Waters. , Springer. Dordrecht. (2007).
  25. Barbour, M. T., Gerritsen, J., Snyder, B. D., Stribling, J. B. Rapid Bioassessment Protocols for Use in Streams and Wadeable Rivers: Periphyton, Benthic Macroinvertebrates and Fish. United States Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (1999).
  26. Wright, J. F., Armitage, P. D., Furse, M. T., Moss, D. The classification of sites on British rivers using macroinvertebrates. SIL Proceed, 1922-2010. 22 (3), 1939-1943 (1984).
  27. Rico-Sánchez, A. E., Rodríguez-Romero, A. J., Sedeño-Díaz, J. E., López-López, E., Sundermann, A. Aquatic macroinvertebrate assemblages in rivers influenced by mining activities. Sci Rep. 12 (1), 3209(2022).
  28. Ramírez, A., Pringle, C. M., Wantzen, K. M. Tropical Stream Conservation. Tropical Stream Ecology. , Academic Press, Elsevier. (2008).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hellgrammite Biyomonit rY zey Suyu De erlendirmesiCorydalus texanusSucul EkosistemlerKirlilik Duyarl lA r Metal Biyoak m lasyonuMaden Kirlili iKonvansiyonel Olmayan Biyoindikat rEkosistem Sa l G stergesi
Video yakında

İlgili makaleler