Yöntem makalesi

Mezenkimal Kök Hücreler ve Retinal Pigment Epiteli Arasında İn Vitro Tünelleme Nanotüpleri Yoluyla Mitokondriyal Transfer

1.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66917

⸱

4 Ekim 2024

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

Bu makalede

Özet

Burada, mitokondriyal izleme, mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) ve retinal pigment epitel hücrelerinin (ARPE19) doğrudan ko-kültür prosedürlerinin yanı sıra, MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasındaki TNT'ler yoluyla mitokondriyal alışverişi karakterize etmek için tünelleme nanotüpleri (TNT) oluşumunu ve mitokondriyal transferi gözlemleme ve istatistiksel olarak analiz etme yöntemlerini içeren bir protokol sunuyoruz.

Özet

Mitokondriyal transfer, çeşitli hücre türleri arasında yaygın olarak meydana gelen normal bir fizyolojik olgudur. Bugüne kadar yapılan çalışmada, mitokondriyal taşıma için en önemli yol, tünelleme nanotüplerinden (TNT'ler) geçmektedir. Mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) mitokondriyi TNT'ler aracılığıyla diğer hücrelere aktarabildiğini bildiren birçok çalışma yapılmıştır. Bununla birlikte, az sayıda çalışma çift yönlü mitokondriyal transfer olgusunu göstermiştir. Burada, protokolümüz, MSC'ler ve retinal pigment epitel hücreleri arasındaki mitokondriyal transfer fenomenini in vitro olarak iki mitokondriyal izleme yöntemiyle incelemek için deneysel bir yaklaşımı açıklamaktadır.

Mito-GFP ile transfekte edilmiş MSC'leri mito-RFP ile transfekte edilmiş ARPE19 hücreleri (bir retinal pigment epitel hücre hattı) ile 24 saat boyunca birlikte kültürledik. Daha sonra tüm hücreler falloidin ile boyandı ve konfokal mikroskopi ile görüntülendi. ARPE19 hücrelerinde yeşil floresanslı mitokondri ve MSC'lerde kırmızı floresanslı mitokondri gözlemledik, bu da MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasında çift yönlü mitokondriyal transferin gerçekleştiğini gösteriyor. Bu fenomen, mitokondriyal taşınmanın, MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasında da meydana gelen normal bir fizyolojik fenomen olduğunu ve MSC'lerden ARPE19 hücrelerine mitokondriyal transferin, tersinden çok daha sık meydana geldiğini göstermektedir. Sonuçlarımız, MSC'lerin mitokondriyi retina pigment epiteline aktarabildiğini ve benzer şekilde MSC'lerin gelecekte retina pigment epitelinde mitokondriyal taşıma yoluyla terapötik potansiyellerini yerine getirebileceğini tahmin ettiğini göstermektedir. Ek olarak, ARPE19 hücrelerinden MSC'lere mitokondriyal transfer daha fazla araştırılmayı beklemektedir.

Giriş

Mitokondri, çoğu hücre tipi için birincil enerji kaynağı olarak hizmet eder ve mitokondriyal disfonksiyon özellikle retina1 gibi yüksek enerji gerektiren dokuları etkiler. Retinadaki metabolik değişiklikler biyoenerjetik bir krizi tetikleyebilir ve sonuçta fotoreseptörlerin ve / veya RPE hücrelerininölümüyle sonuçlanabilir 2. Mezenkimal kök hücre (MSC) bazlı tedaviler, oküler dejenerasyonun tedavisinde etkinlik göstermiştir ve MSC'lerin retina dokuları üzerindeki yararlı etkilerinin altında yatan kesin mekanizmalardan biri, fonksiyonel mitokondriyal transfere bağlanabilir 3,4,5,6. 2004 yılında, Rustom ve ark. ilk olarak, tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) tarafından kolaylaştırılan yeni bir hücreden hücreye etkileşim yoluyla mitokondriyal transfer fenomenini bildirdi7.

2D kültürde, tünelleme nanotüpleri (TNT'ler), substrat üzerinde asılı kalan ve iki veya daha fazla homotipik ve heterotipik hücre arasında doğrudan bağlantı kurabilen, onlarca ila yüzlerce nanometre uzunluğunda değişen ince (20-700 nm) membran çıkıntıları ile tanımlanır. Bu yapılar özellikle F-aktin açısından zenginleştirilmiştir ve mitokondri gibi kargoların hücreler arasında taşınmasını kolaylaştırır. Ek olarak, TNT'lerin her iki ucunda açıklıklar bulunur ve bu da birbirine bağlı hücreler arasındaki sitoplazmik içeriğin sürekliliğini sağlar8.

TNT aracılı mitokondriyal transferi tespit etmek zordur in vivo yoğun hücresel düzenleme ve mitokondrinin izlenmesindeki zorluklar nedeniyle. Hücre ko-kültürü ve mitokondriyal izleme tekniklerini kullanan in vitro deneyler, TNT oluşumunun ve mitokondriyal transferingözlemlenmesine olanak tanır 8,9. Ayrıca, MSC'leri ve retinal pigment epitel hücrelerini in vitro10'da birlikte kültürleyerek TNT aracılı mitokondriyal transfer fenomenini de gözlemledik.

Önceki birçok çalışma, MSC'lerden diğer hücreleresadece tek yönlü mitokondriyal transfer gözlemlemiştir 3,4,5,6. Daha önce, sırasıyla mito-tracker yeşil ve mito-tracker kırmızı ile etiketlenmiş iki tür hücre kullanarak çift yönlü mitokondriyal transferi analiz etmeye çalıştık, ancak boyaların karışması deneysel sonuçlara müdahale etti. Mitokondriyal çift yönlü transferi daha kesin bir şekilde incelemek için, burada, lentiviral transfeksiyon tekniğini kullanarak farklı mitokondriyal floresansa sahip iki hücre hattı oluşturduk ve daha sonra, in vitro olarak doğrudan ko-kültür ile TNT oluşumu ve mitokondriyal çift yönlü transfer fenomenlerini gözlemledik ve analiz ettik.

Kısacası, burada mitokondrinin nasıl izleneceği, MSC'lerin ARPE19 hücreleri ile nasıl birlikte kültürleneceği ve TNT oluşumu ve mitokondriyal transferin nasıl analiz edileceği ile ilgili adım adım ve eyleme geçirilebilir bir protokol açıklanmaktadır. Bu deneyin sonuçları, TNT aracılı çift yönlü mitokondriyal transferi gösterdi, bu sadece mitokondriyal taşınmanın yaygın bir fizyolojik fenomen olduğunu kanıtlamakla kalmadı, aynı zamanda MSC'lerin retina hücreleri üzerindeki potansiyel terapötik yeteneğini de gösterdi.

Protokol

1. MSC-mito-GFP ve ARPE19-mito-RFP hücre hatlarının oluşturulması

  1. Hücre kültürü
    NOT: Burada örnek olarak yalnızca MSC'ler kullanılmıştır.
    1. Hücre yoğunluğu% 80 -% 90'a ulaşana kadar% 1 penisilin ve streptomisin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile hMSC ortamında 6 oyuklu bir plakada insan MSC'lerini kültürleyin. Hücre büyümesinin yoğunluğuna bağlı olarak, ortamı her 2-3 günde bir değiştirin.
      1. Orijinal ortamı çıkarın ve hücreleri bir kez fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile yıkayın (bkz. Malzeme Tablosu). 1 mL tripsin-EDTA-DPBS karışımı ekleyin (% 0.05 Tripsin-EDTA:% 0.25 Tripsin-EDTA 1: 5 oranında DPBS ile seyreltilmiş; Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 3-4 dakika (hücrelere bağlı olarak) inkübe edin.
        NOT: Mikroskop altında hücre sindirimini gözlemleyin ve hücrelerin çoğu yuvarlatılmış ve ayrılmışsa sindirimi durdurun.
      2. Yüzeye yapışan hücreleri ayırmak için 6 oyuklu plakaya hafifçe vurun ve ardından sindirimi sonlandırmak için 1 mL taze tam ortam ekleyin.
      3. Tüm hücreleri bir pipet tabancasıyla nazikçe yeniden süspanse edin ve ardından toplanan tüm hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
      4. Hücreleri 200 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
      5. Süpernatanı aspire edin ve 1 mL taze ortam ekleyerek hücreleri yeniden süspanse edin. Hücre sayımı için 10 μL hücre süspansiyonu alın.
      6. Lentiviral transfeksiyondan on sekiz ila 24 saat önce, MSC hücrelerini 6 oyuklu plakalarda oyuk başına 1 × 105 hücre yoğunluğunda tohumlayın ve transfeksiyon sırasındaki hücre yoğunluğunun yaklaşık% 50 olmasını sağlayın.
  2. Lentivirüsün transfeksiyonu
    NOT: Lentiviral transfeksiyon ile ilgili tüm işlemlerin bir biyogüvenlik kabininde yapılması gerekir.
    1. İlk ortamı ertesi gün 2 mL taze ortamla değiştirin ve adjuvanlarla 25 μL lentivirüs süspansiyonu (5.00E + 08 TU / mL) ekleyin, ardından 37 ° C'de inkübasyon yapın.
      NOT: Lentivirus paketlemesi, bir şirket tarafından Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) plazmidi (bkz. Malzeme Tablosu ve Ek Şekil S1) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
    2. 6 saatlik inkübasyondan sonra, virüs içeren ortamı 2 mL taze ortamla değiştirin. Günde bir kez inkübe etmeye ve ortamı değiştirmeye devam edin.
      NOT: Transfeksiyondan 48 saat sonra MSC'lerde önemli mitokondriyal floresan ekspresyonu gözlenir ve 72 saatlik zaman noktasında daha fazla gelişme belirgindir.
    3. Transfeksiyondan 2 gün sonra kültür ortamını puromisin (1 μg/mL) ile takviye ederek başarılı bir şekilde transfekte edilmiş hücreleri tarayın. Aynı zamanda, kontrol olarak viral transfeksiyonu olmayan mezenkimal kök hücrelere eşdeğer bir puromisin konsantrasyonu ekleyin.
      NOT: Mito-GFP viral vektörü, puromisin direnç genini içerecek şekilde tasarlanmıştır.
    4. Puromisin (1 μg / mL) ilavesiyle ortamı günlük olarak değiştirin. Kontrol grubunda neredeyse tam hücre ölümü üzerine puromisin ilavesini durdurun.
      NOT: Ortam bu puromisin konsantrasyonunu içermez. Puromisin ilavesi, yalnızca ortam 6 oyuklu bir plakaya eklendiğinde gereklidir.
    5. Hücreler geçene ve donana kadar puromisin olmadan kültüre devam edin. Bu hücre türünü MSC-mito-GFP olarak adlandırın.
      NOT: ARPE19 hücreleri, ATCC Hücre Bankasından türetilmiş ve %10 FBS ve %1 penisilin ve streptomisin içeren DMEM/F12'de kültürlenmiştir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunların sindirim ve geçiş yöntemleri MSC'lerinkiyle aynıdır. Plazmid Mito-RFP, bir şirket tarafından Mito-GFP'den modifiye edildi. Son olarak, başarılı bir şekilde transfekte edilen hücreleri ARPE19-mito-RFP olarak adlandırdık.

2. MSC ve ARPE19 hücrelerinin doğrudan ko-kültürü

NOT: Bu ko-kültür sisteminde, MSC-mito-GFP hücreleri donör hücreler olarak görev yaparken, ARPE19-mito-RFP hücreleri alıcı hücreler olarak işlev görecektir. Donör ve alıcı hücreleri ayırt etmek için alıcı hücreleri izledik.

  1. Sitoplazmik membranda ARPE19-mito-RFP hücrelerini CellTrace Violet ile etiketleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: CellTrace violet boyasının uyarılması ve emisyonu sırasıyla 405 nm ve 450 nm'dir.
    1. Bir CellTrace Violet Reagent şişesine 20 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek ve kullanımdan hemen önce iyice karıştırarak bir CellTrace Violet ( Malzeme Tablosuna bakın) stok çözeltisi hazırlayın.
    2. ARPE19-mito-RFP hücrelerini istenen %80-90 yoğunluğa kadar büyütün.
    3. CellTrace Violet stok çözeltisini önceden ısıtılmış (37 °C) DPBS'de istenen çalışma konsantrasyonuna (1:1.000) seyreltin. Bu yükleme çözümüdür.
      NOT: CellTrace Violet'in seyreltilmesi DPBS ile yapılmalıdır ve çok kötü boyama sonuçlarına yol açacağından kültür ortamı ile değiştirilemez.
    4. Kültür ortamını çıkarın ve 1 mL yükleme çözeltisi ile değiştirin. Hücreleri 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
      NOT: Koşullar izin verirse, lekelenme 5 dakika sonra floresan mikroskobu altında gözlemlenebilir. İstenen sonuçlar elde edilir edilmez boyama sonlandırılabilir, çünkü bazı hücreler DPBS'ye uzun süre maruz kalmayı tolere edemeyebilir.
    5. Yükleme solüsyonunu çıkarın, hücreleri 2 kez DPBS ile yıkayın ve 2 mL taze tam ortam ile değiştirin. CellTrace Violet'in asetat hidrolizine uğramasına izin vermek için boyamadan sonra hücreleri en az 10 dakika inkübe edin.
      NOT: Bu adım, hücrelerin optimal durumlarına dönmeleri ve sonraki deneylere müdahale etmekten kaçınmaları için gereklidir.
  2. Her oyuğa 50 μL DPBS ekleyerek 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. Ardından, kapak camını (belirtilen çapı 15 mm) ( Malzeme Tablosuna bakın) plakaya yerleştirin ve 1 dakika dinlenmesine izin verin. Kapak sürgüsünün tabağın dibine yakın olduğundan emin olmak için negatif basınç kullanarak DPBS'yi kuyulardan çıkarın.
  3. Donör MSC'leri ve alıcı ARPE19 hücrelerini adım 1.1.1'de açıklandığı gibi tripnize edin.
  4. Hücre sayımı
    1. Sayım için bir sayma plakasına 10 μL hücre süspansiyonu yerleştirin.
      NOT: Hücrelerin yoğunluğu çok yüksekse, orta ile 10 kat seyreltilebilir ve daha sonra yukarıdaki gibi devam edilebilir.
    2. 10.000 MSC ve 10.000 ARPE19 hücresini, 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 500 μL ortamda tohumlayın. Hücreleri 24 oyuklu plakaya eklemeden önce iyice karıştırın. A/mL'lik bir MSC sayısı ve B/mL'lik bir ARPE19 hücre sayısı verilen aşağıda gösterilen hesaplamalara bakın.
      NOT: 4 kuyu için, 2 mL ortamda 40.000 MSC ve 40.000 ARPE19 hücresi gereklidir.
      40.000 MSC içeren MSC süspansiyonunun hacmi (C) = 40.000/A μL
      40.000 MSC içeren ARPE19 süspansiyonunun (D) hacmi = 40.000/B μL
      Hacmi 2 - (C + D) mL ortam ile 2 mL'ye yükseltin.
  5. Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin, hücreler eşit olarak dağılana kadar plakayı sallayın ve ardından 24 saat boyunca kültürde inkübe edin.

3. Bir transwell sisteminde MSC ve ARPE19 hücrelerinin dolaylı ko-kültürü

  1. Hücre kültürü, etiketleme, sindirim ve sayım işlemlerini 2.1 ila 2.4.1 arasındaki adımlarda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
  2. 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1 mL ortamda 20.000 ARPE19 hücresi tohumlayın.
    NOT: Bu deneyde, etiketli mitokondri içermeyen ARPE19 hücreleri kullandık.
  3. Eki hücrenin ekildiği kuyuya yerleştirin.
  4. Oyuk başına üst hücre odasında 100 μL ortamda 10.000 MSC tohumlayın.
  5. Adım 2.5'i tekrarlayın.

4. Hücre iskeleti boyama

NOT: Deney boyunca ışıktan koruyunuz.

  1. Ortamı 24 oyuklu plakalardan çıkarın. Tüm hücreleri 500 μL/kuyucuk %4 poliformaldehit (PFA) ile bir kez yıkayın, 500 μL taze %4 PFA ekleyin ve numuneleri 20 dakika sabitleyin.
    NOT: Transwell sisteminin iç kısımları atılır.
    NOT: Nanotüpler çok kırılgan olduğundan, sağlam nanotüplerin tutulmasını en üst düzeye çıkarmak için hücreleri DPBS yerine doğrudan% 4 PFA ile yıkadık.
  2. Sabitleyiciyi çıkarın ve numuneleri DPBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
  3. % 0.5 Triton X-100 (Malzeme Tablosuna bakınız) ve% 4 sığır serum albümininden (BSA) (Malzeme Tablosuna bakınız) oluşan 500 μL / kuyu bloke edici çözelti ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  4. Bloke edici solüsyonu çıkarın ve numuneleri DPBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
  5. Phalloidin boyama solüsyonunun hazırlanması (Malzeme Tablosuna bakınız)
    NOT: Phalloidinin uyarılması ve emisyonu sırasıyla 650 nm ve 668 nm'dir.
    1. 400x stok çözeltisi elde etmek için flakon içeriğini 150 μL susuz DMSO'da çözerek stok çözeltileri hazırlayın.
    2. 400x depolama solüsyonunu DPBS ile 1x'e seyrelterek boyama solüsyonu hazırlayın. Bu phalloidin boyama çözeltisidir.
  6. Her oyuğa 200 μL phalloidin boyama solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  7. Boyama solüsyonunu geri kazanın ve numuneyi DPBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
    NOT: Hücreleri DPBS ile yıkarken, plakayı bir çalkalayıcı üzerinde bırakmak daha iyi olacaktır.
  8. Kapak camını bir şırınga iğnesi ile çıkarın ve kurumaya bırakın.
    NOT: En uygun durum, kapak camında görünür bir sıvının görülmediği ancak aynı zamanda kuru olmadığı durumdur.
  9. Sürgünün üzerine az miktarda montaj ortamı uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ortamın tüm yüzeyi eşit şekilde kapladığından emin olmak için sürgü üzerindeki kapak camını dikkatlice çevirin. Kenarları oje ile kapatın.
    NOT: Ojenin kuruması için birkaç dakika bekleyin.
  10. Hemen eş odaklı bir görüntü yakalayın veya bir dilim kutusuna aktarın ve kısa bir süre için 4 °C'de saklayın.
    NOT: İdeal saklama süresi 2 haftadır. Bu süre aşılırsa görüntüleme etkisi bozulabilir.

5. Konfokal görüntüleme

NOT: Konfokal görüntüleme kullanım kılavuzuna göre yapılır ve mikroskoplar arasında farklılık gösterebilir. Burada sadece bazı önemli adımları veriyoruz.

  1. Konfokal mikroskobu başlatın ve kullanım kılavuzuna göre dört lazer kanalı (405, 488, 561, 640) açın.
  2. Bilgisayardaki yazılıma erişin ve yazılımın ön parametrelendirmelerini gerçekleştirin.
    1. Proses Yönetimi paneline CF-405, CF-488, CF-561 ve CF-640 floresan kanallarını ekleyin.
    2. Her floresan kanalının pozlama süresini 200 ms'ye ayarlayın ve Kamera Kontrol panelinde kazanç yoğunluğunu 2'ye ayarlayın.
    3. Lazer/LED birleştiriciyi 80 değerine ayarlayın.
  3. Objektif merceği 20x büyütmeye ayarlamak için mikroskobun harici kontrol panelini manipüle edin ve merceğin en düşük ayarda konumlandırıldığından emin olun.
  4. Slaytı, taşıyıcı tabla üzerinde ters yönde konumlandırın.
  5. 405 nm lazeri etkinleştirin ve kaba ve ince odaklama spirallerini kullanarak odağı değiştirin. Mavi floresan hücreler görünene kadar numuneyi göz merceğinin altında gözlemleyin.
  6. Bilgisayardaki yazılım arayüzünde Canlı Görüntüleme'yi seçin, CF-405 kanalına geçin ve bilgisayar ekranında mavi floresan sergileyen hücrelerin belirgin bir görüntüsü görünene kadar ince odak sarmalını yeniden ayarlayın.
  7. Objektif lensi 40x büyütmeye ayarlayın ve CF-640 kanalına geçiş yapın, ardından belirgin bir hücresel mikrofilament yapısı görünene kadar odağı dikkatlice ayarlayın.
  8. Sabit bir odak uzaklığını koruyarak, CF-405, CF-488 ve CF-561 kanallarına sırayla geçiş yapın ve her kanalda görüntüleme için optimum pozlama süresi, kazanç yoğunluğu ve lazer/LED birleştirici parametrelerini gerektiği gibi değiştirin.
  9. Z Görüntü Yığını işlevini etkinleştirin ve Z eksenini kullanarak derinliğe sahip bir görüntü yakalamak için odak uzaklığını manipüle ederek Z ekseninin başlangıç ve bitiş noktalarını tanımlayın.
  10. Fotoğraf çekmek için Süreç Yönetimi panelindeki Başlat düğmesine tıklayın.
  11. Her dilim için rastgele 10 görünüm alanı seçin.
    NOT: İki görüş alanı arasında çakışma olmamalıdır.
  12. İstenen görüş alanının tanımlanmasının ardından toplam 24 saatlik bir görüntüleme süresi ve 5 dakikalık bir fotoğraf aralığı belirleyerek hızlandırılmış çekim işlevini etkinleştirin.
    NOT: Hızlandırılmış bir diziyi yakalamak için, hücreleri cam tabanlı bir tabakta aşılamak ve bunları %5 CO2 gazı içeren havalandırmalı bir kutu içine yerleştirmek gerekir.
  13. Tüm görüntüleri kaydedin ve dışa aktarın.
    NOT: TNT ve mitokondriyal transferin incelemesini geliştirmek için süper çözünürlüklü görüntüleme kullanıldı. Süper çözünürlüklü görüntüleme, bir şirket tarafından sağlanan HIS-SIM (Yüksek Akıllı ve Hassas SIM) olarak adlandırılan ticarileştirilmiş HIS-SIM kullanılarak gerçekleştirildi. Görüntüler, 100x/1.5 NA yağa daldırma objektifi kullanılarak elde edildi.

6. Veri analizi

  1. Her görüntünün istatistiksel analizi için, toplam hücre sayısını, nanotüp sayısını, Menekşe pozitif ARPE19-mito-RFE hücrelerinin sayısını, yeşil floresan sergileyen Menekşe pozitif hücrelerin sayısını (MSC'lerden mitokondriyal transferli ARPE19 hücrelerinin sayısını temsil eder) ve kırmızı floresan sergileyen Menekşe negatif hücrelerin sayısını (ARPE19 hücrelerinden mitokondriyal transferli MSC hücrelerinin sayısını temsil eder) ölçün.
    1. TNT oluşumunu ölçmek için, hücreler arası nanotüplerin sayısının toplam hücre sayısına oranını hesaplayın.
    2. Mitokondriyal transfer hızını, yeşil floresan sergileyen Menekşe pozitif hücrelerin sayısının toplam Mor pozitif hücre sayısına (MSC'lerden ARPE19 hücrelerine mitokondriyal transferi temsil eder) oranı veya kırmızı floresan sergileyen Menekşe negatif hücrelerin sayısının toplam Mor negatif hücre sayısına oranı (ARPE19 hücrelerinden MSC'lere mitokondriyal transferi temsil eder) olarak hesaplayın.

Sonuçlar

Mezenkimal kök hücrelerin (MSC) ve ARPE19 hücrelerinin doğrudan ko-kültürünü gösteren şematik diyagram Şekil 1'de gösterilmiştir. Donör hücreler olarak mito-GFP'yi eksprese etmek üzere tasarlanmış MSC'ler ve alıcı hücreler olarak menekşe işaretli sitoplazmik membranlara sahip ARPE19-mito-RFP hücreleri 1: 1 oranında birlikte kültürlendi. 24 saatlik bir ko-kültür periyodundan sonra, hücreler falloidin için boyandı ve konfokal mikroskopi kullanılarak incelendi. Elde edilen hücre popülasyonları arasında MSC-mito-GFP hücreleri, ARPE19-mito-RFP hücreleri, mito-GFP içeren ARPE19-mito-RFP hücreleri ve mito-RFP içeren MSC-mito-GFP hücreleri vardı. Özellikle, ARPE19 hücrelerinde mito-GFP'nin ve MSC'lerde mito-RFP'nin varlığı, mitokondriyal çift yönlü transferi önerdi.

TNT oluşumunun spesifik detayları Şekil 2'de sunulmuştur. Bu yapılar, aynı tipteki hücreler arasında (Şekil 2A-C) hücreler arası bağlantılar kurabildiği gibi, farklı tipteki hücreler arasında da (Şekil 2D) hücreler arası bağlantılar kurabilir. Tünel nanotüpleri (TNT'ler), bitişik hücreleri birbirine bağlayan kanallar görevi görür ve sitoplazmik sürekliliği ve mitokondrinin taşınmasını kolaylaştıran açık uçlara sahip belirgin bir F-aktin açısından zengin zar yapısı sergiler. Z ekseni görüntülemeyi kullanarak, TNT'lerin hücre dışı matrise sıkıca bağlı olmadığı, bunun yerine kültür ortamı içinde asılı kaldığı ve böylece onları geleneksel hücresel çıkıntılardan ayırdığı açıktır. Mitokondriyal transfer, mor pozitif ARPE19 hücrelerinin MSC'lerden kaynaklanan mitokondriyi gösteren dağınık, yeşil noktalı floresan sergilediği Şekil 3'te belirgindir (Şekil 3A). Kırmızı noktalı floresan içeren mor negatif MSC'ler, ARPE19 hücrelerinden mitokondriyal transferi temsil eder (Şekil 3B). Şekil 4, TNT yoluyla mitokondriyal transferin daha fazla ayrıntısını görebileceğimiz süper çözünürlüklü görüntüleme altında TNT oluşumunu ve mitokondriyal transferi göstermektedir. Video 1, TNT yoluyla mitokondriyal taşınmanın dinamiklerini göstermektedir.

Mitokondriyal transfer için ön koşulun, mitokondriyal sekresyon ve alımdan ziyade TNT gibi fiziksel temas olduğunu daha fazla göstermek için, daha önce bildirilen bir ko-kültür yöntemi10 kullandık. Şekil 5A'da gösterildiği gibi, MSC'ler ve ARPE19 hücreleri, sırasıyla bir transwell plakasının üst ve alt odalarına ekildi. MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasındaki doğrudan teması bloke eden ancak mitokondrinin geçişine izin veren 0.4 μm gözenekli bir filtre ile ayrıldılar. 24 saatlik ko-kültürden sonra, alt odadaki ARPE19 hücreleri test edildi ve üst odadaki MSC'lerden çok az mito-GFP gözlendi (Şekil 5B). Bu sonuçlar, mitokondriyal transferin MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasında doğrudan temas gerektirdiğini göstermektedir.

Sonuç olarak, TNT oluşumunun ve mitokondriyal transferin nicelleştirilmesi gerçekleştirildi ve karşılık gelen sonuçlar Şekil 6'da gösterildi. MSC'ler, ARPE19 hücrelerinden önemli ölçüde daha fazla mitokondri bağışlama yeteneğine sahipti (p = 0.0286). Bu bulgular, MSC'lerin mitokondriyi retinal pigment epitel hücrelerine aktarma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: MSC'lerin ve ARPE19 hücrelerinin ko-kültürünün şematik görünümü. CellTrace Violet ile etiketlenmiş mito-GFP ve ARPE19-mito-RFP hücrelerini eksprese eden MSC'ler, 1: 1 oranında 24 saat boyunca birlikte kültürlenir. Menekşe + hücrelerdeki Mito-GFP, mitokondrinin MSC'lerden ARPE19 hücrelerine transferini işaret ederken, mor hücrelerdeki Mito-RFP, mitokondrinin ARPE19 hücrelerinden MSC'lere transferini işaret eder. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan proteini; RFP = kırmızı floresan proteini; MSC'ler = mezenkimal kök hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasında TNT oluşumu. Beyaz ok uçları TNT oluşumunu, yeşil ok uçları mito-GFP'li mitokondriyi ve kırmızı ok uçları mito-RFP'li mitokondriyi gösterir. (A,B) ARPE19 hücreleri arasında TNT oluşumu. (C) MSC'ler arasında TNT oluşumu. (D) MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasında TNT oluşumu. Kültür ortamında asılı TNT'leri gösteren Z ekseni görüntüleme. Ölçek çubukları = 25 μm. Kısaltmalar: MSC'ler = mezenkimal kök hücreler; TNT'ler = tünel açan nanotüpler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: MSC'lerden ARPE19 hücrelerine mitokondriyal transfer. (A) Beyaz kesikli daire, MSC'lerden ARPE19 hücrelerine mitokondriyal (mito-GFP) transferini ve (B) sarı kesikli daire, ARPE19 hücrelerinden MSC'lere mitokondriyal (mito-RFP) transferini gösterir. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltma: GFP = yeşil floresan proteini; RFP = kırmızı floresan proteini; MSC'ler = mezenkimal kök hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Süper çözünürlüklü mikroskopi ile MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasında TNT oluşumu ve mitokondriyal transfer. (A ve B) MSC'lerden ARPE19 hücrelerine mitokondriyal taşıma. (C) Süper çözünürlüklü görüntüleme altında TNT'lerin ayrıntıları. (D) Süper çözünürlüklü görüntüleme altında ARPE19 hücrelerinde bulunan MSC'lerden yeşil mitokondri. Ölçek çubuğu = 5 μm. Kısaltmalar: MSC'ler = mezenkimal kök hücreler; TNT'ler = tünel açan nanotüpler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: MSC'lerin ve ARPE19 hücrelerinin transwell sisteminde dolaylı ko-kültürde neredeyse tespit edilemeyen mitokondriyal transfer. (A) Transwell sistemindeki MSC'lerin ve ARPE19 hücrelerinin ko-kültürünün şematik görünümü. (B) 24 saat boyunca MSC'lerle dolaylı ko-kültürden sonra transwell plakasının altındaki ARPE19 hücrelerinin temsili görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: TNT oluşumu ve mitokondriyal transferin miktarının belirlenmesi. (A) TNT oluşumu, (B) mitokondriyal transfer. Kısaltmalar: M = MSC'ler = mezenkimal kök hücreler; A = ARPE19 hücreleri; TNT'ler = tünel nanotüpleri; M-A = MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasında TNT oluşumu; M-M = MSC'ler arasında TNT oluşumu; A-A = ARPE19 hücreleri arasında TNT oluşumu. n = 4, ortalama ± SD, Mann-Whitney U-testi, *p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Plazmid pCT-Mito-copGFP'nin haritalanması. Mito-GFP (CYTO102-PA-1) satın alındı. Mitokondri Sito-İzleyici, pCT-Mito-GFP (CMV), bir Cox8 etiketi aracılığıyla copGFP ile birleşir ve mitokondrinin copGFP ile etiketlenmesine neden olur. Bu copGFP füzyonu, CMV promotörü tarafından yönlendirilir ve HeLa, HEK293 ve HT1080 gibi hücre hatlarında sağlam ekspresyon sağlar. Mito-RFP, GFP'yi RFP ile değiştirerek mito-GFP'den modifiye edildi; bir Puromisin direnç geni taşır. Bu plazmidin lentiviral ambalajı uzman şirketler tarafından yapılır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasında TNT aracılı mitokondriyal taşıma. TNT, MSC ve ARPE19 hücrelerinin çift yönlü hareketi yoluyla üretilir ve mitokondrinin MSC hücrelerinden ARPE19 hücrelerine transferini kolaylaştırır. Kısaltmalar: MSC'ler = mezenkimal kök hücreler; TNT'ler = tünel açan nanotüpler. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Çok sayıda çalışma, TNT aracılı mitokondriyal transfer olgusunun, çeşitli doku hücrelerinde yaygın bir fizyolojik süreç olduğunu göstermiştir 10,11,12,13. MSC'lerden mitokondriyal disfonksiyonu olan hücrelere fonksiyonel mitokondriyal bağış, güçlü terapötik potansiyel sergiler 3,14,15,16,17,18.

Burada, MSC'ler ve ARPE19 hücreleri arasında TNT aracılı çift yönlü mitokondriyal transferi sunmak için MSC-mito-GFP ve ARPE19-mito-RFP hücre hatlarını oluşturduk. Daha sonra, iki tür hücre 24 saat boyunca birlikte kültürlendi ve ko-kültürün sonunda hücre iskeleti boyama yapıldı. Konfokal görüntüleme ile TNT oluşumunu ve mitokondriyal transfer hızını gözlemledik ve saydık. Bu gözlemlerin sonuçları, birlikte kültürlenmiş hücrelerin oranı ve hücre yoğunluğu gibi faktörlerden etkilenebilir. Ko-kültür sırasında, homotipik hücreler tarafından hücre kolonilerinin oluşumunu en aza indirmek ve böylece iki hücre tipi arasında mitokondriyal transferin oluşumunu azaltmak için iki hücre tipini iyice karıştırmak ve bunları tek hücreli bir durumda tutmak zorunludur.

Akış sitometrik analizi, mitokondriyal transfer hızlarını analiz etmek için benzer şekilde kullanılabilir ve bu yöntem, görüntüleme sonrası istatistiklerden daha basittir. Bununla birlikte, bu yöntem kullanılarak hesaplanan mitokondriyal transfer hızı, gerçek değerden biraz daha düşük olacaktır, çünkü küçük miktarlarda mitokondriyal transfer kaydedilmeyebilir. Bu protokolde, floresan sahte sinyallerin ihmallerini veya yanlış sayımını önlemek için görüntüleme sonuçlarının sayımının çok dikkatli bir şekilde yapılması gerekir.

Mitokondriyal floresan ile iki hücre hattı oluşturarak çift yönlü mitokondriyal transferin incelenmesi bu protokolün bir yeniliğidir. Yöntem, floresan boyaların girişimini önler ve deneysel sonuçları daha güvenilir hale getirir. Mitokondrinin retina hücrelerinden MSC'lere transferi, örneğin, stresli koşullar altında her iki yönde aktarılan mitokondri oranındaki değişiklikleri araştırmak için daha fazla çalışmayı hak etmektedir.

Bu protokolde belirtilen deneysel prosedürlere bağlı kalarak, MSC'lerin mitokondriyi tünelleme nanotüpleri yoluyla retinal pigment epitel hücrelerine aktarabildiğini tespit edebildik. Bu fenomen, MSC'lerin retina dokuları üzerindeki avantajlı etkilerinin altında yatan makul bir mekanizma olarak hizmet edebilir ve böylece oküler dokular için MSC'lerin güdümlü rejeneratif tedavilerinin aydınlatılmasına yardımcı olabilir.

Açıklamalar

Yazarlar, çatışan hiçbir çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd'ye ticari süper çözünürlüklü mikroskop (HIS-SIM), veri toplama, SR görüntü yeniden yapılandırma, analiz ve tartışma ile görüntüleme için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82125007,92368206) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014) tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTAGibco25200-056
%4 paraformaldehitSolarbioP1110
6 oyuklu plakaNEST703001
15 mL santrifüj tüpüBD Falcon352097
24 oyuklu plakaNEST702001
ARPE19 hücreleriATCCCRL-2302Hücre hatları
Sığır serum albümini (BSA)BeyotimeST025
CellTrace menekşeInvitrogenC34557
Kapak slaytıNEST801007
DMSOsigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
Fetal Sığır Serum (FBS)VivaCellC04002-500
MSC'ler
FluorSave ReaktifiMillipore
ncMissionShownRP02010
Pen StrepGibco15140-122
pCT-Mito-GFPSBICYTO102-PA-1Plasmid; Kimden  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
PuromycinMCEHY-B1743A
PipetAxygenTF-1000-RS
PhalloidinInvitrogenA22287
Triton X-100SolarbioT8200
Transwell plakasıCorning3470
345789 Nuwacell RC02003 Hücre hatları

Kaynaklar

  1. Caprara, C., Grimm, C. From oxygen to erythropoietin: Relevance of hypoxia for retinal development, health and disease. Prog Retin Eye Res. 31 (1), 89-119 (2012).
  2. Ferrington, D. A., Fisher, C. R., Kowluru, R. A. Mitochondrial defects drive degenerative retinal diseases. Trends Mol Med. 26 (1), 105-118 (2020).
  3. Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
  4. Wei, B., et al. Mitochondrial transfer from bone mesenchymal stem cells protects against tendinopathy both in vitro and in vivo. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 104(2023).
  5. Borcherding, N., Brestoff, J. R. The power and potential of mitochondria transfer. Nature. 623 (7986), 283-291 (2023).
  6. Liu, D., et al. Intercellular mitochondrial transfer as a means of tissue revitalization. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 65(2021).
  7. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  8. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-the path forward. Embo j. 40 (8), e105789(2021).
  9. Qin, Y., et al. The functions, methods, and mobility of mitochondrial transfer between cells. Front Oncol. 11, 672781(2021).
  10. Jiang, D., et al. Bioenergetic crosstalk between mesenchymal stem cells and various ocular cells through the intercellular trafficking of mitochondria. Theranostics. 10 (16), 7260-7272 (2020).
  11. Domhan, S., et al. Intercellular communication by exchange of cytoplasmic material via tunneling nano-tube like structures in primary human renal epithelial cells. PLoS One. 6 (6), e21283(2011).
  12. Zhang, J., Zhang, Y. Membrane nanotubes: Novel communication between distant cells. Sci China Life Sci. 56 (11), 994-999 (2013).
  13. Cheng, X. Y., et al. Human ipscs derived astrocytes rescue rotenone-induced mitochondrial dysfunction and dopaminergic neurodegeneration in vitro by donating functional mitochondria. Transl Neurodegener. 9 (1), 13(2020).
  14. Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
  15. Li, C. J., Chen, P. K., Sun, L. Y., Pang, C. Y. Enhancement of mitochondrial transfer by antioxidants in human mesenchymal stem cells. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8510805(2017).
  16. Paliwal, S., Chaudhuri, R., Agrawal, A., Mohanty, S. Regenerative abilities of mesenchymal stem cells through mitochondrial transfer. J Biomed Sci. 25 (1), 31(2018).
  17. Lin, T. K., et al. Mitochondrial transfer of wharton's jelly mesenchymal stem cells eliminates mutation burden and rescues mitochondrial bioenergetics in rotenone-stressed melas fibroblasts. Oxid Med Cell Longev. 2019, 9537504(2019).
  18. Hu, X., Duan, T., Wu, Z., Xiong, Y., Cao, Z. Intercellular mitochondria transfer: A new perspective for the treatment of metabolic diseases. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 53 (7), 958-960 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ift Y nl Mitokondriyal TransferMitokondriyal zlemeKonfokal MikroskopiH cre Ko K lt rMito GFP EtiketlemeMito RFP Etiketleme
Mezenkimal Kök Hücreler ve Retinal Pigment Epiteli Arasında İn Vitro Tünelleme Nanotüpleri Yoluyla Mitokondriyal Transfer
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.