Yöntem makalesi

Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Sertlik Ölçümü için Fare Retina Kılcal Damarlarının ve Subendotelyal Matriksin İzolasyonu

DOI:

10.3791/66922

⸱

12 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, Los Angeles, 2Doheny Eye Institute, 3Molecular, Cellular, and Integrative Physiology Interdepartmental PhD Program, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yakın zamanda retina kapiller sertleşmesini diyabetle ilişkili retina disfonksiyonu için yeni bir paradigma olarak tanımladık. Bu protokol, fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin retinal endotel kültürlerinden izolasyon adımlarını detaylandırır ve ardından atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sertlik ölçüm tekniğinin bir açıklaması yapılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinal kılcal dejenerasyon, diyabetik retinopatinin (DR) erken evrelerinin klinik bir özelliğidir. Son çalışmalarımız, diyabetin neden olduğu retina kılcal damar sertleşmesinin, retina kılcal damarlarının inflamasyon aracılı dejenerasyonunda çok önemli ve daha önce tanınmayan nedensel bir rol oynadığını ortaya koymuştur. Retina kılcal sertliğindeki artış, subendotel matrisini çapraz bağlayan ve sertleştiren bir enzim olan lizil oksidazın aşırı ekspresyonundan kaynaklanır. Erken evrede DR ile mücadelenin DR ilerlemesini ve buna bağlı görme kaybını önlemesi veya yavaşlatması beklendiğinden, subendotelyal matriks ve kapiller sertlik, erken DR yönetimi için ilgili ve yeni terapötik hedefleri temsil eder. Ayrıca, retina kılcal damar sertliğinin doğrudan ölçümü, hayvan ve insan deneklerde retina kılcal damar sertliğinin non-invaziv değerlendirmesi için yeni görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi için çok önemli bir klinik öncesi doğrulama adımı olarak hizmet edebilir. Bu görüşü göz önünde bulundurarak, burada atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin izolasyonu ve sertlik ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina kılcal damarları, retina homeostazını ve görme fonksiyonunu korumak için gereklidir. Gerçekten de, erken diyabetteki dejenerasyonları, diyabetli tüm bireylerin yaklaşık %40'ını etkileyen mikrovasküler bir durum olan diyabetik retinopatinin (DR) görmeyi tehdit eden komplikasyonlarının gelişiminde güçlü bir şekilde rol oynar1. Vasküler inflamasyon, DR'de retinal kılcal dejenerasyona önemli ölçüde katkıda bulunur. Geçmiş çalışmalar, diyabetin neden olduğu retinal vasküler inflamasyonda anormal moleküler ve biyokimyasal ipuçları için önemli bir rol olduğunu göstermiştir 2,3. Bununla birlikte, son çalışmalar, retinal vasküler inflamasyon ve dejenerasyonun çok önemli ancak daha önce tanınmayan bir belirleyicisi olarak retinal kılcal damar sertleşmesini tanımlayan DR patogenezi için yeni bir paradigma ortaya koymuştur 4,5,6.

Spesifik olarak, retinal kılcal damar sertliğindeki diyabetin neden olduğu artışa, retinal endotel hücrelerinde (EC'ler) kollajen çapraz bağlama enzimi lizil oksidazın (LOX) yukarı regülasyonu neden olur ve bu da subendotel matrisini (bazal membran) sertleştirir4,5,6. Matriks sertleştirme, sırayla, üstteki retinal EC'leri (mekanik karşılıklılık nedeniyle) sertleştirir, böylece retina kılcal sertliğinde genel artışa yol açar4. En önemlisi, bu diyabetin neden olduğu retina kılcal damar sertleşmesi tek başına retinal EC aktivasyonunu ve inflamasyon aracılı EC ölümünü teşvik edebilir. Retinal EC kusurlarının bu mekanik regülasyonu, mekanik ipuçlarının biyolojik bir yanıt üretmek için biyokimyasal sinyallere dönüştürüldüğü süreç olan değiştirilmiş endotelyal mekanotransdüksiyona bağlanabilir 7,8,9. Daha da önemlisi, değişen EC mekanik ipuçları ve subendotelyal matriks yapısı, erken yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkili koroidal vasküler dejenerasyonda da rol oynamaktadır10,11,12, bu da dejeneratif retina hastalıklarında vasküler mekanobiyolojinin daha geniş etkilerini kanıtlamaktadır.

Özellikle, retina kılcal damar sertleşmesi, retina iltihabının başlangıcı ile aynı zamana denk gelen diyabetin erken dönemlerinde meydana gelir. Bu nedenle, retinal kılcal sertlikteki artış, DR için hem terapötik bir hedef hem de erken tanısal bir belirteç olarak hizmet edebilir. Bu amaçla, retina kılcal damarlarının ve subendotelyal matriksin güvenilir ve doğrudan sertlik ölçümlerinin elde edilmesi önemlidir. Bu, hücrelerin, hücre dışı matrisin ve dokuların sertliğini doğrudan ölçmek için benzersiz, hassas, doğru ve güvenilir bir teknik sunan bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak elde edilebilir13. Bir AFM, sertliği girintili AFM konsolunun bükülme derecesini belirleyen numuneye çok küçük (nanoNewton seviyesinde) girinti kuvveti uygular - numune ne kadar sert olursa, konsol o kadar fazla bükülür ve bunun tersi de geçerlidir. Kültürlenmiş endotel hücrelerinin, subendotel matrislerinin ve izole fare retina kılcal damarlarınınsertliğini ölçmek için AFM'yi yaygın olarak kullandık 4,5,6,11,12. Bu AFM sertlik ölçümleri, endotelyal mekanobiyolojinin DR ve AMD patogenezinin anahtar belirleyicisi olarak tanımlanmasına yardımcı olmuştur. Görme araştırmalarında mekanobiyolojinin kapsamını genişletmeye yardımcı olmak için, burada izole fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin sertlik ölçümleri için AFM'nin kullanımı hakkında adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, Görme ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Beyanı'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles'taki Kurumsal Hayvan ve Bakım Kullanımı Komiteleri (IACUC; protokol numarası ARC-2020-030) tarafından onaylanmıştır (OLAW kurumu hayvan refahı güvence numarası A3196-01). Aşağıdaki protokol, ~ 25 g (diyabetik fareler) ve ~ 32 g (diyabetik olmayan fareler; Jackson Laboratuvarı).

1. AFM sertlik ölçümü için fare retina kılcal damarlarının izolasyonu (1-4. Gün)

NOT: Yakın tarihli bir çalışmada4 bildirilen bu protokol, fare gözünün enükleasyonunu ve hafif fiksasyonunu, retina izolasyonunu ve tripsin sindirimini ve ardından elde edilen retina damar sisteminin AFM sertlik ölçümü için mikroskopi slaytlarına monte edilmesini detaylandırır.

  1. Enükleasyon ve hafif fiksasyon (1. Gün)
    1. Fareyi karbondioksite maruz kalma ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yaptıktan sonra, göz küresinin arkasına mikro forseps yerleştirin, kas ekini tutun ve mikro forsepsleri çok sıkı sıkıştırmadan gözü dikkatlice dışarı çekin, bu da optik siniri kesebilir.
    2. Hafif fiksasyon için enükleasyonlu gözü 4 ° C'de 24 saat boyunca PBS'de% 5 (h / h) formalin içine yerleştirin.
      NOT:Deneyim 4'e dayanarak, sabitlenmemiş veya daha hafif sabit gözler, AFM numune hazırlama ve sertlik ölçümü sırasında parçalanan kırılgan kılcal damarlar verir.
  2. Retina izolasyonu (2. gün)
    1. Sabit gözü diseksiyon mikroskobu altında bir parça yağlı kağıda yerleştirin. Daha sonra, mikro forseps kullanarak, arka gözün dışına bağlı kas ve optik sinirin kalıntılarını tutun ve gözü, kornea bir tarafa bakacak şekilde yönlendirin (Şekil 1).
    2. Cerrahi bir bıçak kullanarak, limbusun 1-2 mm arkasında ve ona paralel bir kesi yapın (kornea-sklera bileşkesi). Daha sonra, mikro forseps ile gözü yerinde tutarken, bıçakla aşağı doğru bir kuvvet uygulayın ve gözün ön segmenti arka uçtan tamamen ayrılana kadar bastırmaya devam edin (Şekil 1). Ön segmenti ve lensi atın. Retina hasarına neden olabileceğinden ileri geri görmeyin.
    3. Arka segmenti (sklera, koroid ve retina) PBS (pH 7.4) ile doldurulmuş 6 cm'lik bir tabağa aktarın.
    4. Bir mikro spatula kullanarak ve aynı anda optik siniri mikro forseps ile nazikçe tutarak retinayı çıkarın. Retinayı, kılcal izolasyona kadar 4 ° C'de PBS içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın.
       
  3. Retina durulamaları
    1. Bir retinayı durulamak için, 12 oyuklu bir plakanın altı kuyusunu 1 mL çift damıtılmış H2O (ddH2O) ile doldurun. Daha sonra, ters çevrilmiş bir Pasteur pipeti kullanarak, retinayı 2 mL mikrosantrifüj tüpünden ilk kuyucuğa aktarın.
    2. Retinayı orbital çalkalayıcı üzerinde 120 RPM'de oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca durulayın.
    3. Bir P1000 pipeti kullanarak, retinanın yanındaki suyu dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin ve hafif ajitasyona neden olmak için retinaya su üfleyin.
    4. Ters çevrilmiş cam pipeti kullanarak, retinayı ikinci kuyucuğa aktarın ve 1.3.2 ve 1.3.3 adımlarını 4 kez tekrarlayın, her durulama taze (ddH2O içeren) bir kuyuda yapılır.
    5. Son olarak, retinayı altıncı kuyucuğa aktarın ve tripsin sindirimi sırasında retinal nöroglianın kan damarlarından ayrılmasını kolaylaştırmak için 100 RPM'ye ayarlanmış orbital çalkalayıcı üzerinde RT'de gece boyunca (O / N) durulayın.
  4. Retinal tripsin sindirimi (3. gün)
    1. Tripsin 1:250 tozunu Tris tamponunda (pH 8; 0.1 M) çözerek% 10 (a/h) tripsin çözeltisi hazırlayın. Kabarcık oluşumunu en aza indirmek için konik tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın, bu da tripsin çözünürlüğünü doğrulamayı zorlaştırır.
    2. % 10'luk tripsin çözeltisini 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-15 dakika dengeleyin. Tripsin tozu tamamen çözüldüğünde, çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
    3. 12 oyuklu bir plakada, filtrelenmiş% 10 tripsin çözeltisinden 2 mL / kuyu / retina ekleyin. Komşu kuyucuğa bir miktar ekstra tripsin çözeltisi ekleyin (sonraki adımlar için cam pipet duvarlarını dengelemek için).
    4. 6 oyuklu bir plakanın üç oyuğuna 3 mL ddH2O ekleyin (bu üç oyuğu bir retina için ayırın).
    5. 15 mL'lik konik bir tüpe, filtrelenmiş %200 tripsin çözeltisinden 4 mL eklemeden önce bir P10 ucu yerleştirin. Bu konik tüpü 37 ° C'lik banyoya aktarın ve ucun 2-3 dakika boyunca tripsin içinde ıslatılmasına izin verin, çünkü bu, sonraki adımlarda retinanın uç duvarlarına yapışmasını önlemeye yardımcı olur.
    6. Retinanın O/N durulamasından sonra (adım 1.3.5'ten itibaren), retinanın yanındaki suyu dikkatlice yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P1000 pipeti kullanın ve hafif ajitasyona neden olmak için retinaya su püskürtün.
    7. Ters çevrilmiş bir cam pipet kullanarak, durulanmış retinayı 12 oyuklu plakanın tripsin içeren kuyucuğuna aktarın (adım 1.4.3'ten itibaren). Tripsin çözeltisini önemli ölçüde seyreltmemek için retinanın minimum miktarda kalıntı ddH2O ile aktarıldığından emin olun. 37 °C'de 3 saat inkübe edin.
    8. Tripsinle ıslatılmış P200 ucunu (adım 1.4.5'ten itibaren) optik sinir bölgesinde ortalayarak, vasküler olmayan dokuyu ayırmak için tüm vasküler ağı nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin14.
    9. Tripsin içinde önceden durulanmış ters çevrilmiş bir cam pipet kullanarak (tripsini 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek), retina damar sistemini 6 oyuklu plakanın ilk ddH2O içeren kuyucuğuna aktarın (adım 1.4.4'ten itibaren).
    10. Plakayı döndürün ve kalan vasküler olmayan dokuları çıkarmak için ters tripsin ile durulanmış bir cam pipet kullanarak damar sistemini yukarı ve aşağı pipetleyin.
    11. Cam pipeti kullanarak, retina damar sistemini 6 oyuklu plakanın ikinci ddH2O içeren kuyucuğuna aktarın ve AFM sertlik ölçümü için lam üzerine monte edilene kadar 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Hidratlı retina damar sistemi (PBS'de) 4 ° C'de 2 haftaya kadar yapısal olarak sağlamdır. Ancak rutin sertlik ölçümleri yeni izole edilmiş kılcal damarlardan yapılmalıdır.
  5. AFM sertlik ölçümü için retina damar sisteminin montajı (4. Gün)
    1. Ters çevrilmiş tripsin ile durulanmış bir cam pipet kullanarak, retina damar sistemini, herhangi bir kalıntı tripsin çözeltisini çıkarmak için 6 oyuklu plakanın üçüncü ddH2O içeren kuyucuğuna aktarın.
    2. AFM sertlik ölçümü için vasküler ağı monte etmek için kullanılacak yüklü bir yüzey mikroskobu slaytını iyice temizleyin (ddH2O ve silecek mendili kullanarak).
      NOT: Sürgünün yüklü yüzeyi, AFM ölçümü sırasında vasküler ağ için güçlü bir bağlanma sağlar.
    3. Slaytı etiketleyin ve sonraki adımlarda su dökülmesini önlemek için hidrofobik bir kalemle merkezin etrafına 4-5 cm'lik dairesel bir bölge çizin.
    4. Ters çevrilmiş tripsin ile durulanmış bir cam pipet kullanarak, retina damar sistemini dikkatlice işaretli bölgenin merkezine aktarın.
    5. Bir P200 pipeti kullanarak, damar sistemini yanlışlıkla uca aspire etmeden bir kenardan mümkün olduğunca fazla suyu dikkatlice çıkarın.
    6. Sürgüyü ön tarafa (filtreli ağ) yakın bir biyogüvenlik kabinine (BSL-2 davlumbaz) yerleştirin ve kalan suyun buharlaşmasına izin verin.
    7. Damar sistemi neredeyse kuruduktan sonra, bir faz kontrast mikroskobu (4x büyütme) altında, işaretli bölgenin bir tarafına bir P200 pipeti ile ddH2O ekleyerek damar sistemini dikkatlice yeniden sulandırın. ddH2O'nun doğrudan damar sistemine eklenmesi damar sisteminin ayrılmasına neden olur.
    8. İyi bir yapısal bütünlüğe sahip olduğundan ve düzgün bir şekilde yayıldığından (kendi üzerine katlanmadığından) ve güvenilir AFM sertlik ölçümü için temel kriterler olan cam slayta tutturulduğundan emin olmak için 4x ve 20x büyütmelerde rehidre edilmiş damar sisteminin faz kontrast görüntülerini alın.

2. Retinal mikrovasküler endotel hücre (REC) kültürlerinden subendotelyal matriks elde edilmesi (1-17. günler)

NOT: Bu protokol, Beacham ve ark.15 ve son çalışmalarda rapor edilmiştir 4,5,6, modifiye edilmiş cam lameller üzerinde REC kültürünü tanımlar, ardından sonraki AFM sertlik ölçümü için subendotelyal matris elde etmek için hücreden arındırma yapılır.

  1. Jelatin kaplı cam lamellerin hazırlanması ve hücre kaplaması (1. Gün)
    NOT: Sonraki glutaraldehit ve etanolamin işleme adımları için kimyasal çeker ocaklara geçmeden önce jelatin kaplamayı ve sonraki PBS++ durulama adımlarını bir doku kültürü davlumbazında gerçekleştirin.
    1. Steril 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına bir otoklavlanmış 12 mm çapında dairesel cam lamel yerleştirin ve 500 μL önceden ısıtılmış steril% 0.2 (a/h) jelatin (kalsiyum ve Magnezyum içeren PBS'de seyreltilmiş; PBS++) içeren her bir kuyucuğa. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    2. Jelatin çözeltisini aspire edin, lamelleri steril PBS++ ile bir kez durulayın ve RT'de 30 dakika boyunca 500 μL %1 (h/h) glutaraldehit ekleyerek kaplanmış jelatini çapraz bağlayın.
    3. Lamelleri RT'de 100 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca PBS++ ile durulamadan önce glutaraldehit çözeltisini toplayın ve uygun şekilde atın (kurumsal yönergelere göre). Bu durulama adımını 5 kez tekrarlayın. İlk üç durulama sırasında, glutaraldehitin iyice durulanmasını sağlamak için steril bir cımbız kullanarak lamelleri kaldırın. Herhangi bir kalıntı miktar hücre canlılığını azaltabilir.
    4. Kuyuda kalan glutaraldehit izlerini söndürmek için RT'de 30 dakika boyunca jelatin çapraz bağlı lamele 800 μL 1 M etanolamin ekleyin.
    5. Etanolamin çözeltisini toplayın ve uygun şekilde atın (kurumsal yönergelere göre) ve lamelleri RT'de 100 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca PBS++ ile 5 kez durulayın. İlk üç durulama sırasında, etanolaminin iyice durulanmasını sağlamak için steril bir cımbız kullanarak lamelleri kaldırın. Herhangi bir kalıntı miktar hücre canlılığını azaltabilir.
    6. Çapraz bağlı lameller artık hücre kaplaması için hazırdır.
      NOT: Lamel hazırlığından hemen sonra hücreleri rutin olarak plakalamamıza rağmen, 1-2 gün boyunca PBS++ 'da 4 °C'de saklanan çapraz bağlı jelatin lameller üzerindeki hücre kaplamasını karşılaştırmak faydalı olabilir.
    7. Bir doku kültürü başlığındaki steril koşullar altında, faz kontrast mikroskobu ile onaylandığı gibi, 24 saat içinde %100 birleşme sağlayan bir yoğunlukta 500 μL ortamda/kuyuda plaka retinal mikrovasküler endotel hücreleri (REC'ler).
      NOT: 24 saat içinde birleşmeye ulaşmak önemlidir, çünkü ortaya çıkan REC sessizliği hücrelerin matris salgılama yeteneğini artıracaktır (aşağıdaki adıma bakın). İnsan REC'leri ile olan deneyimimize göre, 24 saat içinde birleşmeye ulaşmak için 4 x 104 hücre/cm2'lik bir kaplama yoğunluğu yeterlidir. Bununla birlikte, REC boyutu türe göre değiştiğinden (örneğin, fare REC'leri önemli ölçüde daha küçüktür), ilk kaplama yoğunluğunun optimize edilmesi gerekebilir.
  2. REC kültürü ile subendotelyal matriks üretimi (Gün 2-16)
    1. Hücreler birleştikten sonra (~ 24 saat), kültür ortamını steril filtrelenmiş askorbik asit (200 μg / mL'lik nihai konsantrasyon) ile takviye edilmiş taze ortamla değiştirin.
      NOT: Hastalık risk faktörleri (ör., yüksek glikoz, ileri glikasyon son ürünleri, vb.) veya farmakolojik ajanlarla yapılan herhangi bir REC tedavisi, askorbik asit tedavisi ile birlikte şimdi başlayabilir.
    2. Askorbik asit takviyeli kültür ortamını 15 gün boyunca her gün değiştirin.
      NOT: Askorbik asit çözelti içinde kararsızdır. Orta takviye için her gün taze 100X stok solüsyonu hazırlayın.
  3. Subendotelyal matrisi elde etmek için REC kültürlerinin hücreden arındırılması (16. Gün)
    1. 15 günlük askorbik asit tedavisinden sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri kalsiyum / magnezyum içermeyen PBS ile durulayın.
    2. ~2-3 dakika boyunca 250 μL/kuyu başına ılık hücre giderme tamponu (20 mM amonyum hidroksit ve PBS'de %0.5 Triton X-100) ekleyerek REC kültürlerini hücrelerden arındırın. Faz kontrast mikroskobu (10x büyütme) altında hücrelerin çıkarıldığını onaylayın.
    3. REC tarafından salgılanan subendotelyal matrisi bozmadan hücre giderme tamponunu nazikçe çıkarın ve her oyuğa 0,5 mL PBS ekleyin.
      NOT: Bu ve sonraki durulama adımları sırasında subendotelyal matrisin ayrılmamasını sağlamak için, yalnızca bir P1000 pipeti ile nazikçe durulama yapın. Vakum aspirasyonu yapmayın.
    4. REC tarafından salgılanan matrisi stabilize etmek için plakaları gece boyunca 4 °C'de saklayın.
  4. Hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için subendotelyal matriksin DNaz tedavisi (17. Gün)
    1. Subendotelyal matrisi adım 2.3.4'ten itibaren 800 μL PBS/kuyucuk ile durulayın.
    2. PBS'yi nazikçe çıkarın ve tüm hücresel kalıntı izlerini gidermek için matrisi 200 μL RNaz içermeyen DNaz I (30 K birimi) ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bir faz kontrast mikroskobu altında hücre kalıntılarını dikkatlice arayarak DNaz işleminin verimliliğini kontrol edin.
    3. DNaz I solüsyonunu nazikçe çıkarın ve subendotelyal matrisi 800 μL PBS / kuyucuk ile iki kez durulayın.
    4. Makro ölçekli fibröz subendotelyal matrisin bir faz kontrast mikroskobu (10x büyütme) altında görünür olup olmadığını kontrol edin. Daha ince nano ölçekli matris liflerinin görselleştirilmesi, AFM topografik taramasını veya immün etiketli matris proteinlerinin 100x büyütmede yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemesini gerektirir.
    5. AFM sertlik ölçümü için hemen taze (sabitlenmemiş) subendotelyal matrisi kullanın.
    6. AFM ölçümünü takiben, matris numunelerini %1 (h/h) paraformaldehit (oda sıcaklığında 15 dakika) ile sabitleyin ve subendotelyal matriks proteinlerine ve/veya çapraz bağlama enzimlerine karşı antikorlarla immünoetiketleme için 4 ° C'de saklayın.

3. AFM sertlik ölçümü

NOT: Standart bir AFM kullanım kılavuzundan uyarlanan ve son çalışmalarda 4,5 rapor edilen bu protokol, bir AFM ve veri analiz yazılımı kullanılarak retina kılcal damarlarından ve subendotelyal matristen sertlik verilerinin elde edilmesini ve analizini detaylandırır. Aşağıda özetlenen adımlar belirli bir AFM modeline dayansa da (Malzeme Tablosuna bakınız), temel ilkeler genellikle tüm AFM modelleri için geçerlidir.

  1. Konsol probu seçimi
    NOT: Yumuşak biyolojik numuneler, prob boyutları numunenin boyutlarına uyacak şekilde seçilirken numune girintisi üzerine bükülebilen yumuşak konsollar gerektirir.
    1. 5-8 μm çaplı fare retina damarlarının sertlik ölçümü için, yay sabiti (k) 0.2-0.3 N/m olan 1 μm yarıçaplı konsol probu kullanın. Nano ölçekli liflerden oluşan bir subendotelyal matrisin sertlik ölçümü için, 0.06-0.1 N / m'lik bir yay sabiti (k) olan 70 nm yarıçaplı bir konsol probu kullanın.
  2. Konsol montajı
    1. AFM bilgisayarında, konsolu ve numuneyi görselleştirmek için kullanılan bir faz kontrast mikroskobuna bağlı AFM ünitesini ve kamerayı kontrol eden yazılımı açın.
    2. Konsol tutucuyu konsol değiştirme sehpasına sabitleyin ve konsola fiziksel olarak zarar vermeden bir stereoskop altında saat ustası forsepslerini kullanarak seçilen konsolu tutucuya monte edin. Konsolu sabitlemek için tutucudaki vidayı sıkın.
    3. Konsol tutucuyu sehpa üzerinde duran AFM kafasına yerleştirin ve kilitleyin.
    4. AFM yazılımındaki step motor işlevini kullanarak, AFM kafasını en yüksek noktaya çekin ve bu konumu yazılımda sıfır noktası olarak ayarlayın. Bu adım, AFM konsolunun yanlışlıkla s'ye çarpmasını önler.ampAFM kafasını monte ederken aşama (sonraki adım).
    5. AFM kafasını dikkatlice standından kaldırın ve AFM s'ye monte edin.ampbacakları ilgili yuvalarına yerleştirerek.
  3. Lazer hizalama
    NOT: İlk lazer hizalaması, lazer ışınının konsol ucu üzerinde daha hassas bir şekilde hizalanmasını sağladığı için (sıvıda lazer kırılmasını önleyerek) herhangi bir numune olmadan (yani Hava modunda) gerçekleştirilir. Bununla birlikte, biyolojik numuneler havadan farklı bir kırılma indisine sahip bir ortama daldırıldığından, sertlik ölçümünden önce lazerin ortamda yeniden hizalanması önemlidir.
    1. Havada lazer hizalama için, AFM kafasını s'ye yerleştirinamp ve konsol monitörde canlı modda görselleştirmek için 10x objektifi ve takılı kamerayı kullanın. Kızılötesi lazer, kullanıcının görüş alanından gizlenir, ancak bir CCD kamera ile görülebilir.
    2. Yazılımda Temas Modu Kuvvet Spektroskopisi işlevini seçin ve Lazer hizalama başlıklı pencereyi açın.
    3. AFM kafasında lazer yanal olarak işaretlenmiş iki vidayı kullanarak, lazer hizalama penceresindeki SUM değeri en yüksek olacak şekilde lazer ışınını konsol üzerine odaklayın. Bunu başarmak için lazeri konsolun merkezine veya çevresine odaklayın.
    4. Dedektör ayar vidalarını kullanarak, fotodedektörü, lazer noktası lazer hizalama penceresinin merkezinde olacak şekilde ayarlayın.
    5. Ayna ayar vidasını kullanarak, SUM değerinin mümkün olan en yüksek değerde olduğundan emin olmak için aynayı ayarlayın.
      NOT: Yüksek bir SUM değeri, numune sertliğinin hassas ve doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu nedenle, en yüksek SUM değerini elde etmek için hem lazer hizalama hem de ayna ayarlama adımları gerçekleştirilmelidir.
    6. Daha sonra, sıvı içinde lazer hizalama için, istenen kültür ortamını bir tabağa ekleyin ve numune girintisi sırasında ölçüm artefaktları oluşturan herhangi bir titreşim veya kaymayı önlemek için sahneye sıkıca monte edin.
    7. Konsola odaklanan canlı kamera beslemesine bakarken, step motor işlevini kullanarak sıvıya indirin.
    8. SUM değerinin en yüksek kaldığından ve lazer noktasının lazer hizalama penceresinin merkezinde olduğundan emin olmak için 3.3.4 ve 3.3.5 adımlarını tekrarlayın.
  4. Konsol yay sabitinin kalibrasyonu
    NOT: Konsol probları, üretici tarafından kalibre edilmiş bir yay sabiti (k) ile birlikte gelse de, bir ölçüme başlamadan önce değerini (sıvı içinde) bağımsız olarak doğrulamak iyi bir uygulamadır. Konsol probu ile cam yüzey arasındaki etkileşimleri en aza indiren temiz bir cam yüzey kullanın.
    1. Konsol tarafından uygulanan ayar noktası kuvveti, bir kuvvet girintisi için izin verilen konsoldan maksimum lazer sapmasını ayarlar. Başlangıçta 1,5 V'a ayarlayın. Konsol bu verilen ayar noktası kuvvetine yaklaşamazsa, numuneyi girintileyene ve bir kuvvet girinti eğrisi oluşturana kadar kademeli olarak artırın.
    2. Z Uzunluğu, numune girintisi sırasında konsol ayar noktasına ulaştıktan sonra z-piezo'nun çekildiği maksimum mesafeyi belirtir. Z uzunluğu, konsol probunun numuneden temiz bir şekilde ayrılmasını sağlamak için en az yeterli olmalıdır. Bir cam yüzeyde yay sabitinin kalibrasyonu için Z Uzunluğunu 1 μm olarak ayarlayın.
    3. Z hızı, z-piezo'nun kuvvet girintisi sırasında konsolu numuneye doğru dikey olarak aşağı hareket ettirdiği hızı ifade eder. Optimize edilmelidir, çünkü çok düşük bir hız öncelikle numunenin viskoz davranışını yakalayacak, çok yüksek bir hız ise öncelikle elastik davranışı yakalayacaktır. Optimum hızın, biyolojik numunelerin gerçek viskoelastik doğasını yakalaması beklenmektedir. Viskoelastik biyolojik numuneler için Z hızını 2 μm/s'ye ayarlayın.
    4. Z aralığındaki Hedef yükseklik, bir kuvvet eğrisini ölçtükten sonra ve numune üzerinde farklı bir konuma hareket etmeden önce z-piezo'nun durduğu numuneden yaklaşık mesafeyi gösterir. Z Aralığı hedef yüksekliği, örnek özelliklerin yüksekliğinden daha büyük olmalıdır. Z aralığında hedef yüksekliği 7,5 μm olarak ayarlayın.
    5. Step Motor fonksiyonunu kullanarak, konsolu 10 μm'lik daha küçük artışlarla aşağı indirmek için temas modu kuvvet spektroskopisi penceresinde Yaklaşma fonksiyonunu seçmeden önce konsolu numune yüzeyine oldukça yaklaştırın (15x büyütmede faz kontrast görüntüsündeki odağa bakılırsa).
    6. Bir kuvvet eğrisi yakalamak için Al'ı tıklayın.
    7. Kuvvet Eğrisi'ni seçin, kalibrasyon yöneticisi penceresinde açın ve yöntem bölümünde Temas Tabanlı Mod'u seçin.
    8. Sığdırma Aralığını Seç işlevini kullanarak, doğrusal bir eğri uyumu için Konsol Geri Çekme Eğrisi'ni seçin. Ardından, kuvvet birimini V'den N'ye dönüştürmek için Hassasiyet Onay kutusunu işaretleyin.
    9. Konsolu sıvı içinde 100-200 μm kaldırın ve Termal Gürültü işlevini seçin. Yine, Uygun Aralığı Seç'i kullanarak, termal gürültü çan eğrisini bir Lorentz eğrisi ile eşleştirin. Eğri uydurduktan sonra, Yay Sabiti (k) kutusunu seçin. Yay sabitinin (k) üreticinin değerine yakın olduğunu onaylayın ve ileride başvurmak üzere not edin. Kalibrasyondan sonra, ayar noktası birimi mV'den nN'ye değişecektir.
      NOT: Termal gürültü, konsolun belirli bir sıcaklıktaki doğal frekansıdır. Doğru yay sabiti ölçümü için termal gürültünün düzeltilmesi gereklidir.
  5. Kuvvet-mesafe eğrilerinin elde edilmesi
    1. Kayar monteli numuneyi (retina damarları veya subendotelyal matriks) AFM tablasına yerleştirin ve yazılımın deney bölümünde Temas Modu Kuvvet Spektroskopisi'ni seçin.
    2. Ayar noktası kuvvetini 0,5 nN'ye ayarlayın ve hem SAA-SPH 1 μm hem de PFQNM-LC-A 70 nm konsol problarının termal sapmasından önemli ölçüde daha yüksek olan Yaklaşım'a tıklayın, bu da numuneye doğru düzgün bir konsol yaklaşımı sağlar.
    3. Konsol yüzeyi algıladıktan ve dinlenme hedef yüksekliğine geri döndükten sonra, ayar noktasını daha sert SAA-SPH 0.2 μm konsol probu için 1 nN veya daha yumuşak PFQNM-LC-A 0.1 nm konsol probu için 70 nN olarak ayarlayın. Bu ayar noktası ayarı, numune girintisi sırasında hem sert hem de yumuşak konsolların kolayca bükülmesini sağlar (bkz. bölüm 3.1).
    4. Geri çekme sırasında konsol probunun biyolojik numunelerden temiz bir şekilde ayrılmasını sağlamak için Z Uzunluğunu ~2.5 μm'ye ayarlayın (bkz. adım 3.4.2) ve Z hızını 2 μm/s'ye (bkz. adım 3.4.3).
    5. AFM tablasındaki s'yi kullanaraktage, konsol probunu numune üzerinde istenen bir yere dikkatlice yerleştirin.
      NOT: Kılcal damarlar kızak üzerinde her zaman düz bir şekilde yayılmadığından, sahneyi hareket ettirmeden önce konsolu dinlenme hedef yüksekliğinden 10-20 μm daha çekmek güvenlidir.
    6. Önce konsolu örneğe yaklaştırmak için Yaklaşım'a tıklayın ve ardından istenen konumlar için kuvvet eğrilerini yakalamak için Al'a tıklayın. Analiz için tüm kuvvet eğrilerini kaydedin.
  6. Veri analizi
    1. Veri işleme yazılımında kuvvet eğrisini açın.
    2. Veri analizi için Geri Çekme Kuvveti Eğrisi'ni seçin (adım 3.4.8'e benzer).
    3. Veri yumuşatma işlevini kullanarak, elde edilen verilerdeki istenmeyen gürültüyü gidermek için kuvvet eğrisini bir Gauss filtresiyle düzeltin.
    4. Taban çizgisi çıkarma işlevini kullanarak, kuvvet eğrisinin (temassız) temel kısmının eğiminin ve büyüklüğünün değerini sıfıra ayarlayın.
    5. Kuvvet eğrisinin temas noktasını otomatik olarak X ve Y eksenlerindeki (0,0) koordinatlarına getirmek için Temas Noktası işlevine tıklayın.
    6. Dikey Uç Konumu işlevini kullanarak, herhangi bir numune girintisini düzelterek konsolun Y ekseni üzerindeki gerçek dikey konumunu hesaplayın.
    7. İşlenmiş kuvvet eğrisinde, önce uç şeklini ve yarıçapını (seçilen konsol probuna bağlı olarak) seçerek, ardından Hertz/Sneddon modelini kullanarak kuvvet eğrisi uydurarak Esneklik Uyumu işlevini uygulayın.
      1. 70 nm yarıçaplı probun matris girintisi 70 nm'yi aşarsa, ki bu tipik olarak böyledir, Paraboloid uç şeklini seçin. Kılcal sertlik ölçümü için, 1 μm yarıçaplı prob tarafından numune girintisi hiçbir zaman 1 μm'yi aşmaz, bu nedenle Küre ucu şeklini seçin. Ayrıca, takılan eğrinin temas noktası gerçek geri çekme eğrisinin temas noktasıyla çakışmıyorsa, Eğriyi Kaydır onay kutusunu seçin.
    8. Young modülünün (sertlik) değerini not edin ve kaydedin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare retina kılcal damarları
İzole retina kılcal damarlarının AFM sertlik ölçümü, mekanoyapısal bütünlüklerine potansiyel olarak zarar verebilecek numune işleme adımlarını içerir. Bunu önlemek ve böylece AFM ölçümlerinin fizibilitesini, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için, enükleasyonlu gözler, damar izolasyonundan önce gece boyunca 4 °C'de% 5 formalin içinde sabitlenir. Düşük formalin konsantrasyonu, düşük fiksasyon sıcaklığı, sınırlı fiksasyon süresi ve kornea ponksiyonu eksikliği olan bu hafif fiksasyon protokolü, kimyasal fiksasyonun neden olduğu olası çapraz bağlanma / sertleşme artefaktlarını en aza indirmek için geliştirilmiştir. Şekil 2B,C'de gösterildiği gibi, bu nispeten hafif fiksasyon, izole retina vaskülatürünün yapısal olarak sağlam ve AFM ölçümü için yeterince dayanıklı olmasını sağlar. Buna karşılık, sabitlenmemiş gözlerden (hipotonik yöntem kullanılarak)4 veya kısa süreli sabit gözlerden (8 saat boyunca) izole edilen retina damarları parçalanır veya çöker, bu da onları AFM ölçümü için uygun hale getirmez (Şekil 2B).

Retinal subendotelyal matriks
Vasküler sertlik, vasküler hücrelerin ve bazal membranın (subendotelyal matris) birleşik sertliğini yansıtır4. Hücreler kendi sertliklerinde benzer bir değişiklik geçirerek matriks sertliğine adapte olduklarından, mekanik karşılıklılık9, subendotelyal matriks sertliği olarak adlandırılan bir süreç, genel vasküler sertliğin önemli bir belirleyicisi haline gelir. Matriks rijitliği ölçümü için homojen yoğunlukta bir subendotelyal matriks elde etmek önemlidir. Askorbik asit takviyeli kültür ortamında yetiştirilen insan retinal EC'leri için bu genellikle 10-15 gün sürer (Şekil 3A)4,5,6. Kültür periyodundaki bu farklılık, ticari olarak temin edilebilen primer retinal EC'lerdeki partiden partiye farklılıklardan kaynaklanabilir. Ayrıca, genellikle C57BL/6 farelerinden ticari olarak temin edilebilen retinal EC'lerin, birincil insan retinal EC kültürü ile karşılaştırıldığında daha yoğun bir matris biriktirdiğini ve böylece türe özgü farklılıkları gösterdiğini bulduk. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, faz kontrast görüntüleri matrisin yalnızca makro ölçekte brüt bir görünümünü sağlar. Bununla birlikte, daha ince nano-mikro ölçekli fibriler yapı, matris yapısal proteinleri kollajen IV ve fibronektine karşı antikorlarla immün olarak işaretlenmiş matrisin yüksek çözünürlüklü konfokal floresan görüntülerinde belirginleşir (Şekil 3B). Bu matris proteinlerinin ayrıca spesifik integrin reseptörlerine9 bağlanarak endotel hücrelerine öğretici ipuçları sağladığına dikkat edilmelidir.

AFM sertlik ölçümü
Güvenilir ve hassas ölçümler için uygun konsol sertliğinin (yay sabiti, k) ve prob boyutunun seçilmesi çok önemlidir. Bu parametreler, biyolojik numunenin sertliğine ve boyutlarına uyacak şekilde seçilmelidir. Seçilen konsol AFM'ye monte edildikten sonra, kızılötesi lazer ışını konsolun ucuna odaklanmalı ve yansıyan lazer noktası fotodetektör üzerinde ortalanmalıdır. Bu lazer hizalama, konsol sapmasının hassas ve hassas bir şekilde algılanmasını ve sonuç olarak sertlik ölçümünü sağlar. Bir AFM sertlik ölçümü, z-piezo'nun konsolu numuneye doğru dikey olarak aşağı hareket ettirmesiyle başlar. Şu anda konsol sapması yoktur, bu da yaklaşma eğrisinin düz bir taban çizgisini oluşturur (Şekil 4A). Konsol probu numuneye temas edip girinti yaptığında, konsol bükülür ve fotodetektör üzerinde lazer sapmasına neden olur, bu da yaklaşma eğrisinin dikey sapması ile gösterilir. Numune üzerine önceden ayarlanmış bir girinti kuvveti (ayar noktası kuvveti) uygulandıktan sonra, konsol numuneden uzaktaki başlangıç konumuna (Z hedef yüksekliği) geri çekilir. Saptırılmış geri çekme eğrisi daha sonra numunenin Young modülünü (sertliği) hesaplamak için Hertz/Sneddon modeline takılır.

Şekil 4'te gösterilen temsili kuvvet girinti ölçümünden, diyabetik bir fareden (Şekil 4B) izole edilen bir retinal kılcal damardan elde edilen yaklaşma ve geri çekilme eğrilerinin, diyabetik olmayan bir fareden (Şekil 4A) elde edilenlerden önemli ölçüde daha dik olduğu açıktır. Kuvvet girinti eğrilerinin daha dik eğimi, kuvvet girintisine karşı daha yüksek numune direncinin neden olduğu daha büyük konsol sapmasını gösterir, bu da daha yüksek numune sertliğiniyansıtır 13. Gerçekten de, çoklu kuvvet girinti eğrilerinin müteakip veri analizi, fare retina kılcal damarlarının diyabette önemli ölçüde daha sert hale geldiğini ortaya koymuştur4. Ayrıca, konsol probu ile biyolojik numuneler arasındaki temasın, geri çekme eğrisinin taban çizgisinin ötesine uzatılmasından görüldüğü gibi, geri çekme sırasında negatif konsol sapmasına yol açan spesifik olmayan yüzey yapışmasına neden olduğu da belirtilmelidir (Şekil 4B). Ayrıca, hücreler, matris ve kan damarları gibi biyolojik numuneler doğası gereği viskoelastiktir ve bu nedenle kuvvet girintisini takiben bazı kalıcı deformasyona ve/veya görünür sertlikte değişikliğe uğrayabilir. Eğer öyleyse, bu yaklaşma ve geri çekilme eğrilerinin yanlış hizalanmasına (histerezis) yansıyacaktır. Gerçekten de, Şekil 4A ve Şekil 4B'nin karşılaştırılması, diyabetik olmayan farelerde daha yumuşak kılcal damarların kuvvet girintisinin, daha sert muadillerinde görülenden daha fazla histerezis ürettiği beklenen eğilimi doğrulamaktadır. Daha önce 5,6 bildirildiği gibi, retinal EC kültürlerinden elde edilen subendotelyal matrislerin sertliği (Young modülü) de yukarıda belirtilen şekilde hesaplanır.

figure-results-1
Şekil 1: Retina izolasyonu için bir fare gözü üzerinde yapılan kesi kesiminin şematik gösterimi. Optik siniri tutmak için cımbız kullanılarak, fare retinasını lensten ve ön kamaradan ayırmak için limbusun arkasında tam bir kesi yapmak için bir neşter kullanılır. Mor kesikli çizgi, dikey insizyonun yerini gösterir. Bu şema, bilimsel bir görüntü ve illüstrasyon yazılımı kullanılarak çizilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: AFM ölçümü için sağlam fare retina damarlarının izolasyonu için protokol optimizasyonu. (A) Stereoskop görüntüsü, kılcal izolasyon adımlarından önce hafifçe sabitlenmiş bir fare gözünden izole edilmiş sağlam bir retinayı göstermektedir. Ölçek çubuğu: 2 mm. (B) 4x büyütmede temsili faz kontrast görüntüleri, farklı izolasyon yöntemleri kullanılarak elde edilen fare retina damarlarını gösterir. İzole edilen damarların yapısal bütünlüğü ve dayanıklılığı karşılaştırıldığında, 4 ° C'de 24 saat boyunca% 5 formalin içinde sabitlenmiş enükleasyonlu gözlerden retinaların tripsin sindiriminin AFM sertliği ölçümü için en uygun retina vaskülatürünü verdiği bulundu. Bu yöntem kullanılarak izole edilen retina damarları, cam yüzey boyunca düzgün bir şekilde yayılan berrak bir vasküler ağ sergiledi. Ölçek çubuğu: 500 μm. (C) (B)'de gösterilene benzer şekilde, sağlam bir retina kılcal damar ağının yüksek büyütmeli (20x) görünümü, hafif sabit gözlerden elde edilen kılcal damarların yüksek yapısal bütünlüğünü doğrular. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakam4'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Birincil insan ve fare REC kültürlerinden elde edilen hücreden arındırılmış matrisler. (A) İnsan veya fare REC'lerinin 10 günlük (10 gün) veya 15 günlük (15 gün) kültürlerinin hücreden arındırılmasını takiben cam lameller üzerinde subendotelyal matris agregalarını gösteren 20x büyütmeli temsili faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 μm. (B) 15 günlük insan REC kültürlerinden elde edilen ve anti-kollajen IV ve anti-fibronektin antikorları ile etiketlenmiş hücreden arındırılmış matrislerin temsili yüksek büyütmeli (100x) konfokal floresan görüntüleri, yoğun bir nanofibriller kollajen IV ortaya koymaktadır ve fibronektin matrisi. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Fare retina kılcal damarlarının AFM sertlik ölçümünden kuvvet mesafesi eğrileri. Çizgi grafikler, (A) diyabetik olmayan veya (B) diyabetik bir fareden izole edilen bir fare retinal kılcal damarının bir yerinde tek bir kuvvet girinti ölçümünden temsili bir yaklaşım (açık renk) ve geri çekme (koyu renk) eğrisini gösterir. Bir SAA-SPH 1 μm yarıçaplı yarım küre konsol probu kullanılarak elde edilen kuvvet eğrileri, konsol-numune mesafesi (z-piezo tarafından kontrol edilir) ile konsol sapmasına neden olan uygulanan dikey kuvvet arasındaki ilişkiyi çizer. (A) Sarı ok, numuneye doğru z-piezo tahrikli konsol yaklaşımını, beyaz ok, konsol probunun numune ile temas ettiği temas noktasını ve yeşil ok, bir ayar noktası (tepe) girinti kuvvetine (*) kadar konsol sapmasını gösterir. (B) Diyabetik farelerden izole edilen bir retinal kılcal damardan elde edilen hem yaklaşım hem de geri çekilme eğrileri, diyabetik olmayan muadillerinden (A'da gösterilmiştir) belirgin şekilde daha dik bir eğim sergiler, bu da diyabetik farelerde daha yüksek kılcal sertliği gösterir. Ok ucu, taban çizgisinin altındaki geri çekme eğrisinde bir düşüşü gösterir ve bu, girinti sırasında prob ile numune arasındaki yapışmanın neden olduğu konsol probunun negatif sapmasını yansıtır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM, aort ve arterler gibi daha büyük damarların sertliğindeki hastalığa bağlı değişiklikleri ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır16. Bu bulgular, ateroskleroz17 gibi kardiyovasküler komplikasyonlarda endotelyal mekanobiyolojinin rolünün belirlenmesine yardımcı olmuştur. Bu bulgulara dayanarak, erken DR'de retinal mikrovasküler lezyonların gelişiminde endotelyal mekanobiyolojinin daha önce tanınmayan rolünü araştırmaya başladık. Bununla birlikte, bu arayıştaki başarı, retina kılcal sertliğinde diyabetin neden olduğu değişikliklerin doğru ölçümüne dayanır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, büyük damarlara benzer şekilde, retina kılcal damarlarının sertliğinin ve retinal EC tarafından salgılanan subendotelyal matrisin de AFM 4,5,6 kullanılarak doğrudan, doğru ve güvenilir bir şekilde ölçülebileceğini ortaya koymuştur.

Bu yaklaşım, tripsin sindirimi kullanılarak fare retina kılcal damarlarının hafif sabit gözlerden izole edilmesini içerir. Deneyime dayanarak, sabitlenmemiş gözlerden izole edilen kılcal damarlar (hipotonik yöntem kullanılarak) kırılgan olduğundan ve parçalandığından, bu da onları AFM sertlik ölçümü için uygun olmayan hale getirdiğinden, bu hafif sabitleme adımı gereklidir4. Tersine, diğer retinal tripsin sindirim protokolü18'de bildirilen daha güçlü fiksasyon ve bunun sonucunda ortaya çıkan kapsamlı tripsin sindirimi ihtiyacı, sıkı bağlantıların bozulmasıyla değerlendirildiği gibi kılcal yapısal bütünlüğü de tehlikeye atabilir. Bu nedenle, burada kullanılan hafif kılcal fiksasyon ve nazik tripsin sindirimi, aşırı formalin kaynaklı çapraz bağlamadan kaynaklanan sertlik artefaktlarını azaltmaya yardımcı olur ve güvenilir AFM sertlik ölçümü için kılcal damarların yapısal bütünlüğünü sağlar.

Alternatif bir yaklaşım olarak, yakın zamanda yapılan bir çalışmada, hafifçe sabitlenmiş retinal düz yuvalardan retina kılcal damarlarının AFM sertliği ölçümü bildirilmiştir19. Bu yaklaşım, sağlam retina içindeki retina kılcal damarları üzerinde AFM kuvvet girintileri gerçekleştirerek, yerinde sertlik ölçümünü mümkün kılar. Bununla birlikte, bu kılcal sertlik ölçümleri muhtemelen iç sınırlayıcı zarın sertliğini içerir. Ayrıca, bu yaklaşım, özellikle erken DR20'de etkilenen daha derinde yatan kılcal pleksusu dışarıda bırakırken, retinal düz bir montajda erişilebilen yalnızca yüzeysel kılcal damarların ölçümü ile sınırlıdır. Bu sorunlar, tüm retina katmanlarından damarları temiz bir şekilde (artık retina dokusundan yoksun) çıkaran bu yaklaşım kullanılarak ele alınabilir. Şu anda bu protokolü, koroid damarlarını erken AMD'nin hayvan modellerinden izole etmek için optimize ediyoruz. Bununla birlikte, protokolde kullanılan hafif formalin fiksasyonunun AFM ölçümlerinde çapraz bağlanma ile ilişkili bir sertleşme artefaktına neden olabileceğinin farkındayız. Bu nedenle, bu yaklaşım kullanılarak elde edilen vasküler sertlik değerlerini, mutlak sertlikten ziyade sertlikteki nispi değişiklikler (farklı deney grupları arasında) açısından yorumlamak ihtiyatlı olacaktır.

Hafif fiksasyon gerektiren retinal kapillerlerin aksine, retinal EC kültürlerinden elde edilen subendotelyal matriks herhangi bir değişiklik yapılmadan değerlendirilebilir. Bu, büyük ölçüde, kültür ortamına askorbik asit ilavesi (kollajen sentezini15 artıran), hücre dışı bırakma sırasında matris ayrılmasını önleyen cam lamellerin kimyasal modifikasyonu ve uzun süreli kültür süresi (10-15 gün) dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin bir kombinasyonundan kaynaklanan biriken matrisin sağlamlığından kaynaklanmaktadır. Daha da önemlisi, in vitro olarak görülen subendotelyal matriks sertliğindeki hiperglisemiye bağlı artışın, in vivoolarak görülen retinal kılcal damar sertliğinde diyabete bağlı artışla tutarlı olduğunu gösterdik 4. Matris sertliğindeki bir artışın, birlikte genel kılcal sertliği artıran üstteki retinal EC'lerin sertliğini (mekanik karşılıklılık nedeniyle) artırması beklendiğinden, bu şaşırtıcı değildir. Gerçekten de, yakın zamanda retinal EC'lerin diyabetik koşullar altında büyüdüğünde daha sert hale geldiğinigösterdik 4, muhtemelen Rho / ROCK'a bağlı aktin hücre iskeleti gerginliğindeki21 bir artış yoluyla. Bu bulgular aynı zamanda, erken AMD'nin rhesus maymun modelinde görülen koroidal EC sertleşmesinin, devam eden çalışmalarda test edilmekte olan bir fikir olan koroidal subendotelyal matris ve sağlam damarların12 artan sertliğini yansıttığını ima etmektedir. Genel olarak, sabitlenmemiş retinal subendotelyal matriks ve EC'lerdeki sertlik değişikliklerinin, hafif sabit sağlam retinal damarlarda görülen eğilimi yansıtması, hafif fiksasyon yaklaşımının geçerliliğini kanıtlamaktadır.

DR'nin hayvan modellerinden retina kılcal damarlarının doğrudan sertlik ölçümü, yalnızca DR yönetimi için yeni bir terapötik hedef olarak endotelyal mekanobiyolojinin oluşturulmasına yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda gelecekte DR hastalarında retina kılcal sertliğinin non-invaziv değerlendirmesi için yeni hassas görüntüleme teknikleri geliştirmek için güçlü bir gerekçe sağlar. Bu tür noninvaziv teknikler, diyabetin neden olduğu kardiyovasküler hastalıklarda yaygın olarak tespit edilen arteriyel nabız dalga hızındaki değişikliklere benzer şekilde, kılcal damar sertleşmesinden kaynaklanması beklenen kan akışındaki ince değişiklikleri potansiyel olarak tespit edebilir. Diyabetik donörlerden alınan post-mortem insan gözünden izole edilen retina kılcal damarlarının AFM sertlik ölçümleri bu konuda önemli bir kavram kanıtı sağlayacaktır. Tip 1 diyabet4'ün (streptozotosin) fare modelinde retina kılcal sertliğinin erken dönemde arttığı göz önüne alındığında, AFM'nin sertlik ölçen görüntüleme modalitelerinin doğrulanmasında başarılı kullanımı, erken DR patogenezi için klinik bir biyobelirteç olarak retina kılcal sertliğinin tanımlanmasına yol açabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü/NIH hibe R01EY028242 (K.G.'ye), Körlüğü Önleme Araştırmaları/Uluslararası Retina Araştırma Vakfı AMD için Yenilikçi Araştırma Yaklaşımları Katalizör Ödülü (K.G.'ye), Stephen Ryan Makula Araştırmaları Girişimi (RIMR) W.M. Keck Vakfı'ndan (Doheny Göz Enstitüsü'ne) Özel Hibe ve Ursula Mandel Bursu ve UCLA Lisansüstü Konseyi Çeşitlilik Bursu (IST'ye) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Research to Prevent Blindness, Inc.'den UCLA Oftalmoloji Bölümü'ne Sınırsız Hibe ile desteklenmiştir. Bu makaledeki içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Retinal Kılcal İzolasyon< / güçlü >
0.22 ve mikro; m PVDF şırınga filtresiMerck MilliporeSLGVM33RSDüşük Protein Bağlayıcı Durapore
10X Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Serum Kalsiyum % magnezyum içermezCorning20-031-CVNihai konsantrasyon 1X, pH 7.4
12 oyuklu plakaFalcon Corning353043
15 mL santrifüj tüpüCorning430791Rnaz-Dnaz içermez, Pirojenik Olmayan
20 mL Luer-Lok TIP şırıngaBD302830
5 3/4 inç Tek Kullanımlık Borosilikat Cam / Steril Olmayan Pastör pipetiFisherBrand13-678-20A
60x15 mm Doku Kültürü KabıFalcon Corning353002
6 oyuklu plakaFalcon Corning353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL KalemBilimsel Cihaz Laboratuvarı9804-02
Bıçak tutucuX-ACTO
Karbon Çelik Cerrahi Bıçak # 10Bard-Parker371110
Dental BalmumuElektron Mikroskobu Bilimleri50-949-027
Diseksiyon mikroskobu-scope
Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10Millipore SigmaHT501128-4LNihai konsantrasyon %5 (h/h)
Kimwipes - silecek mendiliKimtech Science34133
Mikro spatulaGüzel Bilim Araçları10089-11
Orbital ShakerLab GeniusSK-O180
PELCO Ekonomi #7 Paslanmaz Çelik 115mm  CımbızTed Pella, Inc.5667
Faz kontrast mikroskobuNikon TS2
Arıtıcı Mantık+ Sınıf II, Tip A2 Biyogüvenlik KabiniLabconco302380001
Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri 2 mLEppendorf22363352
StereoskopAmScopeSM-3 Serisi Zoom Trinoküler Stereomikroskop 3.5X-90X
Superfrost Plus mikroskopi slaytı - Beyaz sekme - Ön temizlenmiş - 25x75x1.0 mmFisherBrand1255015
Tris Tamponu, 0.1M çözelti, pH 7.4 -Tripsin çözeltisi içinVWRE553-500ML
Tripsin 1:250 toz Doku Kültürü SınıfVWRVWRV0458-25G%10 (a/h) tripsin çözeltisi
Su Moleküler Biyoloji SınıfCorning46-000-CM
Subendotelyal Matris< / güçlü >
10X PBSCorning20-031-CV
Kalsiyum ve magnezyum ile 1X PBSThermo Fisher Scientific14040-117pH 7.4
Amonyum hidroksitSigma-Aldrich338818
Askorbik AsitSigma-AldrichA4034
Kollajen IV antikorNovus BiyolojiklerNBP1-26549
DNase IQiagen79254
EtanolaminSigma-Aldrich398136
Fibronektin antikoruSigma-AldrichF6140
FloromountInvitrogen-Thermo Fisher Scientific00-4958-02
JelatinSigma-AldrichG1890
Cam lameller (12mm)Fisher12-541-000
GlutaraldehitElektron mikroskobu Sciences16220
İnsan retinal endotel hücreleri (HREC)Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131 ortaCorning15-100-CV
Fare retinal endotel hücreleri (mREC)Cell BiologicsC57-6065
Triton X-100Thermo Fisher Scientific  BP151-100
TripsinGibco-Thermo Fisher Scientific25200-056
AFM Ölçümü< / güçlü>
1 ve mikro; m ProbBrukerSAA-SPH-1UM1
mikron uç yarıçaplı 19 mikron boyunda yarım küre prob, Yay sabiti 0.25N/m
70 nm LC probuBrukerPFQNM-LC-V270nm uç yarıçaplı 19 mikron boyunda yarım küre prob,
  Yay sabiti 0.1N/m
  kameraXCAM ailesiToupcam1080P HDMI
Masaüstü kamerayı çalıştırmak içinAsus Asus masaüstüIntel i5-6600 CPU, 8GB RAM
Lamel için çanak tutucuCellvisD29-14-1.5-N29mm cam alt tabak ile
  14 mm mikro kuyu
Nanowizard 4BrukerNanowizard 4Yumuşak biyolojik numunelerin mekanoyapısal özelliklerinin (sertlik ve topografya) hassas ölçümü için optik mikroskop üzerine monte edilmiş Bioscience atomik kuvvet mikroskobu
Faz kontrast mikroskopuZeissAxiovert 20010X objektifli ters mikroskop
Biyoteknoloji Sınıfı pH 8

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).
  2. Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy. Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).
  3. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  4. Chandrakumar, S., et al. Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes. Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).
  5. Chandrakumar, S., et al. Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes. Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).
  6. Yang, X., et al. Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes. FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).
  7. Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology. Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).
  8. Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic. Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).
  9. Ghosh, K., Ingber, D. E. Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).
  10. Yang, X., et al. Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).
  11. Cabrera, A. P., et al. Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).
  12. Cabrera, A. P., et al. Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration. J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).
  13. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).
  14. Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. (76), e50489(2013).
  15. Beacham, D. A., et al. Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts. Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).
  16. Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy. J Vis Exp. (116), e54630(2016).
  17. Huynh, J., et al. Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration. Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).
  18. Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature. Microvasc Res. 154, 104682(2024).
  19. Chaqour, B., et al. Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1. Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).
  20. Ashraf, M., et al. Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).
  21. Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy. FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K lcal Damar Sertli iDiyabetik RetinopatiVask ler SertlikRetinal Damar zolasyonuFaz Kontrast MikroskobuDesel larizasyon TamponuKollajen D rt Matrisi

İlgili makaleler