Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Hipoksik HT22 Hücrelerinde AMPK/Sirt1/HIF-1α Yolu ile Salidrosid'in Mitokondriyal Korumasına İlişkin Mekanistik Bilgiler

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66923

⸱

25 Nisan 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Service Office, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, salidrositin hipoksik HT22 hücreleri üzerinde, kısmen AMPK / Sirt1 / HIF-1α yolu yoluyla mitokondriyal koruyucu etkiler uyguladığı benzersiz bir mekanizma tanımlamıştır.

Özet

Rhodiola crenulata'nın (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba'nın aktif bir bileşeni olan Salidrosid (Sal), hipoksik koşullar altında metabolizmayı iyileştirerek ve beyin hücrelerinin enerji arzını artırarak mitokondriyal koruyucu etkiler gösterdiği bulunmuştur. Bununla birlikte, etki mekanizması tam olarak açıklığa kavuşturulmamıştır. Bu çalışmada, Sal'ın nükleotid (ATP, ADP ve AMP) seviyeleri üzerindeki etkilerini analiz etmek için ilk olarak yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılmıştır. Farklı türlerdeki hücrelerde ve dokularda ilaç hedef katılımını doğrulamak ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir moleküler etkileşim yöntemi olan hücresel termal kayma testi (CETSA), daha sonra Sal'ın AMPK/Sirt1/HIF-1α yolu ile ilgili proteinler için afinitesini doğrulamak için seçildi. Sonuçlar, Sal'ın hipoksik HT22 hücrelerinde ATP ve ADP seviyelerini arttırdığını, AMP seviyelerini ise azalttığını ortaya koydu. Ayrıca Sal, AMPKα, p-AMPKα, Sirt1 ve HIF-1α proteinlerine stabil bağlanma sergiledi. Sonuç olarak, Sal, nükleotid içeriğini düzenlemek için AMPK/Sirt1/HIF-1α yolunu modüle ederek mitokondriyal koruyucu etkiler uygulayabilir. Bu çalışma, hücre örneklerinde nükleotid içerik analizi için metodolojik bir referans sağlar ve geleneksel Çin tıbbından türetilen bileşikler için hedeflerin belirlenmesine ve keşfedilmesine katkıda bulunur.

Giriş

Beyin, yüksek metabolik talepleri, sınırlı glikolitik kapasitesi ve oksidatif fosforilasyona bağımlılığı nedeniyle oksijene karşı oldukça hassastır. Sonuç olarak, yüksek irtifalarda düşük oksijenli bir ortama maruz kalmak kolayca hipobarik hipoksik beyin hasarına (HHBI) yol açabilir1,2. Epidemiyolojik çalışmalar, yüksek irtifalara alışkın olmayan bireyler hızlı bir şekilde yüksek rakımlı bölgelere çıktıklarında, akut dağ hastalığı insidansının %75'e kadar çıkabileceğini ve ciddi vakalar için ölüm oranının yaklaşık %1 olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tıbbi bakımın yokluğunda, yüksek irtifa serebral veya pulmoner ödem için ölüm oranları %40'a kadar çıkabilir3,4.

HHBI, geniş bir klinik semptom spektrumu ile kendini gösterir. Hafif ila orta dereceli vakalar baş ağrısı, baş dönmesi ve hafıza kaybınıiçerebilirken 5, ciddi vakalar bilişsel bozulmaya, bilinç değişikliğine ve potansiyel olarak ölümcül sonuçlara neden olabilir5. Yüksek rakımlı bölgelerde HHBI'nin önlenmesi ve tedavisi, tıbbi araştırmaların önemli bir odak noktası haline gelmiştir. Önleyici stratejiler öncelikle yeterli dinlenme, dengeli beslenme, doğru beslenme ve uygun fiziksel egzersiz dahil olmak üzere yüksek irtifa ortamlarında uyarlanabilir eğitimi içerir 6,7. Ek olarak, beyin hücrelerini korumayı ve serebral hipoksiyi hafifletmeyi amaçlayan farmakolojik müdahaleler, mevcut HHBI araştırmalarının merkezinde yer almaktadır.

Mitokondri, hücresel enerji taleplerini karşılamak için adenozin trifosfat (ATP) sentezleyerek hücreler içinde birincil enerji üretim merkezleri olarak hizmet eder. Hipoksik koşullar altında, mitokondriyal enerji üretimi azalır, bu da ATP seviyelerinin azalmasına ve hücre fonksiyonunun bozulmasına neden olur8. Hipoksik yaralanma ayrıcaCa2+ ve pH homeostazının mitokondriyal regülasyonunu bozarak apoptoz ve nekrozutetikler 9,10. Mitokondriyal disfonksiyon ile hipoksik beyin hasarı arasında karşılıklı olarak güçlendirici bir ilişki vardır. Bir yandan, hipoksinin neden olduğu mitokondriyal bozukluk, hücresel enerji metabolizmasını daha da azaltarak oksijen eksikliğini şiddetlendirir ve bir kısır döngü yaratır. Öte yandan, mitokondriyal disfonksiyon hücre içi Ca2+ seviyelerini yükseltir, apoptotik kaskadları aktive eder ve hücre ölümüneyol açar 11. Hipoksik beyin hasarının altında yatan mekanizmalar karmaşık kalmasına ve tam olarak anlaşılamamış olmasına rağmen, çok sayıda çalışma, bozulmuş nöronal mitokondriyal enerji metabolizmasını patogenezinde kritik bir faktör olarak tanımlamıştır12,13. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonun daha fazla araştırılması, hipoksik beyin hasarı için potansiyel terapötik hedefler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Salidroside (Sal), plato bitkisi Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba'dan ekstrakte edilen aktif bir bileşendir ve gıda, sağlık ürünleri ve eczacılıkta yaygın olarak kullanılmaktadır14. Sal'ın moleküler formülü C14H20O7'dir ve aynı zamanda 2- (4-hidroksifenil) -etil β-D-glukopiranozit olarak da bilinir. Anti-hipoksi, antioksidan, anti-yorgunluk, anti-tümör, immünomodülatör, anti-inflamatuar ve kardiyovasküler ve serebrovasküler koruyucu etkiler dahil olmak üzere çeşitli farmakolojik özelliklere sahiptir 15,16,17. Bunlar arasında, anti-hipoksi etkisi en iyi belgelenenlerden biridir. Son çalışmalar, farelerde plato kaynaklı beyin hasarı üzerindeki önleyici ve terapötik etkileri için potansiyel bir mekanizma olarak Sal'ın önemli mitokondriyal koruyucu etkilerini giderek daha fazla vurgulamıştır14,18. Bununla birlikte, Sal'ın ATP, ADP ve AMP seviyelerini etkilediği kesin moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır.

AMP ile aktive olan protein kinaz (AMPK), hücresel enerji homeostazının korunmasına yardımcı olan önemli bir enerji sensörü görevi görür. AMPK'nın aktivasyonu Sirtuin 1'i (Sirt1) uyararak hücre içi NAD + seviyelerinde19 bir artışa yol açar. Çalışmalar, Sirt1'in hipoksi20'ye hücresel yanıtı koordine etmek için hipoksi ile indüklenebilir faktör 1-alfa'yı (HIF-1α) düzenleyebildiğini göstermiştir. Önceki araştırmalar, Sal'ın nöronal mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneğinin açılmasını engellediğini, HIF-1α aracılı mitokondriyal enerji süreçlerini düzenlediğini, nöronal apoptozu zayıflattığını ve kan-beyin bariyeri bütünlüğünü koruduğunu, böylece sıçanları plato kaynaklı beyin hasarından koruduğunu göstermiştir14,21. Bununla birlikte, Sal'ın ATP ve metabolitleri, ADP ve AMP üzerindeki etkisi belirsizliğini korumaktadır.

Bunu araştırmak için, bu üç nükleotidin seviyelerini ölçmek için ilk olarak yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanıldı. Ek olarak, sağlam hücrelerde22 ligand-protein etkileşimlerini incelemek için 2013 yılında tanıtılan yaygın olarak kullanılan bir biyofiziksel teknik olan hücresel termal kayma testi (CETSA) kullanılmıştır. Bu yöntem, farklı türlerdeki hücrelerde ve dokularda ilaç hedefi etkileşimini doğrulamak ve ölçmek için yaygın olarak uygulanır. Spesifik olarak, hedef hücre lizatlarının ilaçla belirli bir süre boyunca değişen sıcaklıklarda birlikte inkübe edilmesinden sonra, ilaca bağlı protein, artan termal stabilite sergiler, bu da onu denatürasyon ve çökelmeye daha az eğilimli hale getirir. Çökeltilmiş bağlanmamış proteinler daha sonra santrifüjleme yoluyla uzaklaştırılır ve ilaç-hedef etkileşimleri daha sonra süpernatant22'nin western blot analizi yoluyla tanımlanır. Sal'ın potansiyel moleküler hedeflerini belirlemek için, AMPK/Sirt1/HIF-1α yolu ile ilgili proteinlerle bağlanma afinitesini değerlendirmek için CETSA seçildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların ticari detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Çözelti hazırlama

  1. % 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ekleyerek tam Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamını (DMEM) hazırlayın.
  2. 3 mg Sal'ı 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözerek 20 mM'lik bir Sal çözeltisi hazırlayın21.
  3. 0,45 μm organik membran kullanarak 500 mL kromatografik olarak saf asetonitril (mobil faz A) süzün.
  4. 1 L deiyonize suya 3,5 mL reaktif I ekleyerek 1000 mL mobil faz B hazırlayın. Nükleotid (ATP, ADP ve AMP) içerik tahlil kitinin talimatlarını izleyerek pH'ı reaktif II ile 6.15'e ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Reaktif I ve reaktif II, nükleotid (ATP, ADP ve AMP) içerik tahlil kitine dahildir.
  5. 0,22 μm sulu membran kullanarak mobil faz B'yi filtreleyin.
    NOT: Mobil faz B, hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır. Mobil faz A ve B, hava kabarcıklarını gidermek için kullanmadan önce 30 dakika boyunca sonikleştirilmelidir.
  6. 0.5 μM, 0.1 μM, 0.05 μM, 0.01 μM ve 0.005 μM ATP, ADP ve AMP serisi standart çözeltiler elde etmek için 1 μM ATP, ADP ve AMP standart stok çözeltisini deiyonize su ile seyreltin.
  7. 0,22 μm iğne tipi mikro gözenekli filtre membranı kullanarak standart çözelti serisini filtreleyin.
    NOT: Seri standart çözeltileri saklamak için kahverengi enjeksiyon şişeleri kullanılmalıdır. Hazırlanan standart çözelti serisi mümkün olan en kısa sürede kullanılmalıdır.

2. Hücre kültürü

NOT: HT22 hücre kültürü ve CoCl2 ile uyarılan hipoksi modeli, önceki bir raporagöre kurulmuştur 21.

  1. HT22 hücrelerini 37 ° C'de% 5 CO2 ile% 80 olana kadar Petri kabında kültür birleşimine ulaşılır. Hücreleri 1 dakika boyunca% 0.25 tripsin ile sindirin.
  2. Tohum 2 × 105 hücreleri, adım 2.1'den tam DMEM (ilaç tedavisi olmayan kontrol grubu) veya ilacı içeren tam DMEM (250 μM CoCl2, 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor, 250 μM CoCl2 + 20 μM Sal ve 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor + 20 μM Sal) ile 6 oyuklu plakalara yerleştirin. % 5 CO2 ile 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
    NOT: Her grupta üç paralel örnek oluşturulmuştur.

3. Nükleotid (ATP, ADP ve AMP) içerik analizi

  1. Adım 2.2'den itibaren 6 oyuklu plakalardaki her bir oyuka 1 mL ekstraksiyon reaktifi I ekleyin.
    NOT: Ekstraksiyon reaktifi I, nükleotid (ATP, ADP ve AMP) içerik tahlil kitine dahildir (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Ultrasonik hücre bozulma aparatı kullanarak bir buz banyosunda sonikasyon yaparak hücreleri parçalayın (güç: 300 W, 3 sn için ultrasonik dalgalar, 7 s aralık, toplam süre: 3 dakika).
  3. Parçalanmış hücreleri 10.304 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca yüksek hızlı soğutmalı bir santrifüj kullanarak santrifüjleyin.
  4. Adım 3.3'ten 0.75 mL süpernatanı 2.0 mL'lik bir tüpe aktarın. 0.75 mL ekstraksiyon reaktifi II ekleyin, bir vorteks karıştırıcı kullanarak çalkalayın ve karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.304 × g'da tekrar santrifüjleyin.
    NOT: Ekstraksiyon reaktifi II, nükleotid (ATP, ADP ve AMP) içerik tahlil kitine dahildir.
  5. Süpernatanı adım 3.4'ten pipetleyin ve 0.22 μm iğne tipi mikro gözenekli filtre membranı kullanarak kahverengi bir şişeye süzün.
    NOT: Ekstrakte edilen numunedeki ATP, ADP ve AMP kararlı değildir. Tüm deneysel prosedürler düşük sıcaklıklarda veya buz üzerinde yapılmalıdır. Numuneler mümkün olan en kısa sürede işlenmeli ve test edilmelidir.
  6. Kromatografi yazılımını açın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: enjeksiyon hacmi: 10 μL; sütun sıcaklığı: 27 °C; akış hızı: 0.8 mL / dak; algılama dalga boyu: 254 nm; Algılama süresi: 70 dk. Gradyan elüsyon prosedürünü Tablo 1'e göre ayarlayın.
  7. Örneği otomatik olarak enjekte etmek ve adım 3.6'da ayarlanan programa göre seri standart çözümlerde (adım 1.7) ve örnek çözümlerde (adım 3.5) ATP, ADP ve AMP içeriğini algılamak için yürüt düğmesine tıklayın.
    NOT: Deneyin sonunda, tıkanmayı önlemek için kromatografik sütunu %98 mobil faz B ile yıkayın.
  8. ATP, ADP ve AMP'nin standart eğrilerini, grafik ve istatistiksel analiz yazılımı kullanarak, x ekseninde seri standart konsantrasyonlar ve y ekseninde tepe alanları ile çizin.
  9. Adım 3.8'deki standart eğri denklemini kullanarak örneklerdeki ATP, ADP ve AMP içeriğini hesaplayın.

4. Hücresel termal kayma deneyi (CETSA)

  1. Hücreleri tekrar tekrar pipetleyerek proteaz inhibitörü içeren lizat (lizat: proteaz inhibitörü = 100:1) kullanarak bir Petri kabında normal HT22 hücrelerini 20 dakika boyunca parçalayın.
    NOT: Protein bozulmasını önlemek için bu adımı bir buz banyosunda gerçekleştirin.
  2. Hücre lizatını adım 4.1'den toplayın ve bir ultrasonik hücre bozulma aparatı kullanarak bir buz banyosunda sonikat yapın (güç: 300 W, 3 sn için ultrasonik dalgalar, 7 s aralık, toplam süre: 3 dakika). 10.304 × g'da, 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
    NOT: Süpernatanı 14 parçaya bölün: Sal ile madeni para için 7 grup ve kontrol olarak PBS ile madeni para kuşağı için 7 grup. Sal ile muamele edilen grup için, numune başına 100 μL süpernatan ve 0.1 μL 20 μM Sal ekleyin. Kontrol grubu için, numune başına 100 μL süpernatan ve 0.1 μL PBS ekleyin.
  3. Her numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından metal bir ısıtma sıcaklık kontrol cihazı kullanarak 37 °C, 42 °C, 47 °C, 52 °C, 57 °C, 62 °C ve 67 °C'de 3 dakika inkübe edin.
  4. Adım 4.3'ten itibaren numuneleri 10.304 × g'da 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet kullanarak toplayın.
  5. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir BCA protein konsantrasyonu test kiti kullanarak adım 4.4'ten süpernatantın toplam protein konsantrasyonunu ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
  6. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir PAGE jel hızlı hazırlama kiti kullanarak %10 ayırma jeli hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
  7. Ayırma jelinin kuyucuklarına 3 μL önceden boyanmış renkli protein işaretleyicisi ve 14 μL numune yükleyin (oyuk başına nihai protein miktarı: 20 μg).
  8. Ayrılmış proteinleri elde etmek için jeli 80-100 mV'de 1 saat boyunca elektroforez tamponu kullanarak çalıştırın.
  9. Proteinleri adım 4.8'den hızlı membran transfer çözeltisi ve 30 dakika boyunca 400 mA'da bir sandviç yapı (pamuk-filtre kağıdı-PVDF membran-protein jel-filtre kağıdı-pamuk) kullanarak bir PVDF membranına aktarın.
  10. PVDF membranlarını oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca% 5 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi ile adım 4.9'dan bloke edin.
    NOT: 5 mg BSA tozunu 100 mL TBS tamponu ve% 0.05 Tween 20 içeren 100 mL TBST çözeltisi içinde çözerek% 5 BSA çözeltisi hazırlayın.
  11. PVDF membranlarını step 4.10'dan itibaren gece boyunca 4 ° C'de 5 mL seyreltilmiş primer antikor ile inkübe edin.
    NOT: Primer antikoru BSA çözeltisi (1:1000 oranında) içinde seyreltin.
  12. Bağlanmamış primer antikorları çıkarmak için PVDF membranlarını TBST ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  13. Adım 4.12'den itibaren zarları seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (HRP) ile bağlı ikincil antikor ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca bir renk giderme çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
    NOT: HRP'ye bağlı ikincil antikoru BSA çözeltisinde (1: 10.000 oranında) seyreltin.
  14. Artık ikincil antikoru çıkarmak için membranları TBST ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  15. Adım 4.14'ten itibaren zarları ECL kemilüminesans geliştiricisi ile kaplayın, ardından bir görüntüleme sistemi kullanarak hedef protein sinyalini görüntüleyin.
    NOT: Floresan söndürmeyi önlemek için bu adımı karanlıkta gerçekleştirin.
  16. ImageJ yazılımını kullanarak hedef proteinlerin gri değerini analiz edin ve miktarını belirleyin (bkz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

HPLC tarafından tespit edilen ATP, ADP ve AMP için standart eğriler sırasıyla Y = 7006.5X - 222.99, Y = 5217.3X - 17.796 ve Y = 9280.1X + 22.749 idi (Şekil 1A-C). Her grupta HPLC ile ölçülen nükleotid içerikleri standart eğriler kullanılarak hesaplandı (Şekil 1D-I). CoCl2'nin HT22 hücrelerinde ATP ve ADP düzeylerini kontrol grubuna göre anlamlı derecede azalttığı bulundu (P &...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mitokondri, HHBI 23,24,25'in terapötik önlenmesinde rol oynayan anahtar organellerdir. Grup tarafından yapılan önceki çalışmalar, Sal'ın AMPK, Sirt1 ve HIF-1α protein ekspresyonunu düzenlediğini, nöronal mitokondriyal fonksiyonu geliştirdiğini ve HHBI21,24'e karşı koruma sağladığını doğrulamıştır. Bununla birlikte, Sal'ın hipoksik hücrel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82274207 ve 82474185), Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı (2024NSFSC1845), Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı Gençleri için Bilim Vakfı (2023NSFSC1776), Ningxia Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2023BEG02012), Çin Çin Tıbbı Derneği'nin 2024-2026 (2024-QNRC2-B07) için Genç Yetenek Destek Projesi ve Xinglin Scholar Research tarafından desteklenmiştir TCM Chengdu Üniversitesi'nin (XKTD2022013 ve QJJJ2024027) Tanıtım Projesi.

YAZAR KATKISI:
Xiaobo Wang, Yating Zhang, Ya Hou, Rui Li ve Xianli Meng bu projeyi tasarladı. Yating Zhang, Ya Hou ve Tingting Kuang deneyleri gerçekleştirdi ve verileri analiz etti. Yating Zhang ve Hong Jiang el yazmasını yazdı. Xiaobo Wang ve Xianli Meng el yazmasını gözden geçirdi. Tüm yazarlar son makaleyi okumuş ve onaylamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetonitrilAladdinA104440
0.22 ve mikro; m sulu membranJintengJTMF0445
0.22 &mikro; m iğne tipi mikro gözenekli filtre membranıJintengJTSFM013001
0.45 &mikro; m organik membranJintengJTMF0448
Agilent OpenLab yazılımı   AgilentVersiyon 2.X
Antikoru-AMPK ve alfa;Hücre Sinyal Teknolojisi# 2532
Antikor-HIF-1 ve alfa;Hücre Sinyal Teknolojisi# 41560
Antikor-p-AMPK ve alfa;Hücre Sinyal Teknolojisi# 50081
Antikor-Sirt1Hücre Sinyal Teknolojisi# 2028
Antikor-β -aktinHücre Sinyal Teknolojisi# 4970
BCA protein konsantrasyonu test kitiBoster Biyolojik Teknoloji17E17B46
Sığır serum albüminiCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW127-02
Geniş spektrumlu fosfataz inhibitörü (100 kez;)Boster Biyolojik TeknolojiAR1183
Kromatografik kolonAgilentSB-C < sub>18 < / sub>
CoCl2< / sub>Sigma15862
Renk giderme çalkalayıcıKylin-BellTS-2
DorsomorfinMedChemExpress (MCE)HY-13418A
Dulbecco'nun modifiye kartalı ortaGibco8121587
Elektroforez tamponuNCM Biotech20230801
Fetal sığır serumuGibco2166090RP
Keçi Anti-tavşan IgG H & L (TRITC)ZenBioScience Co., Ltd.
GraphPad Prism yazılımıGraphPad yazılımı, LLCSürüm 9.0.0
Yüksek performanslı sıvı kromatografisiAgilent1260 Infinity II Prime 
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjThermo Fisher ScientificLegend Micro 17R
HRP konjuge affinipure keçi anti-tavşan IgG (H + L)Boster Biological Technology Co., Ltd.BA1054
HT22 hücreleriGuangzhou Jennio Biotech Co., Ltd.JNO-02001
Aşırı duyarlı ECL kemilüminesans kitiNCM BiotechP10300
Image J yazılımıUlusal Sağlık Enstitüleriv1.8.0
Metal ısıtma sıcaklık kontrol cihazıBaiwan Electronictechnology Co., Ltd.HG221-X3
MetanolAladdinM116118
Nükleotid (ATP, ADP ve AMP) içerik tahlil kitiBeijing Solarbio Science & Teknoloji Co., Ltd.BC5114
PAGE jel hızlı hazırlama kitiBiosharpPL566B-5
Penisilin-streptomisinNCM BiotechC125C5
Fosfat tamponlu salin (1 kez;)Gibco8120485
Önceden boyanmış renkli protein işaretleyici (10-180 kDa)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW176-02
Protein yükleme tamponu (5x)Boster Biyolojik TeknolojisiAR1112
PVDF (0.45 μ m)Cywin İnovasyon (Pekin) Biyoteknoloji Co., Ltd.SW120-01
Hızlı membran transfer çözümüCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW171-02
RIPA lizatBoster Biyolojik Technology Co., Ltd.AR0105
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.RFS-H0400191102
TBS tamponuNCM Biotech23HA0102
Transmembran tamponNCM Biotech23CA2000
Tripsin (% 0.25, 1 kez;)HyCloneJ210045
Tween 20Şanghay Canspec Bilimsel Aletler Co., Ltd.
Ultrasonik hücre bozulma aparatıNingbo Xinyi ultrasonik ekipman Co., Ltd.JY92-IIDN
Visionworks görüntüleme sistemiAnalytik JenaUVP ChemStudio
Vorteks karıştırıcıKylin-BellXW-80A
511202PM12012

Kaynaklar

  1. Marutani, E., Ichinose, F. Sulfide catabolism ameliorates hypoxic brain injury. Nat Commun. 12 (1), 3108(2021).
  2. Chen, X., Ma, W., Li, Y. Current situation of Chinese and Western medicine research on hypoxic brain injury at high altitude. Jilin Medical J. 43 (11), 3099-3101 (2022).
  3. Huo, Y., Zhao, A., Li, X., Li, J., Wang, R. Animal models of acute plateau disease. Chinese Pharmacol Bull. 37 (01), 26-30 (2021).
  4. Netzer, N., Strohl, K., Faulhaber, M., Gatterer, H., Burtscher, M. Hypoxia-related altitude illnesses. J Travel Med. 20 (4), 247-255 (2013).
  5. Lefferts, W. K., et al. Effect of hypoxia on cerebrovascular and cognitive function during moderate intensity exercise. Physiol Behav. 165, 108-118 (2016).
  6. Burtscher, J., Mallet, R. T., Burtscher, M., Millet, G. P. Conditioning the brain: From exercise to hypoxia. Exerc Sport Sci Rev. 49 (4), 291-292 (2021).
  7. Koester-Hegmann, C., et al. High-altitude cognitive impairment is prevented by enriched environment including exercise via VEGF signaling. Front Cell Neurosci. 12, 532(2019).
  8. Coimbra-Costa, D., Alva, N., Duran, M., Carbonell, T., Rama, R. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain. Redox Biol. 12, 216-225 (2017).
  9. Nair, S., et al. Neuroprotection offered by mesenchymal stem cells in perinatal brain injury: Role of mitochondria, inflammation, and reactive oxygen species. J Neurochem. 158 (1), 59-73 (2021).
  10. Rodríguez, M., Valez, V., Cimarra, C., Blasina, F., Radi, R. Hypoxic-Ischemic encephalopathy and mitochondrial dysfunction: facts, unknowns, and challenges. Antioxid Redox Sign. 33 (4), 247-262 (2020).
  11. Li, T., et al. Overexpression of apoptosis inducing factor aggravates hypoxic-ischemic brain injury in neonatal mice. Cell Death Dis. 11 (1), 77(2020).
  12. March-Diaz, R., et al. Hypoxia compromises the mitochondrial metabolism of Alzheimer's disease microglia via HIF1. Nature Aging. 1 (4), 385-399 (2021).
  13. Aabdien, A., Mallard, C., Hagberg, H. Mitochondrial dynamics, mitophagy and biogenesis in neonatal hypoxic-ischaemic brain injury. FEBS Lett. 592 (5), 812-830 (2018).
  14. Bai, X. L., Deng, X. L., Wu, G. J., Li, W. J., Jin, S. Rhodiola and salidroside in the treatment of metabolic disorders. Mini-Rev Med Chem. 19 (19), 1611-1626 (2019).
  15. Ji, R., et al. Salidroside alleviates oxidative stress and apoptosis via AMPK/Nrf2 pathway in DHT-induced human granulosa cell line KGN. Arch Biochem Biophys. 715, 109094(2022).
  16. You, L., Zhang, D., Geng, H., Sun, F., Lei, M. Salidroside protects endothelial cells against LPS-induced inflammatory injury by inhibiting NLRP3 and enhancing autophagy. BMC Complement Med. 21 (1), 146(2021).
  17. Yang, S. X., et al. Salidroside alleviates cognitive impairment by inhibiting ferroptosis via activation of the Nrf2/GPX4 axis in SAMP8 mice. Phytomedicine. 114, 154762(2023).
  18. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  19. Yang, H., et al. Black soybean peptide mediates the AMPK/SIRT1/NF-κB signaling pathway to alleviate Alzheimer's-related neuroinflammation in lead-exposed HT22 cells. Int J Biol Macromol. 286, 138404(2025).
  20. Yoon, H., Shin, S. H., Shin, D. H., Chun, Y. S., Park, J. W. Differential roles of Sirt1 in HIF-1α and HIF-2α mediated hypoxic responses. Biochem Bioph Res Co. 444 (1), 36-43 (2014).
  21. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  22. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nat Protoc. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  23. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. Eur J Pharmacol. 912, 174617(2021).
  24. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  25. Kristián, T. Metabolic stages, mitochondria and calcium in hypoxic/ischemic brain damage. Cell Calcium. 36 (3-4), 221-233 (2004).
  26. Carling, D. AMPK signalling in health and disease. Curr Opin Cell Biol. 45, 31-37 (2017).
  27. Steinberg, G. R., Hardie, D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev. Mol Cell Bio. 24 (4), 255-272 (2023).
  28. Zhang, N., et al. Restoration of energy homeostasis under oxidative stress: Duo synergistic AMPK pathways regulating arginine kinases. PLoS Genet. 19 (8), e1010843(2023).
  29. Wang, Y., et al. Irisin ameliorates neuroinflammation and neuronal apoptosis through integrin αVβ5/AMPK signaling pathway after intracerebral hemorrhage in mice. J Neuroinflamm. 19 (1), 82(2022).
  30. Liu, H., Li, Y., Xiong, J. The role of hypoxia-inducible factor-1 alpha in renal disease. Molecules. 27 (21), 7318(2022).
  31. Wu, H., et al. Mitochondrial dysfunction promotes the transition of precursor to terminally exhausted T cells through HIF-1α-mediated glycolytic reprogramming. Nat Commun. 14 (1), 6858(2023).
  32. Joo, H. Y., et al. NADH elevation during chronic hypoxia leads to VHL-mediated HIF-1α degradation via SIRT1 inhibition. Cell Biosci. 13 (1), 182(2023).
  33. Ham, P. B., Raju, R. Mitochondrial function in hypoxic ischemic injury and influence of aging. Prog Neurobiol. 157, 92-116 (2017).
  34. Dal Cortivo, G., Barracchia, C. G., Marino, V., D'Onofrio, M., Dell'Orco, D. Alterations in calmodulin-cardiac ryanodine receptor molecular recognition in congenital arrhythmias. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 127(2022).
  35. Wang, Z. Q., et al. Cyclovirobuxine D inhibits triple-negative breast cancer via YAP/TAZ suppression and activation of the FOXO3a/PINK1-Parkin pathway-induced mitophagy. Phytomedicine. 136, 156287(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Salidrosid Mitokondriyal KorumaAMPK YolaSirt1 YolaHIF 1 AlfaN kleotid eri iATP SeviyeleriH cresel Termal KaymaY ksek Performansl S v KromatografisiGeleneksel in T bb

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.