Yöntem makalesi

Tıbbi Bitkileri Tanımlamak için DNA Barkodlama Uygulaması

2.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66925

⸱

1 Kasım 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Herbgenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, bitki bazlı tıbbi materyallerin ve tıbbi bitki Angelica sinensis'in (Oliv.) Diels bir örnek olarak tanımlandı.

Özet

Şifalı bitkiler dünya çapında değerli kaynaklardır ve dünya çapında sağlığı korumak ve hastalıkları tedavi etmek için kullanılmaktadır; Bununla birlikte, tağşişin varlığı gelişimlerini engeller. Standart DNA bölgelerine göre tür tanımlama tekniği olan DNA barkodlaması, geleneksel tıbbi bitkilerin hızlı ve doğru bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştırır. DNA barkodlama işlemi altı temel adımı içerir: 1) şifalı bitkilerin işlenmesi, 2) santrifüj kolon yöntemi kullanılarak tıbbi bitkilerden yüksek kaliteli toplam DNA'nın çıkarılması, 3) hedef DNA bölgesi dahili transkripsiyonlu ara parçanın 2 (ITS2) bitkilerin evrensel primerleri ile çoğaltılması ve Sanger dizilemesinin gerçekleştirilmesi, 4) hedef diziyi elde etmek için dizinin eklenmesi ve hizalanması, 5) Tanımlama için barkod dizisini barkod kütüphanesiyle eşleştirmek, 6) diziyi hizalamak, tür içi ve türler arası varyasyonu karşılaştırmak, filogenetik komşu birleştirme ağacı oluşturmak. Sonuçlarda gösterildiği gibi, üniversal astar hedef bölgeyi büyütebilir. Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST), tanımlanan yüzdenin %100 olduğunu ve komşu birleştirme ağacı, ekleme dizilerinin A. sinensis OR879715.1 sınıfı ile kümelendiğini ve sınıf destek değerinin 100 olduğunu gösterir. Bu protokol, şifalı bitkileri ve katkı maddelerini tanımlamak için etkili bir yöntem olarak DNA barkodlama teknolojisinin uygulanması için bir referans sağlar.

Giriş

Tıbbi bitkiler çok çeşitli farmakolojik etkilere sahiptir ve hastalıkların tedavisi ve önlenmesi için önemli maddelerdir. Bitkisel ilaçlar ve farmasötik ürünlerdeki tıbbi bitkilere yönelik pazar talebi çok büyüktür ve hala büyümektedir. Tıbbi bitkiler için artan pazarla birlikte, tağşiş sorunu tıbbi bitkilerin gelişimini engellemiştir. Günümüzde, tıbbi bitki tağşişi şu nedenlerden muzdariptir: 1) Tıbbi bitkilerin benzer morfolojisi, bunların doğru bir şekilde tanımlanmasını ve kullanılmasını zorlaştırmaktadır 1,2,3,4,5, 2) Tıbbi bitkilere olan talebin artması, piyasada yetersiz arza yol açmıştır 6,7, 3) Tıbbi bitkilerin pahalı olması ve fiyatlarının dalgalanması ve ekonomik açıdan değerli malzemeler yerine ucuz bitkilerin kullanılmasının tağşiş ve piyasa vurgunculuğuna yol açması 8,9. Tıbbi bitkilerin doğru tanımlanması ve kullanılması ile ilgili sorunları çözmek için, uzman olmayanların kaynağı tanımlamasına izin veren bir teknolojiye ihtiyaç vardır10.

Tıbbi bitkilerin yalnızca görünüm ve koku ile doğru bir şekilde tanımlanması ve kullanılmasının sınırlamaları vardır11. Daha doğru tanımlama ve kalite kontrol için fizikokimyasal yöntemler kullanılır12. Örneğin, ince tabaka kromatografisi (TLC), şifalı bitkileri tanımlamak için hızlı bir yöntemdir ve Çin Farmakopesi'ne dahil edilmiştir. Bununla birlikte, bitkileri tanımlamak için referans standartlar gerektirir13. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), hem kalitatif hem de kantitatif testler gerçekleştirebilir, bu da onu ilaç kalite testi için uygun hale getirir. Bununla birlikte, bu cihaz pahalıdır ve 14,15'i çalıştırmak için özel bilgi gerektirir. DNA barkodlama teknolojisi, benzer morfolojiye sahip bitkiler arasında ayrım yapmak için kararlı DNA dizileri kullanarak türleri tanımlayan hızlı ve doğru bir tür tanımlama teknolojisidir. Hebert ve ark. genom16 içinde tanınmış ve nispeten kısa bir DNA dizisi kullanan türleri tanımlamak için DNA barkodlama teknolojisini önerdi, Chen ve ark. tıbbi bitkilerin moleküler tanımlanması için evrensel bir dizi olarak ITS2'yi önerdi ve 6600'den fazla bitkiyi tanımladı ve yüksek bir tanımlama yeteneği buldu17. ITS2 ve kloroplast gen fragmanlarına dayalı tıbbi bitkilerin incelenmesi, kaynak koruma, piyasa düzenlemesi ve uluslararası ticaret alanlarındaki uygulamalarla türleri tür düzeyinde ayırt etme yeteneğini göstermiştir 17,18,19. DNA barkodlama uygulaması, şifalı bitkilerin kalitesini ve güvenliğini sağlamada, kaynakların kötüye kullanılmasını ve karışıklığı önlemede yardımcı olan geleneksel tanımlama yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelebilir20. Tıbbi bitkileri incelemek, bitkisel endüstrinin büyümesini sürdürülebilir bir şekilde desteklemek ve tüketicinin doğru ilacı kullandığına dair bir garanti sağlamak için faydalı olduğu kanıtlanmıştır 21,22,23,24.

Makale, örnek olarak A. sinensis kullanarak tıbbi bitkileri tanımlamak için DNA barkodlamasının nasıl uygulanacağına ilişkin protokolleri özetlemektedir. DNA barkodlaması, bir organizmanın DNA'sını belirli bir türe ait olarak tanımak için bir veya daha fazla standartlaştırılmış kısa genetik belirteç kullanır. Tıbbi bitkileri tanımlamak için mevcut yöntemlerin belirli sınırlamaları vardır. Geleneksel morfolojik tanımlama, büyük ölçüde uzmanların insan faktörlerinden etkilenebilen kapsamlı deneyimlerine dayanırken, kimyasal tanımlama, temel bileşiklerin tağşişi gibi konulara eğilimlidir. Buna karşılık, DNA barkodlaması, hız, yüksek tekrarlanabilirlik ve stabilite gibi avantajlar sunarak türlerin tanımlanması için daha doğru bir yol sağlar. Ayrıca, bu teknoloji, mevcut tür dizisi verilerinin internet ve bilgi platformları aracılığıyla merkezi olarak yönetilmesini ve paylaşılmasını sağlayarak, tür tanımlamasının verimliliğini ve güvenilirliğini önemli ölçüde artırır11,12. Benzer morfolojileri ve tıbbi kısımları nedeniyle, A. sinensis genellikle diğer türlerle karıştırılır ve sıklıkla kötüye kullanılır veya piyasada kasıtlı olarak ikame edilir25. Yang ve ark. A. anomala'yı sahte ilaçlardan ayırt etmek için DNA barkodlaması kullanarak tanımladılar26. Yuan ve ark. 23 Angelica türü topladı ve çeşitli türler arasında ayrım yapmak için DNA barkodlaması kullandı27. Kullanıcılar, bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, bitki bazlı tıbbi materyallerin ön işlemeden nihai olarak barkodlama dizisini barkod veritabanıyla eşleştirmesine kadar kimlik doğrulaması yapabileceklerdir (Şekil 1).

Protokol

1. Numune hazırlama

  1. Bu çalışmada, Gansu Eyaleti, Min İlçesi'nden 2800 m yükseklikte, düşük sıcaklıkta ve uzun güneş ışığında yaşayan iki yaşındaki A. sinensis deneysel materyal olarak kullanılmıştır. Deney için üçten fazla kökün seçildiği üç bitki seçildi. Deney sonuçlarının doğruluğunu etkileyebilecek kontaminasyonu önlemek için kökleri önce sterilize suyla durulayın ve ardından alkol püskürtücü veya alkollü çubuklarla temizleyin. Sterilize edilmiş bir neşter kullanarak kökleri 5 mm'den küçük parçalar halinde kesin ve daha fazla analiz için karıştırın. (Şekil 2).
    NOT: Alternatif olarak, kökleri gevrekleştirmek için sıvı nitrojene yerleştirin, bu da kırılmalarını kolaylaştırır. Tıbbi bitkilerin şekline, sertliğine ve diğer özelliklerine bağlı olarak, onlarla başa çıkmak için aletler kullanın.
  2. Paralel deneyler için üç tüp deney numunesi hazırlayın. Her numuneyi AS-1, AS-2 ve AS-3 olarak etiketleyin. Yaklaşık 100 mg taze veya 20 mg kuru ağırlıklı doku (havayla kurutulmuş) alın ve 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun.
  3. 5 mL'lik santrifüj tüplerine iki adet 2 mm paslanmaz çelik boncuk yerleştirin. Tüpleri 60 saniye boyunca 60 Hz'de çalışan yüksek verimli bir doku öğütücüye aktarın.

2 Numuneden DNA ekstraksiyonu

NOT: Bu çalışma, CTAB yöntemine dayanan bir Bitki Genomik DNA Ekstraksiyon Kiti kullanmaktadır. DNA ekstraksiyonu, benzersiz bir Nükleer İzolasyon Tamponunun (NIB) eklenmesi de dahil olmak üzere bazı modifikasyonlarla kullanım kılavuzuna göre gerçekleştirilir. Protokol, önce kirleticileri dokudan ayırarak ve ardından bir başlangıç çekirdek izolasyon adımı 28,29,30 ekleyerek DNA saflığını artırır.

  1. 800 μL önceden soğutulmuş NIB ekleyin ve numuneyi 5 dakika boyunca titreşen bir vorteks karıştırıcıya yerleştirin.
  2. Bir santrifüje koyun ve 10 dakika boyunca 13.780 x g'da işleyin. Süpernatanı çıkarın.
  3. Ek 3 tur için 2.1-2.2 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: NIB, daha yüksek kaliteli DNA'yı çıkarır ve hazırlığı, çeker ocakta kullanılması gereken bazı tehlikeli kimyasallar içerir, bu da acemilerin işlemesini zorlaştırır. Ancak, bu adım zorunlu değildir. Kullanıcılar bu tavsiyeye uymayı veya bu adımları atlamayı tercih edebilir. Detaylı formülasyonu Tablo 1'de yer almaktadır.
  4. 600 μL Tampon P1 ve 5 μL RNase A (10 mg / mL) ekleyin. Numuneyi bir girdap karıştırıcısına yerleştirin ve karıştırmak için girdap. Numuneleri 65 ° C'de 1,5 saat boyunca bir su banyosunda inkübe edin ve inkübasyon sırasında tüpleri 2x-3x ters çevirin.
  5. 200 μL Tampon P2 ekleyin, iyice karıştırın, 15 dakika buzun üzerine koyun ve ardından 13.780 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı bir filtre sütunu AF'ye dikkatlice aspire edin, 13,780 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve toplama tüpünde toplanan alt filtratı yeni bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  7. Süzüntü hacmini hesaplayın, P3 hacminin 1,5 katını ekleyin ve karışık bir çözelti elde etmek için hemen çalkalayın.
  8. Hazırlanan karışımdan 650 μL'yi bir adsorban kolon adsorpsiyon kolonuna (AC) ekleyin ve 5 dakika inkübe edin, ardından 30-60 saniye boyunca 13.780 x g'da santrifüjleyin.
  9. Adım 2.8'den elde edilen süzüntüyü tekrar AC'ye ekleyin, santrifüjleyin ve atık sıvıyı atın. Adım 2.7'den kalan karışık çözelti ile prosedürü tekrarlayın.
  10. 600 μL durulama solüsyonu WB ekleyin, 30 saniye boyunca 13.780 x g'da santrifüjleyin, atık solüsyonu atın ve prosedürü 1x tekrarlayın.
  11. AC sütununu tekrar boş toplama tüpüne yerleştirin, 13.780 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve artık etanolü çıkarmak için oda sıcaklığında bırakın.
  12. Adsorban kolon AC'yi alın ve temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. 65 °C'ye ısıtılmış adsorban membranın ortasına 45 μL sterilize deiyonize su (ddH2O) ekleyin. 5 dakika oda sıcaklığında bırakın. 13.780 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
  13. Elde edilen çözeltiyi tekrar kolona ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 13.780 x g'da santrifüjleyin.
  14. Filtrelenmiş çözeltiyi toplayın. DNA konsantrasyonunu belirlemek için bir spektrofotometre kullanın; OD260, nükleik asitlerin emilimini temsil eder. DNA kalite belirleme standardı için aşağıdaki kriterleri kullanın: OD260 / OD280 = 1.80-2.00, normal aralık; OD260/OD280>2.00; büyük miktarda RNA kontaminasyonu var; OD260/OD280<1.80, proteinler, fenoller ve diğer kirleticiler vardır.

3 Hedef parça amplifikasyonu ve tespiti

NOT: Bitkinin önerilen DNA barkodlama bölgelerine göre uygun amplifikasyon primerlerini seçin; reaksiyon koşulları Tablo 2'de gösterilmiştir.

  1. Primer amplifikasyonuna karşılık gelen reaksiyon koşullarını ayarlayın. Toplam 25 μL hacim için 9,5 μL ddH2O, 12,5 μL 2x PCR Master Mix ve 1 μL ileri primer, ters primer ve şablon DNA ile doldurulmuş 0,2 mL santrifüj tüpleri kullanın. Şablonu suyla değiştirerek negatif bir kontrol hazırlayın.
  2. Isıtmak için 20 mL 1x Tris Asetat-EDTA (TEA) tamponu ve 0.2 g agaroz ekleyin ve% 1'lik bir agaroz jeli hazırlayın, ardından 2 μL nükleik asit jel boyası (10.000x) ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı bir jel döküm tepsisine dökün ve agaroz jeli elde etmek için katılaşmasına izin verin. Jele 3 μL PCR ürünü ve 2 μL DNA markörü 5000 bp ekleyin.
  3. Voltajı 120 V'a, akımı 400 mA'ya ve elektroforezi 40 dakikaya ayarlayın. Jelleri görüntülemek ve sonuçları kontrol etmek için çok yönlü bir jel görüntü analiz sistemi kullanın.

4. Veri toplama ve analizi

NOT: Çok çeşitli dizi montaj ve analiz yazılımı vardır; Örnek olarak Codon kodu Aligner V11.0.1 ve MEGA11'i kullanıyoruz.

  1. Tepe haritasını gözlemlemek ve çift yönlü sıralama tepe haritası dosyalarını birleştirmek için sıralama dosyasını açmak için hizalayıcıyı kullanın.
    1. Yeni Proje Oluştur'u seçin ve yazılım ana sayfasına gitmek için Tamam'a tıklayın. Dosya menüsü altında Örnek Ekle'yi seçin, dizi izleme formatı olarak işlenecek Dosya'yı seçin ve Birleştirilmemiş Örnekler'de içe aktarılan dosya olarak doğrudan yazılıma aktarın.
    2. Contig'i seçin, ardından bölümde Gelişmiş Montaj'ı seçin ve ardından Gruplar Halinde Birleştir'i seçin. İlk kez kullananlar, Gruplarda Birleştir'i seçtikten sonra şu iletişim kutusunu görür: Adları tanımla'yı seçin. Örnek adı tanımla parçalarını dosya adına göre değiştirin ve Birleştir'e tıklayın. Hizalanmış sıra görüntülenecektir.
    3. Gizli Markov modeli (HMM) tabanlı model analizine göre tüm ITS2 dizilerini alın. 5,8s ve 28s bölgelerini kaldırmak için hizalanmış diziyi baştan aramak için 5,8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGCGTCA) ve 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC) dizilerini31 kullanın.
    4. Git'i seçin, ardından bölümde Arama Dizisi'ni seçin ve eşleşen sırayı almak için Tamam'a tıklayın. Contig'i seçin, 5.8s ve 28s bölgelerini ve düşük kaliteli dizileri kaldırmak için bölümde Sil'i seçin, ardından yazılım eşleştirme için ekleme dizilerini çıkaracaktır.
  2. Tanımlama için üç paralel deneysel adımdan elde edilen birleştirme dizilerini kullanın, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi'ndeki (NCBI) nükleotid veritabanını kullanarak BLAST aramasını seçin ve Global Farmakope Genom Veritabanı (GPGD) veritabanında karşılık gelen Tür Tanımlama Aracını ve Spesifik Primer ITS2'yi seçin.
    NOT: NCBI32 ve GPGD33 , tıbbi bitki ve hayvanların nükleotid dizilerini içerir ve bunlar yetkili veritabanları olarak kabul edilir. Tanımlama için başlıca yöntemleri, dizi karşılaştırmasına( BLAST) dayalı yöntemlerdir. Kimlik sonuçlarından elde edilen kimlik yüzdesi, en büyük benzerliğe sahip türün hedef cins olup olmadığını belirlemek için kullanılır.
  3. Dizi hizalaması için MEGA11'i kullanın, tür içi ve türler arası dizi varyasyonunu analiz edin ve karşılaştırın ve filogenetik bir komşu birleştirme ağacı oluşturun.
    1. Üç Angelica türünün ve bir Peucedanum praeruptorum türünün dizilerini NCBI'den bir dış grup olarak indirin. Bu dizileri elde edilen sonuç dizisi ile birlikte analiz edin.
    2. Dosya'ya tıklayın, dosyayı içe aktarmak için Bir Dosya/Oturum Aç'ı seçin ve bir iletişim kutusu görünecektir. DNA> Hizala'yı seçin ve dizi karşılaştırması için ClustalW ile Hizala'yı seçin. Verilerde Filogenetik Analiz'i seçin, ardından ana sayfaya dönün. PHYLOGENY'de Komşu Birleştirme Ağacı Oluştur/Test Et'e tıklayın. Yazılım filogenetik bir ağaç oluşturur.

Sonuçlar

Örnek DNA kalitesi

OD260/OD280 absorbans oranları aralığı 1.80-1.84 idi. Her numune için spektrofotometre ile ölçülen DNA miktarı 100 ng/μL'den büyüktü (Tablo 3), bu da numune DNA ekstraksiyonunun iyi kalitede olduğunu gösteriyor. Bu, numunelerin ekstraksiyon işlemi sırasında protein, RNA veya reaktifler tarafından kontamine olmadığını ve iyi kalitede olduklarını ve aşağı akış PCR amplifikasyonu için uygun olduklarını gösterir.

PCR analizi

Jel elektroforezi, üç paralel deney örneğinin PCR ürünü üzerinde gerçekleştirildi. Kurulum şuydu: Şekil 3'te gösterildiği gibi İşaretleyici, numune 1-3 (AS-1, AS-2, AS-3) ve negatif kontrol (0). AS-1, AS-2 ve AS-3 boyutlarının tümü, tek, parlak, berrak bantlarla 500 bp arasındadır ve 0'da bant yoktur, bu da ekstrakte edilen DNA'nın ITS2 primerleri kullanılarak 500 bp'ye yükseltildiğini gösterir.

Sıralama sonuçlarının veritabanı karşılaştırması

Dizileme sonuçları, GPGD veri tabanının tür tanımlama sonuçlarıyla aynı olan NCBI veri tabanının BLAST tanımlama sonuçlarını birleştirerek 0 dizi benzerliği ile A. sinensis'i tanımlamıştır (Tablo 4

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

Moleküler tanımlama teknolojisinin öğrenilmesi ve ustalaşması, geleneksel tanımlama yöntemlerine göre daha kolaydır. Bitkinin büyüme aşamasından etkilenmediği ve öznel yargıya veya özel uzmanlık birikimine dayanmadığı için geleneksel şifalı bitki tanımlamasının sınırlamalarının üstesinden gelir35. Diğer türler, benzer morfolojisi ve tıbbi kısımları nedeniyle A. sinensis ile karıştırılır, ancak DNA barkodlamasının kullanılmasıyla kesin olarak tanımlanabilir36.

Bu protokoldeki temel adımlar birkaç kritik hususu içerir. İlk olarak, otları işlerken ve DNA'yı çıkarırken kontaminasyondan kaçınmak, yabancı DNA veya safsızlıkların sonuçlardan ödün vermesini önlemek için çok önemlidir. Dış kirleticileri uzaklaştırmak için numunelerin uygun şekilde temizlenmesi gerekirken, kapsamlı toz haline getirme, reaktif etkileşimi için yüzey alanını artırarak DNA ekstraksiyonunu geliştirir. Reaktiflerle verimli bir şekilde karıştırılmasını sağlamak, daha iyi sitolize ve DNA'nın salınmasına izin vermek için uygun miktarda numune kullanmak da önemlidir. Son olarak, su banyosu süresini kontrol etmek çok önemlidir, çünkü aşırı ısınma DNA bozulmasına yol açarak ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini etkileyebilir. Birlikte, bu adımlar analiz için yüksek kaliteli DNA'nın başarılı bir şekilde çıkarılmasını sağlar.

Tıbbi bitkiler, DNA ekstraksiyonunu ve amplifikasyonunu etkileyen polisakkaritler ve polifenoller içerir. Nükleer İzolasyon Tamponunun kullanılması, bu maddelerin etkisini azaltır ve Çekirdek lizizini mümkün kılar, bu da yüksek saflıkta gDNA 28,29,30'un daha iyi ekstraksiyonunu sağlar. Şu anda, üç birincil DNA ekstraksiyon yöntemi vardır: santrifüj kolon yöntemi, CTAB yöntemi ve SDS yöntemi. Bununla birlikte, bu çalışma, stabilitesi, basitliği, verimliliği ve yüksek konsantrasyonlarda DNA37 ekstraksiyonu yapabilmesi nedeniyle deneyler için santrifüj kolon yöntemini seçti ve elüsyon tamponunun ısıtılması, DNA'nın daha iyi kalitede elüte edilmesine yardımcı olabilir. Burada, bu çalışma ITS2'ye özgü primerleri17,38 seçti, kısa ITS2 dizisi, yüksek türler arası varyasyona ve daha geniş bir tanımlama aralığına sahip olan diğer primerlere39 kıyasla verimli bir taksonomik dizi etiketi görevi görür. Amplifikasyon başarısızlığının olası nedeni, bazı örneklerde DNA bozulmasıdır; başka bir olasılık, kullanılan ITS2 üniversal primer çiftinin belirli türler için veya alternatif üniversal primerseti 40 kullanılarak çalışmayabilmesidir. BLAST sonucu, en yüksek yüzde kimlik puanı ve en düşük e-değeri kullanılarak belirlendi. En yüksek maksimum yüzde kimliği tek bir türü içerdiğinde ve %>99,40,41 puan aldığında tür tanımlaması başarılı kabul edildi, puan için %≤99, sıralama dosyasının kalitesini veya PCR ürününün kontamine olup olmadığını kontrol edin.

Özetle, DNA barkodlaması, geleneksel bitkisel tıbbın kalite kontrolünde ve uluslararası bitki ticaretinde kilit bir rol oynamalıdır. Bu makale, bitki DNA'sının çıkarılmasına ilişkin bazı bilgiler ve şifalı bitkileri tanımlamak için DNA barkodlama teknolojisinin kullanımına ilişkin ayrıntılı bir kılavuz sunmaktadır. Deneysel süreç sırasında dikkat edilmesi gereken kilit noktaları vurgular. Bu nedenle, bu makale temel bitkisel tanımlama için referanslar sağlar ve daha fazla insanın teknolojiye hızla hakim olmasına yardımcı olur. Bununla birlikte, tek lokuslu barkod tanımlamanın verimliliğinin yetersiz olduğu özel durumlarda, referans kütüphanesine bağlıdır. Yüksek tür kapsamına sahip bir referans kütüphanesi oluşturmak, DNA barkodlarını42 kullanarak türleri tanımlamaya yönelik önemli bir adım olacaktır ve birçok araştırmacı, çok lokuslu barkodlama teknolojisinin verimliliğiartırabileceğini öne sürmüştür 43,44. Ek olarak, moleküler teknolojinin gelişmesiyle birlikte, Zheng ve ark. zehirli bitkileri hızlı bir şekilde doğrulamak için DNA barkodlama teknolojisini izotermal DNA amplifikasyon teknolojisi ve RPA-LFD tespiti ile birleştirdi45 ve bazı hazır kitler degeliştirilmiştir 46. DNA barkod veri tabanı sürekli olarak gelişmektedir ve bu da bitkisel ilaçların tanımlama yöntemlerinin genelleştirilmesini, standardizasyonunu ve uluslararasılaşmasını teşvik etmede önemli bir rol oynamaktadır.

Açıklamalar

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nin (030040015) yetenekli kişi bilimsel araştırma başlangıç fonları sübvansiyon projesi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CTAB Hızlı Bitki Genomik DNA Ekstraksiyon Kiti ShanghaiHuiling Biotechnology Co.NG411MÇok çeşitli bitkilerin farklı dokularından yüksek kaliteli genomik DNA'nın hızlı bir şekilde çıkarılması için uygundur
DL5000 DNA İşaretleyiciNanjing vazyme Biyo-teknoloji A.Ş.MD102-02Kullanıma hazır ürün, jeli çalıştırırken doğrudan elektroforez için bu üründen uygun miktarda alın.
ElektroforezPekin Liuyi Biyoteknoloji A.Ş.DYY-6CDokunmatik ekran tasarımını benimseyin, ayarlanan voltajı görüntüleyebilir, aynı anda akımı ayarlayabilir, paralel çıkış
Etilendiamintetraasetik asitBeijingpsaitongBiotechnologyCo., LtdE70015-100GNükleer İzolasyon Tamponu formülasyon reaktifleri.
Goldview Nükleik Asit Jel Lekesi (10.000 kez;)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03DNA'yı tespit etmek için agaroz jel elektroforezi kullanıldığında, DNA'ya bağlanır ve güçlü bir floresan sinyali üretir.
Yüksek Hızlı Masa Üstü SantrifüjChangsha Yüksek Teknoloji Sanayi Geliştirme Bölgesi Xiangyi Santrifüj Enstrüman A.Ş.H1650Numunelerin hızlı ve verimli bir şekilde ayrılması için bu kompakt ve hafif santrifüj, güvenilir güvenlik sunar
Yüksek Verimli Doku ÖğütücüShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48Numuneleri öğütmek için yüksek frekanslı bir titreşim aleti
http://www.gpgenome.com/Çin Materia Medica Enstitüsü, Çin Tıp Bilimleri Akademisi-HerbGenomicsveritabanı, genom dizileri, gen setleri, organel genomları, düşük kapsamlı genom verileri ve DNA barkod dizilerini içerir.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ABD Ulusal TıpKütüphanesi-UlusalBiyoteknoloji Bilgi Merkezi, biyomedikal ve genomik bilgilere erişim sağlayarak bilim ve sağlığı ilerletir.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Enstrüman İmalat A.Ş.VORTEX-5Yüksek hızlı girdap şeklinde hızlı karıştırma, karıştırma hızı, homojenlik, titizlik
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BGenel performansını artırmak için gelişmiş termoelektrik soğutma teknolojisinin ve yeni oluşturulan TAS teknolojisinin benimsenmesi
Çok Fonksiyonlu Jel Görüntü Analiz SistemiŞanghay Tianneng Life Science Co.'nun Güneybatı Operasyon MerkeziTanon-Mini Space 2000Amplifikasyon koşullarını haritalamak için bir gradyan fonksiyonu ve 30 ° C'ye kadar bir gradyan sıcaklık aralığı ile hızlı gen amplifikasyon deneyleri gerçekleştirir; C
NaClPekin Solarbio Bilim & Teknoloji Co., Ltd.S8210-100Nükleer İzolasyon Tamponu formülasyon reaktifleri.
Nanodrop BirGenler Ltd.ND ONENA, RNA ve protein örneklerini sadece 1-2 & mikro ile saniyeler içinde ölçün; L örnek
Polivinil pirolidonShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gNükleer İzolasyon Tamponu formülasyon reaktifleri.
Kar Tanesi Buz MakinesiŞangay Zhixin Deneysel Enstrüman Teknolojisi A.Ş.ZX-60XDöner ekstrüzyon buz yapma yöntemini, hızlı buz yapma hızını ve buz üretiminin yüksek verimliliğini benimseyen
Doku Homojenizatörü için Paslanmaz Çelik BoncuklarBeyotime Biyoteknoloji. F6623Doku ve diğer numunelerin titreşimle öğütülmesi ve karıştırılması için ekipman
Tris Asetat-EDTA tamponuBeyotime Biotech IncST716TAE, agaroz jel elektroforezinde sıklıkla kullanılan, DNA elektroforezi için yaygın olarak kullanılan bir tampondur.
Tris-HClPekin Solarbio Bilim & Teknoloji Co., Ltd.T8230Nükleer İzolasyon Tamponu formülasyon reaktifleri.
Su banyosu Su IsıtıcısıŞangay Senxin Deneysel Enstrüman Co.DK-8DHassas termostat ve sıcaklık regülasyonu, doğru ve güvenilir sıcaklık kontrolü
ve beta;-merkaptoetanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml &  Nükleer İzolasyon Tampon formülasyon reaktifleri.

Kaynaklar

  1. Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37(2016).
  2. Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723(2016).
  3. Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848(2023).
  4. Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
  5. Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
  6. Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237(2022).
  8. Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants - suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
  9. An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
  10. Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
  11. Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067(2024).
  12. Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
  13. Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
  14. Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803(2022).
  15. Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
  16. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  17. Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613(2010).
  18. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  19. Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651(2021).
  20. Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
  21. Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
  22. Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112(2022).
  23. Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
  24. Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification - DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
  25. Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
  26. He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
  27. Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
  28. Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526(2023).
  29. Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
  30. Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38(2020).
  31. Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
  32. Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
  33. Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
  34. Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
  35. Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728(2018).
  36. Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940(2016).
  37. Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958(2012).
  38. Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
  39. Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476(2013).
  40. Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771(2022).
  41. Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015(2018).
  42. Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
  43. Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833(2012).
  44. Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934(2013).
  45. Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).
  46. Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037(2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T bbi Bitki Tan mlamaT r Tan mlamaDNA EkstraksiyonuITS2 AmplifikasyonuSanger SekanslamaJel ElektroforeziBLAST AramasFilogenetik A aEvrensel Primerler

İlgili makaleler