Yöntem makalesi

Sıçan Endometriyal Epitel Kök Hücrelerinden Sıçan Uterus Organoidlerinin Üretimi ve Karakterizasyonu

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66928

⸱

2 Ağustos 2024

 ,  ,  ,  , 
1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

Bu makalede

Özet

Burada, sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerini (reESC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz, bu da sıçan endometriyal organoidleri üretiyor. Bu yöntem, endometriyal hastalıkların in vitro çalışmalarını kolaylaştırarak gen düzenlemesini ve diğer hücresel manipülasyonları mümkün kılar.

Özet

Endometriyal organoidler, endometriyal hastalıkların gelişimi ve patofizyolojisi hakkında değerli bilgiler sunar ve ilaç testi için platformlar olarak hizmet eder. İnsan ve fare endometriyal organoidleri geliştirilmiş olsa da, sıçan endometriyal organoidleri üzerine yapılan araştırmalar sınırlı kalmaktadır. Sıçanların intrauterin adezyonlar gibi belirli endometriyal patolojileri daha iyi simüle edebildiği göz önüne alındığında, bu çalışma sıçan endometriyal organoidlerini oluşturmayı amaçladı. Sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerinin (reESC'ler) izolasyonu ve kültürü ve sıçan endometriyal organoidlerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Rafine bir reESC genişletme ortamı kullanarak, reESC'leri başarılı bir şekilde izole ettik ve istikrarlı bir şekilde genişleterek uzun vadeli kültür potansiyellerini gösterdik. ReESC ile üretilen organoidler, hormon duyarlılığı da dahil olmak üzere endometriyumun tipik yapısal ve fonksiyonel özelliklerini sergiledi. Sonuçlarımız, sıçan endometriyal organoidlerinin, glandüler yapıyı, hücre polaritesini ve endometriyal epitelin fonksiyonel özelliklerini koruyarak, stabil proliferasyon ile uzun bir süre boyunca kültürlenebileceğini gösterdi. Bu yeni sıçan türevli endometriyal organoid modeli, çeşitli memeli türlerinde potansiyel uygulamalarla birlikte endometriyal hastalıkları incelemek ve terapötik müdahaleleri test etmek için değerli bir platform sağlar.

Giriş

İnsan vücudunda çok yönlü ve yenileyici bir doku olan endometrium, yumurtalık hormonlarının etkisiyle periyodik olarak dökülme, yenilenme ve farklılaşma geçirir1. Endometriyumdaki anormallikler, endometriozis, endometriyal kanser ve kısırlık gibi çeşitli kadın üreme sistemi hastalıklarıyla bağlantılıdır2. Endometrium için güvenilir araştırma modellerinin olmaması, bu hastalıkların patogenez, klinik tanı ve tedavisi ile ilgili derinlemesine çalışmaları engellemektedir. Hücre hatları ve hayvan modelleri endometriyal araştırmalar için yaygın olarak kullanılırken, hücre dizilerindeki fenotipik kararsızlık, hayvan modellerindeki türler arası farklılıklar ve diğer sınırlamalar gibi zorluklar, insan endometriyumundaki karmaşık fizyolojik yapıyı ve dinamik fonksiyonel değişiklikleri tekrarlamayı zorlaştırmaktadır3.

Organoidler, kök hücrelerin hücre dışı bir ortamda kültürlenmesiyle oluşan, kendini yenileme ve kendi kendini organize etme yeteneklerine sahip üç boyutlu yapılardır. Fizyolojik ve patolojik dokuların yapısını ve işlevini taklit edebilirler ve insan hastalıklarının klinik öncesi modelleri olarak kabul edilirler4. 2017 yılında, fare ve insan endometriyal organoidlerinin başarılı bir şekilde inşası, enzimatik sindirim yoluyla elde edilen parçalanmış serbest endometriyal dokunun hücre dışı bir matris iskelesine gömülmesi ve ardından yetiştirme için spesifik büyüme faktörleri ve sinyal faktörlerinin bir karışımının eklenmesiyle elde edildi5. Sonuçlar, ex vivo endometriyal organoidlerin, mukus sekresyonu vehormon yanıtı 6 dahil olmak üzere endometriyal epitelin glandüler yapısını, hücre polaritesini ve fonksiyonel özelliklerini koruyarak uzun süreli ve stabil proliferatif kapasite sergilediğini göstermiştir. Bununla birlikte, endometriyal organoidleri oluşturan yetişkin kök hücrelerin ex vivo kültürü, bez benzeri yapısal destek gerektirir ve bu da sap kaybı ve geçişte zorluklar gibi zorluklara yol açar7.

Şu anda, endometrial organoidlerin yetiştirilmesi, doku bloğu sindirim kültürü yöntemine dayanmaktadır. Önceki bir çalışmada, araştırma ekibimiz, endometriyal organoidleri oluşturmak için kullandığımız Y27632'den oluşan bir birincil kültür ortamı kullanarak in vitro olarak insan endometriyal epitel kök hücrelerini uzun bir süre boyunca kültürledi8. Bu başarıdan yola çıkarak, küçük moleküllü bir bileşik kültür ortamı kullanarak sıçan endometriyal dokusundan endometrial epitelyal kök hücreleri izole ettik ve kültürledik ve uzun süreli bir in vitro kültür sistemi kurduk. Ayrıca, sıçan endometriyal organoidleri oluşturmak için sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerini (reESC'ler) kullandık. Bu modelin geliştirilmesi, sıçan modelleri ile birlikte endometriyal ilişkili hastalıkların gelecekteki in vitro ve in vivo çalışmalarını geliştirecektir.

Protokol

Bu çalışmada 200-250 g ağırlığında altı adet 7/8 haftalık dişi Sprague-Dawley sıçanı kullanıldı. Sıçanlar, yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan iklim kontrollü bir hayvan tesisine yerleştirildi. Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kurumsal Yönergelere uygun olarak yürütülmüş ve Meizhou Halk Hastanesi Araştırma Etik Komitesi'ndeki hayvan deneyleri için kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır.

Aşağıdaki bölüm, esas olarak Y27632, A8301 ve CHIR990217 8,9'dan oluşan rafine bir reESC genişletme ortamı (REEM) kullanılarak sıçan endometriyal epitel kök hücrelerinin izole edilmesi, geçirilmesi, dondurulması ve çözülmesi sürecini özetlemektedir. REEM formülasyonu, anahtar bileşenlerin spesifik konsantrasyonları ile zenginleştirilmiş serumsuz DMEM / F12'ye dayanmaktadır: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 ve 0.5 μM A8301. Bileşenlerle ilgili kapsamlı ayrıntılar Malzeme Tablosunda bulunabilir. Sıçanlar izofluran inhalasyonu ile uyuşturulduktan sonra, Şekil 1'de gösterilen sonraki prosedürler uygulanmalıdır.

1. Cerrahi prosedür

  1. İzofluran inhalasyonu ile sıçanı uyuşturun.
    1. Sıçanları, oksijenle karıştırılmış% 3-5 izofluran ile doldurulmuş bir indüksiyon odasına yerleştirin. Bir ayak parmağı tutamına yanıt olmaması ve doğru refleksin kaybı ile uygun anesteziyi onaylayın.
    2. Anestezi uygulandıktan sonra, işlem sırasında sıçanları bir burun konisi aracılığıyla% 1-3 izofluran altında tutun. Sıçan anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün.
  2. Rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için düşük abdominal orta hat kesisi yapın.
    NOT: Tüm cerrahi aletler kullanılmadan önce sterilize edilmelidir. Sıçan üzerindeki cerrahi alan traş edilir ve antiseptik bir solüsyonla dezenfekte edilir. Cerrah steril eldiven, maske ve önlük giyer. Cerrahi işlem steril bir örtü üzerinde gerçekleştirilir.
  3. İç endometriyumu ortaya çıkarmak için uterusun her iki tarafında uzunlamasına kesiler yapın. Yüzey pürüzlü olana kadar endometriyumu kazımak için bir T10 neşter bıçağı kullanın.
  4. Cerrahi işlemden sonra, sıçanları düzenlenmiş sıcaklık ve nem seviyelerine sahip steril ve ılık bir iyileşme alanına aktarın ve tam bilinçlerini geri kazanana ve sternal yaslanmış pozisyonda kendilerini destekleyene kadar yakından izleyin. Ameliyat sonrası üç sıçandan oluşan ev gruplarını ayrı ayrı kafeslerde saklayın. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için buprenorfin gibi analjezikler uygulayın (deri altından 0.05-0.1 mg / kg); Gerektiğinde her 8-12 saatte bir 48-72 saate kadar tekrarlayın.

2. Doku işleme

  1. Tüm uterus endometrium parçalarını 3,5 cm'lik bir tabağa koyun ve 3 kez PBS ile yıkayın.
  2. Uterus endometriyum parçalarını 3 mL% 1 kollajenaz tip I (% 0.25 tripsin / 1 mM EDTA içinde seyreltilmiş) ile 37 ° C'de 60 dakika karıştırın. Sindirilmemiş dokuyu 100 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak süzün, daha fazla kültür için süzüntüyü izole etmek ve toplamak için.
  3. Toplanan hücreleri, daha fazla kültür için REEM ortamında 12 oyuklu plakalara tohumlayın. İstenen hücre yoğunluğunu elde etmek için 12 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücreleri tohumlamak için gereken hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın (tipik olarak ~ 1-2 × 105 hücre / 1.5 mL REEM'de kuyu).
  4. Adım 2.2'de toplanan hücreleri PBS ile 3x boyunca yıkayın. İlk yıkamadan sonra hücreleri 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın; spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için% 1 BSA (sığır serum albümini) içeren PBS'de hücre peletini yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 15-30 dakika inkübe edin.
  5. Hücreleri farklı belirteçlere özgü birincil antikorlarla ( Malzeme Tablosuna bakınız) 4 ° C'de 30 dakika ila 1 saat inkübe edin. PBS'deki antikorları, üreticinin talimatlarına göre% 1 BSA ile seyreltin.
  6. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış antikorları çıkarmak için hücreleri 2x PBS ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, akış sitometrisi analizi için hücreleri %1 BSA ile 600 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
  7. Cihazı, deneyde kullanılan floroforlara uygun lazerler ve filtrelerle yapılandırın (örn. FITC, PE, APC). Enkaz ve hücre agregaları hariç olmak üzere canlı, tek hücreli popülasyonu geçmek için ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) ayarlarını kullanın. Doğru hizalamayı sağlamak için lekesiz bir kontrol kullanarak akış sitometresini kalibre edin. İlgilenilen her belirteç için pozitif popülasyonları tanımlamak için boyanmamış kontrole dayalı belirli kapılar ayarlayın (eşik %0,02'dir).

3. Sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerinin uzun süreli kültürü

  1. Koloni oluşumu deneyi
    NOT: Bu tahlil, reESC'ler için en uygun kültür ortamının belirlenmesine yardımcı olmuştur.
    1. P0 reESC'leri 1.000 hücre / kuyucuk yoğunluğunda 6 oyuklu plakalara tohumlayın ve bunları A8301, Y27632 veya CHIR99021 içermeyen REEM veya REEM'de 14 gün boyunca kültürleyin.
    2. Kültür süresinden sonra, hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve ardından 20 dakika daha kristal viyole çözeltisi ile boyayın.
    3. 50'den fazla hücre içeren hücre kümelerinin sayısını ölçün. Hangi ortamın hücre kümelerinin büyümesini desteklediğine bağlı olarak kültür ortamını seçin.
      NOT: REEM'den belirli faktörlerin ihmal edilmesi, reESC'lerin proliferatif kapasitesinin azalmasına neden olmuştur (Şekil 1B, C). Bu bulgulara dayanarak, kültür koşullarını optimize etmek için reESC kültürü için tercih edilen ortam olarak REEM seçilmiştir.
  2. REEM'i her 2 günde bir değiştirin. Hücreler %80-90 birleşime ulaştığında, bunları %0.25 tripsin / 1 mM EDTA ile 5-6 dakika sindirin.
  3. Hücreleri REEM'de 1:3 oranında geçirin.
  4. Proliferasyon testi
    1. P1, P7 ve P14 reESC'leri 150 μL REEM'de 4 ×10 3 hücre / kuyu yoğunluğunda 96 oyuklu plakalara tohumlayın.
    2. 24, 48, 72 ve 96 saat kültürden sonra her bir oyuğa 10 μL CCK-8 reaktifi ekleyin, ardından 37 ° C'de 2 saatlik bir inkübasyon yapın.
    3. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nm'de absorbansı ölçerek proliferasyon oranını belirleyin.
  5. Dondurulmuş stokların hazırlanması ve kullanılması
    1. Dondurulmuş stok çözeltisini %10 DMSO ile REEM kullanarak hazırlayın.
    2. ReESC'leri %0,25 tripsin / 1 mM EDTA ile hasat edin.
    3. Hücre peletini donmuş stok çözeltisinde 1 × 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu tüplere aktarın.
    4. Tüpleri önce -80 °C'de dondurun ve ardından 24 saat içinde sıvı nitrojene aktarın.
      NOT: Hücrelerin yakın zamanda çözülmesi planlanıyorsa, donmuş hücrelerin -80 °C'de en fazla 6 ay süreyle saklanması önerilir.
    5. REEM'i önceden 37 °C'ye ısıtın.
    6. Dondurulmuş reESC'leri alın ve 1-2 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna daldırın.
    7. Çözülmüş reESC'leri REEM'de 1 × 105 hücre/kuyu tohumlama yoğunluğuna sahip 6 oyuklu plakalara aktarın.
  6. İmmünofloresan boyama
    1. Logaritmik büyüme fazındaki reESC'leri, oyuk başına 2 × 103 hücre yoğunluğunda u-Slide 8 oyuklu plakalara tohumlayın ve bunları REEM'de kültürleyin.
    2. ReESC'ler %90 birleşime ulaştığında, 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin. Fiksasyondan önce ve sonra reESC'leri PBS 2x ile yıkayın.
    3. Hücreleri 10 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 ile geçirgenleştirin.
    4. Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 sığır serum albümini (BSA) içinde seyreltilmiş% 30 keçi serumu ile bloke edin. ReESC'leri blokajdan önce ve sonra PBS 2x ile yıkayın.
    5. Hücreleri birincil antikorlarla (anti-SSEA-1 ve anti-Sitokeratin) 4 ° C'de 12 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra reESC'leri PBS 2x ile yıkayın.
    6. Hücreleri ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra reESC'leri PBS 2x ile yıkayın.
    7. Tüm çekirdekleri etiketlemek için hücreleri 150 μL DAPI ile boyayın.
    8. Ters konfokal mikroskop kullanarak lekeli hücrelerin görüntülerini yakalayın.

4. ReESC'lerden sıçan endometriyal organoidlerinin oluşturulması

  1. Organoidlerin oluşumu
    1. ReESC'ler %70 birleşmeye ulaştığında, hücreleri %0.25 tripsin / 1 mM EDTA ile 5-6 dakika sindirin.
    2. 500 μL çözülmüş Matrigel içinde 5 ×10 5 reESC'yi yeniden süspanse edin ve 12 oyuklu plakalara yerleştirin. Jelleşmeyi sağlamak için plakaları 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    3. Hücre-Matrigel karışımı katılaştıktan sonra, Matrigel'i kaplamak için 1.5 mL/kuyu REEM ekleyin. REEM'i her 2-3 günde bir değiştirin.
  2. İmmünofloresan boyama
    1. REEM'i aspire edin ve 12 oyuklu plakalara 1 mL / kuyu önceden soğutulmuş Organoid Hasat Çözeltisi ekleyin. Buz üzerinde 40-60 dakika inkübe edin.
    2. Organoidleri bir Pasteur pipeti ile toplayın ve 300 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
    3. Organoidleri 2-3x PBS ile durulayın.
    4. Organoidleri 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin ve 60 dakika boyunca %5 BSA kullanarak bloke edin.
      NOT: Her adımdan önce ve sonra PBS ile 2 kez yıkayın.
    5. Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin ve% 1 BSA'da seyreltilmiş birincil antikorlarla.
    6. Organoidleri ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    7. Organoidleri 200 μL DAPI ile boyayın.
    8. Ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanarak görüntü yakalayın.
  3. HE boyama
    1. Organoidleri kademeli bir etanol serisi ile kurutun: 30 dakika boyunca% 70 etanol; 30 dakika boyunca% 80 etanol; 30 dakika boyunca% 95 etanol; 2 x 30 dakika boyunca% 100 etanol. Organoidleri 2 x 30 dakika ksilene batırarak temizleyin.
    2. Temizlenmiş organoidleri 1 saat boyunca 60 ° C'de erimiş parafine daldırın. Parafin ile sızan organoidleri gömme kalıplarına aktarın, kalıpları erimiş parafin ile doldurun ve parafinin katılaşması için kalıpları soğuk bir plakaya yerleştirin. Parafin katılaştıktan sonra parafin bloklarını kalıplardan çıkarın ve fazla parafini kesin.
    3. Parafin bloklarını mikrotom üzerine monte edin. 5 μm kalınlığında bölümler kesin ve düzleştirmek için ılık su banyosunda (42-45 °C) yüzdürün. Bölümleri dikkatlice cam slaytlara aktarın ve bir slayt ısıtıcısında kurutun.
    4. Slaytları 2 x 5 dakika boyunca ksilene batırarak bölümleri deparafinize edin. Bir dizi dereceli etanol ile rehidrat: 2 x 3 dakika boyunca% 100 etanol; 3 dakika boyunca% 95 etanol; 3 dakika boyunca% 70 etanol; Damıtılmış suda durulayın.
    5. 5 dakika hematoksilen ile boyayın; Ardından akan musluk suyunda 5 dakika durulayın. Birkaç saniye% 1 asit alkolde farklılaştırın; akan musluk suyunda 5 dakika durulayın; 30 saniye boyunca% 0.2 amonyaklı suda mavi olarak yerleştirin; akan musluk suyunda 5 dakika durulayın; 2 dakika boyunca Eozin ile boyayın. Dereceli etanol ile dehidrat: 1 dakika boyunca% 70 etanol; 1 dakika boyunca% 95 etanol; 2 x 1 dakika boyunca% 100 etanol. 2 x 1 dakika ksilen içinde temizleyin.
    6. Lekeli bölümlere bir damla montaj ortamı ekleyin. Ardından, hava kabarcıklarından kaçınarak doku bölümünün üzerine bir lamel yerleştirin. Lekeli bölümleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
  4. Floresan boyama
    1. Adım 4.3.1'de açıklandığı gibi deparafinizasyon ve rehidrasyon gerçekleştirin. 4.3.4'e kadar.
    2. Antijen alma solüsyonunu bir mikrodalga fırında önceden ısıtın. Slaytları ısıtılmış antijen alma çözeltisine yerleştirin ve 20 dakika boyunca kaynama sıcaklığının altında tutun. Slaytların antijen toplama solüsyonunda 40 dakika soğumasına izin verin. Slaytları deiyonize suda 5 dakika durulayın.
    3. Endojen peroksidaz aktivitesini söndürmek için slaytları metanol içinde% 0.3 hidrojen peroksit içinde 10 dakika inkübe edin. Slaytları PBS'de 3 x 5 dakika durulayın ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici solüsyonda inkübe edin. Fazla engelleme solüsyonunu hafifçe vurun, ancak durulamayın.
    4. Birincil antikoru, üreticinin talimatlarına göre bloke edici çözelti içinde seyreltin. Seyreltilmiş primer antikoru doku kesitlerine uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    5. Slaytları PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın. HRP ile konjuge ikincil antikoru, üreticinin talimatlarına göre bloke edici çözelti içinde seyreltin. Seyreltilmiş ikincil antikoru doku bölümlerine uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Bağlanmamış ikincil antikoru çıkarmak için slaytları PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
    6. Floresein Tyramide çalışma solüsyonunu kitin talimatlarına göre hazırlayın. Çalışma solüsyonunu doku bölümlerine uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Slaytları PBS'de 3 x 5 dakika durulayın.
    7. Adım 4.4.1'i tekrarlayın. üç antikorun tümü ile boyama tamamlanana kadar 4.4.5'e kadar. Her doku bölümüne DAPI ile bir damla floresan montaj ortamı uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek için doku bölümünün üzerine dikkatlice bir lamel yerleştirin. Slaytları ters konfokal mikroskopta inceleyin.
  5. Kantitatif PCR
    1. Organoidleri adım 4.2.1'de açıklandığı gibi toplayın. 4.2.3'e kadar. PBS'yi aspire edin ve üreticinin talimatlarını izleyerek organoidlerden toplam RNA'ları çıkarın.
    2. 1 μg toplam RNA'dan cDNA'yı sentezlemek için ticari olarak mevcut herhangi bir ters transkripsiyon kitini kullanın. Kit üreticisinin protokolüne göre bir q-PCR reaksiyonu ayarlayın. q-PCR için kullanılan primer dizileri için Malzeme Tablosuna bakınız.

5. Sıçan endometriyal organoidlerinin uzun süreli kültürü

  1. REEM'i aspire edin ve organoidleri ayırmak için 40 dakika boyunca 1 mL Organoid Hasat Çözeltisi ekleyin. Organoid bütünlüğünü korumak için buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  2. İnkübasyondan sonra, organoidleri bir Pasteur pipeti kullanarak toplayın ve daha sonraki işlemler için peletlemek için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
    NOT: Pipet ucunun kırpılması, daha büyük organoidlerin (500 μm'den fazla) hasara neden olmadan taşınması için yardımcı olabilir.
  3. Peletlenmiş organoidleri, 12 oyuklu plakalara gömmek ve daha sonra kültür yapmak için Matrigel içinde 1: 2 veya 1: 3 oranında yeniden süspanse edin.
  4. Dondurulmuş stok çözeltisini hazırlayın:% 10 DMSO ile REEM.
  5. Organoidleri hasat edin, donmuş stok çözeltisinde yeniden süspanse edin ve ardından uzun süreli koruma için -80 ° C'de bir dondurucuda veya sıvı nitrojen içinde saklayın.
  6. Donmuş organoidleri çözmek için, REEM'i 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın ve organoidleri nazikçe çözmek için donmuş stok tüpünü su banyosuna daldırın.
  7. Çözüldükten sonra, organoidleri 12 oyuklu bir plakaya yeniden gömmek ve kültür etmek için 500 μL Matrigel içinde yeniden süspanse edin. 4.1.2 adımlarını izleyin. 4.1.3'e kadar.
    NOT: Dondurulmuş organoidlerin daha kısa süreler için -80 °C'de saklanması veya daha uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarılması tavsiye edilir.

6. İsteğe bağlı: Organoidlerin yapışkan kültüre geçirilmesi

NOT: Protokol, organoidleri yapışık kültüre geçirerek düz kültürlenmiş reESC'ler elde etmek için alternatif bir yöntemden bahseder ve organoid morfolojisinin yeniden yapılandırılmasına izin verir.

  1. REEM'i aspire edin ve organoidleri ayırmak için 1 mL Organoid Hasat Çözeltisi ekleyin. Organoid bütünlüğünü korumak için buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  2. İnkübasyondan sonra, organoidleri bir Pasteur pipeti kullanarak toplayın ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca 300 × g'da pelet yapmak için santrifüjleyin.
  3. Organoidleri 3 mL önceden ısıtılmış REEM içinde yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş organoidleri 3,5 cm'lik bir tabağa aktarın. REEM ortamını 2 günde bir değiştirin.
  4. Hücreler %70 birleşmeye ulaştığında, bunları 5-6 dakika boyunca %0.25 tripsin / 1 mM EDTA ile sindirin.
  5. 4.1.1 ila 4.1.3 arasındaki adımları izleyerek organoidleri reESC'lerle yeniden yapılandırın.

7. Organoidlerin estradiol (E2) ve progesteron (P4) ile sıralı kültürü

  1. DMSO'da E2 ve P4 stok çözeltilerini hazırlayın. Stok çözeltilerini istenen çalışma konsantrasyonlarına (E2: 10 nM; P4: 1 μM) REEM'de, sitotoksik etkilerden kaçınmak için nihai DMSO konsantrasyonunun% 0.1'i geçmemesini sağlar.
  2. Adım 4.1.1 olarak REEM'de kültür organoidleri. 4.1.3'e kadar. 4 gün boyunca. OrtamıE2 ile takviye edilmiş REEM ile değiştirin ve 7 gün boyunca kültür. Organoid büyümesini ve morfolojisini günlük olarak izleyin. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin.
  3. OrtamıE2 ve P4 ile takviye edilmiş REEM ile değiştirin. Organoid büyümesini ve morfolojisini günlük olarak izleyin. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin. Organoidleri 7 gün boyunca kültürlemeye devam edin.

Sonuçlar

ReESC'ler ve sıçan uterus organoidleri, Şekil 1'de belirtilen protokolü takiben 200 g ile 250 g arasında değişen altı dişi Sprague-Dawley sıçanından oluşturulmuştur. İnsan endometriyal epitelyal kök hücrelerinin uzun vadeli kültürünün başarısından yararlanan REEM formülasyonu ağırlıklı olarak Y27632, A8301 ve CHIR99021'den oluşuyordu. ReESC'leri in vitro olarak stabilize etmek için, başlangıçta enzimatik ve mekanik teknikler kullanarak sıçan endometriyumundan endometriyal hücreleri izole ettik. Şekil 2A'daki akım sitometri analizi, primer endometriyal hücrelerin yaklaşık P'sinin CD9 (I.8) eksprese eden epitel hücrelerinden oluştuğunu, düşük EpCAM (%4.49) ve CD24 (%2.64) düzeyleri ile ortaya çıktı. ReESC'ler için SSEA-1 belirteci %6.58 oranında mevcutken, endotel belirteçleri CD31 (0.9) ve CD45 (p.3) nispeten yüksekti.

Bununla birlikte, REEM'de kültürleme, P1 reESC'lerin tek tip bir kıvrımlı veya çok yüzlü morfoloji sergilemesine ve kompakt klon yapıları oluşturmasına neden oldu (Şekil 2D). Bireysel faktörlerin REEM'den kademeli olarak çıkarılması, reESC'lerin proliferatif kapasitesinde karşılık gelen bir azalmaya yol açmıştır. Klon oluşumu testi, Y27632'nin reESC'lerin stabil kültüründeki kritik rolünü vurguladı (Şekil 2B, C). Üçüncü pasajda, reESC'ler, kültür sırasında birincil reESC'lerin başarılı bir şekilde genişlediğini gösteren tutarlı SSEA-1 ve Cytokeratin ekspresyonu sergiledi (Şekil 2F). Ayrıca, reESC'ler geç geçişlerde bile sağlam ve stabil proliferatif kapasiteyi korudu (Şekil 2E), bu da mevcut REEM sisteminde başarılı izolasyonlarını ve genişlemelerini gösterdi.

Organoid kültürler, insan endometriyal kök hücrelerindentüretilen daha önce bildirilen bir sistemi takiben kurulmuştur 8. 3 gün içinde, reESC'ler, daha sonra boyut ve kalınlık olarak artan, içi boş bir merkeze sahip organoid benzeri yapılara hızlı bir şekilde kendi kendine organizasyon sergiledi (bkz. Şekil 3A). ReESC'ler tarafından organoidlerin oluşumunu gösteren tipik HE boyama sonuçları Şekil 3B'de sunulmuştur. Bu organoid kültürler, hem doğrudan pasaj hem de donma-çözülme döngülerini takiben Ki67 boyaması ile gösterilen yüksek hücre canlılığı ile kanıtlandığı gibi, pasaj yoluyla sürdürülebilir. Ayrıca, 10. nesil organoidler üzerinde HE boyama yapıldı ve sonuçlar organoid yapının bozulmadan korunabileceğini gösterdi (bkz. Şekil 3E). Ek olarak, qPCR sonuçları, Nanog, Sox2 ve Oct4'ün P1 neslininkilerle karşılaştırılabilir seviyelerde ifade edildiğini göstermiştir (Şekil 3F). Bu bulgu, mevcut sistem içinde uzun vadeli organoid kültürü potansiyelini göstermektedir.

Çalışmamızda, sıçan uterus benzeri yapıların E2 ve P4'e verdiği yanıt ile ilgili bir ön inceleme yapılmıştır. Şekil 4A'daki immünofloresan boyamada östrojen ve progesteron reseptörlerinin varlığı ortaya çıktı. E2 takviyesini takiben, bu organoidler içi boş küresel bir formdan daha yoğun nüfuslu bir iç büyüme modeline geçiş geçirdi (Şekil 4C). Daha sonraP4'e maruz kalma, yoğun yapıların geçirgenliğinin azalmasına yol açtı ve sonuçta parçalanmalarına neden oldu (Şekil 4B). Bu bulgular, E2'nin potansiyel olarak sıçan uterus benzeri yapıların daha fazla farklılaşmasına neden olduğunu, P4'ün ise apoptotik yolları tetikleyebileceğini göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Sıçan endometriyal epitel kök hücreleri ve sıçan uterus organoidlerini oluşturmak için kullanılan prosedürler. Kısaltma: SD = Sprague-Dawley. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerinin in vitro üretimi ve uzun süreli kültürü. (A) Sıçan endometriyumundaki pozitif hücrelerin oranını gösteren akış sitometrik analizi. (B) Sırasıyla A8301, Y27632 veya CHIR99021 olan veya olmayan REEM'deki klonların kristal viyole boyanması. Ölçek çubukları = 1 cm. (C) REEM'deki faktörlü veya faktörsüz klon sayıları. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder; n = 3 bağışçı (***, p<0.001). (D) Kristal viyole boyaması olan ve olmayan P1 sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerinin ışık mikroskobu görüntüleri. (E) Pasaj 1, pasaj 7 ve pasaj 14'te sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerinin CCK-8 analizleri. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder, n = 3. (F) Sitokeratin ve SSEA-1'in ekspresyonunu gösteren immünofloresan analizleri. Kısaltma: REEM = reESCs genleşme ortamı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İn vitro olarak sıçan endometriyal organoidlerinin üretimi ve uzun süreli kültürü.(A) P1 sıçan endometriyal organoidlerinin ışık mikroskobu görüntüleri. (B) Sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerinden P1 organoidleri için H&E boyama. (C) Sitokeratin ve SSEA-1'in ekspresyonunu gösteren immünofloresan analizleri. (D) Ki67 ve SSEA-1'in ekspresyonunu gösteren immünofloresan analizleri. (E) P 10 sıçan organoidleri için H & E boyama. (F) P1 ve P10 sıçan endometriyal organoidlerinde Nanog, Sox2 ve Oct-4'ün ekspresyonu için qPCR analizleri. GAPDH'ye normalize edilmiş ifade (n = 3, iki kuyruklu eşleşmemiş t-testi, n.s. = anlamlı olmayan). Kısaltma: H & E = hematoksilen ve eozin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: E2 ve P4 ile organoidlerin sıralı kültürü. (A) Östrojen reseptörü, progestojen reseptörü ve SSEA-1'in ekspresyonunu gösteren immünofloresan analizleri. (B) E2 ve P4'te kültürlenen sıçan organoidlerinin ışık mikroskobu görüntülerine genel bakış. (C) Işık mikroskobu görüntüleri, içi boş bir kürenin E2'de 7 gün kültürlendikten sonra organoidlerin iç boşluğu içinde yoğuna dönüşümünü göstermektedir. Kısaltmalar: ER = östrojen reseptörü; PR = progestojen reseptörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmada, sıçan endometriyal epitel kök hücrelerinin (reESC'ler) izole edilmesi ve kültürlenmesi için basit bir yöntem tanımladık ve insan endometriyal epitel kök hücreleri için daha önce kurulmuş olan ex vivo sistemi rafine ettik8. Yaklaşımımız, kararlı ve uzun vadeli ex vivo kültürü mümkün kılmak için temel bileşenler olarak Y27632, A8301 ve CHIR99021 içeren küçük bir molekül kültür ortamı kullanır. Ayrıca, reESC'leri kullanarak gerçek zamanlı olarak sıçan endometriyal organoidlerini başarıyla ürettik. Bu yeni sistem, tipik olarak doku bloklarına dayanan mevcut endometrial organoid kültür yöntemlerini basitleştirir ve böylece hücre soyu10 hakkında daha fazla netlik sağlar. Daha da önemlisi, sistemimiz, belirli genleri ifade eden organoidler üretmek için hücresel düzeyde gen düzenlemeyi ve diğer manipülasyonları kolaylaştırır. Ayrıca, bu organoid sistem, sıçan endometriyumundaki spesifik genlerin hedefli nakavtına veya aşırı ekspresyonuna izin vererek, endometriyal epitelyal kök hücrelerin endometriyal organoidler üretmek için taranmasını ve yetiştirilmesini sağlar. Bu kapsamlı araştırma yaklaşımı, belirli gen fonksiyonlarını hem in vivo hem de ex vivo perspektiflerden aydınlatarak endometriyal epitel ile ilgili hastalıkların araştırılmasının önünü açmaktadır.

İlaç taraması, organoidlerin kritik bir uygulamasıdır. Bununla birlikte, organoidlerin mevcut kaynakları ve hazırlama yöntemleri karmaşıktır ve ilaç tarama çalışmalarının sonuçlarını etkileyebilecek partiler arasında önemli değişkenliğe yol açmaktadır11,12. Sistemimiz, kararlı ex vivo kültürlenmiş hücre hatlarından türetilen organoidlerin, oluşan organoidler arasındaki farklılıkları etkili bir şekilde en aza indirebileceğini ve deney düzeneklerinde tekdüzeliği artırabileceğini göstermektedir. Ayrıca, reESC'ler tarafından oluşturulan sıçan organoidleri, in vitro olarak östrojen stimülasyonuna yanıt verme yeteneğini göstermiştir, bu da morfolojik değişikliklere yol açmıştır, bu da bunların ex vivo ilaç taraması için bir araç olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. ReESC'ler endometriyal dokudan kolayca izole edilebilir ve insan endometriyal epitelyal kök hücrelerine kıyasla daha az küçük molekül ile ex vivo genişletilebilir. Bu özellik, kök hücre özelliklerini, öncü hücreleri, farklılaşma süreçlerini ve mikroçevre etkileşimlerini araştırmak için özellikle değerlidir. Daha da önemlisi, bu yaklaşım maymunlar, domuzlar ve köpekler gibi diğer memeli türlerine de tahmin edilebilir ve endometriyal biyoloji, işlev, hastalıklar ve ilaç tepkilerini incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili modeller olarak hizmet eden endometrial organoid kültür sistemlerinin kurulmasını sağlar. Avantajlarına rağmen, bu tekniğin sınırlamaları vardır. Önemli bir sınırlama, deneyler arasında tutarsızlıklara neden olabilen karmaşık ve değişken bir hücre dışı matris olan Matrigel'e güvenmektir. Ayrıca, sıçan modelleri değerli bilgiler sağlarken, türler arası farklılıklar hala mevcuttur ve bulgular insan endometriyal fizyolojisi ve patolojilerine tam olarak tercüme edilmeyebilir. Gelecekteki çalışmalar, potansiyel olarak daha tanımlanmış ve tutarlı hücre dışı matrislerin geliştirilmesi ve bu modelin diğer türler arasında uygulanabilirliğinin araştırılması yoluyla bu sınırlamaları ele almayı amaçlamalıdır.

Avantajlarına rağmen, bu tekniğin sınırlamaları vardır. Önemli bir sınırlama, deneyler arasında tutarsızlıklara neden olabilen karmaşık ve değişken bir hücre dışı matris olan Matrigel'e güvenmektir. Bu nedenle, bu çalışmada anahtar bir teknik, Matrigel'in çıkarılmasıdır. Nazik bir matris jel sindiricinin kullanılması, buz üzerinde işlemlerin sağlanması ve yeterli sindirim süresi başarı için kritik öneme sahiptir. Pasteur pipetinin çapının daha büyük olması nedeniyle, Pasteur pipet aspirasyonunun kullanılması organoidlere verilen zararı azaltabilir ve matris jelinin sindirimini hızlandırabilir. Daha sonraki araştırmalar, organoidlerin kültür ve sindirim sistemlerini daha da optimize etmek için farklı hücre dışı matris jel kültürü yöntemlerini karşılaştırabilir. Gelecekteki çalışmalar, potansiyel olarak daha tanımlanmış ve tutarlı hücre dışı matrislerin geliştirilmesi ve bu modelin diğer türler arasında uygulanabilirliğinin araştırılması yoluyla bu sınırlamaları ele almayı amaçlamalıdır.

Mevcut literatür, epitelyal organoidlerin ex vivo kültürlenmesi için teknikleri tanımlamış olsa da, bu çalışma, berrak hücrelerden elde edilen sıçan endometriyal organoidlerinin yetiştirilmesi ve genişletilmesi için yeni, basit ve kolayca tekrarlanabilir bir sistem sunmaktadır. Bu ilerleme, kadınların üreme biyolojisi alanındaki araştırmaların hızını artırmaya hazırlanıyor.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma GuangDong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2023A1515110760) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-CD15 (SSEA-1)Abcamab135377Tavşan, 1:200 (IHC)
Anti-Östrojen Reseptörü alfaAbcamab32063Tavşan, 1:200 (IHC)
Anti-pan SitokeratinAbcamab7753Fare, 1:250 (IHC)
Anti-Progesteron ReseptörüAbcamab101688Tavşan, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67Abcamab279653Fare, 1:250 (IHC)
A8301TargetMol909910-43-6
β-EstradiolMerckE8875
Hücre Sayma Kiti-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20 (FC), Pasifik Mavisi
CD24BioLegend1018061:20 (FC), FITC
CD31BioLegend3031201:20 (FC), APC
CD45BioLegend3017031:20 (FC), PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex Organoid Hasat ÇözeltisiR& D Sistemleri3700-100-01
Cy3 TSA Floresan Sistemi KitiAPExBIOK1051
Cy5 TSA Floresan Sistemi KitiAPExBIOK1052
DAPISigmaD95421 & g/mL
DMEM/F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20 (FC), PerCP
Floresein TSA Floresan Sistemi KitiAPExBIOK1050
Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
Keçi anti-Fare IgG, Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
Keçi Anti-tavşan IgG / HRP antikoruAPExBIObs-0295G-HRP
Nakavt serum replasmanıInvitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT Master MixTakaraRR063A
ProgesteronMerck57-83-0
Sprague-Dawley sıçan ve nbsp;Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, Çin
SSEA-1BioLegend3230471:20 (FC), APC
TB Yeşil Hızlı qPCR KarışımıTakaraRR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNRNA ekstraksiyonu
u-Slide 8 kuyulu plakalarIbidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
< hedef genlerin güçlü>qPCR primerleri 
GenesCompanySequences
sıçan GAPDH FSangon biyoteknolojiGACATGCCGCCTGGAGAAAC
sıçan GAPDH RSangon biyoteknolojiAGCCCAGGATGCCCTTTAGT
sıçan Nanog FSangon biyoteknolojiGACTAGCAACGGCCTGACTCA
sıçan Nanog R Sangon biyoteknolojiCTGCAATGGATGCTGGGATA
sıçan Sox2 FSangon biyoteknolojiATTACCCGCAGCAAAATGAC
sıçan Sox2 RSangon biyoteknolojiATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
sıçan Oct4 FSangon biyoteknolojiCCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
sıçan Oct4 RSangon biyoteknolojiACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA
GG

Kaynaklar

  1. Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
  2. Garcia-Alonso, L., et al. Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro. Nat Genet. 53 (12), 1698-1711 (2021).
  3. Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Organoids - preclinical models of human disease. N Engl J Med. 380 (6), 569-579 (2019).
  4. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on three dimensional organoid studies for stem cell therapy in regenerative medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  5. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  6. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 19 (5), 568-577 (2017).
  7. Tempest, N., Maclean, A., Hapangama, D. K. Endometrial stem cell markers: current concepts and unresolved questions. Int J Mol Sci. 19 (10), 3240(2018).
  8. He, W., et al. Long-term maintenance of human endometrial epithelial stem cells and their therapeutic effects on intrauterine adhesion. Cell Biosci. 12 (1), 175(2022).
  9. Katsuda, T., et al. Conversion of terminally committed hepatocytes to culturable bipotent progenitor cells with regenerative capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
  10. Murphy, A. R., Campo, H., Kim, J. J. Strategies for modelling endometrial diseases. Nat Rev Endocrinol. 18 (12), 727-743 (2022).
  11. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  12. Esfandiari, F., et al. Endometriosis organoids: prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Endometrial OrganoidlerOrganoid K lt rOrganoid KarakterizasyonuEndometrial Hastal klarOrganoid la TestiOrganoid Gen D zenlemeH cre zolasyonuMatrigel G mme
Sıçan Endometriyal Epitel Kök Hücrelerinden Sıçan Uterus Organoidlerinin Üretimi ve Karakterizasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.