Yöntem makalesi

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

DOI:

10.3791/66930

⸱

5 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  , 
1University of Waikato, 2ArcticZymes Technologies ASA

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ticari satıcılardan bir dizi modifiye sentetik oligonükleotidin mevcudiyeti, herhangi bir standart moleküler biyoloji laboratuvarında çalıştırılabilen nükleik asit metabolize edici enzimlerin çeşitli özelliklerini karakterize etmek için karmaşık tahlillerin geliştirilmesine izin vermiştir. Floresan etiketlerin kullanılması, bu yöntemleri, radyoaktif malzemeler kullanmadan veya radyoaktif malzemelerin depolanması ve hazırlanması için tasarlanmış bir laboratuvar, yani bir Sıcak Laboratuvar gerektirmeden, standart PAGE elektroforez ekipmanı ve floresan özellikli bir görüntüleyiciye sahip araştırmacılar için erişilebilir hale getirmiştir. Fosforilasyon gibi standart modifikasyonların isteğe bağlı olarak eklenmesi, tahlil kurulumunu basitleştirebilirken, DNA hasarlarını veya ara ürünleri taklit eden modifiye edilmiş nükleotidlerin spesifik olarak dahil edilmesi, enzim davranışının belirli yönlerini araştırmak için kullanılabilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen sentetik oligonükleotidler kullanılarak enzimler tarafından DNA işlemenin çeşitli yönlerini sorgulamak için tahlillerin tasarımı ve yürütülmesi gösterilmektedir. Bunlar, ligazların farklı DNA ve RNA hibrit yapılarını bozmak için ligazların birleşme veya nükleazların yeteneğini, DNA ligaz tarafından diferansiyel kofaktör kullanımını ve enzimlerin DNA bağlama kapasitesinin değerlendirilmesini içerir. Sentetik nükleotid substratları tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken faktörler tartışılır ve bir dizi nükleik asit ligaz, polimeraz ve nükleaz enzim tahlili için kullanılabilecek temel bir oligonükleotid seti sağlanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yaşam formları, replikasyon, transkripsiyon ve DNA onarımı dahil olmak üzere temel biyolojik süreçleri gerçekleştirmek için nükleik asit işleme enzimlerine ihtiyaç duyar. Bu yollar için temel enzimatik işlevler, RNA/DNA moleküllerinin kopyalarını üreten polimerazlar, polinükleotid substratlarına katılan ligazlar, bunları bozan nükleazlar ve nükleik asit duplekslerini eriten veya topolojilerini değiştiren helikazlar ve topoizomerazlardır 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Ek olarak, bu enzimlerin birçoğu klonlama, teşhis ve yüksek verimli dizileme gibi uygulamalar için gerekli moleküler araçları sağlar 11,12,13,14,15.

Bu enzimlerin fonksiyonel özellikleri, kinetiği ve substrat özgüllükleri, oligonükleotidlerin tavlanmasıyla üretilen etiketli DNA/RNA substratları kullanılarak belirlenebilir. Alt tabakaların ve ürünlerin izlenmesi geleneksel olarak, daha sonra fotoğraf filmi veya bir fosfor görüntüleme sistemi16,17 ile tespit edilebilen 5' iplikçik ucuna bir radyoaktif etiket (32P) yerleştirilerek gerçekleştirilmiştir. Radyoaktif işaretli substratlar, artan deneysel hassasiyet avantajı sunarken ve bir nükleotidin kimyasal özelliklerini değiştirmezken, radyoizotoplarla çalışmaktan kaynaklanan potansiyel sağlık tehlikeleri, DNA ve RNA tespiti için daha güvenli bir alternatif sağlamak için radyoaktif olmayan nükleik asit etiketlemesinin geliştirilmesini teşvik etmiştir 18,19,20. Bunlar arasında, doğrudan floresan algılama, zamana bağlı floresan ve enerji transferi/floresan söndürme testleri dahil olmak üzere floresan algılama, en çok yönlü 21,22,23,24 olarak öne çıkıyor. Geniş florofor dizisi, her oligonükleotid25 üzerinde benzersiz raporlayıcılar içeren farklı DNA/RNA substratları tasarımlarını mümkün kılar. Ek olarak, floroforların stabilitesi, radyoizotoplarla karşılaştırıldığında, kullanıcıların önemli miktarlarda floresan etiketli DNA substratları üretmesine ve korumasına olanak tanır19. Bu florofor etiketli substratlar, bağlanma ve/veya enzim aktivitesini analiz etmek için farklı metal ve nükleotid kofaktör kombinasyonları ile birlikte ilgilenilen protein ile inkübe edilebilir. Jel görüntüleme sistemi ile çeşitli florofor boya kanalları kullanılarak bağlanma veya aktivitenin görselleştirilmesi gözlemlenebilir. Bu teknik kullanılarak yalnızca floresan olarak işaretlenmiş oligonükleotidler görülebileceğinden, etiketli oligonükleotidin boyutundaki herhangi bir artış veya azalmayı takip etmek kolay olacaktır. Jeller daha sonra, jel üzerinde bulunan tüm DNA bantlarını görselleştirmek için nükleik asit boyama boyaları ile de boyanabilir.

Poli-nükleik asit ligazları, DNA/RNA fragmanlarını birleştiren, 5' fosforile DNA terminalleri ile DNA'nın 3' OH'si arasında bir fosfodiester bağı oluşturarak kırılmaların sızdırmazlığını katalize eden enzimlerdir. Nükleotid substrat gereksinimlerine göre iki gruba ayrılabilirler. Yüksek oranda korunmuş NAD'ye bağımlı ligazlar tüm bakterilerdebulunur 26 yapısal olarak çeşitli ATP'ye bağımlı enzimler yaşamın tüm alanlarında tanımlanabilir 8,27. DNA ligazları, replikasyon sırasında Okazaki fragmanının işlenmesinde önemli bir rol oynamanın yanı sıra, onarımdan sonra kalan spontan çentiklerin ve çentiklerin sızdırmazlığı yoluyla nükleotid ve baz eksizyon onarımı gibi çeşitli DNA onarım yollarında yer alır 8,10. Farklı DNA ligazları, çift yönlü çentikler, çift sarmallı kırılmalar, uyumsuzluklar ve boşlukların yanı sıra RNA ve DNA hibritleri 28,29,30 dahil olmak üzere farklı DNA kırılma konformasyonlarını birleştirmek için değişen kapasiteler sergiler. Bir nükleik asit dubleks31,32,33'te yan yana 5' ve 3' terminaller oluşturmak için oligonükleotidlerin 5' fosfat ile tavlanmasıyla çok çeşitli ligatlanabilir substratlar birleştirilebilir. En yaygın analiz yöntemi, bir uç nokta tahlil formatında üre PAGE ile çözünürlüktür; Bununla birlikte, son yenilikler arasında, yüksek verime34, kütle spektrometrik profillemeye35 izin veren kılcal jel elektroforezinin yanı sıra zamana bağlı izlemeye36 izin veren homojen bir moleküler işaret testinin kullanımı yer almaktadır.

Bir ligasyon reaksiyonundaki ilk adım, ligaz enziminin adenozin trifosfat (ATP) veya Nikotinamid adenin dinükleotidi (NAD) ile aderilasyonudur ve bu da bir kovalent enzim ara maddesi ile sonuçlanır. Reaksiyondaki ikinci adım, çentik bölgesinin 5' ucundaki nükleik asit substratının adenilasyonudur, bunu nükleik asit çentik ipliklerinin ligasyonu takip eder. E. coli'de rekombinant olarak eksprese edilen birçok ligaz enzimi, adenillenmiş formda saflaştırılır ve bu nedenle, bir nükleotid kofaktörü eklenmeden nükleik asitleri başarılı bir şekilde bağlayabilir. Bu, nükleik asitlerin ligasyonu için hangi belirli tipte nükleotid kofaktörüne ihtiyaç duyduklarını belirlemeyi zorlaştırır. DNA ligaz aktivitesini değerlendirmek için tahlilleri tanımlamaya ek olarak, etiketlenmemiş substratlar kullanarak enzimi dedenilasyon yaparak kofaktör kullanımını güvenilir bir şekilde belirlemek için bir yöntem de sunulmaktadır.

Nükleazlar, nükleik asitler37 arasındaki fosfodiester bağlarını parçalayan geniş ve çeşitli bir DNA/RNA modifiye edici enzimler ve katalitik RNA'lar grubudur. Nükleaz enzim işlevleri, DNA replikasyonu, onarımı ve RNA işlemede gereklidir ve DNA, RNA veya her ikisi için şeker özgüllüklerine göre sınıflandırılabilir. Endonükleazlar, bir DNA/RNA zinciri içindeki fosfodiester bağlarını hidrolize ederken, eksonükleazlar DNA/RNA zincirlerini 3' veya 5' ucundan her seferinde bir nükleotidi hidrolize eder ve bunu DNA'nın 3' ila 5' veya 5' ila 3' ucundan yapabilir38.

Birçok nükleaz proteini spesifik değildir ve birden fazla süreçte yer alabilirken, diğerleri belirli bir dizi veya DNA hasarı için oldukça spesifiktir 6,39,40. Diziye özgü nükleazlar, klonlama, mutajenez ve genom düzenleme gibi çok çeşitli biyoteknolojik uygulamalarda kullanılır. Bu uygulamalar için popüler nükleazlar, kısıtlama nükleazları41, çinko parmak nükleazları42, transkripsiyonel aktivatör benzeri efektör nükleazlar ve en son olarak, RNA güdümlü tasarlanmış CRISPR nükleazları43'tür. Uyumsuzluğa özgü RecB benzeri nükleaz alanı 5,44 aracılığıyla DNA'daki uyumsuzluklar için özgüllüğe sahip olan EndoMS nükleaz gibi hasara özgü nükleazlar yakın zamanda tanımlanmıştır. Nükleaz aktivite deneyleri, tarihsel olarak, radyoaktif işaretli substratlar ile süreksiz deneyler olarak yapılmıştır; Bununla birlikte, diğer dezavantajlarına ek olarak, bunlar, floresan etiketli substratlar45,46 kullanıldığında mümkün olan bir nükleaz proteini tarafından kesilen bölgenin tanımlanmasına izin vermez. Daha yakın zamanlarda, farklı durumlarda DNA ile etkileşime giren farklı DNA boyaları kullanarak çalışan sürekli nükleaz tahlilleri geliştirilmiştir; örneğin, dsDNA ile etkileşime girdiğinde, bağlanmamış durumundan daha yüksek bir floresan sinyali yaymak veya spesifik olarak kısa RNA'larabağlanmak 47. Diğer sürekli nükleaz tahlilleri, 5' ucunda bir florofor grubu ve 3' ucunda bir söndürücü bulunan DNA saç tokaları kullanır, böylece florofor ve söndürücü48'in ayrılması nedeniyle oligonükleotid bozuldukça floresan artar. Bu tahliller, DNA parçalayıcı proteinlerin kinetiğini karakterize etmeye izin verirken, enzimin işlevi ve substratı hakkında önceden bilgi gerektirir ve ayrıca boya bağlanmasında bir farka neden olmak için DNA konformasyonunu değiştiren enzimlerle sınırlıdır. Bu nedenle, tek tek nükleaz ürünlerini çözen son nokta tahlilleri, protein aktivitesinin neden olduğu DNA modifikasyonları hakkında bilgi sağlamak için hala arzu edilir.

Burada, yeni nükleaz, polimeraz ve ligaz enzimlerinin aktivitesini test etmek için substratlar oluşturmak üzere karıştırılabilen ve eşleştirilebilen floresan etiketli DNA/RNA oligonükleotidlerinin tasarımı için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu temel oligonükleotid dizileri setinin doğrulanması, deneysel tasarımı basitleştirir ve çok sayıda ısmarlama substrat satın almaya gerek kalmadan çok çeşitli enzimatik işlevlerin ekonomik profilini çıkarmayı kolaylaştırır. DNA ligaz aktivitesi örneği kullanılarak, bu substratlarla standart bir DNA işleme enzim testinin çalıştırılması için ayrıntılı bir prosedür sağlanmıştır ve nükleaz ve polimeraz enzimlerinin tahlil edilmesi ve analiz edilmesi için modifikasyonlar açıklanmaktadır. Ek olarak, DNA ligaz enziminin kofaktör özgüllüğünü yüksek doğrulukla belirlemek için modifiye edilmiş bir test verilir ve çok bileşenli ligasyonların montajını değerlendirmek için çift etiketli problar kullanılır. Son olarak, elektroforetik hareketlilik kaydırma testi (EMSA) ile aynı substratlarla protein-DNA etkileşimlerini belirlemek için kullanılmasına izin vermek için temel tahlil formatındaki modifikasyonlar tartışılmaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oligonükleotidlerin tasarımı ve satın alınması

NOT: İstenilen dublekslere monte edilecek ve tavlanacak tek sarmallı oligonükleotidler tasarlayın. Bir dubleks içindeki ipliklerden biri veya daha fazlası, ilgilenilen enzim tarafından oligonükleotid işlemesini izlemek için bir floresan parçası taşımalıdır. Bir dizi aktivite için bir araya getirilebilen tek sarmallı dizilerin temel bir seti Tablo 1'de verilmiştir.

  1. Aşağıda tarif edildiği gibi ilgilenilen enzim için gerekli olan spesifik modifikasyonları dahil edin.
    1. DNA ligaz substratları için (Şekil 1): Üç oligonükleotidden en basit substratı birleştirin: 5' fosforile donör zincir (NL2), 5' FAM etiketli alıcı zincir (NL1) ve ikisini köprüleyen bir tamamlayıcı (NL3).
      1. Ligatable çentiğin 5' terminalini sağlayan tellerin, 2. adımda substrat ana karışımının montajından önce fosforile edildiğinden emin olun. Bunu NL2 üzerinde bir modifikasyon olarak sipariş edin ( Tablo 1'de verildiği gibi) veya oligonükleotidleri yeniden süspanse ettikten sonra T4 polinükleotid kinaz ile enzimatik fosforilasyon kullanın.
      2. Şekil 1A'da (NL6 / NL7 ve NL8 / NL9) gösterilen çift sarmallı kırılmaların tamamlayıcısını içeren NL6 ve NL8'in 5'-terminal fosforilasyonunu içerir, çünkü bu, bir kısıtlama endonükleazından üretilen doğal substrata en çok benzer. Çok parçalı montajlar için ligasyonun göreli kapsamlarını belirlemek için çift etiketli bir alt tabaka kullanın (bkz. adım 6).
      3. Uyumsuzluklar (NL10) ve boşluklar (NL11) oluşturmak için kompleman ipliğini değiştirin.
        NOT: Basit çentikli alt tabaka üzerindeki varyasyonlar Şekil 1A'da gösterilmiştir. Altı çizili konumu değiştirerek daha da geniş bir uyumsuzluk aralığı veya daha uzun boşluklar üretmek için diğer dizileri kullanmak mümkündür.
      4. RNA oligonükleotidleri için DNA oligonükleotidlerini değiştirin.
        NOT: Basit çentikli alt tabaka üzerindeki varyasyonlar Şekil 1B'de gösterilmiştir. Daha geniş bir DNA/RNA dupleksleri aralığı, örneğin hem RNA hem de DNA içeren çift sarmallı kırılmalar oluşturmak için burada verilen temel setin ek kombinasyonları ile oluşturulabilir. Bu varyasyonun bir örneği, çift etiketli bir stratejinin kullanıldığı aşağıdaki 6. adımda verilmiştir.
    2. DNA polimeraz substratları için: Basit bir primer-uzatma testi vermek için Tablo 1'de listelenen oligonükleotidler NL1 ve NL3'ü birleştirin. NL1 (primer) veya NL3 (şablon) ipliklerine modifikasyonlar uygulayarak polimeraz aktivitesinin ek yönlerini araştırın.
      1. Şablon iplikçik üzerindeki hasarlı lezyonları atlama yeteneğini belirlemek için hasarlı baz analoglarını 20. pozisyondan önce NL3 oligonükleotidine dahil edin.
      2. Hasarlı bir astarı uzatma yeteneğini belirlemek için hasarlı baz analoglarını 1 pozisyonundaki NL20 oligonükleotidine dahil edin.
      3. Bir RNA primerinin uzantısını veya bir RNA şablonunun kullanımını araştırmak için dubleks içinde RNL1 veya RNL3 kullanın.
    3. Nükleaz substratları için (Şekil 2): Oligonükleotidleri, kapsamlı olmayan bir çift ve tek sarmallı substrat aralığı (Şekil 2Ai) ve ayrıca bir dizi kanatlı ve yayvan bağlantı noktası (Şekil 2Aii) ve hasarlı substratlar (Şekil 2B) verecek şekilde birleştirin.
      1. Ribonükleaz aktivitelerini araştırmak için, yinelemeli olarak NL1, NL2 ve NL3'ü RNL1, RNL2 ve RNL3 ile değiştirin. Bu seti daha da genişletmek için HJ5 ve HJ6'nın ek RNA versiyonlarını kullanın.
      2. Oksidatif hasarı, abazik bir onarım ara ürününü veya bir deaminasyon ürününü taklit eden merkezi olarak yerleştirilmiş bir modifikasyona sahip oligonükleotidler MD5, MD6 ve MD9'u kullanın (Şekil 2B). Alt tabakalar bu konumda ipliğin bölünmesini algılayacaktır. Çift iplikli bölünmeyi tespit etmek için tamamlayıcı NL3 zincirini TAMRA gibi ortogonal bir florofor ile etiketleyin (bkz. adım 6).
      3. Hem prob (NL5 ve ND9) hem de kompleman (MD10 ve NL10) ipliklerindeki uyumsuz bölgelerde çift sarmallı kesmeyi tespit etmek için tamamlayıcının ortogonal etiketlemesini kullanın.
  2. Ticari bir satıcıdan ilgili floroforları ve diğer modifikasyonları içeren sentetik oligonükleotidler sipariş edin.
    NOT: Açıklanan tahliller için 100 nM'lik bir sentez ölçeği ve sentezi takiben HPLC saflaştırması uygundur.

2. Nükleik asit dublekslerinin montajı ve tavlanması

  1. Oligonükleotidlerin yeniden süspansiyonu ve seyreltilmesi
    1. Açmadan önce, nükleik asidin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için liyofilize oligonükleotidleri 2 mL'lik tüplerinde 2-5 dakika tezgah üstü bir santrifüjde tam hızda santrifüjleyin.
    2. Oligonükleotidleri TE tamponunda (10 mM tris (hidroksimetil) aminometan (Tris), 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)) içinde yeniden süspanse ederek 100 μM'lik bir ana stok hazırlayın. Oligonükleotidlerin, tekrarlanan yumuşak girdaplama ve tam hızda kısa santrifüjleme ile iyice yeniden süspanse edildiğinden emin olun.
    3. Ana stoğun bir kısmını TE tamponu ile seyrelterek 10 μM'lik bir stok hazırlayın. Tablo 2'ye göre 0,5 μM, 0,7 μM veya 2,5 μM konsantrasyonlarda çalışma stokları hazırlamak için 10 μM stoğu ultra saf su (MQ su) ile seyreltin.
  2. Reaksiyon ana karışımlarının montajı ve tavlanması
    1. Tablo 2'de verilen kombinasyonları ve Tablo 3'te verilen hacimleri kullanarak reaksiyon ana karışımlarını oluşturmak için çalışma stoklarını kullanın. Standart DNA ligaz testi ve burada açıklanan diğer tahlillerin çoğu için, nihai tampon bileşimi, iki değerlikli katyon olarak 10 mM Mg ile 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM Ditiyotreitol'dür (DTT).
    2. Oligonükleotidleri bir PCR veya mikrosantrifüj tüpünde bir ısıtma bloğu veya termosikleter kullanarak 95 ° C'de 5 dakika ısıtarak tavlayın. 30 dakika (hacim <1 mL) ila 1 saat (hacim >1 mL) oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Daha uzun oligonükleotidler (>40 nt) için, 45 dakika boyunca 95 ° C ila 25 ° C arasında bir aşağı rampaya sahip bir termosikler kullanarak daha yavaş soğutma gerçekleştirin veya tavlama karışımı içeren tüpü 1 L'lik bir kaynar su kabında yüzdürün ve gece boyunca oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
    3. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra ana karışıma nükleotid kofaktörleri ve diğer ısıya duyarlı tampon bileşenleri ekleyin. Enzim ilavesiyle son reaksiyon karışımını doğrudan test için kullanın (aşağıdaki 3. adıma bakın) veya ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.

3. Standart tahlil kurulumu

  1. Tahlil reaksiyonunun montajı ve başlatılması
    1. 22.5 μL'lik ilgilenilen substrat ana karışımını 2.5 μL DNA ligaz veya bir PCR tüpünde ilgilenilen diğer enzim ile birleştirin. Reaksiyonları iki veya üç kopya halinde çalıştırın, özellikle de sonuçlar niceliksel olarak belirlenecekse.
    2. Tahlil numunelerine protein içermeyen bir kontrol (yalnızca tampon) ekleyin. Gerekirse, bu noktada hiçbir kofaktör denetimi eklemeyin.
      NOT: Enzimler -20 °C'de P v/v gliserol içinde saklanabilir, bu da doğrudan çözeltiden pipetlenmelerine olanak tanır. Gliserol içeren enzim çözeltilerinin, karıştırmak için pipetleme veya hafif girdaplama yoluyla eklemeden önce iyice karıştırıldığından emin olun.
  2. Reaksiyonları hemen 25 °C'de bir PCR makinesine aktarın ve 30 dakika inkübe edin. Enzim aktivitesi için en uygun koşullara bağlı olarak sıcaklığı ve süreyi değiştirin.


  4. Orantı formülü, P/(P+S)×100, veri analizinde yüzdeyi hesaplamak için kullanılır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA ligaz ile ligasyon
DNA ligaz enzimatik aktivitesi, bir üre PAGE jeli üzerinde görselleştirildiğinde floresan olarak işaretlenmiş oligonükleotidin boyutunda bir artışa neden olacaktır. Tablo 2'de listelenen hem DNA hem de RNA ligasyonu için substratlar söz konusu olduğunda, bu, 20 nt'den 40 nt'ye iki katına çıkan bir boyuta karşılık gelir (Şekil 3A). Optimal enzim aktivitesi, sıcaklık, protein konsantrasyonu veya inkübasyon süresi (Şekil 3B), nükleotid kofaktörleri, metal kofaktörleri (Şekil 3C) gibi değişen koşullarla belirlenebilir. Bir ligazın farklı substratlar üzerindeki nispi aktiviteleri paralel olarak karşılaştırılabilir (Şekil 3D).

Ürün ve substrat bantlarının miktar tayini, bağlanan toplam substratın yüzdesi olarak ifade edilir ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, enzimin spesifik aktivitesini değerlendirmek veya iki değerlikli katyon tercihi, sıcaklık veya pH gibi aktivite optimumunu belirlemek için kullanılabilir.

Bakteriyel DNA ligaz DV-1-1-Lig (Şekil 3), çentik ve uyumsuz DNA substratlarını bağlayabilir ve magnezyum tercihi ile ligasyon aktivitesi için hem magnezyum hem de manganez kullanabilir. Bu enzimin daha fazla detayı51'de verilmiştir.

DNA polimeraz ile primer uzatması
20 nt floresan etiketli primerin uzatılması yoluyla DNA polimeraz aktivitesi, burada sunulan oligonükleotid seti kullanıldığında 40 nt'ye kadar bir boyut artışına neden olacaktır (Şekil 4A). Kısmen genişletilmiş ürünler, şablonun boyutuna kadar bir ürün merdiveni olarak görünecektir (Şekil 4B ve Şekil 4C). Burada gösterilen primer uzatma testi (Şekil 4C), primer ipliğinin tam sentezine yol açtı.

Nükleaz ile bozunma
Nükleaz aktivitesi, bir üre PAGE jeli üzerinde görselleştirildiğinde floresan olarak etiketlenmiş oligonükleotidin boyutunda bir azalmaya neden olur. Spesifik endonükleaz aktivitesine sahip nükleazlar, tek bir 20 nt ürünle sonuçlanabilir (Şekil 5A-C). Eksonükleaz aktivitesine sahip nükleazlar, değişen boyutlarda floresan etiketli oligonükleotidlerle sonuçlanacaktır (Şekil 5D-F). Burada, çift sarmallı abazik bölge substratı üzerinde spesifik endonükleaz aktivitesi ve tek sarmallı substrat üzerinde spesifik olmayan eksonükleaz aktivitesi sergileyen bakteriyel bir Antarktika metagenom nükleaz proteininin sonuçları gösterilmektedir (sırasıyla Şekil 5C ve Şekil 5F).

Ligaz de-adenilasyonu ve nükleotid kofaktör kullanım deneyi
Rekombinant olarak eksprese edilen birçok ligaz enzimi, konakçılarından 51,52,53,54,55 toplanan ATP veya NAD'den zaten adenillenmiş bir durumda saflaştırılır. Bu kovalent AMP ara maddesinin çıkarılması, enzimin nükleik asit substratlarının51 ligasyonu için kullanabileceği nükleotid kofaktörlerinin aralığının doğru bir şekilde tanımlanması için gereklidir. Ekzojen bir nükleotid kofaktörünün yokluğunda etiketlenmemiş substrat ile adenillenmiş ligaz enziminin devri, adenilasyon ara maddesini tüketecektir. Floresan etiketli DNA substratları kullanılarak ve yalnızca ikinci adımda nükleotid kofaktörü eklenerek, jel görüntüleyici üzerinde bir floresan kanal (Floresein-FITC) kullanıldığında görülebilen herhangi bir ligasyon ürünü, bu adımda eklenen nükleotid kofaktörü ile adenilasyonun sonucudur.

Bir E. coli sisteminde eksprese edilen bir bakteriyel DNA ligaz ile kurulan aktivite deneyleri, önceden adenillenmiş bir formda saflaştırıldığını ve ek kofaktör olmadan çentikli DNA'yı bağlamak için bir arka plan yeteneği sergilediğini göstermektedir (Şekil 6Ai-ii). ATP'nin adenillenmiş ligaza eklenmesi, reaksiyonda oluşan bağlanmış ürün miktarını arttırır, ancak bu bazal aktivite, geniş spektrumlu kofaktör kullanımı hakkında yanlış bir izlenim verebileceğinden veya bir reaksiyona nükleotid kofaktörlerinin daha fazla eklenmesi, substratın ligasyonunu inhibe edebileceğinden, bu her zaman güvenilir değildir. İlk önce ligazın, çentikli DNA substratının etiketlenmemiş bir versiyonu ile inkübe edilmesiyle, AMP ters çevrilir ve reaksiyona ATP eklenmedikçe etiketli DNA çentik substratı üzerinde herhangi bir ligasyon gözlenmez. İkinci aktivite testi (Şekil 6B), de-adenillenmiş DNA ligazın, ATP ve ADP ilavesiyle nick DNA substratı üzerinde ligasyon aktivitesini iyileştirdiğini göstermektedir. Ayrıca, kofaktör olmayan kontrolde görülen arka plan ligasyonundan daha büyük olan GTP'nin eklenmesiyle ligasyonda bir miktar iyileşme vardır. NAD ile reaksiyonlarda gözlenen ligasyon, NAD'yi ligasyon için bir kofaktör olarak dışlayan kofaktör kontrol reaksiyonlarında görülen ligasyon ile karşılaştırılabilir.

Çift etiketli testin sonuçları
Ortogonal floroforlar, karmaşık bir substratın farklı kısımlarında aktivite oluşturmak için kullanılabilir. Şekil 7'deki örnek, splintlenmiş bir DNA/RNA dupleksi üzerindeki T4 DNA ligazına kıyasla yakın zamanda tanımlanan bir DNA ligaz R2D56'nın aktivitesini göstermektedir. DNA alıcısının substratın RNA donör bölümüne ligasyonu 6-FAM kullanılarak tespit edilirken, RNA alıcısının bir DNA donörüne bağlanması 5-TAMRA ile tespit edildi (Şekil 7A). RNA substratının her iki ucuna DNA ligasyonunun nispi derecesi, kompozit görüntüde sarı olarak görünen hem 6-FAM hem de 5-TAMRA kanallarında floresanslı bir ürün bandının varlığı ile değerlendirilebilirken, bireysel 6-FAM ve 5-TAMRA sırasıyla yeşil ve sarıdır (Şekil 7B). Önceki bir yayın56'da detaylandırıldığı gibi, sadece R2D ligaz DNA'yı RNA'nın 5'ucuna bağlayabilirken, her iki ligaz da DNA'yı RNA'nın 3'ucuna bağlayabildi. Her iki DNA molekülünü tek reaksiyon karışımlarında RNA'ya bağlarken, R2D ligaz, DNA oligolarını RNA'nın her iki ucuna bağlayabilir, çünkü bir bant yukarı doğru kayar ve rengin sarıya dönüşmesi gözlenir (Şekil 7C).

Şekil 8'deki ikinci örnek, farklı pH'larda çoklu oligonükleotidlerin ligasyonunu göstermek için ikili bir etiketleme yaklaşımı kullanır. Yedi oligonükleotidin bir karışımından birleştirilen substrat, R2D ligazın kısa parçaları bir araya getirme yeteneğini göstermek için kullanıldı. 5' iplikçik, FAM florofor etiketli 14 nt ipliğe sahipken, tamamlayıcı iplikçik, 16 nt oligonükleotidin 3' ucunda bir TAMRA florofora sahiptir. Başarılı ligasyon, FAM (yeşil) oligo ve TAMRA (kırmızı) oligo için ek yüksek bantlarla görülebilir. Her iki floroforun üst üste binmesi, nükleotid bandını aynı boyutta tamamen bağlanmış iplikler olarak sarı renkte verir.

EMSA kullanılarak bir DNA ligaz enziminden DNA bağlanmasının sonuçları
DNA ligaz enziminin fosforile çentikli bir DNA'ya bağlanması, tek başına oligonükleotidden daha yüksek bir moleküler ağırlıkta çalışan bir kompleks ile sonuçlanır (Şekil 9A). Burada, bakteriyel bir ATP'ye bağımlı DNA ligazının nick DNA substratına bağlanması gösterilmektedir. Yüksek protein konsantrasyonlarında, etiketli DNA substratının çoğunluğu bağlanır ve daha yüksek moleküler ağırlık bantlarında görülür; daha düşük protein konsantrasyonlarında, serbest DNA substratı baskındır (Şekil 9B).

DNA/RNA ligaz substratları diyagramı; nick, künt, uyumlu, uyumsuzluk, boşluk; RNA-DNA hibrid iplikleri.
Şekil 1: Ligaz enzimatik aktivitesini test etmek için tasarlanmış farklı nükleik asit substratlarının şemaları. Yıldızlar, 5' terminalinde (5' FAM) 6-karboksifloresein ile etiketlemeyi temsil eder. Etiketli iplikler siyah veya koyu mavi/kırmızı (DNA/RNA dupleksleri durumunda) bir çizgi ile gösterilirken, substrat duplekslerinin etiketlenmemiş kısımları gri veya açık mavi/kırmızı (DNA/RNA dupleksleri durumunda) çizgi ile gösterilir. Etiketli teller 20 nt'dir ve teller bağlanırsa 40 nt'lik bir ürün oluştururlar. 5' fosforile bölgeler bir daire içinde P ile gösterilir. Oligonükleotid iplikleri etiketlenir ve isimlere Tablo 1 ve Tablo 2'de atıfta bulunulur. (A) DNA ligazlarının enzimatik aktivitesini test etmek için kullanılan, farklı kırılma türlerine sahip çift sarmallı DNA substratlarının tasarımı. (B) DNA ve RNA oligonükleotidlerini içeren RNA ve RNA/DNA çift sarmallı substratların tasarımı. Substratlar tek bir çentik bölgesi içerir ve ligazların RNA/DNA duplekslerinin çentik kırılmalarını mühürleme yeteneğini test etmek için kullanılır. Kırmızı çizgi RNA oligonükleotidlerini temsil eder ve mavi çizgiler DNA oligonükleotidlerini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DNA substrat diyagramı: nükleaz, modifiye edilmiş, hasarlı. Türleri: Ds, Ss, kuyruk, kanat, yayvan. Temel uyumsuzluklar.
Şekil 2: Nükleaz enzimatik aktivitesini test etmek için tasarlanmış farklı nükleik asit substratlarının şemaları. Yıldızlar, 5' terminalinde (5' FAM) 6-karboksifloresein ile etiketlemeyi temsil eder. Etiketli şeritler siyah bir çizgi ile gösterilirken, alt tabaka dublekslerinin etiketsiz kısımları gri bir çizgi ile gösterilir. 5' fosforile bölgeler bir daire içinde P ile gösterilir. Oligonükleotid iplikleri etiketlenir ve isimlere Tablo 1 ve Tablo 2'de atıfta bulunulur. (A) Çift ve tek sarmallı kısımlara sahip alt tabakaların tasarımı. (B) Çift sarmallı DNA substratlarının tasarımı, 3' veya 5' ucunda tek sarmallı flepler oluşturacak şekilde modifiye edilir (Çırpılmış 3', çırpılmış 5' veya her iki uçta çırpılmış (yayılmış)). (C) Merkezi bir konumda hasarlı tabanları veya uyumsuzlukları içeren çift sarmallı alt tabakaların tasarımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DNA ligasyon işlemi, PAGE jel analizi; enzim-substrat etkileşimi, elektroforez sonuçları.
Şekil 3: Bakteriyel ATP'ye bağımlı DNA ligaz DV-1-1-Lig'in ligasyon aktivitesinin test edilmesi. (A) DNA substratları üzerindeki ligaz aktivitesi için enzim tahlillerinin şeması ve sonuçlar bir TBE üre PAGE jeli üzerinde analiz edilmiştir. Yıldızlar, 5' terminalinde (5' FAM) 6-karboksifloresein ile etiketlemeyi temsil eder. Etiketli teller siyah bir çizgi ile gösterilirken, analiz sırasında görünmeyen alt tabaka duplekslerinin etiketlenmemiş kısımları gri çizgilerle gösterilir. (B) Farklı zaman noktalarında çentikli DNA üzerinde DV-1-1-Lig ile ligasyonun ölçülmesi. Her bir alt tabakaya karşı aktivite iki kez gerçekleştirildi. Reaksiyonlar, 25 ° C'de farklı zaman periyotları (0.5 saat, 1 saat, 2 saat, 3 saat ve 4 saat) için, 4 μM nihai protein konsantrasyonu, 1 mM nihai ATP konsantrasyonu ve 10 mM nihai magnezyum iyonu konsantrasyonu ile inkübe edildi. (C) Çentikli DNA substratının magnezyum (Mg) veya manganez (Mn) ile bağlanması. Reaksiyonlar, 25 ° C'de 3 saat boyunca, 1 mM nihai ATP konsantrasyonu ve 10 mM nihai metal iyonu konsantrasyonları ile gerçekleştirildi. (D) Farklı DNA substratları üzerindeki ligasyon sonuçları. Reaksiyonlar, 2 μM nihai protein konsantrasyonu, 1 mM nihai ATP konsantrasyonu ve 10 mM nihai magnezyum konsantrasyonu ile 20 ° C'de 8 saat boyunca gerçekleştirildi. Reaksiyona protein ilavesi bir artı sembolü (+) ile gösterilir. Kontrol reaksiyonları C ile gösterilir ve içerdiği proteinin yokluğu eksi sembolü (-) ile gösterilir. Ürün (40 nt) ve alt tabaka (20 nt) kırmızı oklarla gösterilir. Aktivite testlerinin sonuçları bir görüntüleme sistemi kullanılarak görselleştirildi. Bantlar, ImageJ yazılımı49 kullanılarak yoğunluğun entegrasyonu ile ölçüldü ve grafikler bir grafik yazılımı kullanılarak oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DNA polimeraz reaksiyon diyagramı; denatüre edici PAGE jeli; ürün analizi, DNA uzatma işlemi.
Şekil 4: DNA polimeraz testi. (A) Bir DNA substratı üzerindeki primer uzatma testinin şeması. Yıldızlar, 5' terminalinde (5' FAM) 6-karboksifloresein ile etiketlemeyi temsil eder. Etiketli teller siyah bir çizgi ile gösterilirken, analiz sırasında görünmeyen alt tabaka duplekslerinin etiketlenmemiş kısımları gri çizgilerle gösterilir. (B) Nükleotidlerin eklenmesiyle etiketli astarın uzunluğunda bir artış gösteren beklenen bir TBE Urea PAGE jel sonuçlarının şeması. (C) E. coli Klenow fragmanı DNA polimeraz enzimi ile primer uzatma örneği. Reaksiyona protein ilavesi bir artı sembolü (+) ile gösterilir. Şerit 1, 12,5 U; Şerit 2, 2,5 U; Şerit 3, 1.25U. Kontrol reaksiyonları bir C ile gösterilir ve içerdiği proteinin yokluğu bir eksi sembolü (-) ile gösterilir. Reaksiyonlar 25 ° C'de 15 dakika boyunca gerçekleştirildi ve 5 mM MgCl2, 50 mM Tris pH8.0, 50 mM NaCl 2, 1 mM DTT ve 0.25 mM dNTP içeriyordu. Ürün (40 nt) ve alt tabaka (20 nt) kırmızı oklarla gösterilir. Aktivite testlerinin sonuçları bir görüntüleme sistemi kullanılarak görselleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DNA bölünme analizi, PAGE jel diyagramı; sıcaklık etkisi, iyon etkisi; enzim aktivitesi görselleştirmesi.
Şekil 5: Bir bakteriyel Antarktika metagenom nükleazının aktivitesinin farklı substratlar, metaller ve inkübasyon sıcaklıkları kullanılarak test edilmesi. (A) Bir nükleaz proteininin abazik bölge (bir x ile gösterilir) substratı üzerindeki şematik spesifik endonükleaz aktivitesi. Yıldızlar, 5' terminalinde (5' FAM) 6-karboksifloresein ile etiketlemeyi temsil eder. Siyah çizgiler etiketli iplikleri temsil eder ve gri çizgiler etiketlenmemiş DNA ipliklerini temsil eder. Nükleaz tarafından spesifik kesim, abazik bölgenin sağ tarafında gösterilir, ancak sol tarafta da meydana gelebilir. (B) Eksi sembolü (-) ile gösterilen proteinin yokluğunda kesilmemiş substratı (40 nt) ve artı sembolü (+) ile gösterilen bir nükleaz varlığında kesilmiş ürünü (20 nt) gösteren denatüre edici bir üre PAGE jelinin şeması. (C) Bir abazik bölgeye sahip çift sarmallı bir DNA substratı üzerinde spesifik endonükleaz nükleaz aktivitesinin sonuçlarını gösteren bir TBE üre PAGE jeli örneği. Test, 1.0 μM ve 1 mMMgCl2 protein konsantrasyonu ile gerçekleştirildi. 20 °C'de, biri proteinsiz (kuyu 1) ve diğeri metalsiz (kuyu 2) olmak üzere iki kontrol reaksiyonu gerçekleştirildi. Reaksiyonlar, jel görüntüsünün üzerinde gösterildiği gibi, 1 ° C'den 50 ° C'ye artan sıcaklıklarda 5 saat boyunca inkübe edildi. Proteinin eklenmesi bir artı sembolü (+) ile gösterilir ve proteinin yokluğu bir eksi sembolü (-) ile gösterilir. Alt tabaka ve ürün kırmızı oklarla gösterilir. (D) Tek sarmallı bir substrat üzerinde bir nükleaz proteininin spesifik olmayan eksonükleaz aktivitesini gösteren şematik. Yıldızlar, 5' terminalinde (5'FAM) 6-karboksifloresein ile etiketlemeyi temsil eder. Siyah çizgiler etiketli şeritleri temsil eder. Nükleazın spesifik olmayan kesilmesi, değişen uzunluklarda (<39 nt) etiketli ipliklerle sonuçlanır. (E) Hiçbir proteinin eklenmediği (-) kesilmemiş substratı (40 nt) gösteren denatüre edici bir üre PAGE jelini temsil eden şematik ve spesifik olmayan bir eksonükleazın aktivitesinden kaynaklanabilecek proteinin eklendiği (+) değişen uzunluklarda kesilmiş substratı gösteren şematik. (F) TBE üre PAGE jelleri, tek sarmallı bir substrat ile aynı Antarktika metagenom nükleazının spesifik olmayan eksonükleaz aktivitesinin bir örneğini gösterir. Test, 4 saat boyunca 20 ° C'de, 1.5 μM'lik bir nihai konsantrasyonda protein ve 10 mM'de bir nihai metal iyonu konsantrasyonu ile gerçekleştirildi. Kullanılan metal iyonu görüntünün üzerinde belirtilmiştir. Proteinin eklenmesi bir artı sembolü (+) ile gösterilir ve proteinin yokluğu bir eksi sembolü (-) ile gösterilir. Alt tabaka (40 nt) kırmızı okla gösterilir ve farklı uzunluklardaki ürünler kırmızı kelepçe ile gösterilir. Tüm nükleaz reaksiyonlarının sonuçları bir görüntüleme sistemi kullanılarak görüntülendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ligasyon etkinlik tablosu ve jel analizi, ATP ve kofaktör etkisi, DNA ligaz aktivite sonuçları.
Şekil 6: Bir bakteriyel DNA ligazın adenillenmiş ve de-adenillenmiş versiyonları ile çentikli DNA substratının ligasyon sonuçları. (A) i) ATP'li ve ATP'siz adenillenmiş ve de-adenillenmiş ligaz enzimi ile ligasyonun miktarının belirlenmesi. Grafikteki noktalar, tekrarlanan her reaksiyonun ortalamalarını temsil eder. Standart hata çubukları dahildir. ii) ATP'li ve ATP'siz adenillenmiş ve de-adenillenmiş ligaz enzimi ile nick DNA substratı üzerindeki ligasyon sonuçlarını gösteren TBE üre PAGE jeli. Reaksiyonlar üç kopya halinde gerçekleştirildi. De-adenillenmiş enzim, etiketlenmemiş nick DNA substratı ve 0.1 μM enzimi ile 25 ° C'de 2 saat önceden inkübe edildi, ardından etiketli nick DNA substratı ile 1 saatlik bir inkübasyon yapıldı. Adenillenmiş enzim, etiketlenmemiş substrat ile önceden inkübe edilmedi. ATP (1 mM), etiketli DNA substratının eklenmesiyle birlikte reaksiyonlara eklendi. (B) i) Farklı kofaktörler (ATP, NAD, ADP ve GTP) ile nick DNA üzerindeki de-adenillenmiş ligaz tarafından ligasyonun miktarının belirlenmesi. Grafikteki noktalar, her bir konsantrasyonun ortalamasını temsil eder. Standart sapma hata çubukları dahildir. ii) Farklı kofaktörlerin eklenmesi ile ve eklenmemesi ile ligaz tarafından ligasyon sonuçlarını gösteren TBE üre SAYFASI. Her bir alt tabakaya karşı aktivite iki kez gerçekleştirildi. Reaksiyonlar, etiketlenmemiş çentikli DNA substratı, 4 μM proteini ve 5 mM magnezyum iyonu ile 25 ° C'de 2 saat önceden inkübe edildi, ardından etiketli çentikli DNA substratı, 5 mM magnezyum ve 1 mM nihai konsantrasyonda farklı kofaktörlerin eklenmesiyle 4 saatlik bir inkübasyon yapıldı. Reaksiyona protein ilavesi bir artı sembolü (+) ile gösterilir. Protein (Kontroller, C) veya kofaktör (Kofaktör yok) içermeyen kontrol reaksiyonları kullanıldı. Ürün (40 nt) ve alt tabaka (20 nt) kırmızı oklarla gösterilir. Aktivite testlerinin sonuçları bir görüntüleme sistemi kullanılarak görselleştirildi. Bantlar, ImageJ yazılımı49 kullanılarak yoğunluğun entegrasyonu ile ölçüldü. Grafikler bir grafik yazılımı kullanılarak oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

FAM/TAMRA etiketlerini kullanarak DNA ligasyon analizi: diyagram, jel sonuçları, PAGE jel tablosu, ligaz aktivitesi.
Şekil 7: Kısa floresan etiketli DNA oligonükleotidlerinin, DNA şablonları tarafından konumlandırılmış 5' fosforile RNA oligosunun her iki ucuna bağlanması. (A) DNA splintli DNA-RNA ligasyonunun şeması, olası ligasyon ürünlerinin çift etiketleme stratejisi kullanılarak nasıl görselleştirilebileceğini gösterir. (B) İki kanalda görüntülenen bir Urea-PAGE jeli üzerinde görülmesi beklenen olası ürünlerin şeması. (C) Çift florofor ligasyonundan elde edilen deneysel sonuçlar. Ligasyon reaksiyonları, her ikisi de DNA'nın RNA'nın 5' ucuna (şerit 2-4) veya 3' ucuna (şerit 5-7) bağlandığı izole reaksiyonlarda veya her iki DNA oligonükleotidinin aynı reaksiyon karışımında bağlandığı tek bir reaksiyonda T4 DNA Ligaz ve R2D ligaz kullanılarak test edildi (şerit 8-10). Hiçbir protein kontrolüne (NPC) enzim eklenmedi. Bu örnekte kullanılan reaksiyon koşulları ve spesifik oligonükleotidler,56'da verilenle aynıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

pH seviyelerinde ligasyon verimliliğini gösteren elektroforez sonuçlarına sahip DNA ligasyon diyagramı.
Şekil 8: Farklı pH'ta üç R2D varyantı ile çoklu kısa oligonükleotid segmentlerinin ligasyonu. (A) Çok parçalı ligasyon stratejisinin şeması. (B) Hem FAM hem de TAMRA kanalları ile görüntülenen, çok parçalı bir düzeneğin pH bağımlılığını gösteren temsili jel. Lane C'de enzim kontrolü yok, Şerit 1-3 pH 6.0, Şerit 4-6 pH 6.5, Şerit 7-9 pH 7 ve Şerit 10-12 pH 7.5. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Azalan protein konsantrasyonu ile protein-substrat bağlanma varyasyonunu gösteren elektroforez diyagramı ve jel sonucu.
Şekil 9: EMSA sonuçları. ATP'ye bağımlı bir DNA ligazın(McMurdo Dry Valleys, Antarktika'dan elde edilen metagenom verilerinden elde edilen) bir DNA substratı üzerindeki bağlanma aktivitesini görselleştiren bir Elektroforetik hareketlilik kayma testinin (EMSA) şematik ve doğal TBE PAGE jeli. (A) Nick DNA substratı üzerindeki bir DNA ligazının EMSA'lar/DNA bağlanma aktivitesinin şeması. Bağlanma sonuçları, denatüre olmayan bir TBE PAGE jeli üzerinde görselleştirilir. Ligaz enzimine bağlı DNA substratları jel boyunca daha yavaş göç ederken, enzim içermeyen substratlar daha hızlı göç eder ve bu da jel üzerinde görselleştirilen bant boyutunda bir kaymaya (sarı kutular) neden olur. Substratlar denatüre edici olmayan bir jel üzerinde görselleştirildiğinden, oligonükleotidler tavlanmış kalacak ve FAM etiketli ipliğin (sarı yıldız) hem serbest hem de bağlı substratlar üzerinde bulunmasına izin verecektir. Optimum bağlanma için protein konsantrasyonunu belirlemek için bir protein konsantrasyonu gradyanı kullanılabilir. (B) Bir ATP'ye bağımlı DNA ligazının farklı protein konsantrasyonlarında bir nick DNA substratına bağlanma kabiliyetini gösteren, doğal bir TBE PAGE jeli üzerinde bir EMSA'nın görselleştirilmesi. Enzim, 1 mM nihai ATP konsantrasyonu ve 40 mM EDTA ile 25 ° C'de 30 dakika boyunca çentikli DNA substratı ile inkübe edildi. Üç farklı protein konsantrasyonu kullanıldı (5.5 μM, 2.3 μM ve 1.5 μM). Reaksiyonlar, reaksiyonlarda doğal yükleme boyası ile% 10'luk bir doğal TBE jeli üzerinde tükendi. Protein içeren örnekler, farklı protein konsantrasyonları için üç kopya halinde tükendi. Kontrol şeritleri, 1 mM, son ATP ve EDTA içeren çentikli DNA substratı içerir, ancak protein içermez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Test substratlarını oluşturmak için kullanılan DNA substrat oligonükleotid dizileri. Hasarlar kalın ve altı çizili olarak belirtilmiştir. Son dubleks içindeki uyumsuzlukların ve boşlukların konumlarının altı çizilir. Kısaltmalar: 5' 6-karboksiflorescien (5' FAM), 8-Okso-deoksiguanozin (8OxodG), abazik tetrohidrofuran (dSpacer). Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Farklı enzim tahlilleri için ana karışımları bir araya getirmek için kullanılan oligonükleotid kombinasyonları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Dört adede kadar oligonükleotid içeren tahlil ana karışımlarının kurulumu. Farklı tahlil substratları için kullanılacak oligonükleotid kombinasyonları için Tablo 2'ye ve reaksiyon koşullarının ayrıntıları için metne bakın. En azından, etiketli bir oligonükleotid gereklidir - dubleksin ek kısımları braketlerle gösterilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: Nick DNA'yı çift yönlü yapmak için etiketli ve etiketsiz bir ana karışım için bileşenler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5: Farklı dubleks kombinasyonları için EMSA ana karışımlarının kurulumu. Farklı EMSA substratları için kullanılacak oligonükleotid kombinasyonları için Tablo 3'e ve reaksiyon koşullarının ayrıntıları için metne bakın. EMSA substratları, aktivite tahlilleri için olanlarla aynı oligonükleotidler kullanılarak tasarlanmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoldeki kritik adımlar
Oligonükleotid tasarımı ve satın alma: Dubleks oluşumu için oligonükleotidleri satın alırken, dizi tasarımını dikkate almak önemlidir. 57 siparişinden önce GC içeriği, erime sıcaklığı, ikincil yapı ve dimerizasyon potansiyeli gibi nükleotid dizisinin özelliklerini tahmin etmek için bir oligo analizör aracının kullanılması önerilir.

Nükleik asit duplekslerinin montajı ve tavlanması: RNA/RNA-DNA dupleksleri hazırlanırken, RNaz içermeyen reaktifler ve su kullanarak veya bir RNaz inhibitörü ekleyerek (incelenen enzimin kendisi bir RNAse olmadığı sürece) RNaz kontaminasyonunu önlemek için özen gösterilmelidir. Ekipman, eldivenler ve tezgah alanı, oligonükleotidlerin58 bozulmasını önlemek için ana karışımları monte etmeden önce bir RNase dekontaminasyon solüsyonu ile muamele edilmelidir. RNA oligonükleotidlerinin ana stokları, kontaminasyon durumunda daha küçük partiler halinde oluşturulabilir.

DNA ligazları her zaman 0.1 ila 1 mM arasındaki bir nihai konsantrasyonda ATP veya NAD olan bir nükleotid kofaktörü gerektirir. DNA polimerazlar, iplik sentezi için dNTP'lere ihtiyaç duyar ve bunlar genellikle her birinin 50 μM'sinde eşmolar oranlarda eklenir. Ligaz ve polimeraz dupleksleri için ana karışımlar hazırlanırken, ATP, NAD ve dNTP'ler gibi nükleotid kofaktörleri, ısıya duyarlı oldukları için karışım ısıtıldıktan ve oda sıcaklığına soğutulduktan sonra ana karışıma eklenmelidir.

Oligonükleotidleri tavlamak için 10x tampon, kısa bir yarı ömre sahip olan ve ideal olarak kullanımdan önce taze veya donmuş olarak hazırlanması gereken DTT'nin eklenmesini gerektirir. 10x tamponun daha küçük kısımları önceden hazırlanabilir ve kullanımdan önce DTT ilavesiyle 4 ° C'de saklanabilir.

Oligonükleotid stokları ve ana karışımlar, uzun süreli kullanım için -20 °C'de saklanmalı ve floroforun fotoağartılmasını önlemek için floresan etiketli oligonükleotidler veya folyoya sarılmış karışımlar saklanmalıdır. Oligonükleotid bütünlüğünü tehlikeye atabilecek tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçınmak için, daha küçük hacimlerin (>1 mL) hazırlanması ve kullanılması tavsiye edilir.

Tahlil kurulumu ve sonuçların analizi: Tahlil sonuçlarının doğru yorumlanması için kontrollerin dahil edilmesi esastır. Substrat üzerindeki görünür aktivitenin enzimin sonucu olduğundan emin olmak için protein içermeyen bir kontrol (tampon çözeltili DNA substratı) kullanılmalıdır. Nükleaz durumunda, eksojen substrat bozunması, düşük moleküler ağırlıklı bantlara veya kontrolde merdivenlenmeye neden olurken, ligaz veya polimeraz durumunda, eksik dubleks denatürasyon, kontrolde yüksek moleküler ağırlıklı bir bant ile sonuçlanacaktır. Beklenen ürünün boyutunun pozitif bir kontrolü Tablo 2'de verilmiştir ve doğru ürün boyutunu doğrulamak için dahil edilmelidir.

Tahlil ürününün başarılı elektroforezinde önemli parametreler önceki bir protokolde59 tarif edilmiştir. Bunlar, akrilamid yüzdesinin substrat boyutuna uygun olmasının sağlanmasını ve substratın boyutuna ve sonuçların görselleştirilmesi için gereken jel türüne bağlı olarak uygun bir yükleme boyasının kullanılmasını içerir. İzleme boyası bromofenol mavisi, 10 bazlı bir oligonükleotidin yaklaşık boyutunda çalışır ve bu nedenle burada açıklanan oligonükleotid seti için uygundur; Bununla birlikte, daha kısa nükleotidler kullanıldığında floresan ürün veya substrat bantları ile örtüşen bir boya bandı varsa, izleme boyası, daha yavaş çalışan ksilen siyanol ile değiştirilebilir60.

Alt tabaka/ürün bantlarının iyi bir şekilde çözülmesini sağlamak için, jel tankı ya bir su banyosu kullanılarak ya da yüksek bir hacimle (örn. 180 V) çalıştırılarak harici olarak ısıtılmalıdır. Üre PAGE jellerini en az 30 dakika önceden çalıştırmak ve fazla üreyi çıkarmak için kuyucukları bir pipetle yıkamak, miktar tayinine uygun keskin, düz bantlar elde etmek için çok önemlidir.

Alt tabakaların ve ürünlerin miktarının belirlenmesi için, floresan jel bantlarının doğru entegrasyonuna izin vermek için toplam malzemenin %20-80'lik bir aralığı ürüne dönüştürülmelidir. Yeni bir enzim test ediliyorsa, bu aralıkta sonraki ölçümlerin yapılmasına izin vermek için bir protein konsantrasyonları gradyanı çalıştırılması önerilir. Birçok floresan görüntüleyici, bu amaç için kullanılabilecek yerleşik bant entegrasyon özelliklerine sahiptir. ImageJ49 gibi harici bir program kullanıyorsanız, jel görüntüsünün tiff formatında yüksek kalitede dışa aktarıldığından emin olun.

Tekniğin modifikasyonları ve sorun giderme
Oligonükleotid tasarımı ve satın alınması: Bu protokolde verilen oligonükleotidler yararlı başlangıç noktalarıdır ve yöntemler bölümünde önerildiği gibi, oligonükleotid dizilerini değiştirerek ve modifikasyonları dahil ederek genişletilebilir.

Standart tahlil kurulumu ve sonuçların analizi: Optimal reaksiyon koşulları farklı proteinler arasında değişeceğinden, yeni bir enzimin aktivitesini test ederken pilot deneyler gereklidir; Bu protokolde verilen parametreler yalnızca bir başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır. Enzim konsantrasyonu, reaksiyon sıcaklığı, inkübasyon süresi, kofaktör ve tampon bileşimi/pH gibi faktörler, ana karışım ve tahlil reaksiyonu düzeneği sırasında değiştirilebilir. Kofaktör konsantrasyonları, nükleotid kofaktörlerinin veya metal iyonlarının fazlalığı inhibe edici olabileceğinden özellikle önemlidir ve her birinin bir dizi konsantrasyonunun test edilmesi tavsiye edilir. DNA polimerazlar için önerilen dNTP konsantrasyonları toplam 20 ila 200 μM arasında değişir, ancak yüksek dNTP konsantrasyonları aslına uygunluğuazaltır 61. Benzer şekilde, polinükleotid ligazlar tipik olarak 0.1-1.0 mM nükleotid kofaktörü ile test edilir, ancak aşırı konsantrasyonlar birikmiş DNA'nın adenilasyona ve reaksiyon inhibisyonuna neden olur62.

Buradaki standart protokol, iki değerlikli bir katyon olarak Mg'yi kullanır; bununla birlikte, bazı enzimler manganez (Mn) veya çinko (Zn) ile daha aktiftir. Mn veya Zn içeren ana karışımlar daha düşük bir pH tamponu (<7.5) ile hazırlanmalı ve ısıtıldıktan sonra metaller eklenmelidir. Enzim aktivitesinin çökelmesini ve inhibisyonunu önlemek için ana karışımlar aynı gün kullanılmalıdır.

Polietilen glikol (PEG) gibi kalabalıklaştırıcı ajanlar veya sığır serum albümini gibi stabilizatörler dahil olmak üzere katkı maddeleri, bazı enzimlerin aktivitesini artırmak için kullanılabilir63,64. Bunlar, ısıl tabiliteleri nedeniyle tavlama adımından sonra eklenmelidir. Biyolojik olarak türetilmiş tüm reaktifler, kontamine edici nükleazların girmesini önlemek için moleküler biyoloji derecesinde olmalıdır.

Bu protokolde kullanılan formamid söndürme tamponunun hacmi, oligonükleotidlerin temel seti için uygundur. Bununla birlikte, daha uzun oligonükleotidler için, tam iplik ayrılmasını sağlamak için formamid hacmi 10 μL ile 20 μL arasına çıkarılmalıdır ve söndürülen reaksiyonlar buz üzerinde çırpıda soğutulabilir ve elektroforeze kadar 4 °C'de saklanabilir.

Bazı enzimlerde, proteinin substrata / ürüne sıkı bir şekilde bağlanması, özellikle enzim yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, elektroforez sırasında oligonükleotidlerin jele göçünü engelleyebilir. Bu, jel üzerinde ürün/substrat bantlarının eksikliği ve genellikle oyuklarda floresan materyal (protein ile komplekslenmiş ürün ve/veya substrat) birikimi olarak ortaya çıkacaktır. Bu kompleksleri bozmak için, tahlil karışımı, söndürme tamponu eklenmeden önce Proteinaz K ile muamele edilebilir veya su verme sırasında Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) eklenebilir.

DNA ligaz aktivitesi, ölçülmesi kolay olan iki ayrı bant üretir. Tek bir 20 nükleotid ürününün beklendiği DNA hasar substratı üzerindeki endonükleaz aktivitesini ölçmek için aynı yöntemi kullanmak veya bağlı/bağlanmamış durumların açıkça ayırt edildiği EMSA tahlilleri yapmak mümkündür. Polimeraz ve işlemsel nükleaz aktivitesinin doğru bir şekilde ölçülmesi, bant entegrasyonu ile zordur ve genel olarak, giriş bölümünde açıklandığı gibi problar veya işaretler ile gerçek zamanlı tahlilin kullanılması önerilir.

DNA ligazın de-adenilasyonu ve kofaktör özgüllüğü: Tüm arka plan aktivitesini kaldırmak için bu protokolün bir miktar optimizasyonu gerekebilir, bu daha sonra nükleotid kofaktör(ler)inin eklenmesiyle geri yüklenecektir. De-adenilasyondan sonra arka plan ligaz aktivitesi devam ederse (kofaktör olmayan kontrolde ligasyon olarak görülür), de-adenilasyon adımının inkübasyon süresi arttırılabilir veya ligaz konsantrasyonu azaltılabilir. Etiketsiz DNA nick dupleksinin proteinden (> 4:1::substrat: protein) daha konsantre olduğundan emin olun. Etiketli DNA'nın varlığında bir kofaktörün eklenmesi, test edilen kofaktörlerin herhangi biri için ligasyonu eski haline getirmezse, enzimin denatüre olması mümkündür ve de-adenilasyon aşaması kısaltılmalıdır. Yeni bir ligaz veya yeni bir rekombinant enzim grubu için, ek nükleotid kofaktörlerinin yokluğunda adenillenmiş enzim ile arka plan ligasyonunun derecesini belirlemek yararlıdır. Bu, 10 μL etiketlenmemiş ana karışım, 10 μL etiketli ana karışım ve 2.5 μL de-adenillenmemiş taze bir enzimin aynı anda inkübe edildiği başka bir reaksiyonun kurulmasını içerir.

Çift etiketli alt tabakalar kullanın: Bu protokol, orijinal olarak kullanılan florofordan farklı bir uyarma/emisyon spektrumuna sahip bir floresan parçaya sahip bir oligonükleotidin tasarlanmasını ve satın alınmasını ve daha sonra bunun bir dubleks halinde monte edilmesini gerektirir, böylece iki ortogonal florofor substratın farklı kısımlarını etiketler. Şüpheniz varsa, uyarma ve emisyon spektrumlarını kontrol etmek için bir dizi çevrimiçi spektral görüntüleyici mevcuttur, örneğin, hem florofor çiftinin uyumluluğunu hem de en uygun görüntüleyici ayarlarını kontrol etmek için kullanılabilen FPbase Spectra Viewer ve BD Spectrum Viewer. Jeli görselleştirmek için kullanılan özel ayarlar, görüntüleyicinin modeline ve kullanılan florofor(lar)a bağlı olacaktır. Kompozit görüntü, her iki kanaldan gelen sinyali tek jel üzerine kaydedecek ve her iki floroforun aynı ürüne bağlandığı bant bir ara renk olarak gösterilecektir. Diferansiyel olarak etiketlenmiş iplikler üzerindeki ligasyon veya bozulmanın derecesini ölçmek için tek tek kanallardan ayrı görüntüler analiz edilebilir.

Tekniğin sınırlamaları
Floresan etiketli alt tabakalarla çalışmak, düşük sağlık tehlikeleri gibi birçok avantaja sahip olsa da, bu tür etiketli alt tabakalarla çalışırken göz önünde bulundurulması gereken bazı sınırlamalar vardır. Bunlardan biri, bu oligonükleotidleri florofor etiketleri veya hasarlı bazların eklenmesi gibi modifikasyonlarla sipariş etmenin, şirket içi radyoetiketlemeye kıyasla nispeten yüksek maliyetidir. Bir diğeri, etiketli ipliklerin tespiti için özel görüntüleme ekipmanı ve yazılımının gerekli olmasıdır. Bununla birlikte, bu özellikler artık çoğu yeni jel görüntüleme sistemine dahil edilmiştir. Floroforların hedef etkileşim proteinlerinin bağlanma özelliklerini değiştirme potansiyeli de göz önünde bulundurulmalıdır. Floresein ve türevi FAM, oligonükleotidleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılır ve pH ve nükleobaz söndürme65'teki değişikliklere duyarlıdır. Dubleks tasarım için oligonükleotid üzerindeki floroforların tipine ve yerleştirilmesine karar verirken bu sınırlamalar dikkatlice dikkate alınmalıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEG ve UR, R2D ligazın dağıtımını yapan ArcticZymes Technologies AS'nin çalışanlarıdır. AW, ER-S ve RS'nin rekabet eden çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AW, bir Rutherford Keşif Bursu (20-UOW-004) tarafından desteklenmektedir. RS, Yeni Zelanda Post Antarktika Bursu'nun sahibidir.SG ve UR, teknik destek için Norveç Arktik Üniversitesi olan Tromsø Üniversitesi Kimya Enstitüsü'ne teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%30 Akrilamid/Bis Çözeltisi (29:1)BioRad1610156
Adenozin trifosfat (ATP)Birçok tedarikçi
Amonyum persülfat (APS)Birçok tedarikçi
Tezgah üstü santrifüjBirçok tedarikçi
BoratBirçok tedarikçi
Bromofenol mavisiBirçok tedarikçiler
Dithiothreitol (DTT)Birçok tedarikçi
Sirkülasyonlu su banyolu elektroforez sistemiBirçok tedarikçi
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Birçok tedarikçi
Floresan görüntüleyici, örneğin iBright FL1000Thermo Fisher ScientificA32752
FormamidBirçok Tedarikçiler
Jel döküm sistemiBirçok tedarikçi
Isıtma bloğuBirçok tedarikçi
Magnezyum KlorürBirçok tedarikçiİncelenen proteine bağlı olarak diğer metal iyonları tercih edilebilir
Mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL)Birçok tedarikçi
Mikropipetler ve uçlarBirçok tedarikçi1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +)Birçok tedarikçi
OligonükleotidlerEntegre DNA TeknolojileriNAThermo Fisher, Sigma-Aldrich,   Genscript ve diğerleri de bu
mera pipetiniBirçok tedarikçi
PCR termodöngüleyiciBirçok tedarikçi
PCR tüpleriBirçok tedarikçi
RNAse uzaktaThermoFisher7002PKYalnızca RNA oligoları ile çalışırken gereklidir
RNase AWAYMerck83931-250MLRNAse'in uzaklaştırılması için yüzey aktif madde yüzeylerde kirlenme
RNAsesız suNew England BiolabsB1500LYalnızca RNA oligoları Sodyum Klorür ile çalışırken gereklidir
Birçok tedarikçi
SUPERase IN RNase inhibitörüThermo Fisher ScientificAM2694Geniş spektrumlu RNAse inhibitörü (protein bazlı)
SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494Bu, leke sonrası jelleri ve etiketlenmemiş oligonükleotidleri görselleştirmek için kullanılabilir
Tetrametiletilendiamin (TMED)Birçok tedarikçi
Tris veya tris (hidroksimetil) aminometanBirçok tedarikçi
Ultra saf su (Milli-Q)Merck
üreBirçok tedarikçi
VorteksBirçok tedarikçi
tedarik ediyor

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363 (6429), 7003(2019).
  2. Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
  3. Lohman, T. M., Fazio, N. T. How does a helicase unwind DNA? Insights from RecBCD Helicase. Bioessays. 40 (6), e1800009(2018).
  4. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Res. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  5. Wozniak, K. J., Simmons, L. A. Bacterial DNA excision repair pathways. Nat Rev Microbiol. 20 (8), 465-477 (2022).
  6. Zhang, L., Jiang, D., Wu, M., Yang, Z., Oger, P. M. New insights into DNA repair revealed by NucS endonucleases from hyperthermophilic Archaea. Front Microbiol. 11, 1263(2020).
  7. Saathoff, J. H., Kashammer, L., Lammens, K., Byrne, R. T., Hopfner, K. P. The bacterial Mre11-Rad50 homolog SbcCD cleaves opposing strands of DNA by two chemically distinct nuclease reactions. Nucleic Acids Res. 46 (21), 11303-11314 (2018).
  8. Williamson, A., Leiros, H. S. Structural insight into DNA joining: from conserved mechanisms to diverse scaffolds. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8225-8242 (2020).
  9. Caglayan, M. Interplay between DNA polymerases and DNA ligases: Influence on substrate channeling and the fidelity of DNA ligation. J Mol Biol. 431 (11), 2068-2081 (2019).
  10. Shuman, S. DNA ligases: Progress and prospects. J Biol Chem. 284 (26), 17365-17369 (2009).
  11. Lohman, G. J., Tabor, S., Nichols, N. M. DNA ligases. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 3, Unit 3.14 (2011).
  12. Rittié, L., Perbal, B. Enzymes used in molecular biology: a useful guide. J Cell Commun Signal. 2 (1-2), 25-45 (2008).
  13. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of programmable nucleases for genome engineering. J Mol Biol. 428 (5), Part b 963-989 (2016).
  14. Aschenbrenner, J., Marx, A. DNA polymerases and biotechnological applications. Curr Opin Biotechnol. 48, 187-195 (2017).
  15. Loenen, W. A. M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 42 (1), 3-19 (2013).
  16. Voytas, D., Ke, N. Detection and quantitation of radiolabeled proteins and DNA in gels and blots. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3 (A) (2002).
  17. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  18. Huang, C., Yu, Y. T. Synthesis and labeling of RNA in vitro. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 4, Unit 4.15 (2013).
  19. Ballal, R., Cheema, A., Ahmad, W., Rosen, E. M., Saha, T. Fluorescent oligonucleotides can serve as suitable alternatives to radiolabeled oligonucleotides. J Biomol Tech. 20 (4), 190-194 (2009).
  20. Anderson, B. J., Larkin, C., Guja, K., Schildbach, J. F. Using fluorophore-labeled oligonucleotides to measure affinities of protein-DNA interactions. Meth Enzymol. 450, 253-272 (2008).
  21. Liu, W., et al. Establishment of an accurate and fast detection method using molecular beacons in loop-mediated isothermal amplification assay. Sci Rep. 7 (1), 40125(2017).
  22. Ma, C., et al. Simultaneous detection of kinase and phosphatase activities of polynucleotide kinase using molecular beacon probes. Anal Biochem. 443 (2), 166-168 (2013).
  23. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Meth Mol Biol. 429, 209-224 (2008).
  24. Yang, C. J., Li, J. J., Tan, W. Using molecular beacons for sensitive fluorescence assays of the enzymatic cleavage of nucleic acids. Meth Mol Biol. 335, 71-81 (2006).
  25. Nikiforov, T. T., Roman, S. Fluorogenic DNA ligase and base excision repair enzyme assays using substrates labeled with single fluorophores. Anal Biochem. 477, 69-77 (2015).
  26. Pergolizzi, G., Wagner, G. K., Bowater, R. P. Biochemical and structural characterisation of DNA ligases from bacteria and Archaea. Biosci Rep. 36 (5), 00391(2016).
  27. Martin, I. V., MacNeill, S. A. ATP-dependent DNA ligases. Genome Biol. 3 (4), REVIEWS3005 (2002).
  28. Bilotti, K., et al. Mismatch discrimination and sequence bias during end-joining by DNA ligases. Nucleic Acids Res. 50 (8), 4647-4658 (2022).
  29. Bauer, R. J., et al. Comparative analysis of the end-joining activity of several DNA ligases. PLoS One. 12 (12), e0190062(2017).
  30. Lohman, G. J. S., Zhang, Y., Zhelkovsky, A. M., Cantor, E. J., Evans, T. C. Efficient DNA ligation in DNA-RNA hybrid helices by Chlorella virus DNA ligase. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1831-1844 (2014).
  31. Bullard, D. R., Bowater, R. P. Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem J. 398 (1), 135-144 (2006).
  32. Magnet, S., Blanchard, J. S. Mechanistic and kinetic study of the ATP-dependent DNA ligase of Neisseria meningitidis. Biochemistry. 43 (3), 710-717 (2004).
  33. Williamson, A., Grgic, M., Leiros, H. S. DNA binding with a minimal scaffold: structure-function analysis of Lig E DNA ligases. Nucleic Acids Res. 46 (16), 8616-8629 (2018).
  34. Lohman, G. J., et al. A high-throughput assay for the comprehensive profiling of DNA ligase fidelity. Nucleic Acids Res. 44 (2), e14(2016).
  35. Kim, J., Mrksich, M. Profiling the selectivity of DNA ligases in an array format with mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 38 (1), e2(2010).
  36. Tang, Z. W., et al. Real-time monitoring of nucleic acid ligation in homogenous solutions using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (23), e148(2003).
  37. Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Q Rev Biophys. 44 (1), 1-93 (2011).
  38. Marti, T. M., Fleck, O. DNA repair nucleases. Cell Mol Life Sci. 61 (3), 336-354 (2004).
  39. Wang, B. B., et al. Review of DNA repair enzymes in bacteria: With a major focus on AddAB and RecBCD. DNA Repair. 118, 103389(2022).
  40. Pidugu, L. S., et al. Structural insights into the mechanism of base excision by MBD4. J Mol Biol. 433 (15), 167097(2021).
  41. Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 5905-5908 (2005).
  42. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  43. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  44. Takemoto, N., Numata, I., Su'etsugu, M., Miyoshi-Akiyama, T. Bacterial EndoMS/NucS acts as a clamp-mediated mismatch endonuclease to prevent asymmetric accumulation of replication errors. Nucleic Acids Res. 46 (12), 6152-6165 (2018).
  45. Reardon, J. T., Sancar, A. Molecular anatomy of the human excision nuclease assembled at sites of DNA damage. Mol Cell Biol. 22 (16), 5938-5945 (2002).
  46. Kunkel, T. A., Soni, A. Exonucleolytic proofreading enhances the fidelity of DNA synthesis by chick embryo DNA polymerase-gamma. J Biol Chem. 263 (9), 4450-4459 (1988).
  47. Sheppard, E. C., Rogers, S., Harmer, N. J., Chahwan, R. A universal fluorescence-based toolkit for real-time quantification of DNA and RNA nuclease activity. Sci Rep. 9 (1), 8853(2019).
  48. Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA. Nucleic Acids Res. 28 (11), e52(2000).
  49. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9 (7), 671-675 (2012).
  50. Sharma, J. K., et al. Methods for competitive enrichment and evaluation of superior DNA ligases. Meth Enzymol. 644, 209-225 (2020).
  51. Rzoska-Smith, E., Stelzer, R., Monterio, M., Cary, S. C., Williamson, A. DNA repair enzymes of the Antarctic Dry Valley metagenome. Front Microbiol. 14, 1156817(2023).
  52. Williamson, A., Pedersen, H. Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida. Protein Expres Purif. 97 (0), 29-36 (2014).
  53. Akey, D., et al. Crystal structure and nonhomologous end-joining function of the ligase component of Mycobacterium DNA ligase D. J Biol Chem. 281 (19), 13412-13423 (2006).
  54. Kim, D. J., et al. ATP-dependent DNA ligase from Archaeoglobus fulgidus displays a tightly closed conformation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 65, Pt 6 544-550 (2009).
  55. Nishida, H., Kiyonari, S., Ishino, Y., Morikawa, K. The closed structure of an archaeal DNA ligase from Pyrococcus furiosus. J Mol Biol. 360 (5), 956-967 (2006).
  56. Gundesø, S., et al. R2D ligase: Unveiling a novel DNA ligase with surprising DNA-to-RNA ligation activity. Biotechnol J. 19 (3), e2300711(2024).
  57. Hendling, M., Barišić, I. In silico design of DNA oligonucleotides: Challenges and approaches. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1056-1065 (2019).
  58. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harb Prot. 2019 (2), 10.1101/pdb.top101857 (2019).
  59. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), e1485(2009).
  60. Smith, D. R. Gel Electrophoresis of DNA. Mol Biometh Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-33 (1998).
  61. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  62. Rousseau, M., et al. Characterisation and engineering of a thermophilic RNA ligase from Palaeococcus pacificus. Nucleic Acids Res. 52 (7), 3924-3937 (2024).
  63. Kestemont, D., Herdewijn, P., Renders, M. Enzymatic synthesis of backbone-modified oligonucleotides using T4 DNA ligase. Curr Prot Chem Biol. 11 (2), e62(2019).
  64. Farell, E. M., Alexandre, G. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates. BMC Res Notes. 5, 257(2012).
  65. Nazarenko, I., Pires, R., Lowe, B., Obaidy, M., Rashtchian, A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucleic Acids Res. 30 (9), 2089-2195 (2002).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N kleik Asit EnzimleriDNA Ligaz DeneyiRNA Ligaz DeneyiFloresan EtiketlemePAGE ElektroforeziDNA Onar m EnzimleriN kleaz AktivitesiDNA RNA HibritleriEnzim Substrat Tasar m

İlgili makaleler