Yöntem makalesi

Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

DOI:

10.3791/66939

⸱

19 Temmuz 2024

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlık ve hastalık sırasında antijene özgü T hücrelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu, immün patofizyoloji anlayışımızı geliştirmenin anahtarı olmaya devam etmektedir. Endojen T hücresi repertuarı içinde antijene özgü T hücresi popülasyonlarının izlenmesinin teknik zorlukları, peptit: MHC tetramer reaktiflerinin geliştirilmesiyle büyük ölçüde ilerlemiştir. Antijenik peptit epitoplarına kompleks oluşturan MHC sınıf I veya sınıf II moleküllerin bu floresan olarak etiketlenmiş çözünür multimerleri, karşılık gelen T hücresi reseptörü (TCR) özgüllüğü ile doğrudan T hücrelerine bağlanır ve bu nedenle, ex vivo tarafından indüklenen fonksiyonel bir yanıta gerek kalmadan antijene özgü T hücresi popülasyonlarını doğal durumlarında tanımlayabilir Uyarım. Son derece nadir popülasyonlar için, tetramere bağlı T hücreleri, tespitin hassasiyetini ve güvenilirliğini artırmak için manyetik olarak zenginleştirilebilir.

Dokuda yerleşik T hücresi bağışıklığının araştırılması derinleştikçe, lenfoid olmayan dokulara giden ve bu dokularda bulunan antijene özgü T hücrelerinin tanımlanması için acil bir ihtiyaç vardır. Bu protokolde, fare akciğerlerinde bulunan antijene özgü T hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir talimat seti sunuyoruz. Bu, T hücrelerinin sindirilmiş akciğer dokusundan izole edilmesini, ardından genel bir T hücresi manyetik zenginleştirme adımını ve akış sitometrisi analizi ve sıralaması için tetramer boyamayı içerir. Bu protokolde vurgulanan adımlar, ortak teknikleri ve hazır reaktifleri kullanır, bu da onu fare T hücresi immünolojisi ile uğraşan hemen hemen her araştırmacı için erişilebilir kılar ve akciğerlerde bulunan herhangi bir düşük frekanslı antijene özgü T hücresi popülasyonunun çeşitli aşağı akış analizleri için oldukça uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptif bağışıklık sisteminin kalbinde, bir T hücresinin belirli bir antijeni tanıma ve ona yanıt verme yeteneği yatar. Bir T hücresinin aynı kökenli antijene ne zaman ve nerede yanıt verdiği, enfeksiyon ve otoimmünite, homeostaz ve kanser, sağlık ve hastalıkdengesini belirler 1. T hücrelerinin belirli bir bağışıklık bağlamında çalışmasının, ilgili bir antijen için özgüllüğü olan hücrelere odaklanması gerektiği sonucu çıkar. Antijene özgü T hücresi popülasyonlarını karakterize etme yeteneğini büyük ölçüde artıran teknolojik gelişmeler arasında, daha çok "peptit:MHC tetramerleri" olarak bilinen, antijenik peptit epitoplarına kompleks haline getirilmiş majör histouyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I veya sınıf II moleküllerin floresan olarak etiketlenmiş çözünür multimerleri (genellikle tetramerler) bulunmaktadır2,3,4,5. T hücresi antijen reseptörlerinin (TCR'ler) doğal ligandlarını temsil ederek, peptit: MHC sınıf I ve sınıf II tetramerler, bir testte antijen stimülasyonuna yanıt gerektirmeden bağışıklık sistemindeki T hücrelerinin endojen repertuarı içinde sırasıyla antijene özgü CD8 + ve CD4 + T hücrelerini doğrudan tanımlamak için bir araç sağlar. Tetramerler, antijene özgü T hücrelerinin incelenmesinde TCR transgenik T hücresi evlat edinici transfer modellerinden6 daha zarif bir yaklaşımı temsil eder ve hem deneysel fare modellerinde hem de insan hastalığında yabancı ve kendi kendine antijene özgü T hücresi popülasyonlarını tanımlamak için giderek daha fazla kullanılmaktadır 4,5.

Tetramerler, antijen stimülasyonuna yanıt olarak genişlemiş olan yüksek frekanslı T hücresi popülasyonlarını kolayca tanımlayabilirken, naif, kendi kendine antijene özgü veya hafıza T hücreleri için kullanımları, bu popülasyonların çok düşük frekansları ile sınırlıdır7. Grubumuz ve diğerleri, fare lenfoid dokularında bu hücre popülasyonlarının incelenmesini sağlamak için tespit hassasiyetini artıran tetramer tabanlı manyetik zenginleştirme stratejileri geliştirmiş ve popüler hale getirmiştir8,9,10,11.

Alanda dokuda yerleşik T hücrelerinin ortaya çıkması, lenfoid olmayan boşlukta T hücrelerini araştırmak için yeni yollar geliştirmeye daha fazla vurgu yapmıştır. Diğer birçok mukozal yüzey gibi, akciğerlerdeki T hücreleri de konak epiteli, kommensal ve enfeksiyöz mikroplar ve alerjenler dahil olmak üzere çevresel varlıklardan türetilen bir dizi öz ve yabancı antijenle karşılaşır. Lenfoid olmayan dokudan (NLT) toplanan T hücrelerinin transkripsiyonel analizi, genellikle kaçakçılık ve doku homeostazına yönelik, dokuya özgü benzersiz kader ve işlev taşıyan hafıza benzeri bir fenotip gösterir12. Ayrıca, dokuda yerleşik bellek T hücreleri (Trm'ler), dolaşımdakilere göre daha klonal olarak sınırlı olma eğilimindedir13. Antijenlerin NLT'de T hücresi ikametgahını nasıl ve neden yönlendirdiğini belirlemek, bağışıklık sisteminin enfeksiyona karşı nasıl koruduğunu, doku homeostazını nasıl koruduğunu ve bazen otoimmüniteye nasıl dönüştüğünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, akciğerlerden gelen dokuda yerleşik T hücreleri arasında diğer NLT14'e kıyasla daha fazla aşınma olduğu görülmektedir. Buna göre, akciğerin endojen T hücrelerini belirli bir antijen özgüllüğü ile tanımlama ve karakterize etme yeteneği, doğal nadirlikleri ile sınırlıdır.

Manyetik boncuk bazlı hücre zenginleştirme tekniklerinin kullanımını ve peptit: MHC tetramer boyamayı birleştirerek, fare akciğerlerinde genişlemiş ancak nadir görülen kendi kendine antijene özgü T hücrelerini tespit etmeyi başardık15,16. Burada, fare akciğerlerinde bulunan herhangi bir nadir antijene özgü T hücresi popülasyonunu güvenilir bir şekilde izole etmek ve karakterize etmek için optimize ettiğimiz bir protokolün ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz (Şekil 1). Bu protokol, dokuda yerleşik olanı vasküler T hücrelerinden17 ayırt etmek için bir in vivo antikor boyama adımını ve ardından kaynak kullanılabilirliğini sağlamak için akciğer dokusu işleme için iki farklı yöntemi içerir. Bunu daha sonra genel bir T hücresi manyetik zenginleştirme adımı, tetramer boyama ve akış sitometrisi ile analiz takip eder. Hücre canlılığı ve tetramer boyama, bu protokolde, indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) aracılı T hücresi aktivasyonunun neden olduğu apoptozu18 bloke eden aminoguanidin ve TCR aşağı regülasyonunusınırlayan Dasatinib 19 ilavesiyle daha da geliştirilmiştir. Bu protokolde vurgulanan adımlar, ortak teknikleri ve hazır reaktifleri kullanır, bu da onu fare T hücresi immünolojisi ile uğraşan hemen hemen her araştırmacı için erişilebilir kılar ve çeşitli aşağı akış analizleri için oldukça uyarlanabilir. Her ne kadar naif T hücrelerinin akciğerlerde bulunma olasılığı düşük olsa da, bu protokolün akciğerlerdeki öz antijene özgü T hücreleri ve Trm'lerin incelenmesi için özellikle yararlı olacağına inanıyoruz.

figure-introduction-1
Şekil 1: Protokol iş akışına genel bakış. Akciğerler farelerden toplanır ve tek hücrelere ayrılır. Numuneler daha sonra peptit:MHC tetramerleri ve akış sitometrik analizi için floresan işaretli antikorlarla boyanmadan önce T hücreleri için zenginleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde açıklanan prosedürler, Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakımı Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş bir hayvan yönetimi programı olan Massachusetts General Hospital'ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak onaylanmış ve geliştirilmiştir. Deneyler, 8-12 haftalık erkek ve dişi fareler üzerinde, belirli patojen içermeyen koşullar altında MGH hayvan tesisinde yetiştirilen ve sürdürülen bir C57BL / 6 genetik arka plan üzerinde gerçekleştirildi.

1. Stok çözeltilerinin hazırlanması

  1. 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 150 mM NaCl ve 1 mM MgCl2'yi çözerek HEPES tamponunu hazırlayın ve pH 7.4'e ayarlayın.
  2. 700 μg/mL Liberaz Termolizin Ortamını (TM) Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinde Ca++ ve Mg++ ile çözerek 10x Liferaz stok çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  3. 100 mM Aminoguanidin Hemisülfat Tuzunu (Malzeme Tablosuna bakınız) Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinde Ca++ ve Mg++ ile çözerek 10x aminoguanidin stok çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. EHAA ortamını (Malzeme Tablosuna bakınız) fetal sığır serumu (FBS), 100 U/mL penisilin/streptomisin, 50 μg/mL gentamisin, 2 mM L-glutamin ve 55 μM 2-merkaptoetanol ile karıştırarak eksiksiz Eagle's Ham's Amino Asitler (EHAA) ortamını hazırlayın.
    NOT: RPMI veya DMEM gibi diğer yaygın T hücresi ortamları da kullanılabilir.
  5. 1x PBS'yi %2 FBS ve %0.05 sodyum azid ile karıştırarak sıralayıcı tamponu hazırlayın.
  6. Saflaştırılmış anti-fare CD16/32 antikorunu (Malzeme Tablosuna bakınız) sıralayıcı tamponunda 1:100 v/v'de seyrelterek Fc bloğunu hazırlayın.
  7. L-glutamin içermeyen RPMI 1640 ortamında 100 μg/mL Liberase TM ve 50 μg/mL DNaz I (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek Liberase TM/DNase sindirim solüsyonu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  8. Normal salin (% 0.9 NaCl) içinde 10 mg / mL ketamin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 mg / mL ksilazin (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek ketamin / ksilazin karışımını hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).

2. Otomatik doku ayrıştırıcı ile akciğer dokusundan tek hücreli süspansiyon oluşturulması

  1. Her fare için, özel bir doku ayrıştırıcı tüpte (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 mL buz gibi soğuk HEPES tamponu hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
  2. 150-200 μL ketamin / ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile fareleri uyuşturun. Her anestezi uygulanmış fareye intravenöz olarak 100 μL normal salin içinde seyreltilmiş 1-3 μg florofor konjuge anti-fare CD45 antikoru (Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edin. Antikor uygulamasından 3 dakika sonra fareyi 500-600 μL ketamin / ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile ötenazi yapın.
  3. Akciğerleri rezeke edin ve buz üzerinde soğutulmuş ilgili doku ayrıştırıcı tüplerine yerleştirin. Tüpleri otomatik doku ayrıştırıcıya yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve akciğer dokusu için ilk programı (önceden ayarlanmış program) çalıştırın.
  4. Ayrışmış akciğer dokusunu içeren her tüpe 500 μL Liberaz stok çözeltisi ve 500 μL aminoguanidin stok çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 30 dakika somun sıkma mikseri üzerinde inkübe edin.
  5. Tüpleri tekrar ayrıştırıcıya yerleştirin ve akciğer dokusu için ikinci programı (önceden ayarlanmış program) çalıştırın.
  6. Tek hücreli süspansiyonu doku ayrıştırıcı tüpünden 100 μm'lik bir hücre süzgecinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) 50 mL'lik bir konik tüpe dökün. Doku ayrıştırıcı tüpünü 5 mL tam EHAA (veya herhangi bir eşdeğer T hücresi ortamı) ile durulayın ve süzgeçten 50 mL'lik tüpe geçirin.
  7. Süzgeci çıkarın ve tam EHAA ile hücre süspansiyonunun hacmini 50 mL'ye yükseltin. Hücre süspansiyonunu 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve geride yaklaşık 100 μL süpernatan ve hücre peleti bırakın.
  8. Toplam hacmi 200 μL'ye çıkarmak için yaklaşık 100 μL Fc Blok çözeltisi ekleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için kuvvetlice girdaplayın.

3. Alternatif protokol: Manuel ayrışma yoluyla akciğer dokusundan tek hücreli süspansiyon oluşturulması

  1. Her fare için 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde 1 mL tam EHAA hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
  2. 150-200 μL ketamin / ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile fareleri uyuşturun. Anestezi uygulanmış her fareye intravenöz olarak 100 μL normal salin içinde seyreltilmiş 1-3 μg florofor konjuge anti-fare CD45 antikoru enjekte edin. Antikor uygulamasından 3 dakika sonra fareyi 500-600 μL ketamin / ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile ötenazi yapın.
  3. Akciğerleri inceleyin ve buz üzerinde soğutulmuş ilgili 1.5 mL mikrofüj tüpüne yerleştirin.
  4. Tüm akciğerler alındıktan sonra, her bir akciğeri herhangi bir hücre ortamı olmadan yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın.
  5. Mikrofüj tüpü içinde makas kullanarak akciğerleri küçük parçalar halinde (~ 2-3 mm'lik parçalar) kesin.
  6. Her tüpe 1 mL Liberase TM / DNase I sindirim kokteyli ekleyin.
  7. Bir su banyosunda 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Aşırı sindirimi önlemek için numuneleri daha sonra buza geri koyun.
  8. Numuneyi 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 100 μm'lik bir hücre süzgecinin üzerine dökün. Steril bir 1 mL şırıngadan pistonun kauçuk ucu ile dokuyu ağa doğru ezin.
  9. Süzgeci soğuk ayırıcı tampon ile durulayın ve tüpte 7 mL'lik bir son hacim toplayın. Hücre süspansiyonunu 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve yaklaşık 100 μL süpernatan ve hücre peleti bırakın.
  10. Toplam hacmi 200 μL'ye çıkarmak için 100 μL Fc Blok çözeltisi ekleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için kuvvetlice girdaplayın.

4. Manyetik boncuk zenginleştirme yoluyla akciğer örneğinin T hücreleri için zenginleştirilmesi

  1. 50 μL anti-fare CD90.2 mikro boncuk ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Girdap yapın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    NOT: CD90.2, C57BL / 6 farelerinde T hücreleri tarafından ifade edilen alele karşılık gelir. Diğer fare suşları kullanılıyorsa alel genotipini kontrol edin.
  2. Bu arada, bir veya dört konumlu hücre ayırma mıknatısına (Malzeme Tablosuna bakınız) bir paramanyetik hücre ayırma sütunu yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Akışı yakalamak için her sütunun altına 15 mL'lik açık bir konik tüp yerleştirin. Kolonu 3 mL soğuk ayırıcı tamponu ile astarlayın ve kolonun yerçekimi ile aşağıdaki konik boruya akmasına izin verin.
  3. Hücreler mikro boncuklarla 10 dakika inkübe edildikten sonra, 1 mL'lik bir hacme soğuk sıralayıcı tamponu ekleyin ve kolonun üzerine yerleştirilmiş 100 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Kolon akışını, kolonun altına yerleştirilmiş 15 mL'lik yeni bir konik tüpe toplayın.
  4. Hücre süspansiyonu yerçekimi ile kolondan tamamen boşaldığında, orijinal tüpü ek bir 3 mL soğuk ayırıcı tamponu ile durulayarak ve ağ boyunca kolona uygulayarak kolonu yıkayın, böylece süzgeci durulayın. Süzgeci çıkarın.
  5. Numune tekrar kolona tamamen boşaldığında ve kolondan başka bir akış çıkmadığında, kolonu mıknatıstan çıkarın ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpün üzerine yerleştirin.
  6. Sütuna 5 mL soğuk sıralayıcı tamponu ekleyin.
  7. Kolon pistonunu tek bir sürekli hareketle üste iterek ve sıralayıcı tamponunu kolonun altından yeni tüpe zorlayarak kolona bağlı hücreleri hemen boşaltın.
  8. Ayrıştırılan numuneleri 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve geride yaklaşık 100 μL süpernatan ve hücre peleti bırakın.
  9. Toplam hacmi 200 μL'ye çıkarmak için 100 μL soğuk ayırıcı tamponu ekleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için kuvvetlice girdap yapın.
  10. İstenirse, bağlanmamış hücre fraksiyonunu içeren akış örneğini analiz edin.

5. Antijene özgü T hücrelerinin peptit: MHC tetramerleri ile boyanması

  1. Her numuneye, girdaba 1 μL 10 μM Dasatinib ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
  2. PE veya APC ile konjuge peptit: MHC tetramerini 10 nM'lik bir nihai konsantrasyona (veya belirli bir tetramer için ampirik olarak optimize edilmiş konsantrasyona) ekleyin.
  3. Girdap yapın ve karanlıkta RT'de (veya ampirik olarak optimize edilmiş zaman ve sıcaklıkta) 1 saat inkübe edin.

6. Tetramer işaretli T hücrelerinin akış sitometrisi ile analiz edilmesi

  1. Numune peptit:MHC tetramerleri ile boyanırken, hücrelerin yüzey belirteçlerini lekelemek için bir ana antikor karışımı hazırlayın (Tablo 1).
    NOT: İntravenöz olarak uygulanan CD45 antikoru veya tetramerlerle çakışan floroforlardan kaçının.
  2. Tetramer boyama için inkübasyon periyoduna 15 dakika kala, her numuneye 1:100'de (veya ampirik olarak optimize edilmiş konsantrasyonda) yüzey antikoru ana karışımı ekleyin.
  3. 1 saatlik kuluçka süresinin geri kalanında karanlıkta RT'de kuluçkaya yatırmaya devam edin.
  4. 50.000 akış sitometrisi sayım boncuğu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve yaklaşık 5 mL'lik bir nihai hacme soğuk sıralayıcı tamponu ekleyin. Lekeli numuneyi 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin, geride yaklaşık 100 μL süpernatan ve hücre/boncuk peleti bırakın.
  5. Numuneyi ek bir 200 μL ayırıcı tamponu ile yeniden süspanse edin ve numuneyi 5 mL floresan aktif hücre ayırma (FACS) tüpüne aktarın.
  6. Numuneyi bir akış sitometresinde analiz edin. Toplam en fazla 2.500.000 olaya kadar mümkün olduğunca çok hücre toplayın. En az 20.000 sayım boncuk olayının toplandığından emin olun. Edinme oranını saniyede 5.000 olayda veya altında tutun.
  7. Tüm verileri FCS dosyaları olarak kaydedin.

  

FlorokromAntikor
BUV395 SerisiCD90.2 (İngilizce)
Pasifik MavisiCD45 (daha önce i.v. enjeksiyonu ile eklenmiştir)
Pasifik PortakalıCD8 Serisi
Parlak Menekşe 785CD4 (İngilizce)
FITC (Finans Finans Kurumu)CD3 (İngilizce)
PerCP-CY5.5Boşaltma (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
PEpMHC tetramer veya fenotipik belirteç
PE-CY7 SerisiFenotipik belirteç (ör. CD44, PD-1, CD69, vb.)
APCpMHC tetramer veya fenotipik belirteç
AlexaFluor 700 SerisiFenotipik belirteç (ör. CD44, PD-1, CD69, vb.)
APC-CY7 SerisiCanlı/ölü leke

Tablo 1: Örnek boyama matrisi. Antijene özgü T hücrelerini tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılan tipik bir florofor konjuge akış sitometrisi antikorları paneli.

7. Verileri analiz etme

  1. Uygun akış sitometrisi yazılımını kullanarak FCS veri dosyalarını analiz edin.
    1. CD4 veya CD8 pozitif olan 1) lenfosit benzeri, 2) tek, 3) canlı, 4) ekstravasküler, 5) döküm negatif ve 6) CD90.2 pozitif olayları tanımlamak için bir dizi ardışık inklüzyon kapısı ayarlayın (Şekil 2).
    2. Bu popülasyonlardaki tetramer pozitif T hücrelerini tanımlayın.
  2. Eklenen boncukların (50.000) numune çalışması sırasında toplanan boncuk sayısına oranını hesaplayarak ve değeri toplanan toplam tetramer pozitif hücre sayısıyla çarparak mutlak tetramer pozitif hücre sayımlarını belirleyin.
    figure-protocol-1

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2 , akciğerlerdeki nadir antijene özgü CD4 + T hücrelerinin peptit: MHC sınıf II tetramerleri ile tanımlanmasında kullanılan temsili geçit stratejisini göstermektedir. Aynı işlem, peptit:MHC sınıf I tetramerli antijene özgü CD8 + T hücreleri için de uygulanabilir (veriler gösterilmemiştir).

Akciğerlerdeki yüksek sayıda lenfoid olmayan hücre nedeniyle, nadir antijene özgü T hücrelerinin tetramer tarafından güvenilir bir şekilde tespit edilmesi, sinyal-gürültüyü iyileştirmek için ilgilenilen T hücreleri için bir tür önceden zenginleştirme gerektirir. Şekil 3 , bu protokolde tarif ettiğimiz akciğer dokusundan toplam T hücrelerinin CD90.2 antikor bazlı manyetik zenginleştirmesinin etkinliğini göstermektedir. Ortalama olarak, bu zenginleştirme işlemi ile akciğerlerdeki tüm CD90.2+

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğerlerden alınan antijene özgü T hücrelerinin önceki karakterizasyonları, intranazal immünizasyon veya enfeksiyon gibi akut bir hazırlama olayını takiben genişleyen antijene özgü T hücrelerinin sağlam sayılarından yararlanmıştır 20,21,22. Bununla birlikte, kendi kendine antijene özgü T hücreleri veya dokuda yerleşik bellek T hücreleri gibi akciğerlerdeki daha nadir T hücresi popülasyonlarının, ilgilenilen T hücreleri için bir tür numune zenginleştirme olmadan tespit edilmesi zordur 15,16,23. Bu amaca, daha önce yüksek oranda canlı lenfosit24,25 elde etmek için tarif edilen akciğer dokusu ayrışma tekniklerini, intravasküler parankimal T hücrelerinden ayırt etme stratejisi ve genel bir T hücresi bazlı zenginleştirme işlemi ve ardından tetramer boyama17 ile birleştirerek ulaştık. Bu protokolü kullanarak, doku hasarı sırasında ekzojen peptit ile doğrudan bağışıklamaya veya antijen salınımından dolaylı aktivasyona yanıt olarak ortaya çıkan akciğerdeki öz antijenlere karşı spesifik olan nadir T hücrelerini tanımlama ve karakterize etme yeteneğini gösterdik15,16. Bu protokolün geliştirilmesinde bazı hususlar göz önünde bulundurulmuştur.

İyi çalışan iki farklı akciğer dokusu işleme protokolü tanımladık. Biri otomatik bir doku ayrışma cihazının kullanımını içerirken, diğeri manuel bir işleme dayanır. Daha da önemlisi, her iki yöntem de aynı zamanda bir metalloprotaz termolizin içeren bir kollajenaz I ve II karışımı olan Liberase TM'yi kullanır. Bu enzim karışımının, tek bir kollajenaz kokteyli üzerinde sindirim aktivitesini arttırdığı gösterilmiştir ve akciğer dokusundan lökositlerin geri kazanımı ile iyi çalıştığı gösterilmiştir26.

Otomatik doku ayrışma protokolü, makine ve özel doku ayrışma tüpleri için büyük bir ön maliyet gerektirir, ancak tüpler, genellikle yeniden kullanılabilen hücre süzgeçleri ile birlikte yıkanabilir ve yeniden kullanılabilir. Manuel ayrıştırma protokolü, özel ekipmanın peşin maliyetine neden olmaz, ancak emek yoğundur ve her numune ayrı ayrı doğrandığı için hasadı uzatır. Hücre ölümünü ve hücre topaklanmasını sınırlamak için aminoguanidin veya DNaz I kullanımına ilişkin protokoller arasında başka farklılıklar da vardır, ancak bu katkı maddelerinin etkisini dikkatlice karşılaştırmadık. Her iki protokolü de kullanma kararı, gerçekleştirilen çalışma türündeki kişisel deneyime ve maliyetteki en büyük faktörü temsil edecek otomatik bir doku ayrışma cihazının mevcudiyetine bağlı olmalıdır. Gerçekten de, çalışmanın özel ihtiyaçları için en iyi performansı sağlamak üzere iki protokolün unsurları karıştırılabilir ve eşleştirilebilir.

Yukarıda bahsedilen protokol, doku ayrışmasından hazırlanan tek hücreli süspansiyondan lenfositleri izole etmek için bir yoğunluk gradyanının kullanımını özellikle hariç tutar. Nadir antijene özgü T hücrelerinin tanımlanması için gerekli olan manyetik T hücresi zenginleştirme adımının bu adımı ortadan kaldırdığını bulduk. Bununla birlikte, antijene özgü T hücresi frekanslarının, bir T hücresi zenginleştirme adımına olan ihtiyacı tamamen ortadan kaldıracak kadar yüksek olduğu durumlarda, çok sayıda lenfoid olmayan hücreyi uzaklaştırarak önemli miktarda hedef hücre zenginleştirmesi sağlayacağı için bir yoğunluk gradyanı önerilir. Ek olarak, akciğer tek hücreli preparatlar özellikle büyük ve/veya dağınıksa, daha sonra kolonları tıkayabilecek aşırı hücre kalıntılarını gidermek için manyetik zenginleştirmeden önce bir yoğunluk gradyan adımı kullanılabilir (adım 4.4-4.7).

Daha doğrudan tetramer bazlı hücre zenginleştirme stratejisi yerine, CD90 pan T hücre markörüne (C57BL / 6 farelerinde eksprese edilen alel için CD90.2) dayalı olarak tüm T hücrelerinin genel bir zenginleştirmesini seçtik. Bu, çeşitli avantajlar sunar. (1) CD90 bazlı zenginleştirme, akış sitometrisinde tespit edilen antijene özgü olayların, zenginleştirilmemiş veya tetramer bazlı zenginleştirme örneklerinden daha fazla sayıda olmasına neden olur (Şekil 4). Bu, aşırı sayıda toplam olayın (2.500.000 >) toplanmasını gerektirmeden nadir antijene özgü T hücresi frekanslarının daha iyi tahminlerine katkıda bulunur, bu da numune toplama sürelerini uzatır ve sinyal-gürültü çözünürlüğünü kötüleştirir. (2) Tetramer bazlı zenginleştirmeden farklı olarak, CD90 bazlı zenginleştirme, CD4 + ve CD8 + T hücreleri, intravasküler ve ekstravasküler T hücreleri ve antijene özgü ve antijene özgü olmayan dahil olmak üzere akciğerin tüm T hücresi bölmesinin değerlendirilmesine izin verir, hepsi tek bir örnekte (Şekil 2). (3) CD90 bazlı zenginleştirme adımı tetramer boyamadan önce gerçekleştiğinden, tetramer etiketli hücrelerin akış sitometresinde analiz edilmesinden önceki süreyi en aza indirir, böylece tetramer ayrılmasından kaynaklanan potansiyel sinyal kaybını sınırlar.

Bu protokoldeki T hücresi zenginleştirme işlemi, CD90.2 manyetik boncuklarla pozitif seçime dayanır, ancak CD4, CD8 veya pan T hücre izolasyon kitleri tarafından sağlanan negatif seçim stratejileri ile benzer sonuçlar elde edilebilir. Belirli bir marka mikro boncuk, sütun ve mıknatısın kullanımını açıklıyoruz, ancak diğer manyetik zenginleştirme sistemleri de çalışmalıdır. Yine kararlar, gerçekleştirilen belirli bir çalışmadaki performansın yanı sıra önemli olabilecek genel maliyetlere dayanmalıdır. Zenginleştirme protokolleri konusundaki deneyimlerimize göre, hedef hücre verimi ve saflığı arasında genel bir denge vardır ve son derece sınırlı sayıda antijene özgü T hücresinin tespit edilmesi amacıyla verim önceliklidir.

Temsili sonuçlar, CD4 + T hücreleri ve peptit: MHC sınıf II tetramerleri içeren deneyleri gösterirken, bu protokol CD8 + T hücreleri ve peptit: MHC sınıf I tetramerleri için de aynı derecede etkilidir. Bu gibi durumlarda, sınıf I tetramer boyamanın gerektirdiği potansiyel olarak farklı koşullar (konsantrasyon, zaman, sıcaklık) için değerlendirmeler yapılmalıdır. Ayrıca, uygun florokrom etiketli B hücresi antijen reaktifleri ile antijene özgü B hücresi çalışmaları için kullanımını engelleyen herhangi bir neden görmüyoruz27.

Son olarak, burada tarif edilen protokol, tetramer boyamadan önce numuneye protein kinaz inhibitörü Dasatinib'in eklenmesini içerir. Dasatinib, T hücrelerinin tetramer etiketlemesini geliştiren ve aynı zamanda tetramerin neden olduğu T hücresi ölümünü potansiyel olarak azaltan TCR sinyalizasyonunu ve içselleştirmesini bloke eder19. Dasatinib tedavisinin faydasını, daha nadir görülen kendi kendine antijene özgü popülasyonun tespitinde en belirgin şekilde bulduk. Bunun nedeni muhtemelen, öz antijene özgü T hücrelerinin, merkezi tolerans 28,29,30,31 sırasında negatif seçilimin etkilerine bağlı olarak daha düşük afinite TCR eksprese etmesidir.

Burada kullanılan protokol, nadir akciğerde yerleşik antijene özgü T hücrelerinde transkripsiyon faktörünü ve sitokin ekspresyonunu analiz etmek için hücre içi boyama protokolleri ile başarılı bir şekilde birleştirilmiştir. Ayrıca, tek hücreli transkriptomik ve TCR dizilimi de dahil olmak üzere aşağı akış analizleri için bu nadir popülasyonları başarılı bir şekilde akışla sıraladık. Bu protokolün sürekli kullanımı ve geliştirilmesi, akciğer patofizyolojisinde adaptif bağışıklık çalışmalarına büyük fayda sağlayacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku işleme ve tetramer üretimi ile ilgili teknik yardım için L. Kuhn'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AI107020 ve P01 AI165072 JJM, T32 AI007512 DSS), Massachusetts Patojen Hazırlık Konsorsiyumu (JJM) ve Massachusetts Genel Hastanesi Araştırma İcra Komitesi (JJM) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 mm hücre süzgeciFisher Scientific22-363-549
Ca++ veya Mg++ Corning46-013-CM
Ca++ veya Mg olmadan 1x PBS Corning21-031-CV
AccuCheck Sayma BoncuklarıInvitrogenPCB100
Aminoguanidin Hemisülfat TuzuSigma-AldrichA7009
CD90.2 mikro boncuklar, fareMiltenyi130-121-278
Hücre ayırma mıknatısı (MidiMACS Ayırıcı)Miltenyi130-042-302Tek LS sütununu tutar
Hücre ayırma mıknatısı (QuadroMACS Ayırıcı)Miltenyi130-090-9764 LS sütunu
tutar DasatinibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Kartal' s Jambon' s Amino Asitler ortamıSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Otomatik doku ayrıştırıcı
gentleMACS C TüpleriMiltenyi130-093-237Otomatik doku ayrıştırıcı tüpler
Hank'in Ca < sup > ++ < / sup> veya Mg < sup > ++ < / sup >Corning21-020-CM
Gibco15630080
KetaminVedcoNDC 50989-996-06
Liberaz TMRoche5401119001
Pasifik Mavisi anti-fare CD45 antikoru (Klon: 30-F11)Biolegend103126
Paramanyetik hücre ayırma sütunları (LS Sütunları)Miltenyi130-042-401Piston ile birlikte gelir
Saflaştırılmış anti fare CD16/32 antikoru (Klon: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 ortamı L-glutamin içermezCorning15-040-CM
Sodyum Klorür% 0.9 (Normal Salin)CytivaZ1376
XylazinePivetalNDC 466066-750-02
olmadan 1x PBSHEPES ile Dengeli Tuz Çözeltisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  3. Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
  4. Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
  5. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  6. Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
  7. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  8. Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
  10. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. (68), e4420(2012).
  12. Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), 9673(2019).
  13. Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
  14. Zheng, M. Z. M., Wakim, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
  15. Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
  16. Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839(2023).
  17. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
  18. Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
  19. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  20. Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
  21. Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
  22. Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
  23. Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
  24. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  25. Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
  26. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
  27. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  28. Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
  29. Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
  30. Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
  31. Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Peptid MHC TetramerleriFare Akci er mm nolojisiDoku Yerle ik T H creleriManyetik Zenginle tirmeAk SitometrisiAkci er Dokusu DisosiasyonuBellek T H creleriH cre Y zey Belirte leriT H cresi zolasyonu

İlgili makaleler